相關申請

本申請要求2014年9月17日提交的美國臨時申請第62/051,497號的權益，其全部內(nèi)容通過引用納入本文。

政府支持

本發(fā)明在arpa-e授予的de-ar0000294下由政府支持完成，題名為“用于咸水和重金屬污染水的可放大的，自動力的純化技術(scalable,self-poweredpurificationtechnologyforbrackishandheavy-metalcontaminatedwater)”。美國政府享有本發(fā)明的某些權利。

背景技術：

哺乳動物細胞培養(yǎng)物廣泛用于制造大型且復雜的化學物質(zhì)，例如用于生物技術和醫(yī)藥的藥物和蛋白質(zhì)[1]。對于這些產(chǎn)物越來越多的需求導致對“上游”(生物反應器操作)改進的不斷推動[2]。出于此目的，已廣泛使用灌注生物反應器，因為它們能以營養(yǎng)物質(zhì)的連續(xù)饋給和廢料的去除，以及對于ph和其它條件的更好控制，來維持高細胞數(shù)量。連續(xù)灌注生物反應器的設計和操作的主要挑戰(zhàn)是細胞保留裝置的成本和可靠性。已有多種技術用于細胞保留或回收，然而它們均多多少少存在一些缺點[3]。

哺乳動物細胞可用于合成大且復雜的化學物質(zhì)，例如用于生物技術和醫(yī)藥目的的藥物和蛋白質(zhì)，因為它們能以藥物形式準確地產(chǎn)生人體所需的復雜結(jié)構(gòu)[3]。在過去的十年間，哺乳動物細胞已用于多種診斷性和治療性產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)，例如單克隆抗體[4,5]，重組蛋白[6](例如糖蛋白)，以及抗脊髓灰質(zhì)炎[1]、乙型肝炎和麻疹的病毒疫苗。在其它地方詳細介紹了哺乳動物細胞的產(chǎn)品[7,8]。細胞(酵母，藻類和其它細胞)也用于生產(chǎn)生物燃料和其它有用的化學物質(zhì)，預計這在美國和其它國家的國內(nèi)能源生產(chǎn)中發(fā)揮越來越大的作用。照慣例，哺乳動物和酵母細胞(用于發(fā)酵)的大規(guī)模培養(yǎng)可用多種方式完成，例如懸浮(例如分批、分批補料或灌注)，滾瓶以及微載體[1,2]。然而，自二十世紀八十年代面世以來，懸浮培養(yǎng)已廣泛地用于生物制藥和生物燃料工業(yè)，這歸因于其可擴大性，細胞均勻濃度、營養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物和產(chǎn)品[9]。

有三種以不同模式操作的生物反應器類型，即分批，分批補料和灌注。這些操作模式在進行營養(yǎng)物質(zhì)補充和代謝物移除的方式上基本不同，這可直接影響產(chǎn)品質(zhì)量、生產(chǎn)率和最終成本[1]。雖然目前分批補料工藝仍是生物制藥生產(chǎn)和生物燃料發(fā)酵中最受歡迎的選擇，但是最近的研究顯示，在不久的將來，灌注生物反應器會占主導地位。灌注生物反應器對于制造目的而言是理想的選擇，因為它可以通過連續(xù)饋給營養(yǎng)物質(zhì)和去除廢料/產(chǎn)物來維持高細胞數(shù)量，并且可以仔細調(diào)節(jié)如溫度和ph的參數(shù)，以使細胞生長最大化并確保產(chǎn)品批次一致性。此外，它們可以長時間連續(xù)地從大小有限的(可擴大的)生物反應器生產(chǎn)大量的產(chǎn)物，降低資本成本[10]。相反，由于缺少營養(yǎng)物質(zhì)和廢料的交換，分批和分批補料模式相容性較低，這大大限制了生產(chǎn)率并且需要大型容器。此外，需要大規(guī)模的離心系統(tǒng)從培養(yǎng)后的產(chǎn)物分子分離細胞，這會導致高資本成本，且難以保持無菌[11]。特別是在第二代生物燃料中，使用的生物體對產(chǎn)物和廢料限制的生長更敏感，并且，一些較新的生物燃料(例如丁醇)對細胞是有毒的[12]。因此，對于這些工藝，預計未來將愈發(fā)需要從分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到灌注培養(yǎng)。

成功灌注的關鍵參數(shù)是生物反應器中大多數(shù)細胞的保留。這允許以一致的產(chǎn)品質(zhì)量/穩(wěn)定性以及細胞的最佳使用，在相對較高的流速下進行操作。在制藥業(yè)中已使用幾種不同的細胞保留技術來在灌注培養(yǎng)過程中分離生物反應器中的細胞。它們通常基于離心作用(離心機、水力旋流器)，過濾(交叉流過濾器、中空纖維、渦流過濾器)，重力/聲沉降，超聲和雙向電泳分離[1,13]。良好的保留系統(tǒng)必須具有的重要因素是[1]：

-高分離效率(約100％)和高通量(100-1000l/天)

-該裝置須對細胞造成最小的傷害(歸因于剪切力)以維持高的細胞活力

-該裝置必須穩(wěn)定可靠，并且可用于長期操作(7-12天)

該裝置應該是可清潔、可滅菌和可重復使用的。

-成本節(jié)約型(資本和試劑成本低)

保留裝置的第一重要類型基于物理過濾。在這一類別中，有不同種過濾方式，例如交叉流(或切向)過濾、渦流濾器、旋轉(zhuǎn)濾器以及中空纖維濾器。盡管用微過濾器的物理過濾一直是支持大多數(shù)分離技術的主力，但是在該保留模式中存在一些主要的缺陷，例如細胞破裂、細胞聚集、膜堵塞和結(jié)垢，這使它們的大規(guī)?？捎眯詮碗s化[2]。

在制藥工業(yè)中起重要作用的另一個重要的類別是離心。離心是一種使用離心機，用離心力來使混合物沉降的方法。盡管使用簡單，離心裝置難以保持無菌，并且不能適應連續(xù)流生產(chǎn)[14]。據(jù)報道，500g的高加速度強度可以阻礙高達50％的細胞生長[1]，并且可對抗體生產(chǎn)速率產(chǎn)生不利影響[15]。

分離裝置的另一種類是水力旋流器。最近，研究者將水力旋流器應用于哺乳動物細胞的分離，這種技術以前用于從酒精發(fā)酵μ中分離酵母。離心力是由將細胞懸液切向地引入裝置的圓柱形部分產(chǎn)生的，其一般壓差高達4-6巴，細胞在該體系中承受約1000g。由于流體的強渦旋運動，當澄清的培養(yǎng)基在溢流中流出時，濃集的細胞懸液在底流中流出。用與常規(guī)離心機(離心場沉淀)相同的分離原理，水力旋流器用于生物技術行業(yè)具有許多優(yōu)勢，例如簡易、安全以及不存在移動部分。研究者提出了關于水力旋流器在灌注能力方面的性能的有趣結(jié)果，但是必須建立該技術與剪切敏感性細胞的相容性[1,2]。此外，因為當前水力旋流器系統(tǒng)無法有效捕獲那些較小的細胞，所以較小的細胞(直徑小于約10μm)的使用通常受到限制[16,17]。

重力沉降器可能是最簡單的裝置，其已在工業(yè)中被用于保留細胞。相較于過濾、離心和水力旋流器，重力沉降法不易于因高剪切力損傷細胞和堵塞過濾器[27]。然而，重力沉降法所需的長處理時間是關鍵問題。此外，沉降器的規(guī)模擴大也仍是一個問題，特別是對持續(xù)處理而言。

除了上述技術以外，還有一些工業(yè)正在探索用于灌注培養(yǎng)中細胞保留的新方法。已經(jīng)證明了超聲細胞保留法，但是這種技術所需的巨大振動幅度會導致局部溫度升高，使得它與熱敏感的哺乳動物細胞和不耐熱產(chǎn)物不相容。導致共振器聲學特性不均勻的溫度異質(zhì)性也降低了該技術的生產(chǎn)率[1]。

最近已經(jīng)測試了雙向電泳方法用于細胞保留的性能。該技術顯示了活細胞和死細胞之間分離效率的不同。然而，必須調(diào)整用于每種細胞類型的最佳頻率和流速，并且還沒有在灌注培養(yǎng)中使用這項技術的工業(yè)規(guī)模。

可用于細胞保留的其它方法包括電荷和表面性質(zhì)。

技術實現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，提供了用于灌注生物反應器的細胞保留的微流體系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含至少一個入口，其經(jīng)設定以接收待處理的生物反應混合物；至少一個曲線形微通道，其與所述至少一個入口流體流動連接，所述至少一個曲線形微通道適于基于細胞大小，沿著所述至少一個曲線形微通道的橫截面的至少一部分，分離所述生物反應混合物中的細胞；和，至少兩個出口，其與所述至少一個曲線形微通道流體流動連接，所述至少兩個出口中的至少一個出口經(jīng)設定以供待回收的分離的細胞流至所述灌注生物反應器。

在其他相關實施方式中，所述至少一個曲線形微通道可包括至少一個螺旋通道。所述至少一個曲線形微通道可包括多個曲線形微通道；所述多個曲線形微通道的各曲線形微通道的至少一個入口與微流體系統(tǒng)的共用入口流體流動連接；以及，所述多個曲線形微通道的各曲線形微通道的至少兩個出口與微流體系統(tǒng)的至少兩個相應的共用出口流體流動連接。該系統(tǒng)可包括彼此貼附的多個通道層，所述多個通道層的各通道層包括所述多個曲線形微通道的至少一些曲線形微通道；該系統(tǒng)還包括貼附于所述多個通道層的引導層，所述引導層包括用于所述多個曲線形微通道的共用入口和至少兩個共用出口。至少兩個出口中的至少另一個出口可被設定以供以下至少一種物料流動：來自灌注生物反應器的廢料，和，灌注生物反應器的產(chǎn)物。微流體系統(tǒng)可被設置以在至少一個入口接收生物反應混合物的連續(xù)流，并且提供分離的培養(yǎng)基連續(xù)流至至少兩個出口中的至少另一個出口，并且提供待回收的分離細胞連續(xù)流至所述灌注生物反應器。

在其它相關的實施方式中，所述至少一個曲線形微通道可適于僅由于至少一個曲線形微通道中的水動力分離細胞，而不在微流體系統(tǒng)中使用膜。所述至少一個曲線形微通道可具有長度，并且所述橫截面可具有限定縱橫比的高度和寬度，從而所述曲線形微通道通過所述長度和橫截面以適于沿著通道橫截面的部分，基于細胞大小，分離所述生物反應混合物中的細胞。所述至少一個曲線形微通道的橫截面可以是由徑向內(nèi)側(cè)、徑向外側(cè)、底側(cè)和頂側(cè)限定的梯形橫截面，所述梯形橫截面具有a)高度不等的徑向內(nèi)側(cè)與徑向外側(cè)，或b)高度相等的徑向內(nèi)側(cè)與徑向外側(cè)，且其中所述頂側(cè)具有至少兩個連續(xù)平整部分，每個平整部分與所述底側(cè)的寬度不相等。

在其它相關的實施方式中，所述至少一個曲線形微通道可適于過濾生物反應混合物，例如通過在所述至少一個曲線形微通道的一側(cè)的附近分離生物反應混合物中的懸浮顆粒，所述懸浮顆粒包括細胞，并且可適于在至少一個曲線形微通道的另一側(cè)收集干凈的過濾物。所述至少一個曲線形微通道可適于分級分離(fractionate)生物反應混合物，例如通過在所述至少一個曲線形微通道的外壁的附近分離生物反應混合物中的至少一種類型的較小顆粒，以及在所述至少一個曲線形微通道的內(nèi)壁附近分離生物反應混合物中的至少一種類型的較大顆粒。所述至少一個曲線形微通道可適于分離哺乳動物細胞和酵母細胞中的至少一種。灌注生物反應器的產(chǎn)物可包括藥物、蛋白質(zhì)和生物燃料中的至少一種。灌注生物反應器的產(chǎn)物可包括單克隆抗體、重組蛋白和病毒疫苗中的至少一種。待處理的生物反應混合物可包括水，用于水預處理。生物反應混合物可包括生物流體，例如血液。細胞可包括癌細胞、胎兒細胞和干細胞中的至少一種。

提供其它相關的方法。

附圖說明

通過本發(fā)明的示例性實施方式更為具體的描述使得前述內(nèi)容是更為清楚的，在所示附圖中，對于所有不同視圖，相似附圖標記表示相同部件。附圖不一定是成比例的，進行了突出強調(diào)來顯示本發(fā)明的實施方式。

圖1說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式多層慣性過濾系統(tǒng)的制造過程的步驟，如圖1a至1h中的每一附圖所示。圖1a中，使用solidworks進行模具設計。在圖1b中，使用常規(guī)的微銑削法在鋁上制造模具。在圖1c中，使用制造的模具將軟性平版印刷品和圖案轉(zhuǎn)移到單層pdms上。在圖1d中，進行兩個單獨層的氧等離子體的結(jié)合(即圖案的手動對準)以及使用精密打孔機進行穿孔。在圖1e中，顯示了穿孔之后將兩組單獨的兩層結(jié)合在一起，以形成4層裝置。在圖1f中，重復所述步驟，結(jié)合兩組單獨的四層以制得8層裝置(即所述步驟可持續(xù)以制出具有高達100層的裝置的設備)。在圖1g中，3d打印引導層置于設備中，用于流體傳送。圖1h顯示了包含使用管道連接到蠕動泵的15層pdms(總共60個螺旋通道)和3d打印引導層的高通量裝置。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于具有一個入口和兩個出口的，哺乳動物細胞的過濾和/或分級分離的單螺旋微流體芯片的構(gòu)造和操作機理的示意圖

圖3a是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，由多層pdms片組成的高通量系統(tǒng)的光學圖像，其具有結(jié)合在一起用于大樣品體積中連續(xù)細胞保留的凹凸微通道(即120個螺旋微通道)。圖3b是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的樣品處理工作流程，其顯示了使用來自模擬灌注生物反應器條件的旋轉(zhuǎn)瓶的高通量過濾系統(tǒng)的細胞富集過程。

圖4a是顯示了具有引導層的多層螺旋通道堆疊組件的分解示意圖，而圖4b是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的單層堆疊的示意圖。

圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，顯示用于從灌注生物反應器中細胞保留的高通量微量過濾系統(tǒng)的特征的圖。圖5a顯示不同細胞系的回收效率。圖5b顯示隨細胞濃度變化的分離效率。圖5c顯示了操作期間細胞的活力和密度。圖5d顯示了操作期間，由雜交瘤細胞生產(chǎn)igg的速率。

圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，顯示實驗中由流式細胞儀(accuric6，美國的bd生物科學公司(bdbiosciences，usa))獲得的facs數(shù)據(jù)的圖，其顯示了在兩種不同的濃度下，模擬灌注生物反應器的條件，使用高通量慣性過濾系統(tǒng)的cho細胞的分離結(jié)果。

圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，通過慣性微過濾系統(tǒng)的對照(未分選)cho細胞(a-c)和分選細胞(d-f)的培養(yǎng)的相差(phasecontrast)顯微圖。

圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于系統(tǒng)中的曲線形微通道的替代性橫截面的圖。

發(fā)明詳述

以下描述了示例性實施方式。

本發(fā)明的一個實施方式提供一種用慣性微流體學以極高產(chǎn)量進行超高通量(以升/分鐘級別)的細胞分離的無膜、無阻塞的微過濾平臺。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的開發(fā)的系統(tǒng)是高度多重的微流體裝置，其由具有凹凸的微通道(即，多達500個螺旋)的多層pdms片組成，其結(jié)合在一起用于從大體積生物樣品基于大小連續(xù)分離細胞。該技術利用存在于曲線形微通道中水動力進行細胞集中和分選。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的一個系統(tǒng)中，細胞僅由于由外部驅(qū)動流體驅(qū)動的流體相互作用而分離，所以所述系統(tǒng)本質(zhì)上是無阻塞的，并且無需膜過濾器更換或外力場就可持續(xù)運作。為了表征根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的系統(tǒng)，當模擬灌注生物反應器的條件時，使用250ml一次性旋轉(zhuǎn)瓶在三個不同細胞系的加濕培養(yǎng)箱內(nèi)進行細胞培養(yǎng)。每天通過使用根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的慣性過濾系統(tǒng)在無菌環(huán)境中將產(chǎn)物從細胞中分離來進行微過濾測試，同時在每個實驗之后將新鮮培養(yǎng)基和富集的細胞一起加入每個瓶中。分別監(jiān)測各樣品的細胞密度、活力、葡萄糖、抗體效價和ph。使用不同細胞濃度的微過濾測試揭示了該系統(tǒng)可用于以超過95％的分離效率的有效性持續(xù)從生物反應器中分離細胞。分選細胞的活力與未分選的(對照)相似，且超過90％的細胞排除染料，這表明最小的由分離造成的物理損傷。細胞生產(chǎn)力也通過用酶學實驗測量分泌的igg蛋白質(zhì)的活性來評估。結(jié)果表明細胞的可持續(xù)生長和為期10天的抗體生產(chǎn)，指示這一用于將動物細胞從培養(yǎng)基中分離的新技術的價值。本文提出的高通量的微過濾系統(tǒng)可使用常規(guī)的微細銑削(micro-milling)和pdms澆鑄，以極低的成本生產(chǎn)。相較于膜過濾器，該系統(tǒng)不會經(jīng)受過濾器的進行性蛋白質(zhì)和細胞污染，并且可不停地運作很長的時間而不降低通量。這一平臺預期將結(jié)合高通量、低成本、可擴大以及小足跡，使得其本質(zhì)上適合多種微過濾應用。

微流體學是許多新興的應用和學科，主要是生物、工程和醫(yī)藥領域所需的技術。因其具有匹配細胞級別的合適長度量級，普遍認為微流體學為細胞生物學作出巨大貢獻[18]。近年來，利用微流體學平臺分選細胞和顆粒已經(jīng)是興盛的研發(fā)領域[19]。最近，已報道了基于曲線形微通道中顆粒的慣性移動分選高通量惰性顆粒并作為一種有效微流體學細胞分離方法已引起廣泛的關注[20,21]。使用水動力分離顆粒的慣性微流體學裝置僅依靠微通道的尺寸、流體力和顆粒大小來實現(xiàn)分離。最近，它們已用于多種應用，包括癌細胞分離、顆粒分離和血液分級分離[21,22]。由于使用強大的容錯物理效應和高運行率，慣性微流體學系統(tǒng)將對制藥行業(yè)、環(huán)境清理和生理學流體處理中的高通量分離應用產(chǎn)生重大影響[23]。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，證明了微流體學在大規(guī)模過濾應用中的可用性。表1總結(jié)了上文背景技術部分中討論的細胞保留的現(xiàn)有方法，其基于五個重要的選擇標準，并伴以優(yōu)缺點；與根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的微流體技術相比(參見標記為“螺旋系統(tǒng)”的列)：

表1.生物反應器細胞保留的現(xiàn)有技術(取自參考文獻[1]和[2])

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的集成微流體系統(tǒng)由具有凹凸微通道(即，高達500個具有梯形橫截面的螺旋微通道)的多層pdms片組成，其結(jié)合在一起，用于從大體積臨床/生物樣品連續(xù)、無標記/阻塞地分離細胞。為了簡化操作，這一系統(tǒng)中的流體通道內(nèi)部連接，其中流體流可以經(jīng)由共享的入口分布通過所有的螺旋通道，并通過集合出口離開系統(tǒng)。圖1說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式多層慣性過濾系統(tǒng)的制造過程的步驟，如圖1a至1h中的每一附圖所示。圖1a中，使用solidworks進行模具設計100。圖1b中，用常規(guī)的微銑削法在鋁上制造模具，以生產(chǎn)鋁模具101。在圖1c中，使用制造的模具101將軟性平版印刷品和圖案轉(zhuǎn)移到單層聚二甲基硅氧烷(pdms)102上。在圖1d中，進行兩個單獨層103、104的氧等離子體結(jié)合(即，圖案的手動對準)，并使用精密打孔機進行孔105a-f的穿孔。在圖1e中，顯示了穿孔之后將兩組單獨的兩層結(jié)合在一起，以制成4層裝置，其中4層如106處所示。在圖1f中，重復所述步驟，結(jié)合兩組單獨的4層以制成8層裝置，其中8層如107處所示?？沙掷m(xù)所述步驟，制得具有高達例如100層裝置的設備。在圖1g中，3d打印引導層108置于設備中，用于流體傳送。圖1h顯示了包含使用管道連接到蠕動泵的15層109pdms(總共60個螺旋通道，其中各15層上有四個螺旋通道)和3d打印引導層108的高通量裝置。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，具有一個入口211和兩個出口——一個內(nèi)部出口212和一個外部出口213——的用于哺乳動物細胞的過濾和/或分級分離的微流體芯片的單螺旋通道210的構(gòu)造和操作機理的示意圖。

如圖2示意性地所示，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，例如，該系統(tǒng)可設計用于兩種不同的應用。一種是用于過濾目的，如圖214a和214b所示。此時，當流體在通道的入口211附近流動時，流體中初始時隨機分布的所有的懸浮顆粒215(如組圖214a所示)可聚集在微通道210的一側(cè)附近，即通常在有強烈渦流的外壁216的附近；并且可從另一側(cè)，例如內(nèi)壁217，收集干凈的過濾物(見組圖214b)。這樣的聚集導致顆粒被引導至一個出口，例如外部出口213，并且干凈的過濾物被引導至另一個出口，例如內(nèi)部出口212?？烧{(diào)整流體經(jīng)過通道的流速來實現(xiàn)這樣的過濾；例如，如組圖214b所示，使用6ml/分鐘的流速來實現(xiàn)顆粒在通道外部出口213附近處的聚集。該系統(tǒng)可設計應用的另一個目的是用于分級分離目的，如組圖214c和214d所示。此時，當流體在通道的入口211附近流動時，懸浮顆粒218是隨機分布的，如組圖214c所示；但是，經(jīng)過螺旋通道210的流體，如組圖214d所示，使得較小的顆粒218a在迪恩渦旋(deanvortices)中被捕獲，并保留在通道的外壁219附近，而較大的顆粒218b在通道的內(nèi)壁220附近聚集，所以使得顆粒在內(nèi)部212和外部213出口處分離?？烧{(diào)整流體經(jīng)過通道的流速來實現(xiàn)這樣的過濾；例如，如組圖214d所示，使用2ml/分鐘的流速來使顆粒在內(nèi)部212和外部213出口附近聚集。雖然圖2顯示，螺旋通道210在流體從入口211流到出口212和213時向內(nèi)螺旋，但該通道也可能具有處于螺旋中心的入口211以及處于通道的外邊緣的出口212和213，從而當流體從入口流至出口時，螺旋通道210向外螺旋。此外，如圖2所示，通道210可具有梯形橫截面，其具有徑向內(nèi)側(cè)220、徑向外側(cè)219、底側(cè)221和頂側(cè)222，其中徑向內(nèi)側(cè)220和徑向外側(cè)219的高度不相等。或者，如圖8的實施方式所示，通道810可具有高度相等的徑向內(nèi)側(cè)820和徑向外側(cè)819，同時頂側(cè)具有至少兩條連續(xù)平整部分821a和821b，每一條的寬度與底側(cè)822不等。

圖3a是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，由具有凹凸微通道的30片pdms片的多層323(即，120螺旋微通道，其中每一片上有4個螺旋通道)組成的高通量系統(tǒng)的光學圖像，其結(jié)合在一起用于大體積樣品在灌注生物反應器的連續(xù)、高通量的細胞保留。顯示引導層308在層323旁邊，其中可以看出，入口和出口柱(inletandoutletposts)324延伸出引導層308的底側(cè)，以插入用于多層323上的螺旋通道的共有入口和出口的孔305中(在下文附圖4a和4b中討論)。通過這種方法，共有入口和出口可連接至與引導層308的其它側(cè)相連的入口和出口管道。圖3b是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的樣品處理工作流程，其顯示了使用來自模擬灌注生物反應器條件的旋轉(zhuǎn)瓶的高通量過濾系統(tǒng)的細胞富集過程。將新鮮饋料325加入旋轉(zhuǎn)瓶326中，從其中將細胞懸浮液327泵入根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的慣性過濾系統(tǒng)328。澄清培養(yǎng)基329被引導出系統(tǒng)328，而濃集的細胞回收物330被引導回旋轉(zhuǎn)瓶326。泵331和332用于使流體從新鮮饋料325流至旋轉(zhuǎn)瓶326，并從旋轉(zhuǎn)瓶326流至過濾系統(tǒng)328。應當理解，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，替代性流動排布可用于其它操作，例如分級分離。

圖4a是顯示了具有引導層的多層螺旋通道堆疊組件的分解示意圖，而圖4b是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的單層堆疊的示意圖。在圖4b中可看出，與附圖2的螺旋通道相似的多螺旋通道439在單層堆疊440上合并在一起。此時，四個這樣的螺旋通道439在層440上合并，盡管每層可能使用不同的數(shù)量。在圖4b中顯示的螺旋通道439，每一個都具有處在螺旋通道中心的入口441，以及從每個螺旋外緣出現(xiàn)的兩個出口通道442和443。或者，每個螺旋通道439可具有一個在螺旋外部的入口，以及兩個在螺旋中心出現(xiàn)的出口通道(如圖2的實施方式所示)。在層440內(nèi)，來自層上的每個螺旋通道439的出口通道442和443接合至每一層440上的兩個共用出口點444和445，其可以通過該層的孔的形式而被穿孔。如附圖4a中，當多層440a、440b、440c連接在一起以形成堆疊時，通過每堆上的每個共用出口點444和445(參見圖4b)的孔可以接合在一起，以形成兩個共用出口通道446、447，其垂直延伸穿過整堆以到達引導層408。在引導層的底部，兩個出口銷448、449從引導層408的底部延伸以待插入該堆疊的頂層440a中；并且連接到延伸穿過引導層408的出口通道450、451，其連接到從引導層408的頂部延伸的出口端452和453，使得將系統(tǒng)與生物反應器的其他組件連接的管道(未示出)能夠連接，例如圖3b的布局。相似地，入口441(參見圖4b)可以通過每一層440的孔的形式而被穿孔，其可在堆疊440a、440b、440c接合于一起時連接在一起，使得四個(例如)共用入口通道454延伸通過堆疊。入口銷455從引導層408的底部延伸以待插入堆疊的頂層440a。引導層408的內(nèi)部入口通道456接合在一起以使流體流入單一入口端457，其可用于連接外部管道(未示出)，含有細胞懸浮液的流體通過該外部管道流入系統(tǒng)。通過這種方式，可使用共用入口端457來向系統(tǒng)中的多個不同層440a、440b、440c上的各多螺旋通道439的各入口441提供入口流體；而對于系統(tǒng)中的各多螺旋通道439，一個共用出口端452從一個出口(例如螺旋通道的內(nèi)部出口212(參見圖2))接收流體，另一個共用出口端453從另一個出口(例如外部出口213(參見圖2))接收流體。應當理解，圖4a和4b的螺旋通道具有處在螺旋通道中心的入口，而圖2的螺旋通道具有處于螺旋通道外邊緣上的入口，但可以使用任一構(gòu)造。

在圖4a和4b的實施方式中，入口457經(jīng)設定以接收待處理的生物反應混合物。螺旋通道439，或其它曲線形微通道，與入口457流體流動連接，并且適于基于細胞大小，沿著通道439的橫截面的至少一部分，分離生物反應混合物中的細胞。兩個出口452和453與通道439流體流動連接，其中出口452和453中的至少一個經(jīng)設定以供待回收的分離的細胞流至灌注生物反應器。出口452和453的至少另一個可被設定以從灌注生物反應器流出廢料或流出灌注生物反應器的產(chǎn)物。可以向入口457提供生物反應混合物的連續(xù)流，同時使分離的培養(yǎng)基的連續(xù)流流到出口452和453之一，并將分離的細胞的連續(xù)流回收至灌注生物反應器。通道439適于以僅由于至少一個曲線形微通道中的水動力分離細胞，而不在微流體系統(tǒng)中使用膜。具體而言，通道439具有長度，并且其橫截面具有限定縱橫比的高度和寬度，使得通道439通過其長度和橫截面而適于沿著通道439橫截面的部分，基于細胞大小，分離生物反應混合物中的細胞，例如圖2所示。

實驗

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，為了評估細胞分離系統(tǒng)的性能，使用了三種不同的細胞系，其廣泛應用于抗體生產(chǎn)工業(yè)。這些細胞以懸浮模式培養(yǎng)，以準確模擬生物反應器條件。培養(yǎng)基包含6.3g/l葡萄糖，并補充8mm的l-谷氨酰胺和100μg/ml的抗生素溶液。將冷凍細胞(cho\mda-mb-231和雜交瘤)解凍并轉(zhuǎn)移到具有化學限定培養(yǎng)基的t-25瓶中并使其增殖。當培養(yǎng)的細胞達到90％融合時，其采用根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的微過濾系統(tǒng)在無菌環(huán)境中過濾，然后轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)瓶中長期培養(yǎng)(參見圖3b)。這一步驟持續(xù)10天，以達到高至1×10⁸的細胞密度，與現(xiàn)有灌注生物反應器相似。

圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，顯示用于灌注生物反應器中細胞保留的高通量微量過濾系統(tǒng)的特征的圖表。圖5a顯示不同細胞系的回收效率。圖5b顯示隨細胞濃度變化的分離效率。圖5c顯示了操作期間細胞的活力和密度。圖5d顯示了操作期間，由雜交瘤細胞生產(chǎn)igg的速率。

圖5a描繪了在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的實驗中多種細胞系的分離效率?？梢娛褂迷撓到y(tǒng)可達到高水平分離(>90％)，無關細胞類型。還已證明，該系統(tǒng)可在類似于灌注生物反應器的高水平細胞濃度下工作(參見圖5b和6)，包括高達10⁶個細胞/ml或更高，例如10⁷和10⁸個細胞/ml。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，圖5c顯示了在三個獨立的實驗中細胞的生長和活力，其中觀察到細胞密度(細胞/ml)增加，而活力(百分比)顯示為最小程度地下降?？梢娍蓪崿F(xiàn)持續(xù)的細胞生長，確認在過濾期間對細胞造成最小的損傷。細胞生產(chǎn)力(圖5d)也通過用酶學實驗測量分泌的igg蛋白質(zhì)的活性來評估。觀察到igg蛋白質(zhì)濃度(μg/ml)在10天內(nèi)穩(wěn)定地上升。結(jié)果表明細胞的可持續(xù)生長和持續(xù)10天的抗體生產(chǎn)，指示這一用于將動物細胞從培養(yǎng)基中分離的新技術的價值。分選細胞的活力與未分選的(對照)相似，且超過90％的細胞排除染料，這表明歸因于分離的最小物理損傷(參見圖7)。

圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，顯示實驗中由流式細胞儀(accuric6，美國的bd生物科學公司)獲得的facs數(shù)據(jù)的圖表，其顯示了在兩種不同的濃度下，模擬灌注生物反應器的條件，使用高通量慣性過濾系統(tǒng)的cho細胞的分離結(jié)果。在組圖633中，在入口處可觀察到濃度為10⁶細胞/ml，系統(tǒng)能夠在內(nèi)部出口處(參見組圖634)得到0.01％的濃度，即細胞幾乎完全被清理，并在外部出口處(參見組圖635)獲得99.9％的濃度。相似的，在組圖636中，在入口處可觀察到濃度為10⁷細胞/ml，在內(nèi)部出口處(組圖637)為3.7％的低濃度，并且在外部出口處(組圖638)為96.7％的高濃度。

圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，通過慣性過濾系統(tǒng)的對照(未分選)cho細胞(a-c)和分選細胞(d-f)的培養(yǎng)的相差顯微圖。圖像表明細胞的形態(tài)和增殖速率之間沒有明顯的差異，表明高活力和無菌性。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，高通量的微過濾系統(tǒng)可使用常規(guī)的微銑削法和pdms澆鑄，用極低的成本生產(chǎn)。相較于膜過濾器，該系統(tǒng)不會經(jīng)受過濾器的進行性蛋白質(zhì)和細胞污染，并且可不停止的運作很長的時間而不降低通量。這一平臺預期將結(jié)合高通量、低成本、可擴大以及小足跡，使得其本質(zhì)上適合多種微過濾應用。在生物驗證實驗中，已成功顯示了該系統(tǒng)用于從生物反應器(1000ml/分鐘)大規(guī)模地保留哺乳動物細胞，分離酵母和分級分離干細胞的可用性。設計的簡單使得這一裝置與灌注生物反應器中的其它下游工藝進行串聯(lián)整合或用作獨立、高通量、微過濾/分級分離裝置是理想的。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的新型無膜的微過濾系統(tǒng)是一個用于高通量顆粒的分離/分級分離的低成本的平臺，并且可應用于許多需要細胞或顆粒分離的工業(yè)中，例如釀酒、醫(yī)藥和水工業(yè)。作為概念驗證，已證明從用于抗體生產(chǎn)從灌注生物反應器分離動物細胞。這一平臺可用于水工業(yè)中的水的預處理或可用于啤酒釀造/葡萄酒釀造中的酵母從發(fā)酵液移除。此外，該系統(tǒng)有用于生物醫(yī)藥應用的潛力，所述生物醫(yī)藥應用需要從大量生物流體(如血液)中分離稀有細胞(如癌細胞，胎兒細胞、干細胞)。

本文所用，“曲線形微通道”是指沿著微通道的流動方向的縱軸偏離直線的微通道，并且例如，可以是螺旋型或正弦曲線型通道。

如本領域普通技術人員所理解的，通道可具有各種各樣的形狀(如，彎曲、螺旋、多環(huán)、s型、線性)，使得通道的尺寸適于基于細胞的大小，沿著至少一個曲線形微通道的橫截面的至少一部分，分離生物反應混合物中的細胞。

在一個方面中，該通道是彎曲的。在一個具體的方面中，該通道是螺旋的。螺旋通道的高度可在大約10μm-200μm的范圍內(nèi)，例如大約為100μm-140μm。螺旋通道的寬度可在大約100μm-500μm的范圍內(nèi)。螺旋通道的長度可在大約1cm-10cm的范圍內(nèi)。

在一個方面中，螺旋通道可以是雙環(huán)螺旋通道。在另一個方面中，螺旋通道可以是2環(huán)螺旋通道。在另一個方面中，螺旋通道可以是3環(huán)螺旋通道。在另一個方面中，螺旋通道可以是4環(huán)螺旋通道。在另一個方面中，螺旋通道可以是5環(huán)螺旋通道，等。

螺旋通道的半徑可適于產(chǎn)生約1-10的范圍內(nèi)的迪恩數(shù)(deannumber)，例如約1cm的半徑產(chǎn)生約等于5的迪恩數(shù)。螺旋通道的長度可大于或等于3cm，例如大約為9cm，大約為10cm，大約為15cm，以及大約為20cm。螺旋通道的寬度可在大約100μm-1000μm的范圍內(nèi)，例如大約為200μm，大約為300μm，大約為400μm，大約為500μm，大約為600μm，大約為700μm，大約為800μm，以及大約為900μm。螺旋通道的高度可在大約20μm-200μm的范圍內(nèi)，例如大約為30μm，大約為40μm，大約為50μm，大約為60μm，大約為70μm，大約為80μm，大約為90μm，大約為100μm，大約為110μm，大約為120μm，大約為130μm，大約為140μm，大約為150μm，大約為160μm，大約為170μm，大約為180μm，以及大約為190μm。螺旋通道的縱橫比可在大約0.1-1的范圍內(nèi)，例如大約為0.12，大約為0.2，大約為0.3，大約為0.4，大約為0.5，大約為0.6，大約為0.7，大約為0.8，以及大約為0.9。

本文所用的“縱橫比”是指，通道的高度除以其寬度的比，并提供了適當?shù)耐ǖ罊M截面，以基于細胞大小，沿著至少一個曲線形微通道的橫截面的至少一部分，分離生物反應混合物中的細胞。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，可以使用包括螺旋微通道的微通道，其描述于lim等的美國專利申請公開號2013/0130226a1中，其整個公開內(nèi)容通過引用納入本文。例如，其中，可利用流速、寬度、高度、縱橫比和長度以及其它與細胞的水動力分離相關的條件的描述。

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本文引用的所有專利、公開申請和參考文獻的全部教導都通過引用全文納入本文。

雖然參照實施方式對本發(fā)明進行了具體展示和描述，但本領域技術人員應理解，可在不背離所附權利要求所包含的本發(fā)明范圍的情況下對形式和細節(jié)作出各種改變。