描述了用于合成麥角硫因以及式v的相關(guān)化合物的方法。

背景技術(shù)：

諸如結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)等許多革蘭氏陽性菌產(chǎn)生作為保護(hù)性小分子硫醇的麥角硫因(esh)。^1,2,3esh是在咪唑環(huán)的c2原子(ε位)處具有硫醇基的硫代組氨酸甜菜堿衍生物(方案1)。近來，發(fā)現(xiàn)了esh通過恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis)⁴主動(dòng)地分泌到培養(yǎng)基中，并且現(xiàn)有的知識(shí)表明esh可能在分枝桿菌的體內(nèi)和體外存活中起關(guān)鍵作用。

esh的結(jié)構(gòu)變體，卵硫醇(ovothiol卵硫醇)a，也充當(dāng)海膽(seaurchin)卵以及病原體、碩大利什曼蟲(leishmaniamajor)和克氏錐蟲(trypanosomacruzi)中的抗氧化劑⁵。

人類不合成esh，但具有主動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng)，一種具有高度特異性的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(octn1)，其從飲食來源中攝入其^6,7。

1956年，heath等人闡述了麥角菌(clavicepspurpurea)中的esh生物合成。他表明，組氨酸或與組氨酸密切相關(guān)的化合物可能是esh的前體，隨后的出版物借助放射性同位素標(biāo)記(¹⁴c和³⁵s)公開了利用有機(jī)體(如粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)和恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis))的esh的生物合成裝配^8,9,10。

melville等人通過在o2和fe²⁺存在下于粗細(xì)脈孢菌的無細(xì)胞提取物中溫育組氨酸三甲基內(nèi)鹽(hercynine)而進(jìn)一步建立了s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜作為esh合成中的中間體的參與¹¹。

亞砜是分枝桿菌酶egte的底物。然而，并不知曉亞砜對于天然底物或合成底物的絕對手性。中間體(ii)的先前合成在1974年報(bào)道，但是復(fù)雜且不可再現(xiàn)，導(dǎo)致8.5％的低總產(chǎn)率¹⁵。作者僅報(bào)告了芳族質(zhì)子共振的位置，而沒有進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)確認(rèn)。報(bào)道了旋光度[α]d+74.4(c＝0.5,h2o)，且不能與真正的天然產(chǎn)物[α]d+9.1(c＝0.5,h2o)一致。但是，天然和合成產(chǎn)品的熔點(diǎn)記錄為188℃～190℃。然而，據(jù)稱合成s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)被粗糙脈孢菌的無粗細(xì)胞提取物普遍切割成esh。

現(xiàn)已確定，esh通過由基因egta、egtb、egtc、egtd和egte編碼的5種酶的相繼作用合成(方案1)¹²。egta被認(rèn)為是γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶并催化γ-谷氨酰半胱氨酸的形成。組氨酸被s-腺苷甲硫氨酸(sam)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶egtd甲基化，從而得到三甲基銨甜菜堿，組氨酸三甲基內(nèi)鹽。組氨酸三甲基內(nèi)鹽隨后通過需要氧和γ-谷氨酰半胱氨酸的鐵(ii)依賴性氧化酶(egtb)轉(zhuǎn)化為s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)，以產(chǎn)生γ-谷氨酰半胱氨酰組氨酸三甲基內(nèi)鹽(i)。后者轉(zhuǎn)化(特別是亞砜形成)的確切性質(zhì)仍在調(diào)查之后。隨后，推定的ii類谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶egtc介導(dǎo)n末端谷氨酸的水解，提供s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)。最后，egte，吡哆醛5-磷酸鹽(plp)依賴性β-裂解酶提供最終產(chǎn)物esh。

近來，關(guān)于這些巰基組氨酸的研究重點(diǎn)已經(jīng)揭示了在咪唑環(huán)的δ或ε位上形成cs鍵的機(jī)制¹³。ovoa是一種鐵(ii)依賴性亞砜合酶，其催化卵硫醇(ovothiol)a合成中的第一步，并且是egtb的同系物。有趣的是，egtb與ovoa在實(shí)現(xiàn)c-s鍵形成中的底物特異性方面顯著不同。ovoa對其硫供體底物非常有選擇性，并且僅接受l-半胱氨酸，同時(shí)其優(yōu)選組氨酸作為共底物。然而，egtb需要γ-谷氨酰-l-半胱氨酸作為硫供體。此外，其對作為共底物的組氨酸(組氨酸三甲基內(nèi)鹽)的α-n,n,n-甲基化是選擇性的。令人驚訝的是，ovoa根據(jù)α-n-甲基化水平將組氨酸環(huán)上的硫化模式從δ-碳轉(zhuǎn)化為ε-碳¹⁴。因此，ovoa將組氨酸三甲基內(nèi)鹽直接轉(zhuǎn)化為s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(ii)，并且在α-n,n-二甲基組氨酸用作共底物時(shí)產(chǎn)生少量的δ-亞砜(卵硫醇取代模式)(方案1)。

方案1：esh生物合成

雖然酶egtb和egtc已經(jīng)以功能形式表達(dá)，但egte仍然難以捉摸，并且由于缺乏容易獲得的底物中間體，所述酶都沒有被徹底研究。

近來，esh作為超級抗氧化劑分子的商業(yè)利益為該分子的合成方法開發(fā)增添了更大的價(jià)值。然而，用于合成esh的已知合成方法僅能以非常高的成本實(shí)現(xiàn)低至中等產(chǎn)率。因此，仍然需要改進(jìn)合成生產(chǎn)esh的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施方式，提供了一種合成式v化合物或者其生理學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物的方法，

其中：

n是0、1或2；并且

r是h或

所述方法包括以下步驟：

a)將式11的n-芐基保護(hù)的組氨酸脫保護(hù)以形成式12的n-芐基組氨酸

b)將化合物12轉(zhuǎn)化為式13的(s)-3-(1-芐基-1h-咪唑-4-基)-2-(二甲基氨基)丙酸

c)將化合物13轉(zhuǎn)化為式14的(2s)-n,n,n-2-三甲基乙銨-3-(1-芐基-1h-咪唑-4-基)丙酸

d)將式14的化合物的咪唑環(huán)溴化以形成5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯；和

e)將步驟(d)的5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為式15的(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物

其中所述方法可選地還包括步驟(f)～(h)中任一步：

f)將式15的化合物轉(zhuǎn)化為式ii的亞砜

或

g)將式15的化合物轉(zhuǎn)化為式iii的砜

或

h)將式15的化合物轉(zhuǎn)化為式iv的麥角硫因(esh)

例如，

當(dāng)n是0時(shí)；

r可以是或

當(dāng)n是1時(shí)；

r可以是或

當(dāng)n是2時(shí)；

r可以是或

當(dāng)n是0時(shí)；

r可以是h。

式v化合物可選自由以下組成的組：

式11的化合物可以是n^α-boc-n(im)-芐基保護(hù)的l-組氨酸。

在步驟(d)中，可使用二甲基甲酰胺(dmf)和n-溴代琥珀酰亞胺(nbs)以形成5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯?？墒褂孟鄬τ诨衔?4為至少2mol當(dāng)量，優(yōu)選至少2.5mol當(dāng)量的nbs。在進(jìn)行步驟(e)之前，可將5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯與步驟(d)中形成的其他產(chǎn)物(例如2,5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽)分離。

在步驟(e)中，可使用半胱氨酸或硫代乙酸以形成式15的化合物。

步驟(d)和(e)可以以一鍋合成法中進(jìn)行。

在步驟(h)中，可使用吡哆醛-5磷酸鹽(plp)以形成式iv的麥角硫因。

在步驟(f)之后，可將式ii的亞砜進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為式iv的麥角硫因。式ii的亞砜可以與由egte基因編碼的酶(優(yōu)選egte酶)接觸以形成式iv的麥角硫因。

在步驟(e)中形成的式15的硫化物或在所述方法中形成的任一種中間體化合物(例如5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽)可用穩(wěn)定同位素(例如氘)標(biāo)記。經(jīng)標(biāo)記的化合物或中間體可以用于研究麥角硫因的生物合成途徑或用作在外部刺激或藥物治療期間定量途徑代謝物的內(nèi)標(biāo)。

根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施方式，提供了一種合成式iv的麥角硫因(esh)或者其生理學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物的方法，

所述方法包括用式15的化合物與由egte基因編碼的酶接觸的步驟

例如，式15的化合物可與恥垢分枝桿菌或egte的粗酶提取物接觸。

根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施方式，提供了一種合成式iv的麥角硫因(esh)或者其生理學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物的方法，

所述方法包括使式15的化合物與吡哆醛磷酸鹽接觸的步驟

附圖說明

圖1esh的體外重構(gòu)；含有20mmtrishclph＝7.4，20mmnacl，0.2mmfeso4.7h2o，0.5mm巰基乙醇，83μl粗恥垢分枝桿菌酶以及50mm(a)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)、(b)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)和(c)對照中任一種的100μl反應(yīng)物。將粗酶反應(yīng)物在37℃溫育1天，然后通過lc/ms進(jìn)行分析。

圖2由plp催化的esh的非酶生產(chǎn)。使用s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)、s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)和s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(iii)對esh和plp提取的tic。僅s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)產(chǎn)生顯著量的esh(96.34ng/ml)，而亞砜(ii)和砜(iii)根本不產(chǎn)生esh。

圖3esh圖的非酶促生產(chǎn)包含；含有20mmtrishclph＝7.4，20mmnacl，分別為50mm的(1)硫化物(15)+plp、(2)亞砜(ii)+plp、(3)砜(iii)+plp的100μl反應(yīng)物。反應(yīng)時(shí)間：24小時(shí)。

圖4dmso中的(12)在400mhz處的¹hnmr譜。

圖5dmso中的(12)在101mhz處的¹³cnmr譜。

圖6d2o中的(14)在400mhz處的¹hnmr譜。

圖7d2o中的(14)在101mhz處的¹³cnmr譜。

圖8d2o中的(a)在300mhz處的¹hnmr譜。

圖9d2o中的(b)在300mhz處的¹hnmr譜。

圖10d2o中的(15)在400mhz處的¹hnmr譜。

圖11d2o中的(ii)在300mhz處的¹hnmr譜。

圖12d2o中的(iii)在300mhz處的¹hnmr譜。

圖13bradford蛋白濃度校準(zhǔn)曲線。

圖14as-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)的tic。

圖14b正離子模式的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)的esi/qtof質(zhì)譜。

圖15as-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)的tic。

圖15b正離子模式的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)的esi/qtof質(zhì)譜。

圖16as-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(iii)的tic。

圖16b正離子模式的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(iii)的esi/qtof質(zhì)譜。

圖17esh的校準(zhǔn)曲線。

圖18麥角硫因的重疊tic。保留時(shí)間為1.5分鐘。

圖19正離子模式的esh標(biāo)準(zhǔn)的esi/qtof質(zhì)譜。

圖20使用以下底物對esh體外重建實(shí)驗(yàn)提取的tic：(a)作為底物的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)，(b)作為底物的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)和作為底物的(c)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(iii)。

圖21dmso中的(13)在400mhz處的¹hnmr譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種合成式v化合物或者其生理學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體的混合物的方法，

其中：

n是0、1或2；并且

r是h或(其中波形線表示r與式v分子的其余部分的附接點(diǎn))。

所述方法利用n-芐基保護(hù)的組氨酸而不是形成式v化合物的已知方法使用的組氨酸的脫保護(hù)形式，例如麥角硫因、(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物、(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜和(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜。

本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)將式11的n-芐基保護(hù)的組氨酸脫保護(hù)以形成式12的n-芐基組氨酸

b)將化合物12轉(zhuǎn)化為式13的(s)-3-(1-芐基-1h-咪唑-4-基)-2-(二甲基氨基)丙酸

c)將化合物13轉(zhuǎn)化為式14的(2s)-n,n,n-2-三甲基乙銨-3-(1-芐基-1h-咪唑-4-基)丙酸

d)將式14的化合物的咪唑環(huán)溴化以形成作為反應(yīng)性中間體的5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯，并將該5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽衍生物(此反應(yīng)的主要產(chǎn)物)與2,5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽分離；并且

e)將步驟(d)的5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為式15的(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物

并且可選地還包括步驟(f)～(h)中任一步：

f)將式15的化合物轉(zhuǎn)化為式ii的亞砜

或

g)將式15的化合物轉(zhuǎn)化為式iii的砜

或

h)將式15的化合物轉(zhuǎn)化為式iv的麥角硫因(esh)

合適的n-芐基保護(hù)的組氨酸可以商品名nα-boc-n(im)-芐基-l-氨基酸從sigma-aldrich商購獲得。作為另一選擇，該方法可以包括形成適當(dāng)封閉的組氨酸的步驟。

細(xì)菌，特別是分枝桿菌(或其酶促提取物)可用于由合成產(chǎn)生的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物或s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)酶促產(chǎn)生麥角硫因。合適的細(xì)菌產(chǎn)生egte酶，并且包括麥角菌、粗糙脈孢菌和恥垢分枝桿菌。

根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的麥角硫因可以用作中性藥物、藥用化妝品、頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品以及在運(yùn)動(dòng)等后輔助恢復(fù)的產(chǎn)品等。該產(chǎn)品可以配制用于局部施用或口服給藥。式iii的砜可用作麥角硫因合成的抑制劑或用于鑒定或設(shè)計(jì)麥角硫因合成途徑中的抑制劑。

在構(gòu)思本發(fā)明的方法之前，申請人對目標(biāo)化合物s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)嘗試了兩種不同的途徑。在第一種途徑中，s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)的逆合成切割得到β-氯-丙氨酸甲基酯和esh(方案2，s1)。因此，來源于絲氨酸的受保護(hù)的氯甲基丙氨酸酯(2)的s-烷基化提供核心結(jié)構(gòu)(3)。所得硫化物(3)用mcpba或h2o2氧化。

ishikawa等人表明反應(yīng)可能通過以下過程發(fā)生：由β-氯丙氨酸(2)的分子內(nèi)sn2反應(yīng)產(chǎn)生的環(huán)狀亞乙基亞胺羧酸中間體形成，隨后是由esh的硫原子的親核攻擊引起開環(huán)，得到主要產(chǎn)品n-boc甲基酯(3a)。

先前由ishikawa等人研究的伴隨h2o2的亞砜化反應(yīng)條件在申請人的實(shí)驗(yàn)中引起過度氧化成砜(iii)，并且沒有提供分析證據(jù)。為了防止亞砜過度氧化，使用了mcpba。與過氧化氫相比，其較溫和的性質(zhì)和可控的磺化氧化的潛力是有利的。硫化物甲基酯(3a)用1當(dāng)量mcpba進(jìn)行s-氧化，以便提供亞砜甲基酯(4a)。合成產(chǎn)品很可能是rcss和rcrs非對映異構(gòu)體的混合物。硫化物甲基酯(3a)的最低空間能量構(gòu)象(總能量34.37kcal/mol)表明對于亞砜氧化的潛在面選擇性，這可能主要產(chǎn)生sr非對映異構(gòu)體亞砜衍生物。亞砜甲基酯(4b)的¹hnmr光譜顯示了非對映選擇性的證據(jù)(約3:1比例)。然而，只有由cd(圓二色性)光譜支持的晶體結(jié)構(gòu)將有助于建立主要手性亞砜的絕對構(gòu)型以及天然亞砜(ii)的絕對構(gòu)型。用過量的氧化劑實(shí)現(xiàn)硫化物(3b)、(4b)或亞砜(5a)對砜(iii)的有意氧化。

最后，在酸性水溶液條件下，boc基團(tuán)的嘗試全部脫保護(hù)和甲基酯的水解分別由(3a)和(4a)僅提供甲基酯硫化物(3b)或甲基酯亞砜(4b)。不成功的酸、堿或酯酶介導(dǎo)的酯水解強(qiáng)制重新考慮合成路線。先前已經(jīng)報(bào)道了穩(wěn)定的氨基酸甲基酯^17,18。β-氯代絲氨酸的烯丙酯衍生物在s-烷基化后提供了n-boc烯丙基酯硫化物(3c)?；腔趸筮m度rhcl(pph3)3催化烯丙酯切割¹⁹和酸介導(dǎo)的boc保護(hù)基團(tuán)去除以63％的中等總產(chǎn)率提供了目標(biāo)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)。

通過第二合成途徑，s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫基亞砜(3)的組氨酸部分的切割提供半胱氨酸和溴代氨基三甲基內(nèi)鹽衍生物(方案2)。此途徑受到最多的關(guān)注，因?yàn)樗峁┙M氨酸所需的硫化從而提供商業(yè)上重要的esh。s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(5a)通過略微改進(jìn)的erdelmeier方法合成²⁰(方案2)。然而，必須除去大量的鹽副產(chǎn)物，其妨礙純化。用3-巰基丙酸在90℃下將s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(5a)處理18小時(shí)，得到esh。硫化物(5a)轉(zhuǎn)化為雙-芐氧基n-boc保護(hù)的酯(5b)，使鹽被有機(jī)萃取和除去，從而得到干凈的芐基酯(5b)。在50psi氫壓下，在tfa的存在下，通過氫化(pd/c)來實(shí)現(xiàn)n-boc芐酯(5b)的全部脫保護(hù)，從而得到純s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(5a)。硫化物(5a)與mcpba在dcm/水混合物中的雙相磺化氧化以36％的低總產(chǎn)率提供s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)。

方案2

試劑和條件：(i)et3n/h2o在30℃下5小時(shí)，(3a)；(ii)n-boc脫保護(hù)：tfa，dcm/h2o，0～5℃(3b)、(4b)或(ii)(iii)a)rhcl(pph3)3，etoh/h2o(1:1)回流b)tfa，dcm/h2o，0～5℃(5a)；(iv)mcpba,h2o/dcm1:1，在25℃下5小時(shí)(4a)或(ii)(v)a)boc2o/naoh，h2o/ch3cn，在室溫下過夜b)bnbr/dmf，在室溫下過夜(vi)pd/c，3eqtfa，h250psi，室溫2h；h2o2，在室溫下3小時(shí)(vii)a)ch2o，三乙酰氧基硼氫化鈉/ch3cn，在室溫下18～24小時(shí)(6)，b)nh4oh，ch3i或cd3i/meoh，在室溫下24小時(shí)，(7)；(viii)a)t-buoh/hcl，回流3～4小時(shí)，s-叔丁基巰基組氨酸；b)ch2o，三乙酰氧基硼氫化鈉/thf，在10℃下6～8小時(shí)，(9)；(ix)a)nh4oh，cd3i/meoh，在室溫下表24h；b)hcl，2-巰基丙酸，回流21小時(shí)(定量)；(x)br2，半胱氨酸hcl，h2o，在0℃下1小時(shí)，(5a)；(xi)3-巰基丙酸，hcl/h2o，回流19小時(shí)。

根據(jù)本發(fā)明合成esh的方法

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，n-芐基保護(hù)的組氨酸三甲基內(nèi)鹽中間體被一當(dāng)量n-溴代琥珀酰亞胺(nbs)的溴化利用dmf作為溶劑，以90％的產(chǎn)率(w/w)提供了更穩(wěn)定的n-芐基脫保護(hù)的5-溴代組氨酸三甲基內(nèi)鹽內(nèi)酯衍生物。與其它已知方法相比，該方法的成功在于區(qū)域選擇性c-5溴化。然而，更出乎意料的是，當(dāng)使用相對于反應(yīng)物為2摩爾當(dāng)量nbs試劑時(shí)，發(fā)生n-芐基的前所未有的脫保護(hù)，導(dǎo)致n-芐基的新原位脫保護(hù)。當(dāng)通過此后一種中間體進(jìn)行時(shí)，隨后的方法步驟接近于定量，相對簡單，全部在室溫下，縮短時(shí)間，并允許總合成產(chǎn)率為80％(w/w)。因此，本發(fā)明的方法能夠提供比任何先前公布的方法至少高2倍的總產(chǎn)率。最終步驟可以以化學(xué)、生物合成或微生物手段實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化涉及熱解性c-s切割²⁰。作為另一選擇，仿生吡哆醇磷酸鹽(plp)介導(dǎo)的硫化物或亞砜底物的切割以及利用恥垢分枝桿菌的粗酶提取物產(chǎn)生esh(方案3和4)。

方案3.亞砜(ii)、砜(iii)和esh的改進(jìn)的合成：(i)tfa，dcm，在室溫下過夜；(ii)ch2o，nabh(oac)3，ch3cn，在室溫下24小時(shí)；(iii)mei，thf，在室溫下24小時(shí)；(iv)(a)nbs(2.5eq)，dmf，在室溫下暗處，b)l-半胱氨酸hcl.h2o(2.5eq)，dmf，在室溫下24小時(shí)；(v)對甲苯磺酸(cat)，h2o2(2.4eq)；(vi)硼酸(cat)，h2o2(4.8eq)；(vii)c-s酶裂解酶或plp非酶促切割。

方案4：使用硫代乙酸代替半胱氨酸的本發(fā)明方法

比較了從合成亞砜(ii)開始的酶促和非酶plp介導(dǎo)的esh合成。為此，從晚期指數(shù)期生長和收獲的培養(yǎng)物中分離出無恥垢分枝桿菌細(xì)胞粗提取物，其特征在于高酶促活性¹⁰。

如通過lcms測定的，esh生物合成途徑前體(包括硫化物和亞砜變體)的粗酶促轉(zhuǎn)化，通過超出基準(zhǔn)水平的esh伴隨產(chǎn)生來評估。esh前體代謝物(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)和(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)通過無細(xì)胞粗提取物在37℃，ph＝7.4下孵育1天，并通過lcms分析。

僅含有無恥垢分枝桿菌細(xì)胞粗提取物的對照反應(yīng)也在與代謝物相同的條件下處理。由此獲得的esh濃度為5.70(±0.30)ng/ml，其與內(nèi)源性esh的濃度相當(dāng)。該濃度高于檢測限(0.78ng/ml)，因此試驗(yàn)中超過1ng/ml的esh濃度的任何增加都被認(rèn)為足夠顯著從而歸因于基準(zhǔn)水平或各底物通過esh途徑的粗內(nèi)源性酶的生物轉(zhuǎn)化。

(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)生物合成地產(chǎn)生最高濃度的esh(22.6ng/ml)(圖1)。(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)似乎幾乎與(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫基亞砜(ii)(19.2ng/mlesh)是一樣好的底物。眾所周知，plp依賴性轉(zhuǎn)化可以進(jìn)行無酶轉(zhuǎn)化，盡管速度和特異性低得多²²。因此，在37℃下用50mmplp非酶促處理硫化物(15)導(dǎo)致esh的有效形成(96.3ng/ml)(圖2)。然而，在相同條件下，亞砜(ii)根本不產(chǎn)生esh(圖3)。

通過本發(fā)明方法獲得的增加的產(chǎn)率也將允許中間體以更高的量回收以用于同位素標(biāo)記。中間體產(chǎn)物的高產(chǎn)率還允許進(jìn)行可行的同位素標(biāo)記步驟。同位素通常非常昂貴，并且優(yōu)勢在于高產(chǎn)率轉(zhuǎn)化。

先前，經(jīng)放射性標(biāo)記的中間體已被用于闡明esh的生物合成途徑。申請人現(xiàn)發(fā)現(xiàn)可以合成引入穩(wěn)定同位素的相同的中間體，并且在下面更詳細(xì)地描述由氘化組氨酸三甲基內(nèi)鹽合成esh-d3(10)。

這些具有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的中間體可用于例如進(jìn)一步研究esh途徑，或用作外部刺激或藥物治療期間途徑代謝物定量的內(nèi)標(biāo)。

預(yù)期如前所述的對egte酶介導(dǎo)的c-s切割穩(wěn)定的s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜，可用作esh合成的抑制劑或可用于設(shè)計(jì)或篩選esh途徑中其他酶抑制劑(特別是egte)。esh生物合成酶抑制劑可能導(dǎo)致開發(fā)新蛋白質(zhì)靶標(biāo)以及用于開發(fā)使結(jié)核分枝桿菌對治療方案更敏感的藥物的。

現(xiàn)將通過以下非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

實(shí)施例

1.一般程序

所有溶劑通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)干燥并在使用前新鮮蒸餾。所有市售的試劑均購自sigma-aldrich和merck，且無需進(jìn)一步純化即可使用。

除非另有說明，反應(yīng)在烘干玻璃器皿中于氮的惰性氣氛下進(jìn)行，并通過在merck硅膠60-f254片(0.2mm層)預(yù)涂板上進(jìn)行的薄層色譜(tlc)監(jiān)測，產(chǎn)物在254nm的uv光下可視化或者通過用茚三酮(2％v/v)的乙醇溶液噴涂板然后通過加熱可視化。

通過使用merckkieselgel硅膠60(0.040mm～0.063mm)進(jìn)行柱層析，并用合適的溶劑混合物洗脫。所有化合物在確定產(chǎn)率之前在真空下干燥。

除非另有說明，核磁共振譜(¹h和¹³c)記錄在varianmercury300mhz(75mhz，¹³c)、varianunity400mhz(101mhz，¹³c)、brukerunity400mhz(101mhz，¹³c)或brukerunity600mhz(151mhz，¹³c)上，并在作為溶劑的cdcl3、dmso-d6和d2o中進(jìn)行?；瘜W(xué)位移相對于四甲基硅烷(tms，δ＝0.00ppm)(其用作內(nèi)標(biāo))以ppm提供。需要時(shí)，通過cozy、apt和hsqc分析確認(rèn)賦值。耦合常數(shù)(j)以赫茲(hz)報(bào)告。自旋多重性通過以下符號(hào)表示：s(單峰)、d(雙重峰)、dd(雙重雙峰)、t(三重峰)、m(多重峰)、q(四重峰)和br(寬峰)。

在20℃下使用perkingelmer141偏光計(jì)獲得旋光度。濃度c指g/100ml。

熔點(diǎn)使用reichert-jungthermovar熱板顯微鏡測定，并且未校正。在4000cm^-1至450cm^-1的perkin-elmerft-ir光譜儀(以cm^-1計(jì))上記錄紅外光譜。

在jeolgcmateιι磁扇形質(zhì)譜儀上記錄質(zhì)譜，并提供基峰，開普敦大學(xué)。

使用裝配有agilent噴射流電離源(陽離子模式)(esi⁺)和柱(eclipse+c18rrhd1.8μm.2.1x50，agilent，德國)的uhplcagilent1290infinity系列(德國)精確質(zhì)譜儀agilent6530qradrupoletimeofflight(qtof)進(jìn)行l(wèi)cms分析。

使酶促反應(yīng)在nuaire溫育器(dhautoflowco2air–jarcketed溫育器)中孵溫育并在eppendhorf離心機(jī)(型號(hào)5810r，德國)，南非開普敦tygerbergstellenbosch大學(xué)。

2.麥角硫因底物和砜的合成

方案5：亞砜(ii)和砜(iii)的合成

n-芐基-l-組氨酸(12)

將nα-boc-n(im)-芐基-l-組氨酸11(sigma-aldrich)(750mg,2.17mmol)懸浮在二氯甲烷(10ml)中，然后添加三氟乙酸(1ml)并在冰浴中冷卻。使所得均勻溶液在室溫下攪拌直至如薄層色譜所示的完全脫保護(hù)。去除溶劑，用et2o(15ml)研磨并干燥，從而得到為白色晶體的產(chǎn)物12(700mg，定量)。mp:230-233℃,(lit.240℃)¹；¹hnmr(400mhz,dmso)δ9.01(s,1h,h-2'),7.50(s,1h,h-5'),7.39(m,5h,phenyl),5.37(s,2h,h-1”),4.22(t,j＝7.0hz,1h,h-2),3.22(dd,j＝15.6,7.0hz,1h,h-3a),3.14(dd,j＝15.6,7.0hz,1h,h-3b)；¹³cnmr(101mhz,dmso)δ170.1(c-1),136.3(c-2”),135.8(c-2'),130.0(c-4'),129.4(c-5”c-6”),129.0(c-7”),128.6(c-3”c-4”),120.6(c-5'),51.7(c-1”),51.6(c-2),26.3(c-3)(圖4和5)。

(s)-3-(1-芐基-1h-咪唑-4-基)-2-(二甲基氨基)丙酸(13)

在ch3cn(20ml)中懸浮12(1.31g,5.34mmol)，然后添加甲醛(1.2ml,15.5mmol,37％)。向所得均勻溶液中加入nabh(oac)3(3.2g,15.5mmol)，并將溶液在室溫下攪拌24小時(shí)。通過硅藻土過濾出不希望的鹽，將溶劑蒸發(fā)至干燥，從而得到為黃色油狀物的粗二甲基產(chǎn)物13(1.80g，定量)。由于分子的兩性離子性質(zhì)，嘗試用液-液萃取方法分離該產(chǎn)物是不成功的。然而，該產(chǎn)物是足夠純的并且不經(jīng)進(jìn)一步純化而用于下一步驟(圖21)。

(2s)-n,n,n-2-三甲基乙銨-3-(1-芐基-1h-咪唑-4-基)丙酸(14)

將粗二甲基產(chǎn)物13(870mg,3.16mmol)溶解在干燥四氫呋喃(10ml)中，然后添加mei(0.41ml,942mg,6.64mmol)。使所得溶液在暗處于室溫下攪拌1～2天。去除溶劑，從而得到為黃色油的產(chǎn)物14(822mg,93％)。在無水乙醇中結(jié)晶，得到為白色固體的產(chǎn)物14。mp:156℃(dec),¹hnmr(400mhz,d2o)δ8.65(d,j＝1.6hz,1h,h-2'),7.39–7.29(m,5h,ph),7.28–7.24(m,1h,h-5'),5.27(s,2h,h-1'),4.26(dd,j＝9.7,4.7hz,1h,h-2),3.47–3.36(m,2h,h-3),2.88(s,9h,h-1”h-2”h-3”)；¹³cnmr(101mhz,d2o)δ169.0(c-1),134.9(c-2'),134.7(c-2”),133.5(c-4'),129.3(c-3”c-4”),128.4(c-5”c-6”),127.5(c-7”),121.0(c-5'),81.8(c-2),65.4(c-1”),52.7(c-1”'c-2”'c-3”'),21.8(c-3)；對c16h21n3o2287.2[m-1]⁺計(jì)算的lrms(ei⁺)m/z為287.1([m]⁺,1％)，而對c14h17n3⁺227.1[m-co2和-ch3]⁺計(jì)算的為227.1([m-co2和-ch3]⁺,100％)(圖6和7)。

咪唑環(huán)的選擇性和輕度溴化

方案6：咪唑環(huán)的選擇性和輕度溴化

溴化條件被優(yōu)化為非常有選擇性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)溴化中間體足夠穩(wěn)定從而通過反相c18色譜分離。單溴代中間體——5-溴組氨酸三甲基內(nèi)鹽(a)(圖8)以非常高的產(chǎn)率(90％)分離，而2,5-二溴組氨酸三甲基內(nèi)鹽中間體(b)(圖9)以10％的低產(chǎn)率分離。

組氨酸三甲基(hercynyl)半胱氨酸硫代醚(15)(一鍋合成)

將14(700mg,2.43mmol)溶解在二甲基甲酰胺(8ml)中，然后添加n-溴代琥珀酰亞胺(1.8g,6.08mmol)。使所得溶液在室溫下攪拌直至原料完全消失(薄層色譜分離監(jiān)測)，溶液變?yōu)榧t橙色，表明成功溴化。

在成功溴化之后，一次性添加半胱氨酸hcl.h2o(1.07g,6.08mmol)，使所得溶液在室溫下攪拌24小時(shí)。反相色譜分離c18提供作為黃色吸濕性固體乙酸鹽形式分離的產(chǎn)物15(695mg,90％)。¹hnmr(400mhz,d2o)δ7.41(m,1h),4.54(dd,j＝7.7,4.4hz,1h,h-2”),4.42(t,j＝5.0hz,1h,h-2),3.50(dd,j＝15.2,4.4hz,1h,h-3a”),3.36(dd,j＝15.2,7.7hz,1h,h-3b”),3.19(m,2h,h-3),2.80(s,9h,h-1”h-2”h-3”),2.75(s,3h,乙酸鹽)；¹³cnmr(101mhz,d2o)δ170.3(c-1”),170.0(c-1),129.4(c-2'),128.9(c-4'),120.9(c-5'),61.0(c-2),54.4(c-2”),51.7(c-1”'c-2”'c-3”'),36.3(c-3”),23.9(c-3)；hrms(esi⁺):m/z317.1284[m]⁺。對c12h21n4o4s⁺計(jì)算的為317.1277[m]⁺(圖10)。

組氨酸三甲基半胱氨酸亞砜(ii)和砜(iii)的合成

s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜或(2s)-n,n,n-2-三甲銨-3-[2-((2r)-2-氨基-2-羥基羰基)乙基亞磺?；?-1h-咪唑-4-基]丙酸(ii)²⁶

向h2o2溶液(30％,224mg,6.58mmol,2.4eq)中加入15(870mg,2.74mmol)和對甲苯磺酸(15mg,0.08mmol)。使所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。在終點(diǎn)時(shí)，最后通過加入h2o(10ml)使反應(yīng)猝滅，并在真空下蒸發(fā)，從而得到粗產(chǎn)物，其通過c18反相純化，從而得到為黃色固體的產(chǎn)物ii(640mg,70％)。¹hnmr(300mhz,d2o)δ8.01(s,1h,h-5'),4.49(dd,j＝8.6,3.3hz,1h,h-2”),3.90(dd,j＝16.1,9.3hz,1h,h-2),3.65(dd,j＝15.0,3.3hz,2h,h-1”),3.52(dd,j＝9.3,4.9hz,1h,h-3a),3.44(dd,j＝9.3,4.9hz,1h,h-3b),2.86(s,9h,nme3),2.79(s,3h,乙酸鹽)；¹³cnmr(101mhz,d2o)δ171.8(c-3”),170.1(c-1),156.6(c-2'),129.5(c-4'),125.5(c-5'),72.5(c-2),49.5(nme3),49.1(c-1”),43.5(c-2”),20.8(c-3)；hrms(esi⁺):m/z334.1306[mh]⁺。對c12h22n4o5s²⁺計(jì)算的為334.1321[mh]⁺(圖11)。

s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜或(2s)-n,n,n-2-三甲銨-3-[2-((2r)-2-氨基2-羥基羰基)乙基亞磺酰基)-1h-咪唑-4-基]丙酸(iii)²⁷

將15(810mg,2.55mmol)加入h2o2(30％,416mg,12.24mmol,4.8eq)和硼酸(5mg,0.08mmol)的溶液中，使反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。在終點(diǎn)時(shí)，通過加入h2o(10ml)使反應(yīng)猝滅，并在真空下蒸發(fā)，從而得到粗產(chǎn)物，其通過c18反相純化，從而得到為黃色固體的產(chǎn)物iii(545mg,61％).¹hnmr(300mhz,d2o)δ8.01(s,1h,h-5'),4.52(dd,j＝8.3,3.1hz,1h,h-2”),3.89(dd,j＝16.1,9.3hz,1h,h-2),3.65(dd,j＝15.0,2.8hz,2h,h-1”),3.59–3.43(m,2h.h-3),2.85(s,9h,nme3),2.79(s,3h,acetate)；¹³cnmr(101mhz,d2o)δ171.7(c-3”),170.0(c-1),159.8(c-2'),156.6(c-4'),132.9(c-5'),64.3(c-2),56.7(c-1”),49.4(nme3),49.1(c-2”),34.7(c-3)；hrms(esi⁺):m/z349.1177[m]⁺。對c12h21n4o6s⁺計(jì)算的為349.1192[m]⁺(圖12)。

3.從恥垢分枝桿菌進(jìn)行的總蛋白提取和純化

mc²155(恥垢分枝桿菌)生長條件

使恥垢分枝桿菌培養(yǎng)物(800ml)生長至指數(shù)期，然后干燥以獲得10g干燥細(xì)胞。其后，將獲得的恥垢分枝桿菌細(xì)胞球團(tuán)在-80℃下儲(chǔ)存直到需要。

總蛋白提取

將恥垢分枝桿菌細(xì)胞在4℃下超聲處理35分鐘(25脈沖(pulsars))，然后添加磷酸鉀緩沖液(60ml；ph7)。使溶液在4℃下攪拌10分鐘，而后以3000rpm離心分離20分鐘。收集上清液，進(jìn)行測量，然后逐漸添加適量的硫酸銨，同時(shí)在4℃下攪拌過夜，從而獲得60％～70％飽和度。²⁸

在總蛋白沉淀后，懸浮液在4℃下以3000rpm離心分離20分鐘，并在-20℃下儲(chǔ)存。

總蛋白純化

將復(fù)合的總蛋白銨鹽沉淀物重新懸浮于含有吡哆醛磷酸鹽(10ml；20μm)、磷酸鉀緩沖液(8ml；50mm；ph7)和(2ml；1mmedta)的緩沖液混合物(20ml；ph7)中。

蛋白校準(zhǔn)曲線

為了測定總蛋白濃度，使用蛋白質(zhì)dc檢驗(yàn)和bradford檢驗(yàn)法。在目前的情況下，發(fā)現(xiàn)bradford校準(zhǔn)曲線比蛋白dc更精確(圖13)。

計(jì)算出的恥垢分枝桿菌總蛋白濃度為10.33μg/μl。

4.hplc–esi/ms(qtof)分析

材料和方法

用配備有agilent噴射流電離源(正電離模式)(esi⁺)和柱(polaris3c18ether100x2mm,粒徑3μm,agilent,德國)的uhplcagilent1290infinity系列(德國)，精確質(zhì)譜儀agilent6530quadrupoletimeofflight(qtof)進(jìn)行分析。

將15μl濃縮樣品注入lcms。在0.1％甲酸的milli-q水(溶劑a)溶液和作為流動(dòng)相的90％乙腈、0.1％甲酸、10％milli-q水(溶劑b)的混合物中以0.3ml/分鐘的等流量嘗試分析物分離。

該系統(tǒng)使用軟件包masshunter工作站軟件(定性和定量版本b.05.00；build5.0.519.0，agilent2011，德國)進(jìn)行控制。

實(shí)驗(yàn)lcms

由于所有代謝物中存在的季銨基團(tuán)的極性和電荷，對于esh(rt＝0.8分鐘)觀察到uhplc(eclipse+c18rrhd1.8μm.2.1x50)柱上的保留性差。所有后續(xù)分析用如s3.1節(jié)(rt＝1.5min)中所述的改進(jìn)的柱進(jìn)行(圖14至16)。

麥角硫因在恥垢分枝桿菌中的體外重組生物合成¹²

實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，重復(fù)數(shù)次(超過三次)，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果是可再現(xiàn)的。

esh校準(zhǔn)曲線

為了構(gòu)建用于量化esh的校準(zhǔn)曲線，一式三份地制備了八種不同濃度(0.78ng/ml,1.56ng/ml,3.125ng/ml,6.25ng/ml,12.5ng/ml,25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml)的esh，給出了esh的定量限制(loq)0.78ng/ml，其與lzwang等[15]發(fā)現(xiàn)的相似。¹⁵esh的檢出限(lod)為9pg/ml。esh的保留時(shí)間為1.5分鐘。對于分析的esh標(biāo)準(zhǔn)品和反應(yīng)樣品，都獲得了極好的對稱峰(圖17至19)。

利用粗恥垢分枝桿菌酶制備將底物生物轉(zhuǎn)化成麥角硫因

三組100μl反應(yīng)物(1～4)，其含有20mmtrishclph＝7.4、20mmnacl、0.2mmfeso4.7h2o、0.5mm巰基乙醇、83μl粗酶以及50mm的(1)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)、(2)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)、(3)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(iii)或(4)對照(僅粗酶，無底物)中任一種。將粗酶反應(yīng)物在37℃溫育1天。通過將混合物在90℃加熱2分鐘而停止反應(yīng)，然后冷凍干燥，隨后在lc緩沖液中重構(gòu)，然后通過lc/ms進(jìn)行分析(圖20)。

由plp催化的c-s鍵的非酶促切割

三組100μl反應(yīng)物(1～3)，其含有20mmtrishclph＝7.4以及50mm的(1)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因硫化物(15)和plp(2)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因亞砜(ii)和plp或(3)s-(β-氨基-β-羧乙基)麥角硫因砜(iii)和plp中斷任一種。將非酶促反應(yīng)物在37℃培育1天，然后冷凍干燥，隨后在lc緩沖液中重構(gòu)，然后通過lc/ms進(jìn)行分析(圖2和3)。

5.同位素標(biāo)記

組氨酸三甲基內(nèi)鹽-d3(7)在由市售l-組氨酸開始的兩步反應(yīng)中合成(方案2)。第一步涉及使用甲醛水溶液和三乙酰氧基硼氫化鈉還原性胺化以得到n,n-二甲基組氨酸(6)。第二步涉及在堿性條件下使用甲基-d3碘化物對粗n,n-二甲基組氨酸(6)進(jìn)行季銨化，以得到組氨酸三甲基內(nèi)鹽-d3(7)。

esh-d3(10)在由s-叔丁基保護(hù)的2-巰基-組氨酸(9)開始的兩個(gè)連續(xù)的反應(yīng)步驟中合成，所述s-叔丁基保護(hù)的2-巰基-組氨酸(9)得自于巰基組氨酸(8)。²¹用甲基-d3碘化物進(jìn)行選擇性n-甲基化，然后使用2-巰基丙酸(叔丁基清除劑)在hcl中進(jìn)行s-叔丁基脫保護(hù)，得到esh-d3(10)。

組氨酸三甲基內(nèi)鹽和麥角硫因氘代化合物的合成

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