本發(fā)明要求美國(guó)系列號(hào)62/056,834(2014年9月29日提交)和美國(guó)系列號(hào)62/206,586(2015年8月18提交)的利益和優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入本文。該專(zhuān)利公開(kāi)包含受版權(quán)保護(hù)的材料。版權(quán)所有者不反對(duì)任何人對(duì)在美國(guó)專(zhuān)利商標(biāo)局專(zhuān)利文檔或記錄中出現(xiàn)的專(zhuān)利文件或?qū)＠_(kāi)內(nèi)容進(jìn)行復(fù)制，但在其他方面保留任何和所有版權(quán)。本文引用的所有專(zhuān)利，專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物通過(guò)引用以其整體并入本文。這些出版物的公開(kāi)以其整體通過(guò)引用并入本申請(qǐng)中，以便更全面地描述截止本文所述的發(fā)明之日，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)。政府支持本發(fā)明是在國(guó)立衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)的批準(zhǔn)號(hào)為u19ai067854和um1ai100645的政府支持下進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。本發(fā)明涉及hiv-1抗體和包含hiv-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子，以及它們的用途。
背景技術(shù)：
：：高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)已經(jīng)有效地降低病毒負(fù)荷并減輕感染個(gè)體中hiv-1感染的影響。然而，盡管有這種療法，由于逃避這種治療的hiv感染的細(xì)胞的潛伏庫(kù)(latentreservoir)，病毒仍存留于個(gè)體中。因此，需要用于治療hiv-1感染的個(gè)體的治療劑以及靶向病毒感染的細(xì)胞并且具有減小hiv-1感染的細(xì)胞的潛伏庫(kù)的潛力的劑。發(fā)明概述本發(fā)明涉及雙特異性分子，例如形成抗體的共價(jià)連接的多肽鏈、共價(jià)雙抗體和/或共價(jià)雙抗體分子及其在治療hiv-1中的用途。在某些方面，本發(fā)明的雙特異性分子可以結(jié)合至兩個(gè)不同細(xì)胞上的兩個(gè)不同的靶標(biāo)或表位，其中第一表位相比第二表位在不同的細(xì)胞類(lèi)型上表達(dá)，以便所述雙特異性分子可以使兩個(gè)細(xì)胞聯(lián)合在一起。在某些方面，本發(fā)明的雙特異性分子可以結(jié)合至兩個(gè)不同的細(xì)胞，其中所述雙特異性分子包括具有a32、7b2、ch27、ch28或ch44的結(jié)合特異性的臂，該臂結(jié)合至在第一細(xì)胞(例如hiv感染的細(xì)胞)上表達(dá)的hiv-1包膜，以及包括第二臂，所述第二臂對(duì)在不同于第一細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型上表達(dá)的表位具有結(jié)合特異性，以便所述雙特異性分子可以使兩個(gè)細(xì)胞聯(lián)合在一起。在某些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞在表達(dá)cd3或cd16的效應(yīng)細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，即使在可能不知道特異性表位的情況下，抗體特異性結(jié)合至特定靶標(biāo)，肽或多糖(如存在于病原體表面上的抗原，例如gpl20、gp41或cd3)，并且不會(huì)大量結(jié)合至存在于樣品或者受試者中的其他蛋白質(zhì)或多糖?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法確定特異性結(jié)合。各種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于抗體抗原復(fù)合物，在某些實(shí)施方案中，抗原和抗體的特異性結(jié)合具有小于約106摩爾的kd，諸如小于約106摩爾、107摩爾、108摩爾、109摩爾或甚至小于約1010摩爾的kd。在某些方面，本發(fā)明提供了雙特異性分子，其包括彼此共價(jià)結(jié)合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：(i)所述第一多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)結(jié)構(gòu)域(a)，其包括具有a32、7b2、ch28或ch44hiv-1包膜抗體的結(jié)合特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl1)的結(jié)合區(qū)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(b)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh2)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(a)和(b)通過(guò)肽連接體1彼此分開(kāi)；和(iii)結(jié)構(gòu)域(c)，其包括包含k螺旋或e螺旋的異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；其中異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(c)和結(jié)構(gòu)域(b)被肽連接體2分開(kāi)；(ii)所述第二多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)結(jié)構(gòu)域(d)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl2)的結(jié)合區(qū)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(e)，其包括具有a32、7b2、ch28或ch44hiv-1抗體的結(jié)合特異性的第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh1)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(d)和(e)通過(guò)肽連接體1彼此分開(kāi)；和(iii)結(jié)構(gòu)域(f)，其包括包含k螺旋或e螺旋的異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；其中異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(f)和結(jié)構(gòu)域(e)被肽連接體2分開(kāi)；并且其中：所述結(jié)構(gòu)域(a)和(b)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(d)和(e)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；和所述結(jié)構(gòu)域(a)和(e)締合以形成結(jié)合位點(diǎn)，其像a32、7b2、ch28或ch44抗體一樣結(jié)合hiv-1包膜(1)；并且所述結(jié)構(gòu)域(b)和(d)締合以形成結(jié)合表位(2)的結(jié)合位點(diǎn)。在某些方面，本發(fā)明提供了雙特異性分子，其包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中一些多肽共價(jià)結(jié)合(見(jiàn)圖8)，并且其中：(i)所述第一多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)結(jié)構(gòu)域(a)，其包括具有a32、7b2、ch28或ch44hiv-1抗體的結(jié)合特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl1)的結(jié)合區(qū)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(b)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh2)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(a)和(b)通過(guò)肽連接體1彼此分開(kāi)；(iii)結(jié)構(gòu)域(c)，其包括包含k螺旋或e螺旋的異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；其中異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(c)和結(jié)構(gòu)域(b)被肽連接體2分開(kāi)；(iv)ch2-ch3結(jié)構(gòu)域，其中所述ch2-ch3結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域(c)被肽連接體3或間隔體-連接體3分開(kāi)；(ii)所述第二多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)結(jié)構(gòu)域(d)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl2)的結(jié)合區(qū)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(e)，其包括具有a32、7b2、ch28或ch44hiv-1抗體的結(jié)合特異性的第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh1)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(d)和(e)通過(guò)肽連接體1彼此分開(kāi)；(iii)結(jié)構(gòu)域(f)，其包括包含k螺旋或e螺旋的異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；其中異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(f)和結(jié)構(gòu)域(e)被肽連接體2分開(kāi)；(iii)所述第三多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)肽連接體3，(ii)ch2-ch3結(jié)構(gòu)域，并且其中：所述結(jié)構(gòu)域(a)和(b)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(d)和(e)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(a)和(e)締合以形成結(jié)合位點(diǎn)，其像a32、7b2、ch28或ch44抗體一樣結(jié)合hiv-1包膜(1)；所述結(jié)構(gòu)域(b)和(d)締合以形成結(jié)合表位(2)的結(jié)合位點(diǎn)；和第一和第三多肽的所述ch2-ch3結(jié)構(gòu)域形成fc鏈。一種雙特異性分子，其包括第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈，其中一些多肽共價(jià)結(jié)合(見(jiàn)圖8)，并且其中：(i)所述第一多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)肽連接體3，之后是ch2-ch3結(jié)構(gòu)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(a)，其包括具有a32、7b2、ch28或ch44hiv-1抗體的結(jié)合特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl1)的結(jié)合區(qū)域，其中所述ch2-ch3結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域(a)被肽連接體4分開(kāi)；(iii)結(jié)構(gòu)域(b)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh2)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(a)和(b)通過(guò)肽連接體1彼此分開(kāi)；(iv)結(jié)構(gòu)域(c)，其包括包含k螺旋或e螺旋的異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；其中異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(c)和結(jié)構(gòu)域(b)被肽連接體2分開(kāi)；(ii)所述第二多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)結(jié)構(gòu)域(d)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl2)的結(jié)合區(qū)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(e)，其包括具有a32、7b2、ch28或ch44hiv-1抗體的結(jié)合特異性的第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh1)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(d)和(e)通過(guò)肽連接體1彼此分開(kāi)；(iii)結(jié)構(gòu)域(f)，其包括包含k螺旋或e螺旋的異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；其中異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(f)和結(jié)構(gòu)域(e)被肽連接體2分開(kāi)；(iii)所述第三多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：(i)肽連接體3，(ii)ch2-ch3結(jié)構(gòu)域，并且其中：所述結(jié)構(gòu)域(a)和(b)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(d)和(e)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(a)和(e)締合以形成結(jié)合位點(diǎn)，其像a32、7b2、ch28或ch44抗體一樣結(jié)合hiv-1包膜(1)；所述結(jié)構(gòu)域(b)和(d)締合以形成結(jié)合表位(2)的結(jié)合位點(diǎn)；和第一和第三多肽的所述ch2-ch3結(jié)構(gòu)域形成fc鏈。在某些實(shí)施方案中，多肽鏈1的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域?yàn)椤拌?knob)”設(shè)計(jì)，以及第三多肽鏈的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域?yàn)椤熬?hole)”設(shè)計(jì)，或反之亦然。在某些實(shí)施方案中，表位(2)為cd3表位或cd16表位。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以a32抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd3。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以7b2抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd3。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以ch28抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd3。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以ch44抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd3。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以a32抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以7b2抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以ch28抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子以ch44抗體的特異性結(jié)合hiv包膜，并且也結(jié)合cd16。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域(a)和(e)締合以形成結(jié)合位點(diǎn)，其以a32、7b2、ch28或ch44抗體的結(jié)合特異性結(jié)合hiv-1包膜。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域(a)和(e)締合以形成結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體表位。在某些實(shí)施方案中，a32免疫球蛋白(vl1)的結(jié)構(gòu)域(a)結(jié)合區(qū)域包括vl-a32cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，其中a32免疫球蛋白(vh1)的結(jié)構(gòu)域(e)結(jié)合區(qū)域包括vh-a32cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，7b2免疫球蛋白(vl1)的結(jié)構(gòu)域(a)結(jié)合區(qū)域包括vl-7b2cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，7b2免疫球蛋白(vh1)的結(jié)構(gòu)域(e)結(jié)合區(qū)域包括vh-7b2cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，ch28免疫球蛋白(vl1)的結(jié)構(gòu)域(a)結(jié)合區(qū)域包括vl-ch28cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，ch28免疫球蛋白(vh1)的結(jié)構(gòu)域(e)結(jié)合區(qū)域包括vh-ch28cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，ch44免疫球蛋白(vl1)的結(jié)構(gòu)域(a)結(jié)合區(qū)域包括vl-ch44cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，ch44免疫球蛋白(vh1)的結(jié)構(gòu)域(e)結(jié)合區(qū)域包括vh-ch44cdr3、cdr2和cdr1。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域(a)包括vl-a32、vl-7b2、vl-ch28或vl-ch44。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域(e)包括vh-a32、vh-7b2、vh-ch28、vh-ch44。在某些實(shí)施方案中，第一多肽包括seqidno:9、seqidno:13、seqidno:17、seqidno:21、seqidno:25或seqidno:44。在某些實(shí)施方案中，第二多肽包括seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23、seqidno:27或seqidno:45。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括互補(bǔ)的第二多肽，并且其中所述第二多肽包括seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23、seqidno:27或seqidno:45。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:9、seqidno:13、seqidno:17、seqidno:21、seqidno:25或seqidno:44的第一多肽和seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23、seqidno:27或seqidno:45的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:9的第一多肽和seqidno:11的互補(bǔ)的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:13的第一多肽和seqidno:15的互補(bǔ)的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:17的第一多肽和seqidno:19的互補(bǔ)的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:21的第一多肽和seqidno:23的互補(bǔ)的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:25的第一多肽和seqidno:27的互補(bǔ)的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括(基本上由以下組成)seqidno:9、seqidno:13、seqidno:17、seqidno:21、seqidno:25或seqidno:44的第一多肽和seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23、seqidno:27或seqidno:45的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括(由以下組成)：seqidno:9、seqidno:13、seqidno:17、seqidno:21、seqidno:25或seqidno:44的第一多肽和seqidno:11、seqidno:15、seqidno:19、seqidno:23、seqidno:27或seqidno:45的第二多肽。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括seqidno:46、47和48。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子基本上由seqidno:46、47和48組成。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子由seqidno:46、47和48組成。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子的第一多肽包括seqidno:46，雙特異性分子的第二多肽包括seqidno:47，和雙特異性分子的第三多肽包括seqidno:48。在某些方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包括任何一種雙特異性分子或其任何組合。在某些實(shí)施方案中，組合物包括包含雙特異性分子的組合物，所述雙特異性分子包括具有hiv-1抗體a32、hiv-1抗體7b2、hiv-1抗體ch28、hiv-1抗體ch44的結(jié)合特異性的第一臂和靶向cd3或cd16的第二臂。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子包括fc部分或延長(zhǎng)其血清半衰期的任何其他修飾。在某些實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括第二雙特異性分子，所述第二雙特異性分子包括具有hiv-1抗體a32、hiv-1抗體7b2、hiv-1抗體ch28、hiv-1抗體ch44的結(jié)合特異性的第一臂和靶向cd3或cd16的第二臂，其中第一和第二雙特異性分子是不同的。在某些方面，本發(fā)明提供了一種在需要其的受試者中治療或預(yù)防hiv-1感染的方法，其包括以治療上有效的量向受試者施用組合物，所述組合物包括本發(fā)明的任何一種雙特異性分子或任何一種雙特異性分子的組合。在某些實(shí)施方案中，要求保護(hù)的方法進(jìn)一步包括施用潛伏期激活劑。在一些實(shí)施方案中，所述潛伏期激活劑為伏立諾他(vorinostat)、羅咪酯肽(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、戒酒硫(disulfiram)、jq1、苔蘚抑制素、pma、離子霉素(inonomycin)或其任何組合。在某些方面，本發(fā)明提供了核酸，其包括編碼本發(fā)明的雙特異性分子的核苷酸。在某些方面，本發(fā)明提供了一種載體，其包括核酸，所述核酸包括編碼本發(fā)明的雙特異性分子的核苷酸。也提供了組合物，其包括載體，所述載體包括編碼雙特異性分子的核酸。在某些方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞系，其包括編碼本發(fā)明的雙特異性分子的載體或核酸，其中所述載體編碼用于本發(fā)明的雙特異性分子的表達(dá)的多肽鏈，例如多肽鏈1和多肽鏈2或多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3。在某些實(shí)施方案中，載體適合于基因遞送和表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，載體為腺病毒載體、基于腺伴隨病毒的載體或其組合。在某些方面，本發(fā)明提供了一種雙特異性分子，其包括具有雙親和力重靶向試劑(dart)的多肽，其中所述dart包括雙抗體分子，所述雙抗體分子包括彼此共價(jià)結(jié)合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：(a)所述第一多肽鏈包括：(i)結(jié)構(gòu)域(a)，其包括對(duì)第一表位(1)特異性的第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl1)的結(jié)合區(qū)域；其中第一vl1包括來(lái)自a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體的vl或vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3、基本上由來(lái)自a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體的vl或vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3組成、由來(lái)自a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體的vl或vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3組成。(ii)結(jié)構(gòu)域(b)，其包括對(duì)第二靶標(biāo)例如表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh2)的結(jié)合區(qū)域，其中結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)通過(guò)肽連接體彼此分開(kāi)；和(iii)結(jié)構(gòu)域(c)，其包括異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域；(b)所述第二多肽鏈包括：(i)結(jié)構(gòu)域(d)，其包括對(duì)表位(2)特異性的第二免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl2)的結(jié)合區(qū)域；(ii)結(jié)構(gòu)域(e)，其包括對(duì)第一表位(1)特異性的第一免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh1)的結(jié)合區(qū)域；其中第一vh1包括來(lái)自a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體的vh或vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3、基本上由來(lái)自a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體的vh或vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3組成、由來(lái)自a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體的vh或vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3組成，其中結(jié)構(gòu)域(d)和(e)通過(guò)肽連接體彼此分開(kāi)，和(iii)結(jié)構(gòu)域(f)，其包括異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域，并且其中：所述結(jié)構(gòu)域(a)和(b)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(d)和(e)彼此不締合形成表位結(jié)合位點(diǎn)；所述結(jié)構(gòu)域(a)和(e)締合以形成結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合a32、7b2、ch27、ch28或ch44hiv-1抗體表位(1)；所述結(jié)構(gòu)域(b)和(d)締合以形成結(jié)合第二靶標(biāo)例如表位(2)的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性分子，其中hiv抗體vh和vl結(jié)構(gòu)域以及cd3和cd16vh和vl結(jié)構(gòu)域處于不同的取向。例如，在非限制性實(shí)施方案中，多肽鏈1中的vl1結(jié)構(gòu)域來(lái)自cd3，且vh2結(jié)構(gòu)域來(lái)自hiv包膜結(jié)合抗體。在該實(shí)施方案中，多肽2的vh1結(jié)構(gòu)域來(lái)自cd3，且vl2結(jié)構(gòu)域來(lái)自hiv包膜結(jié)合抗體。在某些方面，本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合至hiv-1包膜和結(jié)合至cd3的表位的雙特異性分子，其中所述雙特異性分子包括彼此共價(jià)結(jié)合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：a.所述第一多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：i.結(jié)構(gòu)域1，其包括：(1)亞結(jié)構(gòu)域(1a)，其包括能夠結(jié)合至cd3的單克隆抗體的vl結(jié)構(gòu)域(vlcd3)；和(2)亞結(jié)構(gòu)域(1b)，其包括能夠結(jié)合至hiv-1的單克隆抗體的vh結(jié)構(gòu)域(vhhiv-1)，其中所述亞結(jié)構(gòu)域1a和1b通過(guò)肽連接體(例如seqidno:1)彼此分開(kāi)；ii.結(jié)構(gòu)域2，其中所述結(jié)構(gòu)域2為e-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:7)或k-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:8)，其中所述結(jié)構(gòu)域2通過(guò)肽連接體(seqidno:2)與所述結(jié)構(gòu)域1分開(kāi)；和b.所述第二多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：i.結(jié)構(gòu)域1，其包括：(1)亞結(jié)構(gòu)域(1a)，其包括能夠結(jié)合至hiv-1的單克隆抗體的vl結(jié)構(gòu)域(vlhiv-1)；和(2)亞結(jié)構(gòu)域(1b)，其包括能夠結(jié)合至cd3的單克隆抗體的vh結(jié)構(gòu)域(vhcd3)，其中所述亞結(jié)構(gòu)域1a和1b通過(guò)肽連接體(例如seqidno:1)彼此分開(kāi)；和ii.結(jié)構(gòu)域2，其中所述結(jié)構(gòu)域2為k-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:8)或e-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:7)，其中所述結(jié)構(gòu)域2通過(guò)肽連接體(seqidno:2)與所述結(jié)構(gòu)域1分開(kāi)；并且其中所述第一和第二多肽鏈的所述結(jié)構(gòu)域2不都是e-螺旋結(jié)構(gòu)域或不都是k-螺旋結(jié)構(gòu)域，并且其中：(a)所述第一多肽鏈的vl結(jié)構(gòu)域和所述第二多肽鏈的vh結(jié)構(gòu)域形成能夠特異性地結(jié)合至cd3的表位的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)所述第二多肽鏈的vl結(jié)構(gòu)域和所述第一多肽鏈的vh結(jié)構(gòu)域形成能夠特異性地結(jié)合至hiv-1包膜的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一種雙特異性分子，其能夠特異性結(jié)合至hiv-1包膜和結(jié)合至cd16的表位，其中所述雙特異性分子包括彼此共價(jià)結(jié)合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：a.所述第一多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：i.結(jié)構(gòu)域1，其包括：(1)亞結(jié)構(gòu)域(1a)，其包括能夠結(jié)合至cd16的單克隆抗體的vl結(jié)構(gòu)域(vlcd16)；和(2)亞結(jié)構(gòu)域(1b)，其包括能夠結(jié)合至hiv-1的單克隆抗體的vh結(jié)構(gòu)域(vhhiv-1)，其中所述亞結(jié)構(gòu)域1a和1b通過(guò)肽連接體(例如seqidno:1)彼此分開(kāi)；ii.結(jié)構(gòu)域2，其中所述結(jié)構(gòu)域2為e-螺旋結(jié)構(gòu)域(seqidno:7)或k-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:8)，其中所述結(jié)構(gòu)域2通過(guò)肽連接體(seqidno:2)與所述結(jié)構(gòu)域1分開(kāi)；和b.所述第二多肽鏈在n-末端至c-末端方向包括：i.結(jié)構(gòu)域1，其包括：(1)亞結(jié)構(gòu)域(1a)，其包括能夠結(jié)合至hiv-1的單克隆抗體的vl結(jié)構(gòu)域(vlhiv-1)；和(2)亞結(jié)構(gòu)域(1b)，其包括能夠結(jié)合至cd16的單克隆抗體的vh結(jié)構(gòu)域(vhcd16)，其中所述亞結(jié)構(gòu)域1a和1b通過(guò)肽連接體(例如seqidno:1)彼此分開(kāi)；和ii.結(jié)構(gòu)域2，其中所述結(jié)構(gòu)域2為k-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:8)或e-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:7)，其中所述結(jié)構(gòu)域2通過(guò)肽連接體(seqidno:2)與所述結(jié)構(gòu)域1分開(kāi)；并且其中所述第一和第二多肽鏈的所述結(jié)構(gòu)域2不都是e-螺旋結(jié)構(gòu)域或不都是k-螺旋結(jié)構(gòu)域，并且其中：(a)所述第一多肽鏈的vl結(jié)構(gòu)域和所述第二多肽鏈的vh結(jié)構(gòu)域形成能夠特異性地結(jié)合至cd16的表位的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)所述第二多肽鏈的vl結(jié)構(gòu)域和所述第一多肽鏈的vh結(jié)構(gòu)域形成能夠特異性地結(jié)合至hiv-1包膜的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子結(jié)合至hiv-1包膜，像衍生其的hiv抗體一樣。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子結(jié)合至a32-hiv-1包膜表位(即雙特異性分子像a32抗體一樣結(jié)合至hiv-1包膜)和cd3或cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子結(jié)合至7b2-hiv1包膜表位和cd3或cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子結(jié)合至ch27-hiv-1包膜表位和cd3或cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子結(jié)合至ch28-hiv-1包膜表位和cd3或cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子結(jié)合至ch44-hiv-1包膜表位和cd3或cd16。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子具有a32hiv-1-包膜抗體的結(jié)合特異性。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子具有7b2hiv-1-包膜抗體的結(jié)合特異性。雙特異性分子具有ch27hiv-1-包膜抗體的結(jié)合特異性。雙特異性分子具有ch28hiv-1-包膜抗體的結(jié)合特異性。在某些實(shí)施方案中，雙特異性分子具有ch44hiv-1-包膜抗體的結(jié)合特異性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包括本文所述的序列、基本上由本文所述的序列組成、或由本文所述的序列組成(例如表2和表3)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包括下述序列、基本上由下述序列組成或由下述序列組成：seqidno:9和11；seqidno:13和15、seqidno:17和19；seqidno:21和23；seqidno:25和27；seqidno:44和45(見(jiàn)表2和表3)。在某些方面，本發(fā)明提供了組合物，其包括本文描述的任何雙特異性分子或其組合。在某些實(shí)施方案中，這些組合物被配制成用于治療用途的藥物組合物。在某些方面，本發(fā)明涉及核酸，所述核酸編碼本發(fā)明的雙特異性分子。在某些實(shí)施方案中，這些核酸被包括在載體中，并且與啟動(dòng)子可操作地連接。在某些方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞系或分離的細(xì)胞，其包括用于本發(fā)明的雙特異性分子的表達(dá)的核酸。在某些方面，本發(fā)明提供了組合物，其包括本發(fā)明的雙特異性分子或編碼該雙特異性分子的核酸，用于治療或預(yù)防hiv感染的方法。在一些實(shí)施方案中，這些方法進(jìn)一步包括施用潛伏期激活劑。這些潛伏期激活劑的非限制性實(shí)施例包括hdac抑制劑，例如伏立諾他、羅咪酯肽、帕比司他、戒酒硫、jq1、苔蘚抑制素、pma、離子霉素或其任何組合。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法靶向被潛伏感染的hiv細(xì)胞池。在某些方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者中的hiv感染的方法，所述方法包括以治療上有效的量向受試者施用組合物，所述組合物包括本發(fā)明的任何一種雙特異性分子或其組合。在某些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括施用潛伏期激活劑。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示介導(dǎo)adcc的mab的效力。5種chavimabs針對(duì)22種hiv-1imc的adcc活性被報(bào)告為特異性殺傷的最大百分比。每個(gè)點(diǎn)代表每組mab針對(duì)單獨(dú)的imcs的所有陽(yáng)性結(jié)果的平均活性。線(xiàn)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。黑線(xiàn)代表陽(yáng)性應(yīng)答的截止值(cutoff)。圖2顯示抗-hiv-1-dart-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性。來(lái)自hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的激活的cd4+t細(xì)胞被hiv-1亞型bbal、aecm235和c1086.cimc(從上至下)感染。在存在6種濃度的抗-hiv-1(a32xcd3◆和7b2xcd3■)和對(duì)照(4420xcd3·)dart的情況下，以效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比為33:1，將這些細(xì)胞與自體靜息cd8t細(xì)胞一起孵育6、24和48小時(shí)。結(jié)果被報(bào)告為在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察到的特異性殺傷的最大百分比。圖3顯示抗-hiv-1baldart-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性的劑量依賴(lài)。來(lái)自hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的激活的cd4+t細(xì)胞被hiv-1亞型bbal感染。在存在6種濃度的抗-hiv-1(a32xcd3◆和7b2xcd3■)和對(duì)照(4420xcd3·)dart的情況下，以效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比為33、11和3:1(從上至下)，將這些細(xì)胞與自體靜息cd8t細(xì)胞一起孵育48小時(shí)。結(jié)果被報(bào)告為特異性殺傷的百分比。圖4顯示達(dá)到50％特異性殺傷的dart濃度。來(lái)自hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的激活的cd4+t細(xì)胞被hiv-1亞型bbal、aecm235和c1086.cimc感染。在存在6種濃度的抗-hiv(a32xcd3，紅色；7b2xcd3，藍(lán)色)和對(duì)照(4420xcd3，黑色)dart的情況下，以效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比為33:1，將這些細(xì)胞與自體靜息cd8t細(xì)胞一起孵育48小時(shí)。每個(gè)柱代表針對(duì)每個(gè)被感染的靶標(biāo)群體檢測(cè)到50％特異性殺傷需要的濃度。圖5顯示ch27、ch28和ch44hiv-1抗體的序列。cdr在序列(seqidnos:57-74)中指示。圖6顯示編碼a32抗體的vh和vl鏈的核苷酸序列和a32的vh和vl鏈的氨基酸序列(按出現(xiàn)順序?yàn)閟eqidnos:75-78)。圖7顯示編碼7b2抗體的vh和vk鏈的核苷酸序列和7b2的vh和vk鏈的氨基酸序列(按出現(xiàn)順序?yàn)閟eqidno:79-82)。圖8a-c顯示本發(fā)明的雙特異性分子的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。圖8a示出了由兩條多肽鏈組成的雙特異性分子的結(jié)構(gòu)。圖8b和8c示出了具有fc結(jié)構(gòu)域的三鏈雙特異性分子的第一、第二和第三多肽鏈的兩種形式的結(jié)構(gòu)(形式1，圖8b；形式2，圖8c)。圖9顯示各種序列：連接體1(seqidno:1)；連接體2(seqidno:2)；異源二聚體促進(jìn)結(jié)構(gòu)域和k-螺旋和e-螺旋序列(seqidnos:3-6、7和8)；連接體3(dkthtcppcp(seqidno:49)；連接體4--seqidnos:39、40；ch2-ch3片段--seqidnos:41-43；ch3vh鏈—seqidno:51；cd3vl鏈--seqidno:52；cd16vh鏈—seqidno:53；ch16vl鏈—seqidno:54；7b2vl—seqidno:55；7b2vh-seqidno:56。seqidnos:9-38、44-48顯示各種雙特異性抗體(見(jiàn)表2)。圖10a-10c顯示hivxcd3dart結(jié)構(gòu)。(圖10a-10b)這些dart分子包含與抗-cd3結(jié)合臂(hxr32)組合的抗-hiv-1結(jié)合臂(a32或7b2)。它們由兩條多肽鏈組成：一條具有與抗-hiv的vh連接的抗-cd3的vl；第二條具有與抗-cd3的vh連接的抗-hiv的vl。鏈的羧基末端具有鏈間二硫鍵和配對(duì)的、帶相反電荷的e-螺旋/k-螺旋二聚化結(jié)構(gòu)域。對(duì)照dart的一條臂被來(lái)源于抗-fitc抗體(4420)或來(lái)源于抗-rsv抗體、帕利珠單抗(palivizumab)(rsv)序列的不相關(guān)的臂取代。(圖10c)圖示了hivxcd3dart同時(shí)結(jié)合至兩個(gè)不同的抗原并重定向細(xì)胞毒性t細(xì)胞(效應(yīng)子)，以裂解表達(dá)env的hiv-1感染的細(xì)胞(靶標(biāo))。圖11a-11f顯示hivxcd3dart的結(jié)合性質(zhì)。圖11a-11c顯示通過(guò)elisa的抗原結(jié)合。dart結(jié)合人cd3蛋白(圖11a)、結(jié)合jr-flgp140蛋白(圖11b)或同時(shí)結(jié)合jr-flgp140和人cd3蛋白兩者(圖11c)。圖11d-11f顯示通過(guò)facs的細(xì)胞表面結(jié)合。dart結(jié)合表達(dá)cd3的原代人t細(xì)胞(圖11d)、結(jié)合表達(dá)hiv-1env、cm244、亞型ae的hek293-d371細(xì)胞(圖11e)或結(jié)合表達(dá)cd3和hiv-1env、hxbc2、亞型b的jurkat522-f/y細(xì)胞(圖11f)。數(shù)據(jù)被報(bào)告為平均熒光強(qiáng)度(mfi)。細(xì)胞的cd3和env表達(dá)特征被報(bào)告在括號(hào)內(nèi)。a32和7b2為分別識(shí)別hiv-1gp120和gp41的靶向臂；cd3為識(shí)別cd3ε的效應(yīng)臂；4420為不相關(guān)的、陰性對(duì)照臂。圖12a-12h顯示hivxcd3dart對(duì)env+靶細(xì)胞的重定向t-細(xì)胞殺傷。圖12a顯示，在存在人t-細(xì)胞的情況下，以e:t比為10:1達(dá)48小時(shí)，dart對(duì)env+jurkat522-f/y細(xì)胞的濃度依賴(lài)性殺傷，其中細(xì)胞裂解通過(guò)ldh釋放試驗(yàn)測(cè)量；a32xcd3和7b2xcd3的ec50分別為230和160pg/ml。對(duì)照dart(a32x4420、7b2x4420、4420xcd3)是無(wú)活性的。圖12b顯示，在不存在效應(yīng)t-細(xì)胞的情況下，缺乏dart介導(dǎo)的對(duì)env+jurkat522-f/y細(xì)胞的殺傷，其中細(xì)胞裂解通過(guò)ldh釋放試驗(yàn)測(cè)量。圖12c顯示，以e:t比為10:1，48小時(shí)，缺乏dart對(duì)env-jurkatδks細(xì)胞的重定向t-細(xì)胞殺傷，其中通過(guò)ldh釋放試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞裂解。圖12d顯示，在人t-細(xì)胞存在時(shí)，以e:t比為10:1達(dá)48小時(shí)，dart對(duì)env+jurkat522-f/ygf細(xì)胞的濃度依賴(lài)性殺傷，其中通過(guò)lum試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞裂解；a32xcd3和7b2xcd3的ec50值分別為172和147pg/ml。圖12e-12g顯示，在不同的e:t比(10:1、5:1、1:1)和孵育時(shí)間(24、48、72小時(shí))，7b2xcd3dart對(duì)env+jurkat522-f/ygf細(xì)胞的濃度依賴(lài)性重定向t細(xì)胞殺傷，其中通過(guò)lum試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞裂解。圖12h顯示，7b2xcd3在不同的e:t比的最大細(xì)胞溶解活性的時(shí)間過(guò)程(數(shù)據(jù)來(lái)自圖12e-12g)。圖13a-13f顯示hivxcd3dart針對(duì)被不同亞型的hiv-1imc感染的cd4+細(xì)胞的重定向t-細(xì)胞細(xì)胞毒性。圖13a-13c顯示dart濃度依賴(lài)。來(lái)自hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的激活的cd4+t細(xì)胞被hiv-1亞型bbal(圖13a)、亞型aecm235(圖13b)或亞型c1086.c(圖13c)imc感染，并且，在自體靜息cd8+t細(xì)胞存在的情況下以e:t比為33:1(實(shí)心符號(hào))或在不存在效應(yīng)細(xì)胞(e:t比為0:1)的情況下(空心符號(hào))，與a32xcd3(紅色圓)、7b2xcd3(藍(lán)色方形)或4420xcd3(黑色菱形)一起孵育48小時(shí)。數(shù)據(jù)被報(bào)告為特異性裂解的百分比(％sl)。dart濃度范圍從0.001ng/ml至1000ng/ml。圖13d-13f顯示時(shí)間過(guò)程。數(shù)據(jù)代表在6、24和48小時(shí)觀(guān)察到的每種dart針對(duì)被hiv-1亞型bbal(圖13d)、亞型aecm235(圖13e)或亞型c1086.c(圖13f)imc感染并與自體靜息cd8+t細(xì)胞以e:t比為33:1一起孵育的cd4+t細(xì)胞的最大％sl。圖14a-14h顯示hivxcd3dart誘導(dǎo)對(duì)cd8+t-細(xì)胞的特異性脫粒。圖14a-14d顯示在dart存在的情況下與hiv-1bal感染的靶細(xì)胞一起孵育6小時(shí)后鑒定活的/cd3+cd8+cd107+t細(xì)胞的設(shè)門(mén)策略的示意圖。(圖14e-14g)點(diǎn)狀圖代表在1ng/ml的4420xcd3(圖14e)、7b2xcd3(圖14f)或a32xcd3(圖14g)存在的情況下觀(guān)察到的活的/cd3+cd8+cd107+細(xì)胞的百分比。圖14h顯示，與自體感染的cd4+t細(xì)胞以e:t比為33:1一起孵育6小時(shí)后，在5個(gè)hiv-1血清反應(yīng)陰性健康供體的每一個(gè)中觀(guān)察到的cd3+cd4-cd8+cd107+t細(xì)胞的頻率。每個(gè)符號(hào)代表對(duì)每一個(gè)供體進(jìn)行的重復(fù)刺激的平均值。線(xiàn)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示多重比較的dunnett’s檢驗(yàn)后p<0.05。圖15a-15c顯示用來(lái)評(píng)價(jià)hivxcd3dart對(duì)來(lái)自健康的hiv血清反應(yīng)陰性供體的自體jr-csf-感染的cd4+t細(xì)胞的重定向cd8+t細(xì)胞殺傷的病毒清除試驗(yàn)。來(lái)自hiv血清反應(yīng)陰性供體的激活的cd4+t細(xì)胞被hiv-1克隆jr-csf感染，然后在不存在(無(wú)dart)或存在濃度為100ng/ml的hivxcd3或?qū)φ誨art的情況下與自體靜息cd8+t效應(yīng)細(xì)胞以e:t比為1:1一起孵育7天。顯示了兩個(gè)健康供體(圖15a-15b)，以及對(duì)于健康供體2在共培養(yǎng)期間存在整合酶和非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑以抑制病毒復(fù)制(圖15c)的結(jié)果。每個(gè)柱代表在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)的絕對(duì)p24濃度。誤差線(xiàn)代表n＝3的標(biāo)準(zhǔn)誤差均值(sem)。*表示通過(guò)多重比較的dunnett’s檢驗(yàn)，p<0.05。圖16a-16h顯示病毒清除試驗(yàn)利用來(lái)自hiv-感染的art抑制的患者的淋巴細(xì)胞檢測(cè)hivxcd3dart對(duì)jr-csf或自體儲(chǔ)庫(kù)(ar)病毒-感染的cd4+細(xì)胞的重定向cd8+t細(xì)胞清除。來(lái)自hiv-感染的art抑制的患者的cd4+消耗的t細(xì)胞的被pha激活，并且被hiv-1亞型b克隆jr-csf(圖16a-16c)自體儲(chǔ)庫(kù)(ar)病毒分離株(isolates)(圖16d-16f)感染，然后在不存在(無(wú)dart)或存在濃度為100ng/ml的hivxcd3(a32xcd3、7b2xcd3)或?qū)φ?7b2x4420、4420xcd3)dart的情況下不與cd8+t效應(yīng)細(xì)胞(圖16a、16d)或與自體cd8+t效應(yīng)細(xì)胞以e:t比為1:10(圖16b、16e)或1:1(圖16c、16f)一起孵育7天?！甤ombo’表示總濃度為100ng/ml的7b2xcd3和a32xcd3的1:1混合物。每個(gè)柱代表在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到的p24的對(duì)數(shù)倍降低(logfoldreduction)，計(jì)算為對(duì)數(shù)(感染的靶細(xì)胞的p24只有對(duì)照除以測(cè)試條件的p24)。圖16g顯示在dart存在的情況下與hiv-1jr-csf感染的靶細(xì)胞一起孵育6小時(shí)后鑒定活的/cd3+cd4+cd107+效應(yīng)子(tfl4-)t細(xì)胞的設(shè)門(mén)策略的示意圖。圖16h顯示，在n＝4的患者中，與指示的dart和jr-csf感染的靶標(biāo)一起孵育6小時(shí)后，活的/效應(yīng)細(xì)胞(tfl4陰性的)/cd3+/cd4+/107a+細(xì)胞的％。誤差線(xiàn)代表n＝8(圖16a-16c，除了combon＝5和7b2x4420n＝6)、n＝5(圖16d-16f)和n＝4(圖16g-16h)的sem。*表示通過(guò)多重比較的dunnett’s檢驗(yàn)，p<0.05。圖17a-17b顯示用來(lái)評(píng)價(jià)hivxcd3dart重定向的cd8+t-細(xì)胞活性的潛伏清除試驗(yàn)。將來(lái)自hiv-感染的、art抑制的患者的靜息cd4+t細(xì)胞與pha(圖17a)或伏立諾他(圖17b)一起孵育，根據(jù)患者潛伏庫(kù)的大小將其涂覆在12-36個(gè)重復(fù)的孔內(nèi)，并在不存在或存在100ng/ml的hivxcd3或?qū)φ誨art的情況下與自體cd8+t細(xì)胞以e:t比為1:10共培養(yǎng)24小時(shí)(或在指示的情況下長(zhǎng)達(dá)96小時(shí))，隨后將dart洗掉，并添加來(lái)自血清反應(yīng)陰性供體的cd8-消耗的pbmc以擴(kuò)增殘留的病毒。在第15天，通過(guò)elisa對(duì)孔中p24存在與否進(jìn)行評(píng)價(jià)?！甤ombo’表示總濃度為100ng/ml的7b2xcd3和a32xcd3的1:1混合物。結(jié)果顯示為病毒恢復(fù)％(陽(yáng)性孔的數(shù)目/涂覆的總數(shù))，歸一化至沒(méi)有添加cd8+t細(xì)胞的對(duì)照。虛線(xiàn)表示檢測(cè)不到的病毒恢復(fù)。nt表示由于(根據(jù)圖21中顯示的表)低的細(xì)胞可用性而沒(méi)有被測(cè)試的條件。圖18通過(guò)hiv-1亞型和中和層(neutralizationtier)顯示imc的列表。圖19顯示a32xcd3和7b2xcd3結(jié)合至重組env和cd3蛋白質(zhì)的平衡解離常數(shù)(kd)。圖20顯示臨床特征。圖21顯示dart針對(duì)jr-csf感染的自體靶細(xì)胞重定向患者t細(xì)胞和絕對(duì)p24濃度。圖22顯示通過(guò)dart的潛伏清除試驗(yàn)中陽(yáng)性孔的絕對(duì)#。圖23顯示介導(dǎo)adcc的mab的效力和幅度。a32(抗-gp120c1/c2)mab(◆)和7b2(抗-gp41簇i)mab(■)的adcc活性被報(bào)告為針對(duì)22種hiv-1imc的每一種的最大特異性裂解百分比(％sl)。每個(gè)點(diǎn)代表一種hiv-1imc。也報(bào)告了從一個(gè)hiv-1血清反應(yīng)陽(yáng)性(陽(yáng)性對(duì)照；posctrl)和一個(gè)血清反應(yīng)陰性(陰性對(duì)照；negctrl)供體的血漿獲得的結(jié)果。線(xiàn)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。黑線(xiàn)代表陽(yáng)性應(yīng)答的截止值。圖24顯示已知影響7b2和a32mab的結(jié)合的hiv-1env殘基的保守性。在gp41中的線(xiàn)性7-殘基序列(gp160位置598-604；免疫顯性簇i)被報(bào)告含有7b2mab的結(jié)合位點(diǎn)(28,29)。在gp120c1-c4中已知影響a32mab結(jié)合的不連續(xù)的殘基(基于點(diǎn)誘變研究)發(fā)生在位置52、53、66、69、83、86、96、100、103、107、112、215、217、252、256、262、427和479處(37,39,68)。在洛斯阿拉莫斯國(guó)家實(shí)驗(yàn)室[losalamosnationallaboratory(lanl)]hiv1env氨基酸過(guò)濾網(wǎng)絡(luò)比對(duì)，由代表所有亞型的4556條hiv-1env序列組成的數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)quickalign分析(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/quick_alignv2/quickalign.html)評(píng)價(jià)這些殘基的保守性。在env每個(gè)位置處的殘基的高度與其在hiv-1分離株間分布的頻率成正比。根據(jù)疏水性，殘基被著色為：黑色，親水性；綠色，中性；藍(lán)色，疏水性。根據(jù)與n5-i5(一種a32-樣mab)的fab片段復(fù)合的cd4-穩(wěn)定化的gp120核心的晶體結(jié)構(gòu)，52、53、69、103、107和217處(位于c1-c2)的殘基可能是直接的表位觸者(27)。圖25顯示a32x4420和7b2x4420對(duì)照dart的細(xì)胞表面env結(jié)合。結(jié)合表達(dá)hiv-1env、cm244、亞型ae的hek293-d371細(xì)胞的dart被測(cè)量，并且數(shù)據(jù)被報(bào)告為平均熒光強(qiáng)度(mfi)。a32和7b2為分別識(shí)別hiv-1gp120和gp41的靶向臂；4420為不相關(guān)的、陰性對(duì)照臂。圖26a-26d顯示hivxcd3dart-介導(dǎo)的t-細(xì)胞活化取決于與靶細(xì)胞的共-接合(co-engagement)。來(lái)自健康的血清反應(yīng)陰性供體的未刺激的cd4+或cd8+t-細(xì)胞在不存在或存在40、0.32和0ng/ml的對(duì)照(rsvxcd3)或hivxcd3(a32xcd3、7b2xcd3)dart的情況下與表達(dá)env的jurkat-522f/y細(xì)胞系(圖26a、26c)和不與(26b、26d)表達(dá)env的jurkat-522f/y細(xì)胞系一起孵育48小時(shí)。cd8+(圖26a-26b)和cd4+(圖26c-26d)t細(xì)胞活化通過(guò)用cd25ab細(xì)胞染色進(jìn)行評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)被報(bào)告為激活的(cd25+)t細(xì)胞的頻率(％)。每個(gè)柱代表從2個(gè)不同的供體獲得的結(jié)果的平均值。圖27顯示hivdart特異性地結(jié)合hiv-1imc感染的cd4+t細(xì)胞。如在方法部分報(bào)告的，從健康的hiv-1血清反應(yīng)陰性供體獲得的激活的cd4+t細(xì)胞用代表hiv-1亞型bbal、aecm235和c1086.c的hiv-1imc感染48小時(shí)。非感染的cd4+t細(xì)胞(模擬的)被用作陰性對(duì)照。利用7b2x4420和a32x4420dart對(duì)這些細(xì)胞染色，其中cd3臂被不相關(guān)的4420蛋白取代以避免結(jié)合至cd3受體。與dart一起孵育后，細(xì)胞被二級(jí)抗-ek-igg2a-生物素化的復(fù)合體染色，以揭示dart的結(jié)合。通過(guò)二級(jí)鼠抗-人-iggmab，利用間接染色技術(shù)，進(jìn)行用7b2和a32mab的染色，作為對(duì)照。二級(jí)熒光素化抗-人iggab和帕利珠單抗mab被用作為陰性對(duì)照。如方法部分報(bào)告的，利用抗-p24mab，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色測(cè)定被感染細(xì)胞的頻率。如圖上方所指示的，每個(gè)柱代表被imc和對(duì)照感染的cd4+t細(xì)胞。結(jié)果被報(bào)告為存活的被感染的(p24+)cd4+t細(xì)胞的頻率(％)，這些細(xì)胞被如x-軸上所列出的dart、mab和對(duì)照的每一種染色。圖28a-28d顯示在不存在添加的靶細(xì)胞時(shí)，利用來(lái)自hiv-1感染的供體的pbmc，hivxcd3dart對(duì)t細(xì)胞生存力或活化狀態(tài)的影響的缺乏。來(lái)自hiv-感染的、art抑制的未刺激的cd4+或cd8+t-細(xì)胞在不存在或存在100ng/ml的對(duì)照(4420xcd3、7b2x4420、a32x4420)或活性的(a32xcd3、7b2xcd3)dart的情況下被孵育7天。(圖28a-28b)通過(guò)針對(duì)膜聯(lián)蛋白v/7-aad對(duì)細(xì)胞染色來(lái)評(píng)價(jià)t細(xì)胞生存力。存活的細(xì)胞被鑒定為膜聯(lián)蛋白v和7-aad陰性的那些細(xì)胞。(圖28c-28d)通過(guò)針對(duì)hla-dr和cd25表達(dá)對(duì)細(xì)胞染色來(lái)評(píng)價(jià)t細(xì)胞活化。2個(gè)分析的數(shù)據(jù)點(diǎn)均來(lái)自n＝3患者，其在3個(gè)獨(dú)立場(chǎng)合進(jìn)行。誤差線(xiàn)代表標(biāo)準(zhǔn)誤差均值。發(fā)明詳述高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)(單獨(dú)或聯(lián)合潛伏期逆轉(zhuǎn)劑)不能減少潛伏性感染的細(xì)胞池。這是因?yàn)閏d8+t細(xì)胞消除hiv-1潛伏性感染的細(xì)胞的有限能力。雙親和力重靶向蛋白質(zhì)(darts)是雙特異性的，基于抗體的分子，其能夠同時(shí)結(jié)合兩種不同的抗原。hiv-1darts包含與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合臂組合的hiv-1結(jié)合臂，并且被設(shè)計(jì)成重定向細(xì)胞毒性cd3+t細(xì)胞，以接合并殺傷hiv-感染的細(xì)胞。研究了一組單克隆抗體(mabs)，以確定它們針對(duì)22種不同的分離株介導(dǎo)adcc的量級(jí)和幅度。目標(biāo)是：1)鑒定可被用作darts的hiv-1結(jié)合臂的mabs；2)測(cè)試所產(chǎn)生的darts介導(dǎo)hiv-1感染的細(xì)胞殺傷的能力。本文提供了與不同組的介導(dǎo)adcc的mabs的效力相關(guān)的數(shù)據(jù)以及針對(duì)hiv-1傳染性分子克隆(imc)-感染的靶細(xì)胞所產(chǎn)生的darts。抗體和其他結(jié)合分子抗體本發(fā)明提供了多克隆或單克隆抗體、變體、包括具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體和嵌合抗體、以及包括具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的構(gòu)型。遍及本申請(qǐng)，抗體的輕鏈和重鏈的氨基酸殘基的編號(hào)是根據(jù)kabat等人的eu索引(kabat等(1992)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstitutesofhealthpublicationno.91-3242)。在一些實(shí)施方案中，抗體的抗原-結(jié)合片段是具有至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體的一部分。片段包含例如但不限于fab、fab'、f(ab')2fv)和單鏈(scfv)。單克隆抗體在本領(lǐng)域是已知的。在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體不僅包含完整的單克隆抗體和全長(zhǎng)的單克隆抗體，還包含其片段(如fab、fab'、f(ab')2fv)、單鏈(scfv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有所需特異性和結(jié)合至抗原的能力的抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的構(gòu)型。關(guān)于抗體的來(lái)源或其制造方式(例如通過(guò)雜種瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)，單克隆抗體并不受限制。制造單克隆抗體的方法在本領(lǐng)是已知的。在某些實(shí)施方案中，抗體通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法重組產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的抗體被測(cè)序，然后，多核苷酸序列被克隆到載體中用于表達(dá)和增殖。編碼目的抗體的序列可在宿主細(xì)胞中保持在載體中，然后宿主細(xì)胞可以被擴(kuò)增和冷凍以備將來(lái)使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用于基因操作，以產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子以及嵌合抗體、人源化抗體或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其他特征。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的抗原-結(jié)合部分的基本序列，同時(shí)用人抗體序列交換抗體的非-人剩余部分。人源化單克隆抗體有4個(gè)一般步驟。它們是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列，(2)設(shè)計(jì)人源化抗體或犬源化抗體，即決定在人源化或犬源化過(guò)程中使用哪種抗體框架區(qū)域，(3)實(shí)際的人源化或犬源化方法/技術(shù)和(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415。雙特異性抗體、多特異性雙抗體和darttm雙抗體非單特異性“雙抗體”的供應(yīng)提供相比抗體的明顯優(yōu)勢(shì)：共連接和共定位表達(dá)不同表位的細(xì)胞的能力。因此，二價(jià)雙抗體具有廣泛的應(yīng)用，包括治療和免疫診斷。在各種應(yīng)用中，二價(jià)在雙抗體的設(shè)計(jì)和工程化中允許極大的靈活性，提供對(duì)多聚抗原的增強(qiáng)的親合力、不同抗原的交聯(lián)和對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型的導(dǎo)向靶向，這取決于兩個(gè)靶抗原的存在。由于它們?cè)黾拥膬r(jià)、低解離速率和從循環(huán)中快速清除(對(duì)于小尺寸的雙抗體，為～50kda或以下)，本領(lǐng)域已知的雙抗體分子在腫瘤成像領(lǐng)域中也顯示出特定的用途(fitzgerald等(1997)“improvedtumourtargetingbydisulphidestabilizeddiabodiesexpressedinpichiapastoris,”proteineng.10:1221)。尤其重要的是不同細(xì)胞的共連接，例如細(xì)胞毒性t細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的交聯(lián)(staerz等(1985)“hybridantibodiescantargetsitesforattackbytcells,”nature314:628-631；和holliger等(1996)“specifickillingoflymphomacellsbycytotoxict-cellsmediatedbyabispecificdiabody,”proteineng.9:299-305)。雙抗體表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以被引導(dǎo)至b細(xì)胞的表面決定簇，如cd19、cd20、cd22、cd30、cd37、cd40和cd74(moore,p.a.等(2011)“applicationofdualaffinityretargetingmoleculestoachieveoptimalredirectedt-cellkillingofb-celllymphoma,”blood117(17):4542-4551；cheson,b.d.等(2008)“monoclonalantibodytherapyforb-cellnon-hodgkin’slymphoma,”n.engl.j.med.359(6):613-626；castillo,j.等(2008)“newermonoclonalantibodiesforhematologicalmalignancies,”exp.hematol.36(7):755-768)。在許多研究中，還發(fā)現(xiàn)結(jié)合至效應(yīng)細(xì)胞決定簇，例如fcγ受體(fcγr)，的雙抗體，激活效應(yīng)細(xì)胞(holliger等(1996)“specifickillingoflymphomacellsbycytotoxict-cellsmediatedbyabispecificdiabody,”proteineng.9:299-305；holliger等(1999)“carcinoembryonicantigen(cea)-specifict-cellactivationincoloncarcinomainducedbyanti-cd3xanti-ceabispecificdiabodiesandb7xanti-ceabispecificfusionproteins,”cancerres.59:2909-2916；wo2006/113665；wo2008/157379；wo2010/080538；wo2012/018687；wo2012/162068)。通常，效應(yīng)細(xì)胞活化由結(jié)合抗原的抗體通過(guò)fc-fcγr相互作用結(jié)合至效應(yīng)細(xì)胞而觸發(fā)；因此，就這一點(diǎn)而言，雙抗體分子可展示出ig-樣功能性，而不依賴(lài)于它們是否包括fc結(jié)構(gòu)域(如在本領(lǐng)域已知的任何效應(yīng)子功能試驗(yàn)或本文所示例的效應(yīng)子功能試驗(yàn)(例如adcc試驗(yàn))中所測(cè)定的)。通過(guò)交聯(lián)腫瘤和效應(yīng)細(xì)胞，雙抗體不僅使效應(yīng)細(xì)胞接近腫瘤細(xì)胞，而且還導(dǎo)致有效的腫瘤殺傷(見(jiàn)如cao等(2003)“bispecificantibodyconjugatesintherapeutics,”adv.drug.deliv.rev.55:171-197)。這類(lèi)非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩種或更多種獨(dú)特和不同的多肽(即，這樣的形成需要通過(guò)不同多肽鏈種類(lèi)的異源二聚化而形成雙抗體)。該事實(shí)與單特異性雙抗體不同，單特異性雙抗體通過(guò)一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由于至少兩個(gè)不同的多肽(即，兩個(gè)多肽種類(lèi))必須被提供以形成非單特異性雙抗體并且由于這樣的多肽的同源二聚化導(dǎo)致失活分子(takemura,s.等(2000)“constructionofadiabody(smallrecombinantbispecificantibody)usingarefoldingsystem,”proteineng.13(8):583-588)，這類(lèi)多肽的產(chǎn)生必須以這樣的方式完成，以防止相同種類(lèi)的多肽之間的共價(jià)結(jié)合(即，以便防止同源二聚化)(takemura,s.等(2000)“constructionofadiabody(smallrecombinantbispecificantibody)usingarefoldingsystem,”proteineng.13(8):583-588)。因此，本領(lǐng)域教導(dǎo)了這類(lèi)多肽的非共價(jià)締合(見(jiàn)例如olafsen等(2004)“covalentdisulfide-linkedanti-ceadiabodyallowssite-specificconjugationandradiolabelingfortumortargetingapplications,”prot.engr.des.sel.17:21-27；asano等(2004)“adiabodyforcancerimmunotherapyanditsfunctionalenhancementbyfusionofhumanfcdomain,”abstract3p-683,j.biochem.76(8):992；takemura,s.等(2000)“constructionofadiabody(smallrecombinantbispecificantibody)usingarefoldingsystem,”proteineng.13(8):583-588；lu,d.等(2005)“afullyhumanrecombinantigg-likebispecificantibodytoboththeepidermalgrowthfactorreceptorandtheinsulin-likegrowthfactorreceptorforenhancedantitumoractivity,”j.biol.chem.280(20):19665-19672)。本領(lǐng)域已經(jīng)認(rèn)識(shí)到由非共價(jià)締合的多肽構(gòu)成的雙特異性雙抗體是不穩(wěn)定的并且容易解離成非功能性的單體(見(jiàn)例如lu,d.等(2005)“afullyhumanrecombinantigg-likebispecificantibodytoboththeepidermalgrowthfactorreceptorandtheinsulin-likegrowthfactorreceptorforenhancedantitumoractivity,”j.biol.chem.280(20):19665-19672)。面對(duì)這一挑戰(zhàn)，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的、共價(jià)結(jié)合的異源二聚非單特異性雙抗體，稱(chēng)為dartstm(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2014-0099318；2013-0295121；2010-0174053和2009-0060910；歐洲專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)ep2714079；ep2601216；ep2376109；ep2158221；和pct公開(kāi)號(hào)wo2015/026894；wo2015/026892；wo2015/021089；wo2014/159940；wo2012/162068；wo2012/018687；wo2010/080538；moore,p.a.等(2011)“applicationofdualaffinityretargetingmoleculestoachieveoptimalredirectedt-cellkillingofb-celllymphoma,”blood117(17):4542-4551；veri,m.c.等(2010)“therapeuticcontrolofbcellactivationviarecruitmentoffcgammareceptoriib(cd32b)inhibitoryfunctionwithanovelbispecificantibodyscaffold,”arthritisrheum.62(7):1933-1943；johnson,s.等(2010)“effectorcellrecruitmentwithnovelfv-baseddual-affinityre-targetingproteinleadstopotenttumorcytolysisandinvivob-celldepletion,”j.mol.biol.399(3):436-449)，這些出版物的內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入本文。這樣的雙抗體包括兩條或多條共價(jià)復(fù)合的多肽并涉及將一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基工程化到每個(gè)應(yīng)用的多肽種類(lèi)中。例如，已經(jīng)顯示向這類(lèi)構(gòu)建體的c-末端添加半胱氨酸殘基允許多肽鏈之間的二硫鍵結(jié)合，穩(wěn)定化所得的異源二聚體而不干擾二價(jià)分子的結(jié)合特征。在一些實(shí)施方案中，darttm的兩條多肽中的每一條包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖8a)。第一多肽包括：(i)包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl1)的結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)域，(ii)包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh2)的結(jié)合區(qū)域的第二結(jié)構(gòu)域，和(iii)用于促進(jìn)與第二多肽的異源二聚化和促進(jìn)雙抗體的第一多肽和第二多肽共價(jià)結(jié)合的第三結(jié)構(gòu)域。第二多肽包含互補(bǔ)的第一結(jié)構(gòu)域(vl2結(jié)構(gòu)域)，互補(bǔ)的第二結(jié)構(gòu)域(vh1結(jié)構(gòu)域)和第三結(jié)構(gòu)域，所述第三結(jié)構(gòu)域與第一多肽鏈的第三結(jié)構(gòu)域復(fù)合，以促進(jìn)異源二聚化以及與第一多肽鏈的共價(jià)結(jié)合。這樣的分子是穩(wěn)定的、有效的，并且具有同時(shí)結(jié)合兩個(gè)或更多抗原的能力。它們能夠促進(jìn)重定向t細(xì)胞(cd3)或nk(cd16)細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)表達(dá)靶抗原的細(xì)胞的殺傷。在某些方面，本發(fā)明涉及能夠同時(shí)結(jié)合至hiv-1和cd3或hiv-1和cd16的hiv-1xcd3和hiv-1xcd16雙特異性單價(jià)雙抗體，以及涉及這類(lèi)分子在治療hiv-1感染中的用途。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的hiv-1xcd3和hiv-1xcd16雙特異性單價(jià)雙抗體由兩條多肽鏈構(gòu)成，所述兩條多肽鏈彼此締合以形成對(duì)hiv-1的表位特異性的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)cd3或cd16的表位特異性的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖8)，以便能夠同時(shí)結(jié)合至hiv-1和結(jié)合至cd3或cd16。因此，這類(lèi)雙抗體結(jié)合至“第一抗原”(其可能是cd3或hiv-1)和“第二抗原”(當(dāng)?shù)谝槐砦粸閏d3時(shí)，其為hiv-1，當(dāng)?shù)谝槐砦粸閔iv-1時(shí)，其為cd3)?？蛇x地，這類(lèi)雙抗體結(jié)合至“第一抗原”(其可能為cd16或hiv-1)和“第二抗原”(當(dāng)?shù)谝槐砦粸閏d16時(shí)，其為hiv-1，當(dāng)?shù)谝槐砦粸閔iv-1時(shí)，其為cd16)。在圖8顯示的某些實(shí)施方案中，這樣的兩條多肽鏈中的第一條在n-末端至c-末端方向包含n-末端、“第一”抗原(cd3或hiv-1包膜)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第二抗原(若第一抗原為cd3，其為hiv-1；若第一抗原為hiv-1，其為cd3)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域和c-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。在某些實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)間插連接體肽(連接體2)連接至異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，兩條多肽鏈的第一條在n-末端至c-末端方向因此包含vl第一抗原–連接體1–vh第二抗原–連接體2–異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，這樣的兩條多肽鏈的第二條在n-末端至c-末端方向包含n-末端、第二抗原的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第一抗原的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域和c-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。在某些實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)間插連接體肽(連接體2)被連接至異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，兩條多肽鏈的第二條在n-末端至c-末端方向因此包含vl第二抗原–連接體1–vh第一抗原–連接體2–異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。第一多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二多肽鏈的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用以形成對(duì)第一抗原(即hiv-1包膜或cd3/cd16)特異性的功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)。同樣地，第二多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第一多肽鏈的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用以形成對(duì)第二抗原(即，根據(jù)第一抗原的身份為cd3/cd16或hiv-1包膜)特異性的第二功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)。因此，第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇被協(xié)調(diào)，以便所述的兩條多肽鏈總共包括能夠結(jié)合至預(yù)定靶標(biāo)(在某些實(shí)施方案中，例如hiv-1包膜和cd3或cd16)的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，分開(kāi)多肽鏈的這樣的vl和vh結(jié)構(gòu)域的連接體1的長(zhǎng)度被選擇，以基本上或完全阻止這樣的vl和vh結(jié)構(gòu)域彼此結(jié)合。因此，第一多肽鏈的vl和vh結(jié)構(gòu)域基本上或完全不能彼此結(jié)合。同樣地，第二多肽鏈的vl和vh結(jié)構(gòu)域基本上或完全不能彼此結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，這是由于分開(kāi)vh和vl結(jié)構(gòu)域的連接體。在某些實(shí)施方案中，連接體為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個(gè)氨基酸，但不會(huì)超過(guò)15個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，間插間隔體肽(連接體1)具有序列(seqidno:1)：gggsgggg。連接體2將多肽鏈的vh結(jié)構(gòu)域與該多肽鏈的異源二聚體-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。任何種類(lèi)的連接體均可以用于連接體2的目的。在某些實(shí)施方案中，這類(lèi)連接體2的序列具有氨基酸序列：ggcggg(seqidno:2)，其具有半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸殘基通過(guò)二硫鍵可以用于彼此共價(jià)結(jié)合第一和第二多肽鏈。第一和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可以通過(guò)包含異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域而驅(qū)動(dòng)。這類(lèi)結(jié)構(gòu)域包含在一條多肽鏈上的gvepksc(seqidno:3)或vepksc(seqidno:4)和另一條多肽鏈上的gfnrgec(seqidno:5)或fnrgec(seqidno:6)(見(jiàn)us2007/0004909，其通過(guò)引用以其整體并入本文)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域是由1、2、3或4個(gè)具有相反電荷的串聯(lián)重復(fù)的螺旋結(jié)構(gòu)域形成的，所述串聯(lián)重復(fù)的螺旋結(jié)構(gòu)域包括至少6個(gè)、至少7個(gè)或至少8個(gè)帶電荷的氨基酸殘基的序列(apostolovic,b.等(2008)“ph-sensitivityofthee3/k3heterodimericcoiledcoil,”biomacromolecules9:3173–3180；arndt,k.m.等(2001)“helix-stabilizedfv(hsfv)antibodyfragments:substitutingtheconstantdomainsofafabfragmentforaheterodimericcoiled-coildomain,”j.molec.biol.312:221-228；arndt,k.m.等(2002)“comparisonofinvivoselectionandrationaldesignofheterodimericcoiledcoils,”structure10:1235-1248；boucher,c.等(2010)“proteindetectionbywesternblotviacoiled–coilinteractions,”analyticalbiochemistry399:138-140；cachia,p.j.等(2004)“syntheticpeptidevaccinedevelopment:measurementofpolyclonalantibodyaffinityandcross-reactivityusinganewpeptidecaptureandreleasesystemforsurfaceplasmonresonancespectroscopy,”j.mol.recognit.17:540-557；decrescenzo,g.d.等(2003)“real-timemonitoringoftheinteractionsoftwo-strandeddenovodesignedcoiled-coils:effectofchainlengthonthekineticandthermodynamicconstantsofbinding,”biochemistry42:1754-1763；fernandez-rodriquez,j.等(2012)“inducedheterodimerizationandpurificationoftwotargetproteinsbyasyntheticcoiled-coiltag,”proteinscience21:511-519；ghosh,t.s.等(2009)“end-to-endandend-to-middleinterhelicalinteractions:newclassesofinteractinghelixpairsinproteinstructures,”actacrystallographicad65:1032-1041；grigoryan,g.等(2008)“structuralspecificityincoiled-coilinteractions,”curr.opin.struc.biol.18:477-483；litowski,j.r.等(2002)“designingheterodimerictwo-strandedα-helicalcoiled-coils:theeffectsofhydrophobicityandα-helicalpropensityonproteinfolding,stability,andspecificity,”j.biol.chem.277:37272-37279；steinkruger,j.d.等(2012)“thed′--d--d′verticaltriadislessdiscriminatingthanthea′--a--a′verticaltriadintheantiparallelcoiled-coildimermotif,”j.amer.chem.soc.134(5):2626–2633；straussman,r.等(2007)“kinkingthecoiledcoil–negativelychargedresiduesatthecoiled-coilinterface,”j.molec.biol.366:1232-1242；tripet,b.等(2002)“kineticanalysisoftheinteractionsbetweentroponincandthec-terminaltroponiniregulatoryregionandvalidationofanewpeptidedelivery/capturesystemusedforsurfaceplasmonresonance,”j.molec.biol.323:345–362；woolfson,d.n.(2005)“thedesignofcoiled-coilstructuresandassemblies,”adv.prot.chem.70:79-112；zeng,y.等(2008)“aligand-pseudoreceptorsystembasedondenovodesignedpeptidesforthegenerationofadenoviralvectorswithalteredtropism,”j.genemed.10:355-367)。這類(lèi)重復(fù)的螺旋結(jié)構(gòu)域可以是精確的重復(fù)或可具有取代。例如，第一多肽鏈的異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域可以包括8個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基的序列和第二多肽鏈的異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域可以包括8個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基的序列。哪一個(gè)螺旋被提供至第一或第二多肽鏈并不重要，條件是提供相反電荷的螺旋用于另一條多肽鏈。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的hiv-1xcd3雙特異性單價(jià)雙抗體的第一多肽鏈具有帶負(fù)電荷的螺旋。帶正電荷的氨基酸可以是賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負(fù)電荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。在某些實(shí)施方案中，帶正電荷的氨基酸是賴(lài)氨酸和/或帶負(fù)電荷的氨基酸是谷氨酸。有可能只使用單一的異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域(因?yàn)檫@類(lèi)結(jié)構(gòu)域?qū)⒁种仆炊刍瘡亩龠M(jìn)異源二聚化)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙抗體的第一和第二多肽鏈兩者都包含異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域之一包括4個(gè)串聯(lián)“e-螺旋”螺旋結(jié)構(gòu)域(seqidno:7:evaalek-evaalek-evaalek-evaalek)，其谷氨酸殘基在ph7形成負(fù)電荷，而另外一個(gè)異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)串聯(lián)“k-螺旋”結(jié)構(gòu)域(seqidno:8:kvaalke-kvaalke-kvaalke-kvaalke)，其賴(lài)氨酸殘基在ph7形成正電荷。這類(lèi)帶電荷的結(jié)構(gòu)域的存在促進(jìn)第一和第二多肽之間的締合，并且因此促進(jìn)異源二聚化。在一些實(shí)施方案中，k螺旋和e螺旋結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可以變化，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定不同數(shù)量的k-螺旋或e-螺旋是否導(dǎo)致異源二聚化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的hiv-1xcd3或hiv-1xcd16雙特異性單價(jià)雙抗體被工程化，以便它們的第一和第二多肽鏈通過(guò)沿著它們的長(zhǎng)度布置的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基彼此共價(jià)結(jié)合。這類(lèi)半胱氨酸殘基可被引入到分開(kāi)多肽的vl和vh結(jié)構(gòu)域的間插連接體中?？蛇x地，連接體2可以包含半胱氨酸殘基。本發(fā)明還包括本文公開(kāi)的抗體的變體(和片段)，包括這樣的變體：所述變體保持具體公開(kāi)的抗體的結(jié)合至重組env蛋白的能力、結(jié)合至病毒感染的細(xì)胞表面的能力和/或介導(dǎo)adcc的性質(zhì)的變體，本發(fā)明還包括使用它們的方法，例如來(lái)降低hiv-1感染的風(fēng)險(xiǎn)。本文公開(kāi)的抗體或其片段的組合也可以用于本發(fā)明的方法中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體。雙特異性的或雙功能性的抗體為具有兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)的人工雜種(hybrid)抗體(見(jiàn)例如romainrouet&danielchrist“bispecificantibodieswithnativechainstructure”naturebiotechnology32,136–137(2014)；byrne等“ataleoftwospecificities:bispecificantibodiesfortherapeuticanddiagnosticapplications”trendsinbiotechnology,volume31,issue11,november2013,pages621–632songsivilaiandlachmann,clin.exp.immunol.,79:315-321(1990)；kostelny等,j.immunol.148:1547-53(1992)(以及本文的參考文獻(xiàn)))。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體為任何同種型的全抗體。在其他實(shí)施方案中，雙特異性片段例如但不限于f(ab)2片段。在一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體不包含fc部分，這使得這些雙抗體的尺寸相對(duì)小，易于穿透組織。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以包含fc區(qū)域。含fc的雙抗體例如但不限于含fc的darts較重，并且可以結(jié)合新生兒fc受體，增加它們的循環(huán)半衰期。見(jiàn)garber“bispecificantibodiesriseagain”naturereviewsdrugdiscovery13,799–801(2014),figure1a；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20130295121、美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20140099318，其通過(guò)引用以其整體并入本文。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含fc結(jié)構(gòu)域或其部分(如ch2結(jié)構(gòu)域或ch3結(jié)構(gòu)域)的雙抗體分子。fc結(jié)構(gòu)域或其部分可來(lái)源于任何免疫球蛋白同種型或同種異型(allotype)，包括但不限于iga、igd、igg、ige和igm。在一些實(shí)施方案中，fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)來(lái)源于igg。在一些實(shí)施方案中，igg同種型為igg1、igg2、igg3或igg4或其同種異型。在一些實(shí)施方案中，雙抗體分子包括fc結(jié)構(gòu)域，所述fc結(jié)構(gòu)域包括獨(dú)立地選自任何免疫球蛋白同種型的ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域(即fc結(jié)構(gòu)域包括來(lái)源于igg的ch2結(jié)構(gòu)域和來(lái)源于ige的ch3結(jié)構(gòu)域或來(lái)源于igg1的ch2結(jié)構(gòu)域和來(lái)源于igg2的ch3結(jié)構(gòu)域等)。在一些實(shí)施方案中，在相對(duì)于多肽鏈的其他結(jié)構(gòu)域或部分的任意位置處，可以將fc結(jié)構(gòu)域工程化到構(gòu)成本發(fā)明的雙抗體分子的多肽鏈中(例如fc結(jié)構(gòu)域或其部分可以在多肽鏈的vl和vh結(jié)構(gòu)域兩者的c-末端；可以在vl和vh結(jié)構(gòu)域兩者的n-末端；或可以在一個(gè)結(jié)構(gòu)域的n-末端和在另一個(gè)結(jié)構(gòu)域的c-末端(即在多肽鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間))。考慮雙特異性分子的其他修飾以增加雙特異性分子的半衰期。在一些實(shí)施方案中，這些修飾包括添加血清結(jié)合蛋白的多肽部分。見(jiàn)us20100174053a1，其通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，期望本發(fā)明的雙特異性分子的fc變體相對(duì)于非-fc變體具有增加的血清半衰期。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地執(zhí)行各種試驗(yàn)(包括藥物動(dòng)力學(xué)研究)來(lái)確定這些分子的半衰期。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含多肽鏈，每一條多肽鏈包括包含本文所述的cdrs的vh和vl結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)成每條多肽鏈的vl和vh結(jié)構(gòu)域具有相同的特異性，并且多聚體分子是二價(jià)的和單特異性的。在其他實(shí)施方案中，構(gòu)成每條多肽鏈的vl和vh結(jié)構(gòu)域具有不同的特異性，并且多聚體為二價(jià)的和雙特異性的。在一些實(shí)施方案中，多聚體中的多肽鏈進(jìn)一步包括fc結(jié)構(gòu)域。fc結(jié)構(gòu)域的二聚化導(dǎo)致展現(xiàn)免疫球蛋白-樣功能，即fc介導(dǎo)的功能(如fc-fc.γ.r相互作用，補(bǔ)體結(jié)合等)，的雙抗體分子的形成。在前所述的雙特異性分子的形成需要不同多肽鏈的相互作用。由于許多潛在的鏈錯(cuò)配變體，這種相互作用很難在單細(xì)胞重組生產(chǎn)系統(tǒng)中有效地實(shí)現(xiàn)。一種增加錯(cuò)配的可能性的方案是將“杵-入-臼”("knobs-into-holes")型突變工程化到所需的多肽鏈對(duì)中。這樣的突變相對(duì)于同源二聚化利于異源二聚化。例如，關(guān)于fc-fc-相互作用，氨基酸取代(優(yōu)選以包括形成“杵(knob)”的大側(cè)基的氨基酸例如色氨酸進(jìn)行取代)可被引入至ch2或ch3結(jié)構(gòu)域中，以便空間干擾將防止與類(lèi)似的突變結(jié)構(gòu)域的相互作用并將迫使突變的結(jié)構(gòu)域與其中互補(bǔ)或適應(yīng)性突變已經(jīng)被工程化的結(jié)構(gòu)域——即‘臼(hole)’(例如，用甘氨酸取代)——配對(duì)。這樣的突變組可被工程化到構(gòu)成雙抗體分子的任意多肽對(duì)中，并且，進(jìn)一步地被工程化到多肽鏈對(duì)的任何部分中。蛋白質(zhì)工程化以相對(duì)于同源二聚化利于異源二聚化的方法在本領(lǐng)域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，這些都包括在本文中(見(jiàn)例如ridgway等(1996)"`knobs-into-holes`engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization,"proteinengr.9:617-621，atwell等(1997)"stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary,"j.mol.biol.270:26-35,和xie等(2005)"anewformatofbispecificantibody:highlyefficientheterodimerization,expressionandtumorcelllysis,"j.immunol.methods296:95-101；其每一篇通過(guò)引用以其整體并入本文)。本發(fā)明還包括包含變異的fc(或其部分)的雙抗體分子，所述變異的fc結(jié)構(gòu)域相對(duì)于可比較的野生型fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)包括至少一個(gè)氨基酸修飾(如取代、插入刪除)。包括變異的fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-fc結(jié)構(gòu)域(或其部分)的分子(如抗體)相對(duì)于包括野生型fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-fc結(jié)構(gòu)域或其部分的分子通常具有改變的表型。變異的表型可以表示為改變的血清半衰期、改變的穩(wěn)定性、改變的對(duì)細(xì)胞酶的敏感性或改變的效應(yīng)子功能，如在nk依賴(lài)性或巨噬細(xì)胞依賴(lài)性試驗(yàn)中所測(cè)定的。被鑒定為改變效應(yīng)子功能的fc結(jié)構(gòu)域變體在本領(lǐng)域是已知的。例如國(guó)際申請(qǐng)wo04/063351，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2005/0037000和2005/0064514。本發(fā)明的雙特異性雙抗體能同時(shí)結(jié)合兩個(gè)分開(kāi)的和不同的表位。在某些實(shí)施方案中，表位來(lái)自相同的抗原。在其他實(shí)施方案中，表位來(lái)自不同的抗原。在非限制性實(shí)施方案中，至少一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)對(duì)在免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的決定簇(如cd3、cd16、cd32、cd64等)是特異性的，所述決定簇在t淋巴細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞或其他單核細(xì)胞上表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙抗體分子結(jié)合至效應(yīng)細(xì)胞決定簇，并且也激活效應(yīng)細(xì)胞。就這一點(diǎn)而言，本發(fā)明的雙抗體分子可以展現(xiàn)ig-樣功能性而不依賴(lài)于它們是否進(jìn)一步包括fc結(jié)構(gòu)域(例如在本領(lǐng)域已知的任何效應(yīng)子功能試驗(yàn)或本文例示的效應(yīng)子功能試驗(yàn)中所測(cè)定的)。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體包括hiv包膜結(jié)合片段，例如但不限于來(lái)自本文所述的任何抗體的hiv包膜結(jié)合片段。在其他實(shí)施方案中，雙特異性抗體進(jìn)一步包括第二抗原-相互作用-位點(diǎn)/片段。在其他實(shí)施方案中，雙特異性抗體進(jìn)一步包括至少一個(gè)效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體接合細(xì)胞，用于抗體-依賴(lài)性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體接合自然殺傷細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體為t-細(xì)胞接合器(engager)。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體包括hiv包膜結(jié)合片段和cd3結(jié)合片段。各種cd3抗體在本領(lǐng)域是已知的。見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利8,784,821和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2014-0099318，其提供關(guān)于各種cd3抗體的各種公開(kāi)內(nèi)容，所述公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體包括hiv包膜結(jié)合片段和cd16結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有雙靶向特異性的抗體。在某些方面，本發(fā)明提供了能夠?qū)⒚庖咝?yīng)細(xì)胞定位至表達(dá)hiv-1包膜的細(xì)胞的雙特異性分子，以促進(jìn)表達(dá)hiv-1包膜的細(xì)胞的殺傷。就這一點(diǎn)而言，雙特異性抗體用一條“臂”結(jié)合至靶細(xì)胞上的表面抗原，和用第二“臂”結(jié)合至t細(xì)胞受體(tcr)復(fù)合體的激活的、不變的組分。這類(lèi)抗體與其兩個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)結(jié)合促使靶細(xì)胞和t細(xì)胞之間暫時(shí)的相互作用，導(dǎo)致任何細(xì)胞毒性t細(xì)胞的活化并導(dǎo)致靶細(xì)胞的隨后裂解。因此，免疫應(yīng)答被重定向至靶細(xì)胞，并且不依賴(lài)于通過(guò)靶細(xì)胞的肽抗原呈遞或與ctls的正常的mhc-受限的活化相關(guān)的t細(xì)胞的特異性。由于這個(gè)原因，當(dāng)靶細(xì)胞向ctls呈遞雙特異性抗體時(shí)，只有ctls是激活的，即免疫突觸被模擬，這很關(guān)鍵。尤其期望的是這樣的雙特異性抗體：其不要求淋巴細(xì)胞預(yù)處理或共刺激以引發(fā)靶細(xì)胞的有效裂解。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體或片段，例如但不限于darts或毒素標(biāo)記的hiv-1結(jié)合分子，其包括本發(fā)明抗體的vh和/或vl鏈的cdr(s)，或vh和/或vl鏈，作為雙特異性分子的hiv-1結(jié)合臂。在某些實(shí)施方案中，這類(lèi)雙特異性分子包括靶向hiv-1包膜的一個(gè)部分和結(jié)合第二靶標(biāo)的第二部分。在某些實(shí)施方案中，第一部分包括來(lái)自本文所述的抗體的vh和vl序列，或cdrs。在某些實(shí)施方案中，第二靶標(biāo)可以是，例如但不限于效應(yīng)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，第二部分是t-細(xì)胞接合器。在某些實(shí)施方案中，第二部分包括靶向cd3的序列/互補(bǔ)位。在某些實(shí)施方案中，第二部分是來(lái)源于cd3抗體任選地已知cd3抗體)的抗原-結(jié)合區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，抗-cd抗體誘導(dǎo)t細(xì)胞-介導(dǎo)的殺傷。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體是全抗體。在其他實(shí)施方案中，雙靶向抗體基本上由fab片段組成。在其他實(shí)施方案中，雙靶向抗體包括重鏈恒定區(qū)域(ch1)。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體不包括fc區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體具有改善的效應(yīng)子功能。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體具有改善的細(xì)胞殺傷活性。設(shè)計(jì)雙特異性分子的各種方法和平臺(tái)在本領(lǐng)域是已知的。見(jiàn)例如美國(guó)公開(kāi)20140206846、美國(guó)公開(kāi)20140170149、20100174053、美國(guó)公開(kāi)20090060910、美國(guó)公開(kāi)20130295121、美國(guó)公開(kāi)20140099318、美國(guó)公開(kāi)20140088295，其內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入本文。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人、人源化和/或嵌合抗體。構(gòu)建這類(lèi)抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。在某些方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體(包括雙特異性抗體)在治療和預(yù)防個(gè)體中hiv-1感染的方法中的用途，其包括向個(gè)體施用治療上有效量的組合物，所述組合物包括處于藥學(xué)上可接受的形式的本發(fā)明的抗體。在某些實(shí)施方案中，該方法包含組合物，所述組合物包含多于一種hiv-1靶向抗體。在某些實(shí)施方案中，在這類(lèi)組合中的hiv-1靶向抗體結(jié)合hiv-1包膜上的不同表位。在某些實(shí)施方案中，靶向多于一個(gè)hiv-1表位的雙特異性抗體的這類(lèi)組合提供對(duì)hiv-1感染細(xì)胞的增加的殺傷。在其他實(shí)施方案中，靶向多于一個(gè)hiv-1表位的雙特異性抗體的這類(lèi)組合提供識(shí)別不同hiv-1亞型的增加的幅度。本發(fā)明還包括本文公開(kāi)的抗體的變體(和片段)，包括保持具體公開(kāi)的抗體的結(jié)合至重組env蛋白的能力、結(jié)合至病毒感染的細(xì)胞表面的能力和/或介導(dǎo)adcc的性質(zhì)的變體，本發(fā)明還包括還使用它們的方法，以例如減少hiv-1感染的風(fēng)險(xiǎn)。本文公開(kāi)的抗體或其片段的組合也可以用于本發(fā)明的方法中。特異性結(jié)合多肽的抗體的vl或vh的同系物和變體特征通常在于具有至少大約75％，例如至少大約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述序列同一性在與目標(biāo)氨基酸序列的全長(zhǎng)比對(duì)上計(jì)數(shù)。當(dāng)用這種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，與參考序列具有甚至更大相似性的蛋白質(zhì)將顯示增加的同一性百分比，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的序列同一性。當(dāng)小于整體序列針對(duì)序列同一性被比較時(shí)，同系物和變體在10-20個(gè)氨基酸的短的窗口上通常具有至少80％的序列同一性，并且基于它們與參考序列的相似性可具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性。在這么短的窗口上測(cè)定序列同一性的方法可在網(wǎng)絡(luò)上在ncbi網(wǎng)站上獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，提供這些序列同一性范圍僅用于指導(dǎo)；完全有可能獲得超出所提供的范圍的極重要的同系物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其與本文所述的抗體的vh和vl氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％的同一性，并且仍維持它們的表位結(jié)合幅度和/或效力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其與本文所述的抗體的vh氨基酸序列的cdr1、2和/或3，和vl氨基酸序列的cdr1、2和/或3具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％的同一性，并且仍維持它們的表位結(jié)合幅度和/或效力。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含fc的雙特異性分子。在一些實(shí)施方案中，多肽之一或兩者的第三結(jié)構(gòu)域可另外包括ch2-ch3結(jié)構(gòu)域的序列，以便雙抗體多肽的復(fù)合形成能夠結(jié)合至細(xì)胞(如b淋巴細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜伊紅粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)的fc受體的fc結(jié)構(gòu)域(圖8b-8c)。這類(lèi)分子的許多變型已經(jīng)被描述(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2014-0099318；2013-0295121；2010-0174053和2009-0060910；歐洲專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)ep2714079；ep2601216；ep2376109；ep2158221和pct公開(kāi)號(hào)wo2015/026894；wo2015/026892；wo2015/021089；wo2014/159940；wo2012/162068；wo2012/018687；wo2010/080538)，這些出版物的每一個(gè)的內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，這些含fc的darts可包括三條多肽鏈。這類(lèi)雙抗體的第一多肽包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：(i)包含vl1的結(jié)構(gòu)域，(ii)包含vh2的結(jié)構(gòu)域，(iii)促進(jìn)異源二聚化和與該雙抗體的第一多肽鏈共價(jià)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和(iv)包含ch2-ch3序列的結(jié)構(gòu)域。這類(lèi)darttm的第二多肽包含：(i)包含vl2的結(jié)構(gòu)域，(ii)包含vh1的結(jié)構(gòu)域和(iii)促進(jìn)異源二聚化和與該雙抗體的第一多肽鏈共價(jià)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。這類(lèi)darttm的第三多肽包括ch2-ch3序列。因此，這類(lèi)darttm的第一和第二多肽鏈締合在一起，以形成能夠結(jié)合至表位的vl1/vh1結(jié)合位點(diǎn)，以及能夠結(jié)合至第二表位的vl2/vh2結(jié)合位點(diǎn)。第一和第二多肽通過(guò)涉及在它們各自的第三結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結(jié)合。尤其地，第一和第三多肽鏈彼此復(fù)合以形成通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定化的fc結(jié)構(gòu)域。這類(lèi)雙抗體具有增強(qiáng)的效力。這類(lèi)含fc的dartstm可具有兩種取向之一(表1)：hivxcd3雙特異性單價(jià)fc雙抗體由三條多肽鏈構(gòu)成，所述三條多肽鏈彼此締合以形成對(duì)hiv的表位特異性的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)cd3的表位特異性的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖8b-8c)，以便能夠同時(shí)結(jié)合至hiv和結(jié)合至cd3。因此，這類(lèi)雙抗體結(jié)合至“第一抗原”(可以為cd3或hiv)和“第二抗原”(當(dāng)?shù)谝槐砦粸閏d3時(shí)，其為hiv，并且當(dāng)?shù)谝槐砦粸閔iv時(shí)，其為cd3)。如圖8b所顯示，這樣的三條多肽鏈中的第一條在n-末端至c-末端方向包含n-末端、“第一”抗原(cd3或hiv)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第二抗原(若第一抗原為cd3，其為hiv；若第一抗原為hiv，其為cd3)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域和c-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。在非限制性實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)間插連接體肽(連接體2)被連接至異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在hivxcd3雙抗體單價(jià)fc雙抗體的情況下，異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域的c-末端通過(guò)間插連接體肽(連接體3)或通過(guò)間插間隔體-連接體肽(間隔體-連接體3)被連接至fc區(qū)域的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域(“fc結(jié)構(gòu)域”)。在非限制性實(shí)施方案中，該三條多肽鏈中的第一條在n-末端至c-末端方向因此包含：vl第一抗原–連接體1–vh第二抗原–連接體2–異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域–間隔體-連接體3–fc結(jié)構(gòu)域。可選地，如圖8c所顯示，這樣的三條多肽鏈中的第一條在n-末端至c-末端方向包含n-末端、連接體3、fc區(qū)域的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域(“fc結(jié)構(gòu)域”)、具有例如氨基酸序列：apsss(seqidno:39)或氨基酸序列apssspme(seqidno:40)的間插間隔體肽(連接體4)、第一抗原(cd3或hiv)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第二抗原(若第一抗原為cd3，其為hiv；若第一抗原為hiv，其為cd3)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域和c-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。在非限制性實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)間插連接體肽(連接體2)被連接至異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在非限制性實(shí)施方案中，該三條多肽鏈中的第一條在n-末端至c-末端方向因此包含：連接體3–fc結(jié)構(gòu)域–連接體4–vl第一抗原–連接體1–vh第二抗原–連接體2–異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在非限制性實(shí)施方案中，這樣的三條多肽鏈中的第二條在n-末端至c-末端方向包含n-末端、第二抗原的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第一抗原的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域和c-末端。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。在非限制性實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)間插連接體肽(連接體2)被連接至異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在非限制性實(shí)施方案中，該三條多肽鏈中的第二條在n-末端至c-末端方向因此包含：vl第二抗原–連接體1–vh第一抗原–連接體2–異源二聚化-促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。在非限制性實(shí)施方案中，這樣的三條多肽鏈中的第三條包含連接體肽(連接體3)和fc區(qū)域的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域(“fc結(jié)構(gòu)域”)。本發(fā)明的雙特異性分子考慮具有各種連接體的設(shè)計(jì)，以分開(kāi)包括在多肽鏈中的不同的結(jié)構(gòu)域。連接體的具體的非限制性實(shí)施方案公開(kāi)在本文中。其他的連接體可被很容易地確定。連接體的另外的一些實(shí)施例公開(kāi)在美國(guó)公開(kāi)20100174053中，其通過(guò)引用以其整體并入。第一多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二多肽鏈的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用以形成對(duì)第一抗原(即hiv或cd3)特異性的功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)。同樣地，第二多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第一多肽鏈的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用以形成對(duì)第二抗原(即取決于第一抗原的身份，其為cd3或hiv)特異性的第二功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)。因此，第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇被協(xié)調(diào)，以便該兩條多肽鏈總共包括能夠結(jié)合至hiv和cd3的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的hivxcd3雙特異性單價(jià)fc雙抗體的fc結(jié)構(gòu)域可以是完整的fc區(qū)域(如完整的iggfc區(qū)域)或僅是完整的fc區(qū)域的片段。雖然本發(fā)明的雙特異性單價(jià)fc雙抗體的fc結(jié)構(gòu)域可具有結(jié)合至一種或多種fc受體(如fcγr(一種或多種))的能力，但是在非限制性實(shí)施方案中，這類(lèi)fc結(jié)構(gòu)域?qū)⒁鹋cfcγria(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)或fcγriiib(cd16b)減少的結(jié)合(相對(duì)于野生型fc區(qū)域表現(xiàn)的結(jié)合)或?qū)⒒旧舷@類(lèi)fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合至這類(lèi)受體(一種或多種)的能力。本發(fā)明的雙特異性單價(jià)fc雙抗體的fc結(jié)構(gòu)域可包含完整的fc區(qū)域的一些或所有的ch2結(jié)構(gòu)域和/或一些或所有的ch3結(jié)構(gòu)域，或可包括變異的ch2和/或變異的ch3序列(其可包含例如相對(duì)于完整的fc區(qū)域的ch2或ch3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)插入和/或一個(gè)或多個(gè)刪除)。本發(fā)明的雙特異性單價(jià)fc雙抗體的fc結(jié)構(gòu)域可包括非fc多肽部分，或可包括非天然的完整的fc區(qū)域的部分，或可包括非天然產(chǎn)生的取向的ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域(如，例如兩個(gè)ch2結(jié)構(gòu)域或兩個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域，或在n-末端至c-末端方向，ch3結(jié)構(gòu)域連接至ch2結(jié)構(gòu)域等)。在非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明的hivxcd3雙特異性單價(jià)fc雙抗體的第一和第三多肽鏈各自包括復(fù)合在一起以形成免疫球蛋白(igg)fc結(jié)構(gòu)域的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域。人igg1的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是(seqidno:41):因此第一和第三多肽鏈的ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域可以都由seqidno:41或其變體構(gòu)成。在非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明的hivxcd3雙特異性單價(jià)fc雙抗體的第一和第三多肽鏈的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)出對(duì)fcγria(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)或fcγriiib(cd16b)減少的(或基本上沒(méi)有)結(jié)合(相對(duì)于野生型fc區(qū)域(seqidno:41)表現(xiàn)的結(jié)合))。能夠介導(dǎo)這種改變的結(jié)合的fc變體和突變形式在本領(lǐng)域是已知的，其包含在位置234和235處的氨基酸取代、位置265處的取代或位置297處的取代(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,624,821，通過(guò)引用并入本文)。在非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明的hivxcd3雙特異性單價(jià)fc雙抗體的第一和/或第三多肽鏈的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域包含在位置234處通過(guò)丙氨酸的取代和235處通過(guò)丙氨酸的取代。第一和第三多肽鏈的ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域不需要在序列上完全相同，且有利地被修飾以促進(jìn)兩條多肽鏈之間的復(fù)合。例如，氨基酸取代(例如以包括形成“杵”的大側(cè)基的氨基酸例如色氨酸進(jìn)行取代)可被引入至ch2或ch3結(jié)構(gòu)域中，以便空間干擾阻止與類(lèi)似的突變結(jié)構(gòu)域的相互作用，并且迫使該突變結(jié)構(gòu)域與其中互補(bǔ)或適應(yīng)性的突變已被工程化的結(jié)構(gòu)域(即‘臼’(例如用甘氨酸取代))配對(duì)。這樣的突變組可被工程化到構(gòu)成雙特異性單價(jià)fc雙抗體分子的任何多肽對(duì)中，并且進(jìn)一步被工程化到所述多肽鏈對(duì)的任何部分中。蛋白質(zhì)工程化以相對(duì)于同源二聚化利于異源二聚化的方法在本領(lǐng)域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白樣分子而言，這些都包括在本文中(見(jiàn)例如ridgway等(1996)"`knobs-into-holes`engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization,"proteinengr.9:617-621；atwell等(1997)"stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary,"j.mol.biol.270:26-35；和xie等(2005)"anewformatofbispecificantibody:highlyefficientheterodimerization,expressionandtumorcelllysis,"j.immunol.methods296:95-101；其每一篇通過(guò)引用以其整體并入本文)。在非限制性實(shí)施方案中，“杵”被工程化到第一多肽鏈的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域中和“臼”被工程化到第三多肽鏈的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域中。因此，“杵”將幫助防止第一多肽鏈通過(guò)其ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域而進(jìn)行同源二聚(homodimerizing)。在非限制性實(shí)施方案中，由于第三多肽鏈包含“臼”取代，其將與第一多肽鏈異源二聚，并且與其自身同源二聚。在非限制性實(shí)施方案中，杵通過(guò)修飾天然的iggfc結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生，以包含修飾t366w。在非限制性實(shí)施方案中，臼通過(guò)修飾天然的iggfc結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生，以包含修飾t366s、l368a和y407v。為了幫助從包括第一、第二和第三多肽鏈的最終的雙特異性單價(jià)fc雙抗體中純化第三多肽鏈同源二聚體，第三多肽鏈的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的蛋白a結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)位置435處的氨基酸取代被突變(h435r)。因此，第三多肽鏈同源二聚體將不會(huì)結(jié)合至蛋白a，然而雙特異性單價(jià)fc雙抗體將保持其通過(guò)第一多肽鏈上的蛋白a結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合蛋白a的能力。在非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明的hivx效應(yīng)子(例如cd3)雙特異性單價(jià)fc雙抗體的第一多肽鏈的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的序列具有“含有杵的”序列(seqidno:42):在非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明的hivx效應(yīng)子(例如cd3)雙特異性單價(jià)fc雙抗體的第三多肽鏈的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的序列具有“含有臼的”序列(seqidno:43):要注意的是，seqidno:42和seqidno:43的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域包含位置234處通過(guò)丙氨酸的取代和位置235處通過(guò)丙氨酸的取代，因此形成對(duì)fcγria(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)或fcγriiib(cd16b)展現(xiàn)減少的(或基本上沒(méi)有)結(jié)合(相對(duì)于野生型fc區(qū)域(seqidno:41)表現(xiàn)的結(jié)合)的fc結(jié)構(gòu)域。在非限制性實(shí)施方案中，第一多肽鏈具有“含有杵”的ch2-ch3序列，諸如seqidno:42的序列。但是，應(yīng)該意識(shí)到，“含有臼”的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:43)可被用于第一多肽鏈中，在這種情況下，“含有杵”的ch2-ch3結(jié)構(gòu)域(例如seqidno:42)可被用于第三多肽鏈中。在非限制性實(shí)施方案中，fc結(jié)構(gòu)域可通過(guò)氨基酸取代而被修飾，以增加與新生兒fc受體的結(jié)合，因此在向受試者施用時(shí)增加抗體的半衰期。fc結(jié)構(gòu)域可以是iga、igm、igd、ige或iggfc結(jié)構(gòu)域。fc結(jié)構(gòu)域可以是優(yōu)化的fc結(jié)構(gòu)域，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0100093979中所描述的，其通過(guò)引用并入本文。在某些實(shí)施方案中，抗體包括氨基酸改變或其組合，例如在表位結(jié)合之外的fc區(qū)域中，所述改變可以改善它們的性質(zhì)。各種fc修飾在本領(lǐng)域是已知的。氨基酸編碼根據(jù)kabat的eu索引。在一些實(shí)施方案中，發(fā)明考慮包括影響新生兒fc受體(fcrn)結(jié)合、抗體半衰期、和抗體在粘膜位點(diǎn)的定位以及持續(xù)的突變。關(guān)于各種fc區(qū)域突變，見(jiàn)例如kosy等,nature514:642-45,2014,圖1a和其引文；kuo,t.和averson,v.,mabs3(5):422-430,2011,表1；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20110081347(在kabat殘基288處的天冬氨酸和/或在kabat殘基435處的賴(lài)氨酸)；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20150152183，其通過(guò)引用以其整體并入。在某些實(shí)施方案中，抗體包括在已經(jīng)被報(bào)告通過(guò)nk細(xì)胞來(lái)提高adcc的抗體的fc區(qū)域中以及周?chē)腶aaa取代(aaa突變)，其包含s298a以及e333a和k334a的fc區(qū)域氨基酸(shieldsri等jbc,276:6591-6604,2001)以及第四個(gè)a(n434a)是為了提高新生兒fcr介導(dǎo)的igg向粘膜位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)(shieldsri等，同上)。其他抗體突變已經(jīng)被報(bào)告改善抗體半衰期或功能或兩者，其可被并入至抗體的序列中。這些包含dle組的突變(romaing,等.blood124:3241,2014)；ls突變m428l/n434s、單獨(dú)地或與其他fc區(qū)域突變組合(kosy等.nature514:642-45,2014,圖1a和其引文；zlevsky等,naturebiotechnology,28(2):157-159,2010；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20150152183)；ytefc突變(robbieg等antimicrobialagentsandchemotherapy12:6147-53,2013)以及其他對(duì)抗體的工程化突變諸如ql突變、ihh突變(kosy等.nature514:642-45,2014,圖1a和相關(guān)引文；還見(jiàn)rudicellr等.j.virol88:12669-82,201)。在一些實(shí)施方案中，抗體可以包括修飾，例如但不限于糖基化，其減少或消除抗體的多應(yīng)答性。見(jiàn)例如chuang,等.proteinscience24:1019-1030,2015。在一些實(shí)施方案中，抗體可以包括在fc結(jié)構(gòu)域的修飾以便fc結(jié)構(gòu)域相對(duì)于未修飾的fc結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；提高的對(duì)fc.γ.riia或fc.γ.riiia的結(jié)合；減少的對(duì)fc.γ.riib的結(jié)合；或提高的對(duì)fc.γ.riib的結(jié)合。見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20140328836。上述抗體及其片段可被配制為組合物(例如藥物組合物)。合適的組合物可包括溶解在或分散在藥學(xué)上可接受的載體(例如含水介質(zhì))中的介導(dǎo)adcc的抗體(或抗體片段)。組合物可以是無(wú)菌的并且可以是注射形式(例如但不限于適于靜脈內(nèi)注射或肌肉注射的形式)。抗體(及其片段)也可被配制為適于向皮膚或粘膜局部施用的組合物。這類(lèi)組合物可以采用液體、軟膏、霜?jiǎng)⒛z和糊劑的形式?？贵w(及其片段)也可被配制成適于鼻內(nèi)施用的組合物。抗體(及其片段)可被配制以便作為交配后沖洗劑或與避孕套一起施用。標(biāo)準(zhǔn)的配制技術(shù)可用來(lái)制備合適的組合物?？贵w(及其片段)，例如本文所述的介導(dǎo)adcc的抗體具有例如在包括但不限于以下情形(setting)中的效用：i)在預(yù)先的已知的暴露于hiv-1感染的情形中，本文所述的抗體(或其片段)可以作為殺微生物劑被預(yù)防性地(例如iv、局部地或鼻內(nèi))施用。ii)在已知或懷疑暴露的情形中，諸如發(fā)生在強(qiáng)奸受害者、或商業(yè)性工作者、或在沒(méi)有避孕套保護(hù)的任何同性或異性傳播中的情形中，本文所述的抗體(或其片段)可作為暴露后預(yù)防法(例如iv或局部地)被施用，和iii)在急性的hiv-1感染(ahi)的情形中，本文所述的抗體(或其片段)可作為用于ahi的治療被施用，以控制初始病毒載量或用于消除病毒感染的cd4t細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，本文所述的介導(dǎo)adcc的抗體(或抗體片段)可在受試者或受試者的免疫系統(tǒng)/細(xì)胞與hiv-1接觸之前或在這樣的接觸約48小時(shí)內(nèi)被施用。在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)施用可以最大化對(duì)受試者易受攻擊的細(xì)胞受hiv-1感染的抑制。另外，本文所述的抗體的各種形式可被施用于長(zhǎng)期或急性感染的hiv-1患者并且憑借這些抗體結(jié)合至病毒感染的細(xì)胞的表面并且能夠向這些儲(chǔ)庫(kù)細(xì)胞遞送毒素而用于殺死剩余的病毒感染的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與潛伏期激活劑組合施用，以便激活hiv感染的細(xì)胞的潛伏庫(kù)。預(yù)期的是，通過(guò)激活靜息細(xì)胞中潛伏的前病毒hivdna，一旦失活細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生新的病毒，它們將被免疫系統(tǒng)識(shí)別和消除。潛伏期激活劑的非限制性實(shí)施例為hdac抑制劑，例如伏立諾他、羅咪酯肽、帕比司他、戒酒硫、jq1、苔蘚抑制素、pma、離子霉素或其任何組合。見(jiàn)bullen等.naturemedicine20,425–429(2014)。合適的劑量范圍可取決于抗體(或片段)和取決于制劑的性質(zhì)和給藥的途徑。最佳劑量可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)確定，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。例如，可以使用未標(biāo)記的或(以毒素或放射性部分)標(biāo)記的抗體的1-50mg/kg范圍內(nèi)的抗體劑量。如果具有或不具有毒素的片段被使用或可以靶向特定cd4感染的t細(xì)胞的抗體被使用，則可以使用較少的抗體(例如從5mg/kg至0.01mg/kg)。本發(fā)明的抗體及其片段可以使用包括編碼選自在表中和實(shí)施例中顯示的那些vh和vl序列的核苷酸序列的核酸而被重組產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了完整的/全抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其抗原結(jié)合片段。通常地，片段與衍生其的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)與靶標(biāo)的特異性結(jié)合，所述片段包括單獨(dú)的重鏈、輕鏈fab、fab'、f(ab').sub.2、f(ab)c、雙抗體、dabs、納米抗體和fv。片段可由重組dna技術(shù)或由完整的免疫球蛋白的酶或化學(xué)分離產(chǎn)生。編碼用于產(chǎn)生如本文所述的具有特異性的雙特異性抗體的多肽的核酸序列可用于產(chǎn)生質(zhì)粒，用于重組抗體的穩(wěn)定表達(dá)。用于重組表達(dá)和純化的方法在本領(lǐng)域是已知的。在fc的某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒也包括本文所述的fc部分的任何變化。在一些實(shí)施方案中，這些是在已經(jīng)被報(bào)告通過(guò)nk細(xì)胞來(lái)提高adcc的抗體的fc區(qū)域中以及周?chē)腶aaa取代(aaa突變)，其包含s298a以及e333a和k334a的fc區(qū)域氨基酸(shieldsri等jbc,276:6591-6604,2001)以及第四個(gè)a(n434a)是為了提高新生兒fcr介導(dǎo)的igg向粘膜位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)(shieldsri等，同上)。在某些實(shí)施方案中，核酸被優(yōu)化，用于在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，載體適于基因遞送和表達(dá)。有許多表達(dá)系統(tǒng)可用于蛋白的表達(dá)，包括大腸埃希氏菌(e.coli)、其他細(xì)菌宿主、酵母菌和各種高等真核細(xì)胞諸如cos、cho、hela和骨髓瘤細(xì)胞系。任何合適的細(xì)胞系可用于本發(fā)明的多肽的表達(dá)，包括但不限于cho細(xì)胞、293t細(xì)胞。在一些方面，本發(fā)明提供了編碼這些抗體的核酸、包含這些核酸的表達(dá)盒和載體，并且也提供了表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體的核酸的分離細(xì)胞。本發(fā)明的多肽可由用于多肽和/或抗體純化的任何適合的方法純化。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中引用的各種出版物的內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入。實(shí)施例實(shí)施例1a：hiv-1xcd3或hiv-1xcd16雙特異性分子和對(duì)照雙特異性分子的構(gòu)建表2包含被設(shè)計(jì)、表達(dá)和純化的雙特異性雙抗體的列表。雙特異性雙抗體是異源二聚體或所述的氨基酸序列的異源三聚體。wo2006/113665、wo2008/157379、wo2010/080538、wo2012/018687、wo2012/162068、wo2012/162067、wo2014/159940、wo2015/021089、wo2015/026892和wo2015/026894提供了形成雙特異性雙抗體的方法。hiv-1xcd3雙特異性雙抗體能夠同時(shí)結(jié)合至hiv-1和cd3。hiv-1xcd16雙特異性雙抗體能夠同時(shí)結(jié)合至hiv-1和cd16。對(duì)照雙特異性雙抗體(4420xcd3)能夠同時(shí)結(jié)合至fitc和cd3。對(duì)照雙特異性雙抗體(4420xcd16)能夠同時(shí)結(jié)合至fitc和cd16。對(duì)照雙特異性雙抗體(7b2x4420)能夠同時(shí)結(jié)合至hiv-1和fitc。對(duì)照雙特異性雙抗體(a32x4420)能夠同時(shí)結(jié)合至hiv-1和fitc。對(duì)照雙特異性雙抗體(帕利珠單抗xcd3)能夠同時(shí)結(jié)合至rsv和cd3。表3顯示了雙特異性分子的一些實(shí)施方案的概述。說(shuō)明書(shū)中的信息可容易地用于所列出的雙特異性分子的替代設(shè)計(jì)，并且用于利用來(lái)自這些抗體的cdrs或vh和vl鏈設(shè)計(jì)其他雙特異性分子，例如7b2、ch27、ch28、ch44。實(shí)施例1c：具有adcc活性的hiv-1抗體單克隆抗體。5種mabs代表針對(duì)hiv-1envgp120恒定區(qū)域1(c1；n＝1)、cd4結(jié)合位點(diǎn)(cd4bs；n＝3)、和gp41簇1的那些[pollaraj.curr.hivres.2013；11(8):378–3870]。所有的mabs在表1中列出。除了mabs之外，所有的都是用fc區(qū)域的序列生成的，所述fc區(qū)域的序列包括根據(jù)shields等人的氨基酸取代，以?xún)?yōu)化與fcγ-受體(fcγ-r)iiia的結(jié)合[shieldsrljbiolchem2001；276(9):6591–6604]。a32mab識(shí)別在hiv-1envgp120的c1區(qū)域中的構(gòu)象表位(wyatt等,j.virol.69:5723-5733(1995))，可以介導(dǎo)有效的adcc活性，并且可以阻斷在hiv-1感染的個(gè)體中可檢測(cè)到的顯著比例的介導(dǎo)adcc的ab活性(ferrari等,j.virol.85:7029-7036(2011))。ch28或ch44為hiv-1cd4bs中和抗體。表4.針對(duì)adcc測(cè)試的mabs列表感染性分子克隆(imc)。根據(jù)通過(guò)a3r5細(xì)胞系的測(cè)試，hiv-1imcs代表22種分離株，代表對(duì)中和具有不同程度的敏感性的那些。表5報(bào)告了imcs的列表。表5.用于產(chǎn)生感染的靶細(xì)胞的hiv-1亞型的imc列表。如前所述，所有imcs都是在來(lái)源于nhl4-3分離株的骨架上生成的[edmondstg.virology.2010；408(1):1–13；adachia.jvirol.1986；59(2):284–291]，但是對(duì)于亞型ae92th023，其是使用來(lái)自40021aehiv-1分離株的骨架生成的。所有imcs都表達(dá)海腎屬(renilla)螢光素酶報(bào)告基因，并保留所有9個(gè)病毒開(kāi)放閱讀框。海腎屬熒光素酶報(bào)告基因在hiv-1tat基因的控制下表達(dá)。在hiv-1感染cd4+t細(xì)胞時(shí)，在hiv-1復(fù)制過(guò)程中tat的表達(dá)將誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)，并且可以通過(guò)測(cè)量相對(duì)發(fā)光單位容易地量化感染的細(xì)胞。抗體依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)試驗(yàn)。根據(jù)我們以前發(fā)表的方法，使用基于熒光素酶的平臺(tái)作為由mabs介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的讀出，進(jìn)行測(cè)定[pollaraj.jvirol.2014；88(14):7715–7726]。效應(yīng)細(xì)胞群體全部來(lái)源于在fcγ-riiia的位置158處具有氨基酸的表征的雜合表型f/v的單個(gè)供體。在每個(gè)試驗(yàn)中效應(yīng)子與靶標(biāo)比例為30:1。在每個(gè)試驗(yàn)中，來(lái)自hiv-1感染的個(gè)體(a300)的血漿和帕利珠單抗(抗-rsv)mab用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。針對(duì)每個(gè)imc一起測(cè)試所有mabs。特異性殺傷百分比(％sk)如先前報(bào)告的那樣計(jì)算。如果％sk>20％，則結(jié)果被認(rèn)為是陽(yáng)性的。介導(dǎo)adcc的mab的效力和幅度。針對(duì)表2中列出的22種imcs中的每一種，對(duì)表1中列出的每種mabs單獨(dú)地測(cè)試。結(jié)果已被評(píng)估，以不依賴(lài)于活性被觀(guān)察時(shí)的濃度鑒定作為％sk的最大adcc活性?；谧R(shí)別的envgp120和gp41區(qū)域?qū)abs進(jìn)行分組。每種mab的陽(yáng)性應(yīng)答的平均值報(bào)告在圖1中。mabs的量級(jí)和幅度總結(jié)在表3中。針對(duì)gp120c1和gp41簇1的非中和abs通過(guò)分別識(shí)別21種(95％)和20種(91％)hiv-1分離株提供了最寬的adcc譜。特異性殺傷的平均％(％sk)對(duì)于c1mabs為37％，對(duì)于gp41簇imab為34％。a32和7b2的最大％sk的平均值分別為45和42。累積地，ch44mab識(shí)別<60％的分離株，所述分離株經(jīng)測(cè)試具有21至60％sk之間的活性范圍。表6.介導(dǎo)adcc的mabs的量級(jí)和幅度實(shí)施例2：通過(guò)雙親和力重靶向(dart)分子a32/cd3和7b2/cd3的細(xì)胞殺傷設(shè)計(jì)和表達(dá)雙親和力重靶向分子a32/cd3(seqidnos:9和11)和7b2/cd3(seqidno:13和15)。這些分子包含基于抗-hiv-1單克隆抗體(mabs)的fab生成的hiv-1結(jié)合臂(具有結(jié)合至層(tier)2傳播/奠基者(t/f)病毒感染的cd4t細(xì)胞的表面的性質(zhì)的mabs(即a32或7b2))[ferrarig,jvirol.2011；85(14):7029–7036；pollaraj.curr.hivres.2013；11(8):378–3870]，和效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合臂，其可以結(jié)合cd3(αcd3ε臂)受體或cd16(αcd16h3g8臂)受體。用不相關(guān)的結(jié)合臂[α熒光素(4420)或αrsv]代替hiv-1或效應(yīng)臂的適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出。本實(shí)施例中示出的結(jié)果來(lái)自使用cd3-darts的實(shí)驗(yàn)?；跓晒馑孛傅募?xì)胞毒性試驗(yàn)。我們優(yōu)化了一種量化通過(guò)darts招募的細(xì)胞毒性cd8t細(xì)胞對(duì)hiv-1感染的細(xì)胞的消除的方法，該方法基于作為最終讀出的熒光素酶活性的檢測(cè)，如以前報(bào)告的[pollaraj.jvirol.2014；88(14):7715–7726]。使用抗人cd3(克隆okt3；ebioscience)/抗人cd28(克隆cd28.2；bdpharmingen)將來(lái)自正常健康hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的冷凍保存的靜息pbmc激活72小時(shí)。隨后，使用磁珠獲得cd4+富集的細(xì)胞群，在存在代表hiv-1亞型ae(cm235)、b(bal)和c(1086.c)的imc的情況下離心接種(spinoculated)，并培養(yǎng)72小時(shí)。然后將cd4+感染的靶細(xì)胞與靜息cd8+效應(yīng)細(xì)胞一起以33:1、11:1、3:1和0:1效應(yīng)子與靶標(biāo)比例涂覆。將darts(4420xcd3、7b2xcd3或a32xcd3)以0.001至1000ng/ml范圍的濃度加入到組合的細(xì)胞中，并孵育6、24和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。沒(méi)有darts的組合的效應(yīng)子和靶細(xì)胞、未感染的細(xì)胞和靶細(xì)胞單獨(dú)地被包含在每個(gè)板上，用于對(duì)照條件。在每次孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)，將viviren底物加入每個(gè)孔中，并在光度計(jì)上分析孔以通過(guò)熒光素酶讀出來(lái)測(cè)量rlu值。在目的細(xì)胞毒性細(xì)胞存在的情況下，使用適當(dāng)?shù)囊压_(kāi)的公式評(píng)估對(duì)感染的靶細(xì)胞的消除[pollaraj.jvirol.2014；88(14):7715–7726]。結(jié)果報(bào)告為％sk，如針對(duì)adcc試驗(yàn)所述?？筯iv-1dart介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性?；谏鲜鼋Y(jié)果，產(chǎn)生了兩種darts，其抗-hiv-1臂是a32和7b2fab區(qū)域，效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合臂是αcd3ε臂。我們研究了這兩種dart分子識(shí)別和介導(dǎo)感染的cd4+t細(xì)胞的殺傷的能力。從hiv-1血清反應(yīng)陰性供體獲得的白細(xì)胞去除法樣品在體外被感染，以生成如材料和方法部分所述的靶細(xì)胞，使用我們先前描述的基于adcc熒光素酶的試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)dart的細(xì)胞毒性的影響。我們測(cè)試了兩種cd3-dart分子(7b2xcd3和a32xcd3)針對(duì)亞型bbal、aecm235和c1086.chiv-1imc感染的自體cd4+t細(xì)胞重定向靜息cd8+t細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力。以效應(yīng)子-與-靶標(biāo)比例為33:1、11:1和3:1孵育效應(yīng)子和靶細(xì)胞后6、24和48小時(shí)時(shí)，我們?cè)u(píng)估了dart介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。盡管6小時(shí)孵育后已經(jīng)觀(guān)察到細(xì)胞毒性活性，但使用針對(duì)每種hiv-1imc的33:1e:t比例，在48小時(shí)時(shí)檢測(cè)到峰值細(xì)胞毒性活性(>70％sk)(圖2)。兩種hiv-1darts的活性總是大于使用4420xcd3對(duì)照dart觀(guān)察到的背景最大殺傷。還觀(guān)察到兩種darts針對(duì)每種hiv-1imc感染的靶細(xì)胞群體的劑量依賴(lài)效力，其也以每種e:t比例的水平體現(xiàn)，如對(duì)于balimc所示(圖3)。還分析了兩種darts的效力差異，作為以e:t為33:1在48小時(shí)時(shí)檢測(cè)到50％的特異性殺傷(殺傷濃度50或kc50)的dart濃度。針對(duì)每種hiv-1imc，a32xcd3dartkc50總是比7b2xcd3dartkc50低約一個(gè)對(duì)數(shù)(圖4)。這些結(jié)果表明，darts可以有效地招募cd8+t細(xì)胞并引導(dǎo)其針對(duì)hiv-1感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。實(shí)施例3：a32/cd16和7b2/cd16darts如實(shí)施例6所述使用基于熒光素酶細(xì)胞毒性試驗(yàn)和cd4+感染的靶細(xì)胞以及靜息效應(yīng)細(xì)胞分析雙親和力重靶向分子a32/cd16(seqidno:44和45)和7b2/cd16(seqidno:25和27，見(jiàn)表2)。對(duì)于cd16-dart試驗(yàn)，效應(yīng)細(xì)胞是cd16+細(xì)胞，其可以通過(guò)從全pbmc中除去cd3+cd20+細(xì)胞來(lái)純化。實(shí)施例2中描述的基于熒光素酶的殺傷試驗(yàn)將用于檢查和比較cd16-dart增強(qiáng)的對(duì)生產(chǎn)性感染的清除的效力和動(dòng)力學(xué)，如先前針對(duì)cd3-darts提議的。該過(guò)程是相同的，但效應(yīng)細(xì)胞的陰性選擇將提供富集的cd16+細(xì)胞群。實(shí)施例4：ch28和ch44darts制備了具有hiv-1臂(其ch28或ch44的結(jié)合特異性)和靶向cd3或cd16的效應(yīng)細(xì)胞臂的dart分子，并在基于熒光素酶的殺傷試驗(yàn)中測(cè)試，基本上如在實(shí)施例2和3中所述。ch28或ch44是hiv-1cd4bs中和抗體。見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枺?013年9月27日提交的61/883,220和相應(yīng)的pct申請(qǐng)。ch28/cd3包含seqidno：19和19。ch44/cd3包含seqidno：21和23。實(shí)施例5：cd13-和cd16-darts的組合基于熒光素酶的殺傷試驗(yàn)將用于測(cè)試組合制劑中的cd13-和cd16-dart是否提供增強(qiáng)的益處。對(duì)于每種dart組合，我們將使用表達(dá)3種不同的fcγ-riiia(cd16)表型的細(xì)胞和已建立的imcs的組(panel)來(lái)測(cè)試darts同時(shí)招募cd3+和cd16+效應(yīng)細(xì)胞的能力。使用從hiv-1血清反應(yīng)陰性供體獲得的白細(xì)胞去除法樣品進(jìn)行這些評(píng)價(jià)。本文引用的所有文檔及其他信息源通過(guò)引用以其整體并入本文。實(shí)施例6：雙親和力重靶向(dart)蛋白引導(dǎo)對(duì)潛伏性hiv感染的細(xì)胞的t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解可能需要hiv特異性免疫的增強(qiáng)，以消除潛伏性hiv感染。為此目的，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種新穎的免疫治療方式，雙親和力重靶向(dart)蛋白，其是基于雙特異性抗體的分子，可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同的細(xì)胞表面分子。本文所述的是hivxcd3darts，其被設(shè)計(jì)有單價(jià)hiv-1包膜(env)結(jié)合臂，所述單價(jià)hiv-1包膜(env)結(jié)合臂來(lái)源于已知結(jié)合至hiv-感染的靶細(xì)胞的結(jié)合廣泛、介導(dǎo)adcc的抗體，與被設(shè)計(jì)來(lái)接合溶細(xì)胞的效應(yīng)t細(xì)胞的單價(jià)cd3結(jié)合臂連接。因此，dart重定向多克隆t細(xì)胞，以特異性接合并殺傷表達(dá)env的細(xì)胞，包括受不同hiv-1亞型感染的cd4+t細(xì)胞，從而避免對(duì)hiv特異性免疫的要求。使用來(lái)自進(jìn)行抑制性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(art)的患者的淋巴細(xì)胞，darts介導(dǎo)被hiv-1菌株jr-csf超感染或被分離自hiv-感染的患者靜息cd4+t細(xì)胞的自體儲(chǔ)庫(kù)病毒感染的cd4+t細(xì)胞的體外cd8+t細(xì)胞清除。重要的是，在誘導(dǎo)潛伏性病毒表達(dá)后，dart還介導(dǎo)來(lái)自靜息cd4+t細(xì)胞培養(yǎng)物的hiv的cd8+t細(xì)胞清除。聯(lián)合hiv潛伏期逆轉(zhuǎn)劑，hivxcd3darts有可能成為有效的免疫治療劑來(lái)清除hiv感染的個(gè)體中的潛伏性hiv-1儲(chǔ)庫(kù)。通過(guò)以下過(guò)程表明抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(art)無(wú)法根除hiv：首先通過(guò)證明靜息cd4+t細(xì)胞的潛伏性感染(1)，然后通過(guò)從接收有效art的患者的靜息cd4+記憶t細(xì)胞中恢復(fù)稀有的、整合的、能復(fù)制的hiv(2-4)。目前的art無(wú)法根除hiv感染，因?yàn)檫@些長(zhǎng)壽的cd4+t細(xì)胞仍然持續(xù)性地被感染并且不被免疫系統(tǒng)識(shí)別，其中hiv基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)最少(1,5,6)。休眠的hiv感染的持續(xù)性(主要在中央記憶t細(xì)胞內(nèi))是根除hiv感染的主要障礙(2-4,7-9)。通過(guò)非常低水平的可檢測(cè)病毒rna(10,11)，病毒持續(xù)性也出現(xiàn)在相當(dāng)大比例的治療患者中，所述可檢測(cè)病毒rna代表病毒顆粒的表達(dá)，而沒(méi)有有效輪次的新復(fù)制，并且似乎不會(huì)導(dǎo)致耐藥性或治療失敗(12,13)。然而，持續(xù)的病毒血癥說(shuō)明免疫應(yīng)答無(wú)法識(shí)別和清除hiv-1感染的細(xì)胞。長(zhǎng)期感染的個(gè)體通常在撤銷(xiāo)art時(shí)具有快速的病毒反彈(14-16)。這一觀(guān)察結(jié)果表明，除非受進(jìn)一步干預(yù)的支持，否則患者中的免疫系統(tǒng)不能控制病毒血癥。在cd4+和cd8+細(xì)胞免疫應(yīng)答保持相對(duì)保護(hù)(preserved)的情況下，治療性免疫(即使在啟動(dòng)art的個(gè)體中)迄今為止還沒(méi)有成功地誘導(dǎo)在沒(méi)有art的情況下可以限制病毒血癥的增強(qiáng)的抗hiv免疫力(17)。因此，消除hiv感染細(xì)胞的潛伏庫(kù)(盡管存在art)以及在大部分患者發(fā)現(xiàn)的作為低水平的病毒血癥的源的未知細(xì)胞(盡管存在art)，需要新的創(chuàng)新策略。一個(gè)初步的步驟(在潛伏感染的細(xì)胞中潛伏期的中斷和病毒抗原表達(dá)的誘導(dǎo))被集中研究(18,19)。然而，隨著在開(kāi)發(fā)潛伏期逆轉(zhuǎn)劑(lras)中取得早期進(jìn)展，也必須尋求清除持續(xù)感染能力的改善。潛伏感染的細(xì)胞是非常稀有的，并且即使相比每106個(gè)靜息中央記憶cd4+細(xì)胞約1個(gè)感染細(xì)胞的通常估計(jì)值潛伏庫(kù)多達(dá)60倍(20)，但當(dāng)前的lras可能僅在該群體的一小部分中誘導(dǎo)前病毒轉(zhuǎn)錄，并且所呈遞的病毒抗原的數(shù)量可能較低(21,22)。因此，可能需要一種新穎而有力的免疫應(yīng)答來(lái)檢測(cè)和清除產(chǎn)生低水平病毒血癥的細(xì)胞，以及被誘導(dǎo)離開(kāi)潛伏狀態(tài)的休眠的感染細(xì)胞兩者。在潛伏性hiv的再活化之后，病毒抗原呈現(xiàn)在細(xì)胞的表面上，因此可以被抗體或衍生抗體的分子靶向。由免疫毒素(由與毒素效應(yīng)結(jié)構(gòu)域連接的靶向結(jié)構(gòu)域(諸如抗體或配體)組成的雙功能嵌合蛋白)提供這種方法的概念的證據(jù)(23)。盡管在hiv感染的個(gè)體中使用免疫毒素的初步臨床試驗(yàn)未能對(duì)免疫學(xué)或臨床標(biāo)記物持續(xù)產(chǎn)生影響(24)，但據(jù)報(bào)告，免疫毒素3b3-pe38(25)在blt人源化小鼠模型中減少持續(xù)存在的hiv感染的細(xì)胞的水平，盡管存在art(26)。已經(jīng)報(bào)告了幾種單克隆抗體(mabs)能夠識(shí)別hiv-1感染的細(xì)胞并且接合攜帶fc-γ受體的細(xì)胞，以介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞細(xì)胞毒性(adcc)(27)，諸如a32和7b2、分別結(jié)合gp120(28)和gp41(29,30)中保守殘基的非-中和mab?；谶@些性質(zhì)，生成了兩種雙親和力重靶向(dart)蛋白(31,32)，其中來(lái)源于a32和7b2mabs的hiv包膜靶向臂與來(lái)源于hxr32(一種人源化的抗--cd3εmab)的cd3效應(yīng)臂組合，以產(chǎn)生兩種hivxcd3darts(a32xcd3和7b2xcd3)(圖10)。已經(jīng)表征并開(kāi)發(fā)了主要用于腫瘤學(xué)的(31-34)、將t細(xì)胞與表達(dá)抗原的靶細(xì)胞共接合的雙特異性分子，如darts和雙特異性t細(xì)胞接合蛋白(bites)。它們依賴(lài)于兩種結(jié)合臂的接合，以主要組織相容性復(fù)合體(mhc)獨(dú)立的方式，激活并重定向多克隆t細(xì)胞針對(duì)表達(dá)抗原的靶細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(31-34)。在相比通常用于mabs的劑量(33,34)低許多倍的劑量，這類(lèi)雙特異性分子在體內(nèi)是有效的，并且已證明其是臨床有效和有用的，具有可接受的安全性，如通過(guò)批準(zhǔn)利妥木單抗(blinatumumab)(一種cd19xcd3bite)用于治療復(fù)發(fā)性或難治性前體b急性成淋巴細(xì)胞白血病(all)所證明的(35,36)。darts在其c-末端具有鏈間二硫鍵并且結(jié)構(gòu)緊湊，使得它們非常適合于在靶和效應(yīng)細(xì)胞之間形成穩(wěn)定的細(xì)胞-與-細(xì)胞聯(lián)系，在并排比較中展現(xiàn)出比bites更大的效力(32,37)。本文公開(kāi)的是hivxcd3dart使cd8+t細(xì)胞針對(duì)hiv-1感染的cd4+細(xì)胞重定向的能力，所述hiv-1感染的cd4+細(xì)胞包括被真正的潛伏性病毒分離株感染的那些細(xì)胞，所述真正的潛伏性病毒分離株在被設(shè)計(jì)來(lái)模擬潛在的臨床hiv根除策略的模型系統(tǒng)中從hiv感染的患者的細(xì)胞中出現(xiàn)。hivxcd3darts識(shí)別感染細(xì)胞上的保守的hiv-1抗原并同時(shí)接合多克隆效應(yīng)t細(xì)胞膜上的受體的能力，將戰(zhàn)勝激活預(yù)先存在的hiv特異性細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞的需要(38)，從而克服妨礙有效消除感染的cd4+t細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù)的重大障礙。darts的hiv臂選擇。a32mab與gp120c1/c2中的cd4可誘導(dǎo)的構(gòu)象表位結(jié)合(在表位簇a內(nèi))(28,39-41)，并且，7b2mab與gp41簇i中的線(xiàn)性表位結(jié)合(29,30,42)。測(cè)試這兩種mabs針對(duì)亞型a、ae、b和c的22種代表性hiv-1感染性分子克隆(imcs)的組介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)的能力(圖18)。a32mab識(shí)別了21種(95％)hiv-1分離株，平均特異性裂解百分比(％sl)為43.69％(范圍12-86％；圖23)。7b2mab識(shí)別了20種(91％)hiv-1分離株，平均％sl為39.58％(范圍為15-74％；圖23)。除了擁有介導(dǎo)adcc的幅度和效率——指示hiv感染的細(xì)胞表面的表位可及性——之外，hivxcd3darts——a32和7b2mabs——的必要性質(zhì)是用于dart的env結(jié)合結(jié)構(gòu)域的有吸引力的源，因?yàn)橛绊戇@些mabs的結(jié)合的env中的殘基在所有hiv-1亞型中是高度保守的(圖24)?；谶@些性質(zhì)，生成了兩種hivxcd3darts，其中來(lái)源于a32和7b2mabs的hiv靶向臂與來(lái)源于人源化抗-cd3εmab的hxr32的cd3效應(yīng)臂組合(圖10a-10c)。這些hivxcd3darts被命名為a32xcd3和7b2xcd3。也生成了對(duì)照darts，其用來(lái)源于抗-fitc抗體(4420)或來(lái)源于帕利珠單抗(一種呼吸道合胞病毒(rsv)融合蛋白抗體的抗體)的不相關(guān)的臂代替hiv臂(4420xcd3、rsvxcd3)或cd3臂(a32x4420、7b2x4420)。也生成了對(duì)照darts，其用來(lái)源于抗-fitc抗體(4420)或來(lái)源于帕利珠單抗(一種呼吸道合胞病毒(rsv)融合蛋白抗體的抗體)的不相關(guān)的臂代替hiv臂(4420xcd3和rsvxcd3)或cd3臂(a32x4420和7b2x4420)。hivdart結(jié)合性質(zhì)。a32xcd3和7b2xcd3各自(單獨(dú)地和同時(shí)地)表現(xiàn)出與重組人cd3和hiv-1env蛋白的結(jié)合，如elisa所示(圖11a-11c)。雖然兩種darts與cd3蛋白的結(jié)合相似，但是對(duì)于7b2xcd3，與jr-flgp140cf的結(jié)合的量級(jí)比a32xcd3與jr-flgp140cf的結(jié)合的量級(jí)更大，這可能是由于構(gòu)象a32表位是cd4高度依賴(lài)性的(41-44)。基于表面等離子體共振(spr)，a32xcd3和7b2xcd3的cd3臂結(jié)合的平衡解離常數(shù)(kd)分別為3.6和6.1nm，并且對(duì)于使用m.consgp140cfi的a32xcd3以及使用jr-flgp140cf的7b2xcd3，hiv臂結(jié)合的kd分別為47.7nm和15.1nm(圖19)。由于與jr-flgp140cf結(jié)合的a32xcd3效率低下，并且與m.consgp140cfi結(jié)合的7b2xcd3由于缺乏gp41簇i序列而被排除，因此不同的env蛋白在spr研究中用于這兩種darts。hivxcd3darts以特異性結(jié)合其細(xì)胞表面抗原。具有cd3效應(yīng)臂的darts(a32xcd3、7b2xcd3、4420xcd3)以相似的效率結(jié)合人cd3+t細(xì)胞，而cd3臂被不相關(guān)的臂取代(a32x4420、7b2x4420)或具有兩個(gè)不相關(guān)的臂(4420x4420)的darts不結(jié)合(圖11d)。hivxcd3darts(a32xcd3、7b2xcd3)有效結(jié)合表達(dá)亞型aecm244env的hek293-d371細(xì)胞(圖11e)，并通過(guò)a32x4420和7b2x4420對(duì)照darts觀(guān)察到相似的結(jié)合活性(圖25)。如預(yù)期的，4420xcd3對(duì)照dart不與這些細(xì)胞結(jié)合(圖11e)。a32xcd3和7b2xcd3結(jié)合jurkat-522f/y細(xì)胞，所述jurkat-522f/y細(xì)胞表達(dá)cd3和亞型bhxbc2env(45)，并且如通過(guò)4420xcd3、a32xcd3和7b2xcd3結(jié)合的等同物(equivalence)所顯示的，經(jīng)cd3臂的結(jié)合占主導(dǎo)地位。當(dāng)cd3臂被不相關(guān)的4420臂取代以消除cd3結(jié)合時(shí)，用a32x4420而不是用7b2x4420檢測(cè)到與細(xì)胞表面env的低水平結(jié)合(圖11f)。hivxcd3dart對(duì)表達(dá)env的細(xì)胞系的重定向t-細(xì)胞殺傷以及伴隨的t-細(xì)胞活化。jurkat522-f/y是表達(dá)env并作為hiv感染的cd4+t細(xì)胞的模型的人cd4+細(xì)胞系，并且，jurkat-δks是相同的對(duì)照細(xì)胞系，除了在env基因中妨礙其表達(dá)的刪除/移碼突變(45)。這些細(xì)胞系用于評(píng)估hivxcd3darts介導(dǎo)對(duì)env+靶細(xì)胞的重定向t細(xì)胞殺傷的能力。通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測(cè)量乳酸脫氫酶(ldh)釋放來(lái)測(cè)定靶細(xì)胞裂解，并通過(guò)發(fā)光(lum)試驗(yàn)確認(rèn)結(jié)果。如通過(guò)ldh釋放試驗(yàn)測(cè)量的，a32xcd3和7b2xcd3重定向來(lái)源于健康供體的人t細(xì)胞，從而以濃度依賴(lài)性方式，以10:1的e:t比，殺傷jurkat-522f/y細(xì)胞，并且這兩種hivxdarts在以50％有效濃度(ec50)為160-230pg/ml孵育48小時(shí)后，表現(xiàn)相似的效力(圖12a)。通過(guò)對(duì)照darts(4420xcd3、a32x4420、7b2x4420)，其中hiv臂或cd3臂被不相關(guān)的臂取代，沒(méi)有發(fā)生dart介導(dǎo)的對(duì)jurkat-522f/y細(xì)胞的重定向t細(xì)胞殺傷(圖12a)。當(dāng)沒(méi)有效應(yīng)t細(xì)胞時(shí)(圖12b)或當(dāng)靶細(xì)胞缺乏env表達(dá)時(shí)(圖12c)，a32xcd3和7b2xcd3darts不介導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷。這些數(shù)據(jù)表明為了hivxcd3dart介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性而對(duì)于表達(dá)env的靶細(xì)胞及其與表達(dá)cd3的效應(yīng)細(xì)胞的共接合的嚴(yán)格要求。如通過(guò)lum試驗(yàn)測(cè)量的，a32xcd3和7b2xcd3對(duì)于jurkat522-f/ygf細(xì)胞的重定向t細(xì)胞殺傷以ec50值為140-170pg/ml顯示相似的效力(圖12d)，這與通過(guò)ldh釋放試驗(yàn)測(cè)量的那些接近，表明兩種不同試驗(yàn)方式的一致性。此外，以lum試驗(yàn)的靈敏度和特異性，env+靶細(xì)胞的dart依賴(lài)性消除幾乎是完全的(>98％)，而4420xcd3對(duì)照dart不介導(dǎo)細(xì)胞毒性(圖12d)。hivxcd3dart重定向的t細(xì)胞殺傷活性是時(shí)間依賴(lài)性和e:t比依賴(lài)性的。用7b2xcd3，在10:1和5:1的e:t比，48小時(shí)時(shí)達(dá)到幾乎完全的細(xì)胞裂解，而在e:t比為1:1時(shí)，高水平細(xì)胞裂解(>80％)延遲到72小時(shí)(12e-12h)，表明時(shí)間是在較低e:t細(xì)胞比時(shí)有效消除靶細(xì)胞的限制因素。伴隨著重定向的t細(xì)胞殺傷活性，hivxcd3darts在env+靶細(xì)胞的存在下誘導(dǎo)t細(xì)胞活化(通過(guò)活化標(biāo)記物cd25的上調(diào)測(cè)量)，其中在cd8+t細(xì)胞中cd25上調(diào)的程度高于在cd4+t細(xì)胞中的上調(diào)程度(圖26a-26d)。總體數(shù)據(jù)表明，a32xcd3和7b2xcd3有效地激活并重定向t細(xì)胞(尤其是cd8+t細(xì)胞)以特異性殺傷表達(dá)env的靶細(xì)胞。此外，殺傷數(shù)據(jù)證實(shí)，即使通過(guò)facs分析對(duì)env結(jié)合的檢測(cè)是微不足道的，但兩種darts都能識(shí)別和結(jié)合cd4+細(xì)胞系表面上的env抗原(圖13f)。hivxcd3darts結(jié)合hiv感染的cd4+t細(xì)胞的表面，并使用來(lái)自hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的淋巴細(xì)胞重定向cd8+t細(xì)胞以殺傷hiv-1感染的cd4+細(xì)胞。評(píng)估a32x4420和7b2x4420darts結(jié)合和重定向?qū)iv-1感染性分子克隆(代表亞型aecm235，亞型bbal和亞型c1086.chiv-1分離株)感染的cd4+t細(xì)胞的殺傷的能力。用熒光素酶報(bào)告基因工程化每個(gè)imc，以定量測(cè)量感染的靶細(xì)胞的細(xì)胞裂解。為了評(píng)價(jià)與受感染的細(xì)胞表面env的結(jié)合，將a32x4420和7b2x4420darts(其缺少cd3效應(yīng)臂)與親本a32和7b2mabs進(jìn)行比較。觀(guān)察到兩種hivxcd3darts對(duì)p24+(感染的)cd4+t細(xì)胞相似的染色(不依賴(lài)于用于感染的hiv-1imc)(圖27)。有趣的是，通過(guò)a32x4420dart的染色接近地重現(xiàn)通過(guò)a32mabs的染色；相比之下，7b2x4420dart識(shí)別>66％的hiv-1感染的細(xì)胞(范圍66-78％)，而7b2mab識(shí)別>24％(范圍24-38)，表明dart與mab相比具有對(duì)簇igb41表位更好的可及性(圖27)。用作對(duì)照的二次綴合的abs和帕利珠單抗mab識(shí)別小于<5％的hiv-1感染的cd4+t細(xì)胞。隨后研究了a32xcd3和7b2xcd3針對(duì)用三種hiv-1imcs感染的自體cd4+t細(xì)胞重定向來(lái)自hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的cd8+t細(xì)胞的能力。兩種hivxcd3darts以濃度依賴(lài)性方式重定向自體cd8+t效應(yīng)細(xì)胞以殺傷亞型bbal(圖13a)、亞型aecm235(圖13b)和亞型c1086.c(圖13c)imc感染的cd4+靶細(xì)胞，而對(duì)照dart(4420xcd3)是無(wú)活性的。在用imc感染的cd4+細(xì)胞的這些研究中，與7b2xcd3()相比，a32xcd3(ec50≤1ng/ml)表現(xiàn)更強(qiáng)的效力，這與在用env+細(xì)胞系的研究中觀(guān)察到的相似效力形成對(duì)比(圖12a-12c)。dart介導(dǎo)的對(duì)imc感染的cd4+t細(xì)胞的殺傷依賴(lài)于cd8+效應(yīng)細(xì)胞的存在，并且在它們不存在時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到細(xì)胞溶解活性(圖13a-13c)。在時(shí)間過(guò)程研究中，在6小時(shí)時(shí)，dart依賴(lài)性細(xì)胞溶解活性是明顯的，48小時(shí)時(shí)具有最大活性(>70％細(xì)胞裂解)(圖13d-13f)。為了獲得對(duì)由darts招募的效應(yīng)t細(xì)胞殺傷hiv-1感染的靶細(xì)胞的頻率的理解，評(píng)價(jià)了在用于檢測(cè)細(xì)胞溶解活性的相同條件下與自體hiv-1balimc感染的cd4+細(xì)胞共孵育時(shí)，darts誘導(dǎo)從5個(gè)hiv-1血清反應(yīng)陰性供體獲得的cd8+t細(xì)胞脫粒的能力。對(duì)于數(shù)據(jù)分析采用的設(shè)門(mén)策略的實(shí)施例在圖14a-14g中顯示。在對(duì)照條件下(不存在hivxcd3dart或存在對(duì)照dart)，活的/cd3+/cd8+/cd107+細(xì)胞(圖14h)的平均頻率為0.38％(標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10％；范圍為0.24-0.51)，其在1ng/ml7b2xcd3或a32xcd3存在時(shí)，分別增加至平均為3.53％(范圍1.5-6.9％)或18.23％(范圍12.30-23.35％)。數(shù)據(jù)表明，在表達(dá)env的靶細(xì)胞(自體hiv-1感染的cd4+t細(xì)胞)存在時(shí)，hivxcd3darts可以特異性地誘導(dǎo)靜息cd8+t細(xì)胞的脫粒。hivxcd3dart針對(duì)來(lái)自血清反應(yīng)陰性供體的jr-csf感染的細(xì)胞的重定向cd8+t細(xì)胞殺傷活性。使用測(cè)量hivgagp24抗原生產(chǎn)的病毒清除試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)dart重定向的t細(xì)胞殺傷活性的替代方法。來(lái)自健康供體的cd4+細(xì)胞用hiv-1分化枝b克隆jr-csf進(jìn)行超感染，并在不存在或存在100ng/mldarts時(shí)，以1:1的e:t比與自體cd8+t細(xì)胞一起孵育7天。在使用兩種不同供體的實(shí)驗(yàn)中，與在不存在darts的情況下進(jìn)行的孵育相比，添加對(duì)照dart(4420xcd3)沒(méi)有顯著減少p24生產(chǎn)，而添加a32xcd3或7b2xcd3以相似程度顯著減少p24生產(chǎn)(分別減少72-96％或87-99％；p<0.01，學(xué)生t檢驗(yàn)；圖15a-15b)。一旦感染建立，則在加入效應(yīng)細(xì)胞和darts時(shí)，在存在整合酶和非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的情況下還進(jìn)行病毒清除試驗(yàn)，以阻斷更多輪的感染。當(dāng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物(antiretroviral)(arvs)被包括在該試驗(yàn)中時(shí)，a32xcd3和7b2xcd3仍然介導(dǎo)了p24生產(chǎn)降低的趨勢(shì)，盡管可能由于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的基線(xiàn)p24生產(chǎn)的低水平而沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖15c)，這表明darts不是通過(guò)抑制病毒傳播而是通過(guò)感染細(xì)胞的清除來(lái)起作用。使用來(lái)自處于抑制性art的患者的淋巴細(xì)胞，hivxcd3darts重定向cd8+t-細(xì)胞以清除jr-csf超感染的cd4+細(xì)胞。慢性art的特征在于功能障礙和消耗的t細(xì)胞應(yīng)答(46,47)，因此在體外對(duì)患者樣品中有力的dart介導(dǎo)的t細(xì)胞重定向清除活性的確認(rèn)至關(guān)重要。評(píng)估hivxcd3darts在病毒清除試驗(yàn)中的活性，其中淋巴細(xì)胞來(lái)自8名處于抑制性art的hiv感染個(gè)體。所有參與者在研究時(shí)處于art達(dá)至少6個(gè)月，病毒載量<50拷貝/ml，否則表現(xiàn)出不同的臨床背景(圖20)。因?yàn)閬?lái)自hiv-1血清反應(yīng)陽(yáng)性受試者的t細(xì)胞比來(lái)自血清反應(yīng)陰性受試者的細(xì)胞更易于凋亡(48)，評(píng)價(jià)了在不存在靶細(xì)胞的情況下，hivxcd3darts是否可能影響t-細(xì)胞存活力(這可能會(huì)使dart活性的分析與患者細(xì)胞混淆)進(jìn)行了評(píng)估。在存在100ng/mldart的情況下(其模擬病毒清除試驗(yàn)條件)，來(lái)自hiv感染的、art-抑制的患者的cd4+或cd8+t細(xì)胞培養(yǎng)7天后，基于膜聯(lián)蛋白v/7aad染色，沒(méi)有觀(guān)察到t細(xì)胞存活力的下降(圖28a-28b)。此外，在用hivxcd3或?qū)φ誨arts培養(yǎng)后，未觀(guān)察到未刺激的cd4+或cd8+t細(xì)胞上的活化標(biāo)記物(hla-dr、cd25)的變化(圖28c-28d)，表明僅cd3臂的接合不能在體外激活患者的cd8+或cd4+t細(xì)胞。使用來(lái)自處于抑制性art的8名hiv患者的淋巴細(xì)胞進(jìn)行病毒清除試驗(yàn)，其中cd4+細(xì)胞用hiv-1jr-csf(靶細(xì)胞)進(jìn)行超感染，并以0:1、1:10或1:1的e：t比在不存在或存在100ng/mldarts的情況下與自體cd8+細(xì)胞(效應(yīng)子)一起孵育7天。hivxcd3dart活性甚至在沒(méi)有添加的cd8+t細(xì)胞的情況下發(fā)生，表明在這些實(shí)驗(yàn)條件下，cd4+t細(xì)胞可以被招募為效應(yīng)細(xì)胞；與對(duì)照相比，p24的生產(chǎn)通過(guò)7b2xcd3減少了0.89log(p<0.05)，通過(guò)a32xcd3降低了0.32log(p＝ns)，通過(guò)兩種darts的1:1混合物降低了0.81(p<0.05)(圖16a)。事實(shí)上，當(dāng)存在感染的靶細(xì)胞時(shí)，添加完全激活的darts導(dǎo)致cd4+t細(xì)胞顯著增加的脫粒(圖16g、16h)。作為效應(yīng)子的cd8+t細(xì)胞的添加導(dǎo)致p24水平進(jìn)一步降低；與以1:10的e:t僅用cd8+t細(xì)胞觀(guān)察的0.13log相比，用7b2xcd3，p24生產(chǎn)減少1.2log(p<0.05)，用a32xcd3減少0.6log(p＝ns)，用兩種darts的混合物減少1.8log(p<0.05)(圖16b)。以1:1的更高e:t比，觀(guān)察到甚至更明顯的降低，其中僅cd8s導(dǎo)致0.7log降低，但是p24生產(chǎn)通過(guò)7b2xcd3降低2.8log(p<0.05)，通過(guò)a32xcd3降低1.6log(p＝ns)，和通過(guò)兩種darts的混合物降低2.8log(p<0.05)(圖16c)。即使在沒(méi)有任何可檢測(cè)到的基線(xiàn)cd8t細(xì)胞抗病毒活性的情況下，也可見(jiàn)顯著的降低，并且在三種情況下，用darts孵育后(患者749用兩種完全激活的darts，和患者720和725用7b2xcd3)，沒(méi)有病毒能夠被恢復(fù)。絕對(duì)的hivgagp24抗原值在圖21中提供。使用來(lái)自處于抑制性art的患者的淋巴細(xì)胞，hivxcd3darts重定向cd8+t細(xì)胞以清除自體儲(chǔ)庫(kù)病毒(ar)-超感染的cd4+細(xì)胞。通過(guò)采用來(lái)自5名患者的自體儲(chǔ)庫(kù)病毒(ar)-感染的cd4+靶細(xì)胞的病毒清除試驗(yàn)(圖16d-16f)，評(píng)估darts針對(duì)源自潛伏庫(kù)的表達(dá)env序列的靶細(xì)胞而重定向t細(xì)胞能力。由有絲分裂原刺激的靜息cd4+t細(xì)胞的有限稀釋培養(yǎng)物的匯集的上清液產(chǎn)生患者ar病毒分離株，以體現(xiàn)潛伏性病毒再活化后體內(nèi)可能遇到的病毒的多樣性。盡管ar病毒分離株的多樣性，dart活性反映了用jr-csf-感染的靶細(xì)胞所見(jiàn)的活性。在不存在cd8+效應(yīng)子的情況下，用ar-感染的靶細(xì)胞觀(guān)察到適度的活性(因此歸因于cd4+t細(xì)胞；圖16d)，其中通過(guò)7b2xcd3，p24生產(chǎn)減少0.32log，通過(guò)a32xcd3減少0.20log(p＝ns.由于對(duì)7b2xcd3的應(yīng)答的更高的方差)和通過(guò)兩種darts的1:1混合物減少0.51log(p<0.05)，而通過(guò)對(duì)照darts沒(méi)有觀(guān)察到活性(圖16d)。將hivxcd3darts添加至ar病毒-感染的cd4+靶細(xì)胞和自體cd8+效應(yīng)細(xì)胞的混合中導(dǎo)致p24生產(chǎn)的顯著增強(qiáng)的降低。在1:10的e:t比，與單獨(dú)用cd8+細(xì)胞僅減少0.02log相比，p24生產(chǎn)通過(guò)7b2xcd3減少0.51log(p<0.05)，通過(guò)a32xcd3減少0.37log，和通過(guò)兩者的1:1混合物減少0.79log(p<0.05)(圖16e)。在1:1的較高e:t比，也可以看到在hivxcd3darts存在時(shí)p24生產(chǎn)降低的趨勢(shì)，但這種效果的量級(jí)通過(guò)在不存在darts時(shí)看到的可變的基線(xiàn)cd8+活性而被減少(圖16f)。值得注意的是，用來(lái)自所有5名患者的淋巴細(xì)胞觀(guān)察到離體dart活性，所述dart活性用兩種hivxcd3darts中的至少一種進(jìn)行評(píng)估，并且在所有的情況下用1:1的dart混合物。hivxcd3darts重定向來(lái)自處于抑制性art的hiv-感染的個(gè)體的t細(xì)胞，以在誘導(dǎo)潛伏性病毒表達(dá)后從靜息cd4+t細(xì)胞中清除病毒。最終，用于“休克和殺傷”hiv根除策略的劑必須識(shí)別和清除稀有感染細(xì)胞，所述稀有感染細(xì)胞在從潛伏期出現(xiàn)時(shí)可能表達(dá)低水平的抗原。如前所述(49)，采用潛伏清除試驗(yàn)。該試驗(yàn)涉及測(cè)量darts重定向自體cd8+t細(xì)胞以在誘導(dǎo)處于抑制性art的hiv-感染的個(gè)體的靜息cd4+t細(xì)胞后降低病毒恢復(fù)的能力。以1:10的e:t比將完全激活的darts或a32xcd3和7b2xcd3的1:1混合物添加至cd8+t細(xì)胞與pha刺激的靜息cd4+t細(xì)胞的共培養(yǎng)物，在6名患者的所有6例中都降低病毒恢復(fù)，盡管患者的降低的量級(jí)不盡相同(圖17a，22)。使用體內(nèi)最大有絲分裂原刺激的hiv潛伏期的逆轉(zhuǎn)在臨床上是不實(shí)用的(50)。然而，使用不導(dǎo)致整體t細(xì)胞活化的劑(諸如伏立諾他(vor))逆轉(zhuǎn)潛伏期后，病毒抗原的呈遞比最大有絲分裂原刺激后的呈遞更不穩(wěn)健。為了在臨床相關(guān)環(huán)境下評(píng)估hivxcd3darts，使用對(duì)vor的生理相關(guān)暴露以誘導(dǎo)潛伏病毒包膜表達(dá)，所述生理相關(guān)暴露模擬單一400mg體內(nèi)劑量(18)后獲得的暴露。在這種情形下，以1:10的e:t比添加cd8+細(xì)胞以及完全激活的darts，在24小時(shí)共培養(yǎng)期后，當(dāng)與5名測(cè)試患者中的4名中不具有或具有對(duì)照darts的cd8+細(xì)胞相比時(shí)，其導(dǎo)致病毒恢復(fù)的降低。在24小時(shí)共培養(yǎng)期后沒(méi)有對(duì)darts應(yīng)答的單個(gè)患者(患者795)中，將共培養(yǎng)期從24小時(shí)延伸至96小時(shí)，導(dǎo)致病毒恢復(fù)的徹底消除(圖17b,22)。討論在消除潛伏性hiv-1儲(chǔ)庫(kù)中的重大障礙包括：1)在用潛伏逆轉(zhuǎn)劑(lra)誘導(dǎo)之前或之后，免疫系統(tǒng)識(shí)別呈遞適度水平的hiv抗原的稀有hiv-1感染的細(xì)胞的有限能力(38，51)；2)hiv-1潛伏庫(kù)中存在cd8+細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞逃逸突變體(52)；和3)在處于art的患者中循環(huán)性hiv-特異性cd8+t細(xì)胞的低頻率，并且由于感染細(xì)胞提供的不足刺激而需要激活它們(38)。本文所述的是hivxcd3darts可以克服這些主要阻礙的數(shù)據(jù)。具有來(lái)源于非中和mabsa32和7b2的hiv臂的hivxcd3darts能夠識(shí)別表達(dá)hiv-1env的細(xì)胞系并引起重定向t-細(xì)胞殺傷活性，即使在細(xì)胞表面env表達(dá)看起來(lái)低的時(shí)候。此外，hivxcd3darts在重定向cd8+t細(xì)胞以清除對(duì)vor暴露后從art-治療的病毒血癥(aviremic)患者獲得的靜息cd4+t細(xì)胞是離體有效的。據(jù)報(bào)告潛伏庫(kù)中代表的hiv-1分離株包括由cd8+t細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生的逃逸突變體(52)，這可限制由自然感染誘導(dǎo)的mhc類(lèi)i-限制的cd8+ctl應(yīng)答清除hiv-1感染的細(xì)胞的能力。hivxcd3darts的a32和7b2臂基于廣泛反應(yīng)的非中和抗-hivmabs，其分別與gp120和gp41中的高度保守的殘基相互作用，并且有效地介導(dǎo)針對(duì)受各種亞型的hiv-1分離株感染的細(xì)胞的adcc活性。值得注意的是，a32mab表位是已知在合胞體形成過(guò)程中(53)或在層2病毒感染后(54)在受感染細(xì)胞表面上表達(dá)的最早的表位，并且7b2mab表位在gp41枝干(stumps)上易接近，其在芽殖期間在受感染細(xì)胞的表面上表達(dá)，并且當(dāng)gp120亞基解離時(shí)保留在膜表面(29,55)。這些性質(zhì)表示a32和7b2表位在受感染細(xì)胞表面上的可及性。重要的是，ctl逃逸突變體的存在并不是限制，因?yàn)閏tl表位與dart-介導(dǎo)的重定向殺傷活性是不相關(guān)的。此外，雙特異性分子(如darts)招募的效應(yīng)t細(xì)胞是多克隆的，而不是mhc-限制的(33)。與這些主張一致，a32xcd3和7b2xcd3在重定向來(lái)自患者的cd8+t細(xì)胞以清除由其自身的自體儲(chǔ)庫(kù)(ar)病毒感染的cd4+細(xì)胞方面是有效的，不管是否存在在開(kāi)始治療前可能已經(jīng)累積的任何逃逸突變體(52)。有趣的是，在體外活化用作靶細(xì)胞的cd4+t細(xì)胞后，在不存在cd8+t細(xì)胞的情況下觀(guān)察到病毒恢復(fù)的具體降低，這表明darts也可以在這些具體實(shí)驗(yàn)條件下招募細(xì)胞毒性cd4+t細(xì)胞。根據(jù)這些，發(fā)現(xiàn)darts在存在表達(dá)env的jurkat-522f/y細(xì)胞的情況下誘導(dǎo)cd4+t細(xì)胞的活化，并且當(dāng)與來(lái)自hiv陽(yáng)性個(gè)體的受感染的自體靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)能夠增加cd4+t細(xì)胞的脫粒。在對(duì)hiv-1(56)和巨細(xì)胞病毒(57)應(yīng)答的背景下已經(jīng)被報(bào)告了細(xì)胞毒性cd4+t細(xì)胞。需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定在體內(nèi)環(huán)境中是否發(fā)生有效的dart招募和細(xì)胞毒性cd4+t細(xì)胞的重定向。a32xcd3和7b2xcd3darts的相對(duì)效力在我們的研究中應(yīng)用的不同測(cè)試系統(tǒng)之間是不同的，很可能是由于表達(dá)env的靶細(xì)胞和/或效應(yīng)t細(xì)胞的特征的變化。然而，每當(dāng)darts的其中一個(gè)表現(xiàn)出比另一個(gè)更大的活性時(shí)，在用受感染的患者細(xì)胞的研究中使用兩種darts的組合時(shí)，一貫地觀(guān)察到與更有效的dart的活性相似的活性(圖16a-16h和17a-17b)。因此，靶向不同hiv表位的darts的組合可能是最大化活性的水平和幅度兩者的有利策略，這與針對(duì)介導(dǎo)adcc的(58)或廣泛地中和抗-hiv-1mabs的組合所描述的相似(59,60)。通過(guò)hiv-1特異性cd8+t細(xì)胞應(yīng)答消除潛伏感染的細(xì)胞池受到被感染個(gè)體中這些細(xì)胞的低頻率的限制以及從靜息狀態(tài)激活它們的需要的限制(38)。用來(lái)自先前沒(méi)有對(duì)hiv-1抗原的任何暴露的hiv-1血清反應(yīng)陰性個(gè)體的靜息cd8+t細(xì)胞，當(dāng)與預(yù)定要被殺傷的自體hiv-1感染的靶細(xì)胞一起孵育時(shí)，hivxcd3darts誘導(dǎo)這些靜息cd8+t細(xì)胞的高達(dá)23％的脫粒。dart還能夠重定向來(lái)自在病毒清除試驗(yàn)中接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的hiv-1血清反應(yīng)陽(yáng)性個(gè)體的cd8+t細(xì)胞。因此，hivxcd3dart蛋白可以有效地招募并重定向cd8+t細(xì)胞毒性細(xì)胞，而不依賴(lài)于對(duì)hiv抗原的先前暴露，且不論在慢性hiv-1感染中可能保留的任何功能傷害(46,47,61)。針對(duì)表達(dá)hiv-1env的靶標(biāo)的dart重定向的t細(xì)胞活性依賴(lài)于hivxcd3dart濃度，效應(yīng)子：靶(e:t)細(xì)胞比和孵育時(shí)間。hivxcd3dart分子的每個(gè)結(jié)合臂的單價(jià)性質(zhì)確保靶細(xì)胞殺傷僅僅取決于效應(yīng)/靶細(xì)胞共接合，如用cd19xcd3和其他darts所觀(guān)察到的(31,32,34)。在靶細(xì)胞上不存在env表達(dá)時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到hivxcd3dart介導(dǎo)的t細(xì)胞活化或重定向殺傷活性。類(lèi)似地，用來(lái)自處于抑制性art的hiv感染的患者的t細(xì)胞，在不存在病毒感染的靶細(xì)胞的情況下，沒(méi)有觀(guān)察到t細(xì)胞活化。因?yàn)樗鼈儜?yīng)該僅在hiv-1感染的表達(dá)env的靶細(xì)胞附近從循環(huán)t細(xì)胞引起細(xì)胞毒性活性，不預(yù)期hivxcd3darts在處于art的hiv感染的患者中引起普遍的系統(tǒng)性影響，諸如炎性細(xì)胞因子的釋放，這是由于表達(dá)env的靶細(xì)胞的不足?？紤]到hiv感染在hiv-1特異性t-細(xì)胞亞群中以及在一般的cd8+t細(xì)胞群體中在疾病的急性期和慢性期都誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的非特異性活化，由hivxcd3darts引起的t-細(xì)胞重定向應(yīng)答的特異性在臨床上將是至關(guān)重要的(62-64)。表達(dá)細(xì)胞表面env的hiv-感染的cd4+t細(xì)胞是hivxcd3dart-重定向t細(xì)胞殺傷活性的主要體內(nèi)靶標(biāo)。因?yàn)檫@些靶細(xì)胞也表達(dá)cd3，所以dart分子可以介導(dǎo)感染的和未感染的cd4+t細(xì)胞之間的突觸，這(不是重定向?qū)κ芨腥炯?xì)胞的殺傷或除了重定向?qū)κ芨腥炯?xì)胞的殺傷以外還)令人信服地可促進(jìn)病毒向未感染細(xì)胞的擴(kuò)散。然而，沒(méi)有證據(jù)表明觀(guān)察到darts增強(qiáng)了病毒的擴(kuò)散，因?yàn)榧词乖诓淮嬖赾d8+t細(xì)胞的情況下，darts也降低p24生產(chǎn)(圖16a和16d)?？傊疚乃龅膶?shí)驗(yàn)證明，具有來(lái)源于非中和a32和7b2mabs的hiv臂的hivxcd3darts是針對(duì)由以下組成的靶細(xì)胞重定向溶細(xì)胞t-細(xì)胞的特異性的和有效的劑：1)表達(dá)hiv-1env的cd4+細(xì)胞系，2)來(lái)自受不同亞型的hiv-1imcs感染的血清反應(yīng)陰性個(gè)體的激活的cd4+細(xì)胞，3)來(lái)自受jr-csf或自體儲(chǔ)庫(kù)病毒感染的、處于抑制性art的血清反應(yīng)陽(yáng)性患者的激活的cd4+細(xì)胞，或4)來(lái)自離體暴露于t細(xì)胞有絲分裂原(植物凝集素,pha)或潛伏期逆轉(zhuǎn)劑(伏立諾他，vor)的hiv-感染的患者的靜息cd4+細(xì)胞。重要的是，研究證明，來(lái)自處于抑制性art的hiv感染的患者的自體cd8+t細(xì)胞在darts存在的情況下作為效應(yīng)細(xì)胞是有用的。在伏立諾他存在的情況下，hivxcd3dart-介導(dǎo)的t細(xì)胞殺傷活性的證明是尤其值得注意的，因?yàn)樗峁┑淖C據(jù)表明，針對(duì)從被設(shè)計(jì)來(lái)模擬潛在的臨床hiv根除策略的模型系統(tǒng)中的hiv-感染的患者細(xì)胞中表達(dá)的真正的潛伏性病毒分離株的活性與使用離體擴(kuò)增的ctls的早期發(fā)現(xiàn)相似(49)。因此，所公開(kāi)的數(shù)據(jù)表明，hivxcd3darts在“休克和殺傷”hiv根除策略中是用于與lras組合進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試的合適的劑。方法由于我們研究中的樣本數(shù)量相對(duì)有限，我們使用多重比較的dunnett’s檢驗(yàn)再分析了這些數(shù)據(jù)，這被認(rèn)為是適當(dāng)?shù)?。?jì)算的p值在正文(第14頁(yè))和圖5-7的圖例中指示。統(tǒng)計(jì)分析方法部分也已修訂?；颊呷后w。白細(xì)胞除去法樣品從hiv血清反應(yīng)陰性供體或處于至少6個(gè)月的穩(wěn)定的art的、具有不可檢測(cè)的血漿病毒血癥(<50拷貝/ml)的hiv-感染的供體獲得，如所指出的。從每名患者獲得書(shū)面知情同意書(shū)，并且該研究由杜克和unc生物醫(yī)學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(biomedicalinstitutionalreviewboards)批準(zhǔn)。感染性分子克隆(imcs)。如前所述，用來(lái)源于nhl4-3分離株的骨架產(chǎn)生用于亞型bbal、亞型aecm235和亞型c1086.c的hiv-1imc(65,66)。所有imcs都表達(dá)海腎屬熒光素酶報(bào)告基因，并保留了所有9個(gè)病毒開(kāi)放閱讀框。海腎屬熒光素酶報(bào)告基因在hiv-1tat基因的控制下表達(dá)。在hiv-1感染cd4+t細(xì)胞時(shí)，hiv-1復(fù)制過(guò)程中tat的表達(dá)將誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)，這允許通過(guò)測(cè)量相對(duì)發(fā)光單位(rlu)量化受感染的細(xì)胞。hivxcd3darts的構(gòu)建、表達(dá)和純化。darts由共表達(dá)兩條多肽鏈的質(zhì)粒產(chǎn)生，所述兩條多肽鏈的一條具有與抗-hiv的vh連接的抗-cd3的vl；第二條具有與抗-cd3的vh連接的抗-hiv的vl。兩條多肽鏈的羧基末端由成對(duì)的帶相反電荷的e-螺旋/k-螺旋二聚化結(jié)構(gòu)域組成，其包含鏈間二硫鍵(圖10a-10c)。hiv臂序列來(lái)源于非中和mabs，a32[genbank登錄號(hào)3tnm_h和3tnm_l]和7b2[genbank登錄號(hào)afq31502和afq31503]，并且，cd3臂序列來(lái)源于hxr32(一種人源化小鼠抗人cd3εmab(l.huang,l.s.johnson,cd3-bindingmoleculescapableofbindingtohumanandnonhumancd3,美國(guó)專(zhuān)利20140099318(2014))。通過(guò)用來(lái)自抗-熒光素mab(4420)(67)或抗-rsvmab(帕利珠單抗)(68)的不相關(guān)的特異性取代hiv或cd3特異性類(lèi)似地構(gòu)建對(duì)照darts。編碼dart的序列被克隆到cet1019aducoe載體(emdmillipore)中、轉(zhuǎn)染到cho細(xì)胞中，并如前所述純化蛋白質(zhì)(31)。通過(guò)sds-page(nupagebis-tris凝膠系統(tǒng)，invitrogen)和分析sec(tskgs3000swxlse-hplc,tosohbioscience)來(lái)分析純化的蛋白質(zhì)。elisa。對(duì)于單特異性結(jié)合試驗(yàn)，用3％bsa和0.1％tween-20阻斷用碳酸氫鹽緩沖液中的重組蛋白(人cd3ε/δ異二聚體，jr-flgp140δcf；(69))涂覆的maxisorp微量滴定板(nunc)。應(yīng)用dart蛋白，隨后依次加入生物素化的抗-ek螺旋抗體和鏈霉親和素-hrp(bdbiosciences)。對(duì)于雙特異性結(jié)合試驗(yàn)，用jrflgp140δcf涂覆平板，并且應(yīng)用dart，隨后依次加入生物素化的cd3ε/δ和鏈霉親和素-hrp。使用supersignalelisapico化學(xué)發(fā)光底物(thermoscientific)檢測(cè)hrp活性。srp分析。結(jié)合至抗原的hivxcd3dart通過(guò)biacore3000生物傳感器(ge,healthcare)分析，如前所述(31,32)。根據(jù)制造商的程序，將人cd3ε/δ固定在cm5傳感器芯片上。分析結(jié)合至固定化的cd3的dart，以評(píng)估cd3臂的性質(zhì)，并分析結(jié)合至在固定化的cd3上捕獲的hivdart的hiv-1env蛋白，以評(píng)價(jià)hiv臂的性質(zhì)。jrflgp140δcf被用來(lái)評(píng)價(jià)7b2xcd3結(jié)合和m.consgp140δcfi(69)被用來(lái)評(píng)價(jià)a32xcd3結(jié)合。使用不同的env蛋白，因?yàn)閍32xcd3不能有效地結(jié)合至jr-flgp140δcf，并且m.consgp140δcfi缺乏對(duì)7b2xcd3的gp41結(jié)合位點(diǎn)。在10mmhepes，ph7.4、150mmnacl、3mmedta和0.005％p20表面活性劑中進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。固定化受體表面的再生通過(guò)脈沖注射10mm甘氨酸，ph1.5進(jìn)行。通過(guò)對(duì)langmuir1:1結(jié)合模型(bia評(píng)估軟件v4.1)的結(jié)合曲線(xiàn)的全局?jǐn)M合來(lái)確定kd值。細(xì)胞系。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)和克隆選擇，在macrogenics從jurkat-522f/y細(xì)胞產(chǎn)生jurkat-522f/ygf細(xì)胞，其組成型的表達(dá)橈足類(lèi)綠色熒光蛋白(copgfp)和螢火蟲(chóng)熒光素酶的融合蛋白(systembiosciences)。具有hiv-1cm244(亞型ae)gp140的多西環(huán)素誘導(dǎo)型表達(dá)的hek293-d371細(xì)胞從johnkappes博士獲得(伯明翰阿拉巴馬大學(xué))。結(jié)合至細(xì)胞的dart或mab的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。將4μg/ml的darts在含有10％人ab血清的200μlfacs緩沖液中與105個(gè)細(xì)胞在室溫一起孵育30分鐘。洗滌后，將細(xì)胞重懸于100μl的1μg/ml的生物素-綴合的小鼠抗-ek抗體(識(shí)別dart蛋白的e/k異源二聚化區(qū)域)中，與1:500稀釋的鏈霉親和素-pe混合，并在黑暗中在2-8℃孵育45分鐘。洗滌細(xì)胞，用facs緩沖液重懸，并用bdcalibur流式細(xì)胞分析儀和flowjo軟件(treestar，ashlandor)分析。如前所述(54)，對(duì)于a32和7b2mabs，進(jìn)行與來(lái)自正常人供體的imc-感染的cd4+t細(xì)胞的結(jié)合，并且對(duì)于hivx4420darts，用生物素-綴合的小鼠抗-ek抗體和1:500稀釋的鏈霉親和素-pe，進(jìn)行與來(lái)自正常人供體的imc-感染的cd4+t細(xì)胞的結(jié)合。針對(duì)表達(dá)hiv-1env的細(xì)胞系的重定向t-細(xì)胞細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及t-細(xì)胞活化的評(píng)價(jià)。使用untouchedtm人t細(xì)胞試劑盒(invitrogen)從健康的人pbmcs中分離全(pan)t細(xì)胞。用darts的連續(xù)稀釋物與人t細(xì)胞以效應(yīng)子:靶標(biāo)(e:t)比＝10:1(或不然以所指示的變化的e:t比)一起處理表達(dá)hiv-1env的細(xì)胞系(1-4×105個(gè)細(xì)胞/ml)，并在37℃，5％co2孵育過(guò)夜。如前所述，通過(guò)乳酸脫氫酶(ldh)釋放(cytotox非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)，promega)測(cè)量細(xì)胞毒性(32)。用jurkat-522f/ygf細(xì)胞系，還通過(guò)使用熒光素酶-glo底物(promega)的發(fā)光測(cè)量細(xì)胞毒性。從發(fā)光計(jì)數(shù)(rlu)計(jì)算特異性裂解：細(xì)胞毒性(％)＝100×(1-(樣品的rlu÷對(duì)照的rlu))，其中對(duì)照＝在不存在dart時(shí)用效應(yīng)細(xì)胞孵育的靶細(xì)胞的平均rlu。數(shù)據(jù)被擬合至s型劑量應(yīng)答函數(shù)，以獲得50％有效濃度(ec50)和最大特異性裂解值百分比。用cd8-fitc、cd4-apc和cd25-pe抗體(bdbiosciences)標(biāo)記試驗(yàn)板中的細(xì)胞后，通過(guò)facs分析測(cè)量t-細(xì)胞活化，隨后通過(guò)配備有采集軟件cellquestproversion5.2.1的facscalibur流式細(xì)胞分析儀收集細(xì)胞(bdbiosciences)。使用flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(treestar，inc)。針對(duì)hiv-1imc-感染的cd4+細(xì)胞的重定向t-細(xì)胞細(xì)胞毒性試驗(yàn)。用抗人cd3(克隆okt3；ebioscience)和抗人cd28(克隆cd28.2；bdpharmingen)將來(lái)自正常健康hiv-1血清反應(yīng)陰性供體的冷凍保存的靜息pbmc激活72小時(shí)。隨后，通過(guò)使用磁珠(miltenyibiosciences)消耗cd8+t細(xì)胞獲得cd4+富集的細(xì)胞群(純度>92.3％；平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差95.73±2.6％)，在代表hiv-1亞型ae(cm235)、b(bal)或c(1086.c)的、表達(dá)熒光素酶的imc存在的情況下離心接種，并培養(yǎng)72小時(shí)。將cd4+感染的靶細(xì)胞與靜息cd8+效應(yīng)細(xì)胞(通過(guò)陰性選擇從自體pbmc分離，cd8+t細(xì)胞分離試劑盒，miltenyibiosciences)以33:1、11:1、3:1和0:1的e:t比，在不存在或存在darts的情況下，以濃度范圍為1,000至0.0001ng/ml一起孵育6-48小時(shí)。未感染的和感染的靶細(xì)胞單獨(dú)地被包括，作為另外的對(duì)照。每個(gè)條件重復(fù)進(jìn)行測(cè)試。孵育后，加入vivirentm活細(xì)胞底物(promega)，并在光度計(jì)上測(cè)量rlu；如前所述測(cè)定靶細(xì)胞的特異性裂解百分比(％sl)(58)。t-細(xì)胞脫粒(cd107)試驗(yàn)。如針對(duì)以hiv-1imc-感染的細(xì)胞作為靶標(biāo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)所描述的，在不存在或存在1ng/mldarts的情況下，受hiv-1balimc感染的激活的cd4+細(xì)胞與靜息cd8+效應(yīng)細(xì)胞以33:1的e:t比一起被涂覆，并孵育6小時(shí)。對(duì)于cd4t細(xì)胞脫粒，激活的cd4+t細(xì)胞或者受jr-csf感染并用在我們的adcc試驗(yàn)(70)中常規(guī)使用的存活力(nfl1)和靶特異性(tfl4)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，或者在添加darts之前以10:1的比作為效應(yīng)子被添加至靶標(biāo)。每個(gè)條件重復(fù)進(jìn)行測(cè)試。cd107pe-cy5(克隆h4a3；ebioscience)在孵育的最后6小時(shí)內(nèi)連同莫能菌素(monensin)溶液(bdgolgistop)一起被滴定和添加(71)。由live/deadaqua著色劑(stain)、抗-cd3apc-h7(克隆sk7；bdpharmingen)、抗-cd4bv605(克隆okt4；biolegend)、抗-cd8bv650(克隆rpa-t8；biolegend)組成的抗體組用于檢測(cè)cd107+cd8+t細(xì)胞。洗滌和固定后，樣品在接下來(lái)的24小時(shí)內(nèi)在定制的lsrii(bdbioscience,sanjose,ca)上取得。每個(gè)測(cè)試獲得總數(shù)至少300,000可行事件。使用flow-jo軟件(treestar，ashland，or)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。t-細(xì)胞存活力和活化試驗(yàn)。cd8+t細(xì)胞和從hiv感染的art抑制患者中獲得的cd8消耗的pbmcs以每孔5x104個(gè)細(xì)胞被涂覆到具有100ng/ml指示的dart的96孔板中。細(xì)胞在0.2ml補(bǔ)充有10％fbs、1％青霉素/鏈霉素和5u/mlil-2的cimdm培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后用以下抗體染色：hla-dr-percp(克隆l243)、cd25-pe(克隆m-a251)、cd8-fitc(克隆hit8a)、cd8-pe(克隆hit8a)、cd4-fitc(克隆rpa-t4)和膜聯(lián)蛋白v-pe和7-aad(所有bdbiosciences,sanjose,ca)。重定向t-細(xì)胞病毒性清除試驗(yàn)。通過(guò)陽(yáng)性選擇(easysep人cd8+選擇試劑盒，stemcell)從pbmcs中分離cd8+t細(xì)胞。首先用2μg/ml的pha(remel，lenexa，ks)和60u/ml的il-2激活cd8消耗的pbmcs，然后，通過(guò)在1200xg離心接種90分鐘，以moi為0.01，用jr-csf或自體儲(chǔ)庫(kù)病毒(ar)感染，如前所述的(47)。對(duì)于如前所述進(jìn)行的每個(gè)患者，從靜息cd4+t細(xì)胞的派生(outgrowth)試驗(yàn)的重復(fù)的孔的匯集的上清液獲得ar病毒(72)。在0.2m補(bǔ)充有10％fbs、1％青霉素/鏈霉素和5u/mlil-2的cimdm培養(yǎng)基中，在不存在或存在100ng/mldart的情況下，以指定的e:t比將五萬(wàn)(5×104)個(gè)靶標(biāo)/孔與cd8+t細(xì)胞共培養(yǎng)，重復(fù)三次。對(duì)于在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物(arvs)存在下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，在離心接種后24小時(shí)，洗滌細(xì)胞，添加1μm的雷特格韋(raltegravir)和4μm的阿巴卡韋(abacavir)，然后將darts和cd8+t細(xì)胞添加到培養(yǎng)物中。通過(guò)p24elisa(abl，rockville，md)在第7天測(cè)試上清液。結(jié)果計(jì)算為對(duì)數(shù)(感染的靶細(xì)胞的p24只有對(duì)照除以測(cè)試條件的p24)。潛伏清除試驗(yàn)(lca)。在添加抗病毒效應(yīng)細(xì)胞和/或分子后，使用art-治療的病毒血癥患者的靜息cd4+t細(xì)胞，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)定量病毒派生試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)來(lái)自cd4+感染的細(xì)胞的病毒恢復(fù)的降低，如前所述(49)。在這種情況下，lca用于模擬darts在臨床和藥理學(xué)相關(guān)條件下清除從潛伏庫(kù)中出現(xiàn)的病毒的能力。如前所述(72)，從白細(xì)胞去除法產(chǎn)物中分離靜息cd4+t細(xì)胞，并暴露于pha(4μg/ml)和il-2(60u/ml)24小時(shí)或暴露于伏立諾他(vor)(335nm，6小時(shí))(merckresearchlaboratories)，并根據(jù)儲(chǔ)庫(kù)的大小在12至36個(gè)重復(fù)的孔中以0.5至1×106個(gè)細(xì)胞/孔涂覆。然后將vor洗去，并以1:10的e:t比添加cd8，以及100ng/ml的指示的dart。將細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)(除非另有說(shuō)明)，隨后將dart蛋白質(zhì)洗去，并添加來(lái)自hiv陰性供體的同種異體cd8消耗的pbmcs以擴(kuò)增殘留的病毒。在第15天，對(duì)每只孔測(cè)試上清液中p24抗原的存在。結(jié)果計(jì)算為病毒性恢復(fù)％[(陽(yáng)性孔的數(shù)目/總的涂覆數(shù))×100]，歸一化至沒(méi)有添加cd8+t細(xì)胞的對(duì)照。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用多重比較的dunnett’s檢驗(yàn)，利用graphpadprismsoftward(lajolla,ca)分析組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較；用多重比較的dunnett校正計(jì)算，p值<0.05被認(rèn)為是顯著的。多重比較的dunnett檢驗(yàn)被認(rèn)為是適當(dāng)?shù)?，因?yàn)檠芯恐袠颖緮?shù)量相對(duì)有限。實(shí)施例6的參考文獻(xiàn)1.chunt-wetal.invivofateofhiv-1-infectedtcells:quantitativeanalysisofthetransitiontostablelatency.natmed.1995；1(12):1284–1290.2.chunt-wetal.quantificationoflatenttissuereservoirsandtotalbodyviralloadinhiv-1infection.nature.1997；387(6629):183–188.3.finzidetal.identificationofareservoirforhiv-1inpatientsonhighlyactiveantiretroviraltherapy.science.1997；278(5341):1295–1300.4.wongjk.recoveryofreplication-competenthivdespiteprolongedsuppressionofplasmaviremia.science.1997；278(5341):1291–1295.5.piersontcetal.molecularcharacterizationofpreintegrationlatencyinhumanimmunodeficiencyvirustype1infection.jvirol.2002；76(17):8518–8531.6.pomerantzrj.reservoirsofhumanimmunodeficiencyvirustype1:themainobstaclestoviraleradication.clininfectdis.2002；34(1):91–97.7.chomontnetal.hivreservoirsizeandpersistencearedrivenbytcellsurvivalandhomeostaticproliferation.natmed.2009；15(8):893–900.8.bosquea,famigliettim,weyrichas,goulstonc,planellesv.homeostaticproliferationfailstoefficientlyreactivatehiv-1latentlyinfectedcentralmemorycd4+tcells.plospathog.2011；7(10):e1002288.9.soriano-sarabianetal.quantitationofreplication-competenthiv-1inpopulationsofrestingcd4+tcells.jvirol.2014；88(24):14070–14077.10.palmersetal.newreal-timereversetranscriptase-initiatedpcrassaywithsingle-copysensitivityforhumanimmunodeficiencyvirustype1rnainplasma.jclinmicrobiol.2003；41(10):4531–4536.11.palmersetal.low-levelviremiapersistsforatleast7yearsinpatientsonsuppressiveantiretroviraltherapy.procnatlacadsciusa.2008；105(10):3879–3884.12.dinosojbetal.treatmentintensificationdoesnotreduceresidualhiv-1viremiainpatientsonhighlyactiveantiretroviraltherapy.procnatlacadsciusa.2009；106(23):9403–9408.13.gandhirtetal.noevidencefordecayofthelatentreservoirinhiv-1—infectedpatientsreceivingintensiveenfuvirtide-containingantiretroviraltherapy.jinfectdis.2010；201:293–296.14.daveyrtetal.hiv-1andtcelldynamicsafterinterruptionofhighlyactiveantiretroviraltherapy(haart)inpatientswithahistoryofsustainedviralsuppression.procnatlacadsciusa.1999；96(26):15109–15114.15.carcelaingetal.transientmobilizationofhumanimmunodeficiencyvirus(hiv)-specificcd4t-helpercellsfailstocontrolvirusreboundsduringintermittentantiretroviraltherapyinchronichivtype1infection.jvirol.2001；75(1):234–241.16.rothenbergermketal.largenumberofrebounding/founderhivvariantsemergefrommultifocalinfectioninlymphatictissuesaftertreatmentinterruption.procnatlacadsciusa.2015；pii:201414926[epubaheadofprint].17.robbml,kimjh.shotinthehaart:vaccinetherapyforhiv.thelancetinfectiousdiseases.2014；14(4):259–260.18.archinnmetal.administrationofvorinostatdisruptshiv-1latencyinpatientsonantiretroviraltherapy.nature.2012；487(7408):482–485.19.dentonpwetal.targetedcytotoxictherapykillspersistinghivinfectedcellsduringart.plospathog.2014；10(1):e1003872.20.hoy-cetal.replication-competentnoninducedprovirusesinthelatentreservoirincreasebarriertohiv-1cure.cell.2013；155(3):540–551.21.bullenck,lairdgm,durandcm,silicianojd,silicianorf.newexvivoapproachesdistinguisheffectiveandineffectivesingleagentsforreversinghiv-1latencyinvivo.natmed.2014；20(4):425–429.22.cilloaretal.quantificationofhiv-1latencyreversalinrestingcd4+tcellsfrompatientsonsuppressiveantiretroviraltherapy.procnatlacadsciusa.2014；111(19):7078–7083.23.pincussh.therapeuticpotentialofanti-hivimmunotoxins.antiviralresearch.1996；33(1):1–9.24.daveyrtetal.useofrecombinantsolublecd4pseudomonasexotoxin,anovelimmunotoxin,fortreatmentofpersonsinfectedwithhumanimmunodeficiencyvirus.jinfectdis.1994；！170(november):1180–1188.25.beratk,kennedype,bergerea,barbascfi,pastani.specifickillingofhiv-infectedlymphocytesbyarecombinantimmunotoxindirectedagainstthehiv-1envelopeglycoprotein.molecularmedicine.1998；4(6):384.26.dentonpwetal.generationofhivlatencyinhumanizedbltmice.jvirol.2012；86(1):630–634.27.pollarajetal.epitopespecificityofhumanimmunodeficiencyvirus-1antibodydependentcellularcytotoxicity[adcc]responses.currhivres.2013；11(8):378–387.28.acharyapetal.structuraldefinitionofanantibody-dependentcellularcytotoxicityresponseimplicatedinreducedriskforhiv-1infection.jvirol.2014；88(21):12895–12906.29.pincusshetal.invivoefficacyofanti-glycoprotein41,butnotanti-glycoprotein120,immunotoxinsinamousemodelofhivinfection.jimmunol.2003；170:2236–2241.30.craigrb,summacm,cortim,pincussh.anti-hivdoublevariabledomainimmunoglobulinsbindingbothgp41andgp120fortargeteddeliveryofimmunoconjugates.plosone.2012；7(10):e46778.31.johnsonsetal.effectorcellrecruitmentwithnovelfv-baseddual-affinityre-targetingproteinleadstopotenttumorcytolysisandinvivob-celldepletion.jmolbiol.2010；399(3):436–449.32.moorepaetal.applicationofdualaffinityretargetingmoleculestoachieveoptimalredirectedt-cellkillingofb-celllymphoma.blood.2011；117(17):4542–4551.33.nagorsend,baeuerlepa.immunomodulatorytherapyofcancerwithtcell-engagingbiteantibodyblinatumomab.experimentalcellresearch.2011；317(9):1255–1260.34.chichiligretal.acd3xcd123bispecificdartforredirectinghosttcellstomyelogenousleukemia:preclinicalactivityandsafetyinnonhumanprimates.scitranslmed.2015；7(289):289ra82.35.toppmsetal.phaseiitrialoftheanti-cd19bispecifictcell-engagerblinatumomabshowshematologicandmolecularremissionsinpatientswithrelapsedorrefractoryb-precursoracutelymphoblasticleukemia.jclinoncol.2014；32(36):4134–4140.36.toppmsetal.safetyandactivityofblinatumomabforadultpatientswithrelapsedorrefractoryb-precursoracutelymphoblasticleukaemia:amulticentre,single-arm,phase2study.lancetoncol.2014；16:57–66.37.raderc.dartstakeaimatbites.blood.2011；117(17):4403–4404.38.shanletal.stimulationofhiv-1-specificcytolytictlymphocytesfacilitateseliminationoflatentviralreservoiraftervirusreactivation.immunity.2012；36(3):491–501.39.moorejpetal.explorationofantigenicvariationingp120fromcladesathroughfofhumanimmunodeficiencyvirustype1byusingmonoclonalantibodies.jvirol.1994；68(12):8350–8364.40.guanyetal.diversespecificityandeffectorfunctionamonghumanantibodiestohiv-1envelopeglycoproteinepitopesexposedbycd4binding.procnatlacadsciusa.2013；110(1):e69–78.41.veillettemetal.interactionwithcellularcd4exposeshiv-1envelopeepitopestargetedbyantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity.jvirol.2014；88(5):2633–2644.42.zhangm-yetal.identificationandcharacterizationofabroadlycross-reactivehiv-1humanmonoclonalantibodythatbindstobothgp120andgp41.plosone.2012；7(9):e44241.43.wyattretal.involvementofthev1/v2variableloopstructureintheexposureofhumanimmunodeficiencyvirustype1gp120epitopesinducedbyreceptorbinding.jvirol.1995；69(9):5723–5733.44.sandersrwetal.anext-generationcleaved,solublehiv-1envtrimer,bg505sosip.664gp140,expressesmultipleepitopesforbroadlyneutralizingbutnotnon-neutralizingantibodies.plospathog.2013；9(9):e1003618.45.caoj,parkiw,coopera,sodroskij.moleculardeterminantsofacutesingle-celllysisbyhumanimmunodeficiencyvirustype1.jvirol.1996；70(3):1340–1354.46.trautmannl,janbazianl,chomontn,thee.upregulationofpd-1expressiononhiv-specificcd8tcellsleadstoreversibleimmunedysfunction.natmed.2006；12(10):1198–1202.47.blackburnsdetal.coregulationofcd8+tcellexhaustionbymultipleinhibitoryreceptorsduringchronicviralinfection.natimmunol.2008；10(1):29–37.48.grouxh.activation-induceddeathbyapoptosisincd4+tcellsfromhumanimmunodeficiencyvirus-infectedasymptomaticindividuals.jexpmed.1992；175(2):331–340.49.sungjaetal.expandedcytotoxict-celllymphocytestargetthelatenthivreservoir.jinfectdis.2015；:1–15.50.vanpraagrmeetal.okt3andil-2treatmentforpurgingofthelatenthiv-1reservoirinvivoresultsinselectivelong-lastingcd4+tcelldepletion-springer.jclinimmunol.2001；21(3):218–226.51.durandcm,blanksonjn,silicianorf.developingstrategiesforhiv-1eradication.trendsimmunol.2012；33(11):554–562.52.dengketal.broadctlresponseisrequiredtoclearlatenthiv-1duetodominanceofescapemutations.nature.2015；517(7534):381–385.53.finnegancm,bergw,lewisgk,devicoal.antigenicpropertiesofthehumanimmunodeficiencyvirusenvelopeduringcell-cellfusion.jvirol.2001；75(22):11096–11105.54.ferrarigetal.anhiv-1gp120envelopehumanmonoclonalantibodythatrecognizesac1conformationalepitopemediatespotentantibody-dependentcellularcytotoxicity(adcc)activityanddefinesacommonadccepitopeinhumanhiv-1serum.jvirol.2011；85(14):7029–7036.55.moorepletal.natureofnonfunctionalenvelopeproteinsonthesurfaceofhumanimmunodeficiencyvirustype1.jvirol.2006；80(5):2515–2528.56.johnsonsetal.cooperativityofhiv-specificcytolyticcd4tcellsandcd8tcellsincontrolofhivviremia.jvirol.2015；89(15):7494–7505.57.casazzajpetal.acquisitionofdirectantiviraleffectorfunctionsbycmv-specificcd4+tlymphocyteswithcellularmaturation.jexpmed.2006；203(13):2865–2877.58.pollarajetal.hiv-1vaccine-inducedc1andv2env-specificantibodiessynergizeforincreasedantiviralactivities.jvirol.2014；88(14):7715–7726.59.shingaimetal.antibody-mediatedimmunotherapyofmacaqueschronicallyinfectedwithshivsuppressesviraemia.nature.2013；503(7475):277–280.60.barouchdhetal.therapeuticefficacyofpotentneutralizinghiv-1-specificmonoclonalantibodiesinshiv-infectedrhesusmonkeys.nature.2013；503(7475):224–228.61.yamamototetal.surfaceexpressionpatternsofnegativeregulatorymoleculesidentifydeterminantsofvirus-specificcd8+t-cellexhaustioninhivinfection.blood.2011；117(18):4805–4815.62.giorgijvetal.elevatedlevelsofcd38+cd8+tcellsinhivinfectionaddtotheprognosticvalueoflowcd4+tcelllevels:resultsof6yearsoffollow-up.thelosangelescenter,multicenteraidscohortstudy.jacquirimmunedeficsyndr.1993；6(8):904–912.63.perfettospetal.cd38expressiononcryopreservedcd8+tcellspredictshivdiseaseprogression.cytometry.1998；33(2):133–137.64.vinikoormjetal.antiretroviraltherapyinitiatedduringacutehivinfectionfailstopreventpersistentt-cellactivation.jacquirimmunedeficsyndr.2013；62(5):505–508.65.edmondstgetal.replicationcompetentmolecularclonesofhiv-1expressingrenillaluciferasefacilitatetheanalysisofantibodyinhibitioninpbmc.virology.2010；408(1):1–13.66.adachiaetal.productionofacquiredimmunodeficiencysyndrome-associatedretrovirusinhumanandnonhumancellstransfectedwithaninfectiousmolecularclone.jvirol.1986；59(2):284–291.67.kranzdm,vossew.partialelucidationofananti-haptenrepertoireinbalb/cmice:comparativecharacterizationofseveralmonoclonalanti-fluorescylantibodies.molimmunol.1981；18(10):889–898.68.johnsonsetal.developmentofahumanizedmonoclonalantibody(medi-493)withpotentinvitroandinvivoactivityagainstrespiratorysyncytialvirus.jinfectdis.1997；176(november):1215–1224.69.liaoh-xetal.agroupmconsensusenvelopeglycoproteininducesantibodiesthatneutralizesubsetsofsubtypebandchiv-1primaryviruses.virology.2006；353:268–282.70.pollarajetal.high-throughputquantitativeanalysisofhiv-1andsiv-specificadcc-mediatingantibodyresponses.cytometrya.2011；79a(8):603–612.71.bettsmretal.sensitiveandviableidentificationofantigen-specificcd8+tcellsbyaflowcytometricassayfordegranulation.jimmunolmethods.2003；281(1-2):65–78.72.archinnmetal.valproicacidwithoutintensifiedantiviraltherapyhaslimitedimpactonpersistenthivinfectionofrestingcd4+tcells.aids.2008；22(10):1131–1135.當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12