對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用此申請(qǐng)要求2014年11月5日提交的臨時(shí)美國(guó)申請(qǐng)no.62/075,740的優(yōu)先權(quán)，通過述及將其完整收入本文。序列表無。發(fā)明領(lǐng)域一般而言，本發(fā)明涉及雙重特異性抗fgfr2/3抗體，及其用途。發(fā)明背景成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)及其受體(fgfr)在胚胎發(fā)育，組織穩(wěn)態(tài)和代謝期間發(fā)揮至關(guān)重要的作用(eswarakumar,v.p.,lax,i.,andschlessinger,j.2005.cellularsignalingbyfibroblastgrowthfactorreceptors.cytokinegrowthfactorrev16:139-149；l′hote,c.g.,andknowles,m.a.2005.cellresponsestofgfr3signalling:growth,differentiationandapoptosis.expcellres304:417-431；dailey,l.,ambrosetti,d.,mansukhani,a.,andbasilico,c.2005.mechanismsunderlyingdifferentialresponsestofgfsignaling.cytokinegrowthfactorrev16:233-247)。在人中，有22種fgf(fgf1-14，fgf16-23)和4種具有酪氨酸激酶域的fgf受體(fgfr1-4)。fgfr由胞外配體結(jié)合區(qū)(其具有兩個(gè)或三個(gè)免疫球蛋白樣域(igd1-3))，單次跨膜區(qū)，和胞質(zhì)分裂酪氨酸激酶域組成。fgfr1，2和3每種具有兩種主要可變剪接同種型，稱作iiib和iiic。這些同種型差異在于第二半igd3中的約50個(gè)氨基酸，而且具有獨(dú)特的組織分布和配體特異性。一般而言，iiib同種型見于上皮細(xì)胞，而iiic在間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。一旦與硫酸類肝素蛋白聚糖協(xié)同結(jié)合fgf，fgfr二聚化并在特定酪氨酸殘基處變成磷酸化的。這推動(dòng)募集至關(guān)重要的銜接蛋白，諸如fgfr底物2α(frs2α)，導(dǎo)致多種信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)活化，包括絲裂原活化的蛋白質(zhì)激酶(mapk)和pi3k-akt途徑(eswarakumar,v.p.,lax,i.,andschlessinger,j.2005.cellularsignalingbyfibroblastgrowthfactorreceptors.cytokinegrowthfactorrev16:139-149；dailey,l.,ambrosetti,d.,mansukhani,a.,andbasilico,c.2005.mechanismsunderlyingdifferentialresponsestofgfsignaling.cytokinegrowthfactorrev16:233-247；mohammadi,m.,olsen,s.k.,andibrahimi,o.a.2005.structuralbasisforfibroblastgrowthfactorreceptoractivation.cytokinegrowthfactorrev16:107-137)。從而，fgf及其關(guān)聯(lián)受體以背景依賴性方式調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞過程，包括增殖，分化，遷移和存活。已經(jīng)將異?；罨膄gfr與特定的人惡性聯(lián)系起來(eswarakumar,v.p.,lax,i.,andschlessinger,j.2005.cellularsignalingbyfibroblastgrowthfactorreceptors.cytokinegrowthfactorrev16:139-149；grose,r.,anddickson,c.2005.fibroblastgrowthfactorsignalingintumorigenesis.cytokinegrowthfactorrev16:179-186)。特別是，在約15-20％的多發(fā)性骨髓瘤患者中發(fā)生t(4；14)(p16.3；q32)染色體易位，導(dǎo)致fgfr3過表達(dá)且與更短的總體存活有關(guān)聯(lián)(chang,h.,stewart,a.k.,qi,x.y.,li,z.h.,yi,q.l.,andtrudel,s.2005.immunohistochemistryaccuratelypredictsfgfr3aberrantexpressionandt(4；14)inmultiplemyeloma.blood106:353-355；chesi,m.,nardini,e.,brents,l.a.,schrock,e.,ried,t.,kuehl,w.m.,andbergsagel,p.l.1997.frequenttranslocationt(4；14)(p16.3；q32.3)inmultiplemyelomaisassociatedwithincreasedexpressionandactivatingmutationsoffibroblastgrowthfactorreceptor3.natgenet16:260-264；fonseca,r.,blood,e.,rue,m.,harrington,d.,oken,m.m.,kyle,r.a.,dewald,g.w.,vanness,b.,vanwier,s.a.,henderson,k.j.,etal.2003.clinicalandbiologicimplicationsofrecurrentgenomicaberrationsinmyeloma.blood101:4569-4575；moreau,p.,facon,t.,leleu,x.,morineau,n.,huyghe,p.,harousseau,j.l.,bataille,r.,andavet-loiseau,h.2002.recurrent14q32translocationsdeterminetheprognosisofmultiplemyeloma,especiallyinpatientsreceivingintensivechemotherapy.blood100:1579-1583)。fgfr3還牽涉賦予培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞系以化學(xué)抗性(pollett,j.b.,trudel,s.,stern,d.,li,z.h.,andstewart,a.k.2002.overexpressionofthemyeloma-associatedoncogenefibroblastgrowthfactorreceptor3confersdexamethasoneresistance.blood100:3819-3821)，與t(4；14)+患者較差的對(duì)常規(guī)化療的臨床響應(yīng)一致(fonseca,r.,blood,e.,rue,m.,harrington,d.,oken,m.m.,kyle,r.a.,dewald,g.w.,vanness,b.,vanwier,s.a.,henderson,k.j.,etal.2003.clinicalandbiologicimplicationsofrecurrentgenomicaberrationsinmyeloma.blood101:4569-4575)。突變活化的fgfr3的過表達(dá)足以在造血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(bernard-pierrot,i.,brams,a.,dunois-larde,c.,caillault,a.,diezdemedina,s.g.,cappellen,d.,graff,g.,thiery,j.p.,chopin,d.,ricol,d.,etal.2006.oncogenicpropertiesofthemutatedformsoffibroblastgrowthfactorreceptor3b.carcinogenesis27:740-747；agazie,y.m.,movilla,n.,ischenko,i.,andhayman,m.j.2003.thephosphotyrosinephosphataseshp2isacriticalmediatoroftransformationinducedbytheoncogenicfibroblastgrowthfactorreceptor3.oncogene22:6909-6918；ronchetti,d.,greco,a.,compasso,s.,colombo,g.,dell′era,p.,otsuki,t.,lombardi,l.,andneri,a.2001.deregulatedfgfr3mutantsinmultiplemyelomacelllineswitht(4；14):comparativeanalysisofy373c,k650eandthenovelg384dmutations.oncogene20:3553-3562；chesi,m.,brents,l.a.,ely,s.a.,bais,c.,robbiani,d.f.,mesri,e.a.,kuehl,w.m.,andbergsagel,p.l.2001.activatedfibroblastgrowthfactorreceptor3isanoncogenethatcontributestotumorprogressioninmultiplemyeloma.blood97:729-736；plowright,e.e.,li,z.,bergsagel,p.l.,chesi,m.,barber,d.l.,branch,d.r.,hawley,r.g.,andstewart,a.k.2000.ectopicexpressionoffibroblastgrowthfactorreceptor3promotesmyelomacellproliferationandpreventsapoptosis.blood95:992-998)和鼠骨髓移植模型(chen,j.,williams,i.r.,lee,b.h.,duclos,n.,huntly,b.j.,donoghue,d.j.,andgilliland,d.g.2005.constitutivelyactivatedfgfr3mutantssignalthroughplcgamma-dependentand-independentpathwaysforhematopoietictransformation.blood106:328-337；li,z.,zhu,y.x.,plowright,e.e.,bergsagel,p.l.,chesi,m.,patterson,b.,hawley,t.s.,hawley,r.g.,andstewart,a.k.2001.themyeloma-associatedoncogenefibroblastgrowthfactorreceptor3istransforminginhematopoieticcells.blood97:2413-2419)中誘導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)化。因而，已經(jīng)提出fgfr3作為多發(fā)性骨髓瘤中的潛在治療靶。事實(shí)上，數(shù)種靶向fgfr，盡管并非對(duì)fgfr3選擇性的且針對(duì)某些其它激酶具有交叉抑制活性的小分子抑制劑已經(jīng)在培養(yǎng)物中及在小鼠模型中展現(xiàn)針對(duì)fgfr3陽性骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(trudel,s.,ely,s.,farooqi,y.,affer,m.,robbiani,d.f.,chesi,m.,andbergsagel,p.l.2004.inhibitionoffibroblastgrowthfactorreceptor3inducesdifferentiationandapoptosisint(4；14)myeloma.blood103:3521-3528；trudel,s.,li,z.h.,wei,e.,wiesmann,m.,chang,h.,chen,c.,reece,d.,heise,c.,andstewart,a.k.2005.chir-258,anovel,multitargetedtyrosinekinaseinhibitorforthepotentialtreatmentoft(4；14)multiplemyeloma.blood105:2941-2948；chen,j.,lee,b.h.,williams,i.r.,kutok,j.l.,mitsiades,c.s.,duclos,n.,cohen,s.,adelsperger,j.,okabe,r.,coburn,a.,etal.2005.fgfr3asatherapeutictargetofthesmallmoleculeinhibitorpkc412inhematopoieticmalignancies.oncogene24:8259-8267；paterson,j.l.,li,z.,wen,x.y.,masih-khan,e.,chang,h.,pollett,j.b.,trudel,s.,andstewart,a.k.2004.preclinicalstudiesoffibroblastgrowthfactorreceptor3asatherapeutictargetinmultiplemyeloma.brjhaematol124:595-603；grand,e.k.,chase,a.j.,heath,c.,rahemtulla,a.,andcross,n.c.2004.targetingfgfr3inmultiplemyeloma:inhibitionoft(4；14)-positivecellsbysu5402andpd173074.leukemia18:962-966)。還已經(jīng)在大比例的膀胱癌中記錄了fgfr3過表達(dá)(gomez-roman,j.j.,saenz,p.,molina,m.,cuevasgonzalez,j.,escuredo,k.,santacruz,s.,junquera,c.,simon,l.,martinez,a.,gutierrezbanos,j.l.,etal.2005.fibroblastgrowthfactorreceptor3isoverexpressedinurinarytractcarcinomasandmodulatestheneoplasticcellgrowth.clincancerres11:459-465；tomlinson,d.c.,baldo,o.,harnden,p.,andknowles,m.a.2007.fgfr3proteinexpressionanditsrelationshiptomutationstatusandprognosticvariablesinbladdercancer.jpathol213:91-98)。而且，已經(jīng)在60-70％的乳頭狀和16-20％的肌肉侵入性膀胱癌中鑒定出fgfr3中的體細(xì)胞活化性突變(tomlinson,d.c.,baldo,o.,harnden,p.,andknowles,m.a.2007.fgfr3proteinexpressionanditsrelationshiptomutationstatusandprognosticvariablesinbladdercancer.jpathol213:91-98；vanrhijn,b.w.,montironi,r.,zwarthoff,e.c.,jobsis,a.c.,andvanderkwast,t.h.2002.frequentfgfr3mutationsinurothelialpapilloma.jpathol198:245-251)。在細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)中，rna干擾(bernard-pierrot,i.,brams,a.,dunois-larde,c.,caillault,a.,diezdemedina,s.g.,cappellen,d.,graff,g.,thiery,j.p.,chopin,d.,ricol,d.,etal.2006.oncogenicpropertiesofthemutatedformsoffibroblastgrowthfactorreceptor3b.carcinogenesis27:740-747；tomlinson,d.c.,hurst,c.d.,andknowles,m.a.2007.knockdownbyshrnaidentifiess249cmutantfgfr3asapotentialtherapeutictargetinbladdercancer.oncogene26:5889-5899)或fgfr3單鏈fv抗體片段抑制膀胱癌細(xì)胞增殖(martinez-torrecuadrada,j.,cifuentes,g.,lopez-serra,p.,saenz,p.,martinez,a.,andcasal,j.i.2005.targetingtheextracellulardomainoffibroblastgrowthfactorreceptor3withhumansingle-chainfvantibodiesinhibitsbladdercarcinomacelllineproliferation.clincancerres11:6280-6290)。一項(xiàng)最近的研究證明fgfr3抗體-毒素綴合物經(jīng)由fgfr3介導(dǎo)的毒素進(jìn)入腫瘤的投遞而削弱膀胱癌細(xì)胞系的異種移植物生長(zhǎng)(martinez-torrecuadrada,j.l.,cheung,l.h.,lopez-serra,p.,barderas,r.,canamero,m.,ferreiro,s.,rosenblum,m.g.,andcasal,j.i.2008.antitumoractivityoffibroblastgrowthfactorreceptor3-specificimmunotoxinsinaxenograftmousemodelofbladdercarcinomaismediatedbyapoptosis.molcancerther7:862-873)。然而，仍然不清楚fgfr3信號(hào)傳導(dǎo)是否確實(shí)是膀胱腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)的致癌驅(qū)動(dòng)物。此外，尚未在體內(nèi)模型的基礎(chǔ)上定義在膀胱癌中靶向fgfr3的治療潛力。涉及fgfr3和抗fgfr3抗體的出版物包括美國(guó)專利公開文本no.2005/0147612；rauchenbergeretal,jbiolchem278(40):38194-38205(2003)；wo2006/048877；martinez-torrecuadradaetal,(2008)molcancerther7(4):862-873；wo2007/144893；trudeletal.(2006)107(10):4039-4046；martinez-torrecuadradaetal(2005)clincancerres11(17):6280-6290；gomez-romanetal(2005)clincancerres11:459-465；direnzo,retal(2007)proceedingsofaacrannualmeeting,abstractno.2080；wo2010/002862。美國(guó)專利公開文本no.20100291114中公開了fgfr3:抗fgfr3抗體的晶體結(jié)構(gòu)。雖然能在不破壞成年組織穩(wěn)態(tài)的情況下抑制fgfr2和fgfr3，但是阻斷密切相關(guān)的調(diào)節(jié)特定代謝功能的fgfr1和fgfr4意味著極大的安全性風(fēng)險(xiǎn)。本文中重新改造美國(guó)專利申請(qǐng)no.20100291114中公開的抗fgfr3抗體以創(chuàng)建以雙重特異性結(jié)合fgfr3和fgfr2但舍棄fgfr1和fgfr4的功能阻斷性抗體。如此，設(shè)計(jì)并生成了在不阻斷fgfr1或fgfr4的情況下阻斷fgf結(jié)合fgfr2和fgfr3(即fgfr2/3)，由此抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)的雙重特異性抗體。清楚的是仍然需要具有最適于開發(fā)成治療劑的臨床屬性的藥劑。如本文中描述的，經(jīng)由多輪改造重新設(shè)計(jì)單特異性結(jié)合fgfr3的抗體來結(jié)合其它fgfr家族成員，包括募集對(duì)fgfr2的結(jié)合及去除對(duì)fgfr4的結(jié)合。使用噬菌體展示文庫進(jìn)行改造的第一步以獲取fgfr2結(jié)合。每個(gè)噬菌體文庫制定一個(gè)接觸cdr的誘變，而且誘變的范圍覆蓋該cdr中文庫容量所容許數(shù)目的殘基。挑選多個(gè)連續(xù)位置進(jìn)行誘變?cè)试Scdr主鏈中的重大自由度。大多數(shù)所得的能夠嚙合fgfr2的克隆包含cdrh2中的所有5處突變。晶體結(jié)構(gòu)證明整個(gè)范圍的誘變與cdr環(huán)的幾何學(xué)的完全重建有聯(lián)系。cdr的空間改組的解決方案是眾多的，表現(xiàn)為獲得了對(duì)fgfr2的結(jié)合的多種多樣h2突變體的鑒定。如此大多樣性的解決方案通常沒有作為標(biāo)準(zhǔn)親和力成熟實(shí)驗(yàn)的結(jié)局看到，由此回收的序列通常含有cdr個(gè)體上的稀少位置。因此，獲取另外的針對(duì)同源抗原的特異性可能需要比親和力成熟更大的誘變自由度。第二輪改造是特異性的精煉，去除fgfr4結(jié)合。使用抗體cdr環(huán)和抗原表面之間的接觸殘基的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析來指導(dǎo)噬菌體展示文庫的設(shè)計(jì)。選定的抗體變體顯示fgfr4結(jié)合的降低及對(duì)fgfr2/3的結(jié)合的保留。這個(gè)特異性精華步驟的序列解決方案與第一輪改造相比更加受限。精煉步驟進(jìn)一步展現(xiàn)抗體重新改造在密切相關(guān)抗原間區(qū)分結(jié)合特異性的能力。經(jīng)由本文中描述的抗體工程改造生成的雙重特異性抗體結(jié)合兩種密切相關(guān)的抗原，即fgfr2和fgfr3(抗fgfr2/3抗體)。這些抗fgfr2/3抗體(2b.1.3抗體變體)是規(guī)則的igg分子，即它們使用相同的重和輕鏈。本發(fā)明的某些抗fgfr2/3抗體能分別以二價(jià)或單價(jià)方式結(jié)合兩種fgfr2同種型，兩種fgfr3同種型或一種fgfr2和一種fgfr3同種型。這與常規(guī)雙特異性igg形成對(duì)比，后者通常以單價(jià)方式使用兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)來結(jié)合兩種不同抗原。所描述的雙重特異性抗體與“二合一”抗體共享一些相似性(grand,e.k.,chase,a.j.,heath,c.,rahemtulla,a.,andcross,n.c.2004.targetingfgfr3inmultiplemyeloma:inhibitionoft(4；14)-positivecellsbysu5402andpd173074.leukemia18:962-966)。bostrom等人隨機(jī)化了herceptin的全部3個(gè)輕鏈cdr并選擇第二特異性以及親本特異性。正如預(yù)期的，第二特異性來自輕鏈cdr的主要貢獻(xiàn)(grand,e.k.,chase,a.j.,heath,c.,rahemtulla,a.,andcross,n.c.2004.targetingfgfr3inmultiplemyeloma:inhibitionoft(4；14)-positivecellsbysu5402andpd173074.leukemia18:962-966；gomez-roman,j.j.,saenz,p.,molina,m.,cuevasgonzalez,j.,escuredo,k.,santacruz,s.,junquera,c.,simon,l.,martinez,a.,gutierrezbanos,j.l.,etal.2005.fibroblastgrowthfactorreceptor3isoverexpressedinurinarytractcarcinomasandmodulatestheneoplasticcellgrowth.clincancerres11:459-465)。在一個(gè)案例中，盡管egfr和her3是同源的，然而抗egfr/her3“二合一”抗體的結(jié)合表位是不同的(gomez-roman,j.j.,saenz,p.,molina,m.,cuevasgonzalez,j.,escuredo,k.,santacruz,s.,junquera,c.,simon,l.,martinez,a.,gutierrezbanos,j.l.,etal.2005.fibroblastgrowthfactorreceptor3isoverexpressedinurinarytractcarcinomasandmodulatestheneoplasticcellgrowth.clincancerres11:459-465)。本文中描述的辦法與“二合一”抗體的區(qū)別在于它重視兩種同源抗原之間的序列和結(jié)構(gòu)相似性，而且聚焦于更加受限的誘變集合來在改造期間保留親本表位。本文中呈現(xiàn)的抗體工程改造始于一種已有的且廣泛表征的抗體，對(duì)于癌癥療法具有潛在效用的抗fgfr抗體。自20世紀(jì)80年代中期引入第一種治療性單克隆抗體起，已經(jīng)在不同疾病領(lǐng)域有許多臨床上和商業(yè)上成功的抗體藥物，包括曲妥珠單抗，cetuximab，adalimumab，貝伐珠單抗，等。這些抗體在抑制它們的分子靶物方面展示杰出的活性。另一方面，像fgfr家族，多種同源蛋白因其各種疾病關(guān)聯(lián)而充當(dāng)分子靶物。獲得靶向功能表位的抗體的傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)路徑，或是動(dòng)物免疫接種或是其它基于展示的文庫選擇，并不保證是成功的。或者，如本文中描述的，可以改造抗體以獲取針對(duì)同源靶物的特異性，由此為抗體發(fā)現(xiàn)提供一種備選路徑。此外，通過維持功能表位，大概還有生物學(xué)功能，這種辦法利用先前開發(fā)的抗體的有利特性。隨著臨床抗體全集擴(kuò)充，可以改造更多的抗體，代替從頭開發(fā)。潛在應(yīng)用可包括包含多個(gè)作為疾病靶物的成員的蛋白家族，諸如egfr家族(tomlinson,d.c.,baldo,o.,harnden,p.,andknowles,m.a.2007.fgfr3proteinexpressionanditsrelationshiptomutationstatusandprognosticvariablesinbladdercancer.jpathol213:91-98)，tnfr家族(vanrhijn,b.w.,montironi,r.,zwarthoff,e.c.,jobsis,a.c.,andvanderkwast,t.h.2002.frequentfgfr3mutationsinurothelialpapilloma.jpathol198:245-251)，tam家族(tomlinson,d.c.,hurst,c.d.,andknowles,m.a.2007.knockdownbyshrnaidentifiess249cmutantfgfr3asapotentialtherapeutictargetinbladdercancer.oncogene26:5889-5899；martinez-torrecuadrada,j.,cifuentes,g.,lopez-serra,p.,saenz,p.,martinez,a.,andcasal,j.i.2005.targetingtheextracellulardomainoffibroblastgrowthfactorreceptor3withhumansingle-chainfvantibodiesinhibitsbladdercarcinomacelllineproliferation.clincancerres11:6280-6290)，ephrin家族(martinez-torrecuadrada,j.l.,cheung,l.h.,lopez-serra,p.,barderas,r.,canamero,m.,ferreiro,s.,rosenblum,m.g.,andcasal,j.i.2008.antitumoractivityoffibroblastgrowthfactorreceptor3-specificimmunotoxinsinaxenograftmousemodelofbladdercarcinomaismediatedbyapoptosis.molcancerther7:862-873)。正如在傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)過程中，針對(duì)同源物的工程化抗體應(yīng)當(dāng)視為新的分子，而且仍然需要全面表征它們的生物化學(xué)，生物物理和生物學(xué)特性以用于任何潛在治療性應(yīng)用。通過述及完整收錄本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和出版物。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于多種結(jié)合fgfr2和fgfr3(“fgfr2/3”)的fgfr結(jié)合劑(諸如抗體及其片段)的鑒定。fgfr3代表了一種重要的且有利的治療靶，而且本發(fā)明提供了基于藥劑(具體是結(jié)合fgfr的藥劑)對(duì)fgfr3的結(jié)合的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供了基于藥劑對(duì)fgfr2/3的結(jié)合(即具有針對(duì)fgfr2和fgfr3的雙重特異性的藥劑的結(jié)合)的組合物和方法。如本文中所描述的，本發(fā)明的fgfr2/3結(jié)合劑提供了重要的治療劑和診斷劑，供靶向與fgfr3和/或fgfr2信號(hào)傳導(dǎo)途徑的表達(dá)和/或活性有關(guān)的病理性疾患中使用。因而，本發(fā)明提供了與fgfr3和fgfr2結(jié)合有關(guān)的方法，組合物，試劑盒，和制品。本發(fā)明提供了結(jié)合fgfr2和fgfr3的抗體(抗fgfr2/3抗體)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是一種分離的結(jié)合fgfr3的抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合fgfr3iiib同種型和/或fgfr3iiic同種型。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合突變的fgfr3(例如fgfr3iiibr248c，s249c，g372c，y375c，k652e中的一種或多種，和/或fgfr3iiicr248c，s249c，g370c，y373c，k650e中的一種或多種)。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合單體fgfr3(例如單體fgfr3iiib和/或iiic同種型)。在一些實(shí)施方案中，該抗體促進(jìn)單體fgfr3的形成，諸如通過相對(duì)于二聚體fgfr3形式穩(wěn)定化單體fgfr3形式。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合fgfr2或其變體。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合fgfr2和本文中描述的fgfr3變體中任一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的抗fgfr2/3抗體，其中該抗體的全長(zhǎng)igg形式以1x10-7m的kd或更高親和力結(jié)合人fgfr3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的抗fgfr2/3抗體，其中該抗體的全長(zhǎng)igg形式以1x10-7m的kd或更高親和力結(jié)合人fgfr2。如本領(lǐng)域完全確立的，配體對(duì)其受體的結(jié)合親和力可以使用多種測(cè)定法任一來測(cè)定，而且以多種定量數(shù)值來表述。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力表述成kd值，而且反映了內(nèi)在結(jié)合親和力(例如具有最小化的親合效應(yīng))。通常且優(yōu)選的是，結(jié)合親和力是在體外測(cè)量的，無論是在無細(xì)胞背景下還是在細(xì)胞相關(guān)背景下?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種測(cè)定法之任一來獲得結(jié)合親和力測(cè)量，包括本文中所描述的測(cè)定法，包括例如biacore，放射免疫測(cè)定法(ria)，和elisa。在一些實(shí)施方案中，該抗體的全長(zhǎng)igg形式以1x10-8m的kd或更高親和力，以1x10-9m的kd或更高親和力，或以1x10-10m的kd或更高親和力結(jié)合人fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該抗體的全長(zhǎng)igg形式以1x10-8m的kd或更高親和力，以1x10-9m的kd或更高親和力，或以1x10-10m的kd或更高親和力結(jié)合人fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該抗體的全長(zhǎng)igg形式以1x10-8m的kd或更高親和力，以1x10-9m的kd或更高親和力，或以1x10-10m的kd或更高親和力結(jié)合人fgfr2和fgfr3。一般而言，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體為拮抗性抗體。如此，在一個(gè)方面，該抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3活性(例如fgfr3-iiib和/或fgfr3-iiic活性)。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體(通常處于二價(jià)形式)不擁有實(shí)質(zhì)性fgfr3激動(dòng)劑功能。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3拮抗性抗體(通常處于二價(jià)形式)擁有很少的或無fgfr3激動(dòng)劑功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(通常處于二價(jià)形式)不展現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的超出背景水平的fgfr3激動(dòng)劑活性水平。在一個(gè)方面，該抗體對(duì)fgfr3的結(jié)合可抑制該受體與另一個(gè)單元的該受體的二聚化，由此該受體的活化受到抑制(至少部分由于缺乏受體二聚化)。抑制可以是直接的或間接的。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗fgfr2/3抗體不擁有實(shí)質(zhì)性凋亡活性(例如不誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，例如移行細(xì)胞癌細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，諸如包含fgfr3易位，諸如t(4；14)易位的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體擁有很少的或無凋亡功能。在一些實(shí)施方案中，該fgfr2/3抗體不展現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的超出背景水平的凋亡功能。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了不誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)性fgfr3下調(diào)的抗fgfr2/3抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體誘導(dǎo)很少的或無受體下調(diào)。在一些實(shí)施方案中，該fgfr2/3抗體不誘導(dǎo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的超出背景水平的受體下調(diào)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了擁有效應(yīng)器功能的抗fgfr2/3抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該效應(yīng)器功能包含抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體(在一些實(shí)施方案中，裸的抗fgfr2/3抗體)能夠殺傷細(xì)胞，在一些實(shí)施方案中，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(例如包含易位，例如t(4；14)易位的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體能夠殺傷表達(dá)約10,000個(gè)fgfr3分子每個(gè)細(xì)胞或更多(諸如約11,000，約12,000，約13,000，約14,000，約15,000，約16,000，約17,000，約18,000或更多個(gè)fgfr3分子每個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞表達(dá)約2000，約3000，約4000，約5000，約6000，約7000，約8000，或更多個(gè)fgfr3分子每個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的該抗fgfr2/3抗體能夠殺傷表達(dá)約10,000個(gè)fgfr2分子每個(gè)細(xì)胞或更多(諸如約11,000，約12,000，約13,000，約14,000，約15,000，約16,000，約17,000，約18,000或更多個(gè)fgfr3分子每個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞表達(dá)約2000，約3000，約4000，約5000，約6000，約7000，約8000，或更多個(gè)fgfr2分子每個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制組成性fgfr3活性。在一些實(shí)施方案中，組成性fgfr3活性為配體依賴性fgfr3組成性活性。在一些實(shí)施方案中，組成性fgfr3活性為配體不依賴性組成性fgfr3活性。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制組成性fgfr2活性。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制組成性fgfr2和fgfr3活性。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制包含與fgfr3-iiibr248c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。如本文中使用的，術(shù)語“包含與fgfr3-iiibr248c對(duì)應(yīng)的突變”理解為涵蓋fgfr3-iiibr248c和fgfr3-iiicr248c，以及在與fgfr3-iiibr248對(duì)應(yīng)的位置處包含r至c突變的另外的fgfr3形式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解如何比對(duì)fgfr3序列以鑒定各自fgfr3序列之間的相應(yīng)殘基，例如比對(duì)fgfr3-iiic序列與fgfr3-iiib序列以鑒定fgfr3中與fgfr3-iiib中的r248位置對(duì)應(yīng)的位置。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiibr248c和/或fgfr3-iiicr248c。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制包含與fgfr3-iiibk652e對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。為了方便起見，術(shù)語“包含與fgfr3-iiibk652e對(duì)應(yīng)的突變”理解為涵蓋fgfr3-iiibk652e和fgfr3-iiick650e，以及在與fgfr3-iiibk652對(duì)應(yīng)的位置處包含k至e突變的另外的fgfr3形式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解如何比對(duì)fgfr3序列以鑒定各自fgfr3序列之間的對(duì)應(yīng)殘基，例如比對(duì)fgfr3-iiic序列與fgfr3-iiib序列以鑒定fgfr3中與fgfr3-iiib中的k652位置對(duì)應(yīng)的位置。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiibk652e和/或fgfr3-iiick650e。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3包含與fgfr3-iiibs249c對(duì)應(yīng)的突變。為了方便起見，術(shù)語“包含與fgfr3-iiibs249c對(duì)應(yīng)的突變”理解為涵蓋fgfr3-iiibs249c和fgfr3-iiics249c，以及在與fgfr3-iiibs249對(duì)應(yīng)的位置處包含s至c突變的另外的fgfr3形式。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiibs249c和/或fgfr3-iiics249c。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制包含與fgfr3-iiibg372c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。為了方便起見，術(shù)語“包含與fgfr3-iiibg372c對(duì)應(yīng)的突變”理解為涵蓋fgfr3-iiibg372c和fgfr3-iiicg370c，以及在與fgfr3-iiibg372對(duì)應(yīng)的位置處包含g至c突變的另外的fgfr3形式。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiibg372c和/或fgfr3-iiicg370c。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制包含與fgfr3-iiiby375c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。為了方便起見，術(shù)語“包含與fgfr3-iiiby375c對(duì)應(yīng)的突變”理解為涵蓋fgfr3-iiiby375c和fgfr3-iiicy373c，以及在與fgfr3-iiibs249對(duì)應(yīng)的位置處包含s至c突變的另外的fgfr3形式。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiiby375c和/或fgfr3-iiicy373c。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制(a)fgfr3-iiibk652e和(b)fgfr3-iiibr248c，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c中的一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制(a)fgfr3-iiick650e和(b)fgfr3-iiicr248c，fgfr3-iiicy373c，fgfr3-iiics249c，和fgfr3-iiicg370c中的一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制(a)fgfr3-iiibr248c和(b)fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c中的一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制(a)fgfr3-iiicr248c和(b)fgfr3-iiick650e，fgfr3-iiicy373c，fgfr3-iiics249c，和fgfr3-iiicg370c中的一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制(a)fgfr3-iiibg372c和(b)fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibr248c中的一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制(a)fgfr3-iiicg370c和(b)fgfr3-iiick650e，fgfr3-iiicy373c，fgfr3-iiics249c，和fgfr3-iiicr248c中的一種或多種。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiibr248c，fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體抑制fgfr3-iiicr248c，fgfr3-iiick650e，fgfr3-iiicy373c，fgfr3-iiics249c，和fgfr3-iiicg370c。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的抗fgfr2/3抗體，其包含至少一種，兩種，三種，四種，或五種選自下述的高變區(qū)(hvr)序列：seqidno1:rasqdvdtsla，seqidno2:sasflys，seqidno3:qqstghpqt，seqidno4:gfpftsqgis，seqidno5:rthlgdgstnyadsvkg，和seqidno6:artygiydtydkyteyvmdy。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了2b.1.3.10抗fgfr2/3抗體，其包含hvr-l1:rasqdvdtsla，hvr-l2:sasflys，hvr-l3:qqstghpqt，hvr-h1:gfpftsqgis，hvr-h2:rthlgdgstnyadsvkg，和hvr-h3:artygiydtydkyteyvmdy。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的抗fgfr2/3抗體，其包含至少一種，兩種，三種，四種，或五種選自下述的高變區(qū)(hvr)序列：seqidno7:rasqdvdtsla，seqidno8:sasflys，seqidno9:qqstghpqt，seqidno10:gfpftstgis，seqidno11:rthlgdgstnyadsvkg，和seqidno12:artygiydtydmyteyvmdy。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體，其包含hvr-l1:rasqdvdtsla，hvr-l2:sasflys，hvr-l3:qqstghpqt，hvr-h1:gfpftstgis，hvr-h2:rthlgdgstnyadsvkg，和hvr-h3:artygiydtydmyteyvmdy。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的抗fgfr2/3抗體的hvr-h1在seqidno:4的位置4-6處包含序列fts。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的抗fgfr2/3抗體的至少一種hvr為變體hvr，其中該變體hvr序列包含seqidno:1-6中描繪的序列的至少一個(gè)殘基(至少兩個(gè)殘基，至少三個(gè)或更多個(gè)殘基)的修飾。該修飾期望為替代，插入，或刪除。在一些實(shí)施方案中，hvr-l1變體包含1-6(1，2，3，4，5，或6)處替代。在一些實(shí)施方案中，hvr-l2變體包含1-6(1，2，3，4，5，或6)處替代。在一些實(shí)施方案中，hvr-l3變體包含1-6(1，2，3，4，5，或6)處替代。在一些實(shí)施方案中，hvr-h1變體包含1-6(1，2，3，4，5，或6)處替代。在一些實(shí)施方案中，hvr-h2變體包含1-6(1，2，3，4，5，或6)處替代。在一些實(shí)施方案中，hvr-h3變體包含1-6(1，2，3，4，5，或6)處替代。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的抗fgfr2/3抗體的hvr-h1為變體hvr-h1，其中該變體hvr-h1在氨基酸p3和/或q7(seqidno:4)處包含替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h1包含p3t替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h1包含q7t或q7l替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h1包含p3t和q7l替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h1包含p3t和q7t替代。在某些實(shí)施方案中，該變體hvr-h1包含選自表11中列出的組的序列：tftst，pftsl，pftsq，和pftst。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的抗fgfr2/3抗體的hvr-h3為變體hvr-h3，其中該變體hvr-h3在氨基酸t(yī)9，d11，和/或k12(seqidno:6)處包含替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含t9i替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含t9l替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含d11v替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含d11g替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含d11e替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含k12d替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含k12n替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含k12g替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含k12e替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含k12m替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含t9l，d11v，和k12d替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3只包含k12d替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含t9i，d11g，和k12g替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3只包含k12e替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含t9i和d11e替代。在具體的實(shí)施方案中，該變體hvr-h3只包含k12m替代。在某些實(shí)施方案中，該變體hvr-h3包含選自表11中列出的組的序列：lyvd，tydn，iygg，tyde，ikek，tydk，和tydm。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的抗fgfr2/3抗體的hvr-h1為變體hvr-h1，其中該變體hvr-h1在氨基酸p3和/或q7(seqidno:4)處包含替代，而且本文中描述的抗fgfr2/3抗體的hvr-h3為變體hvr-h3，其中該變體hvr-h3在氨基酸t(yī)9，d11，和/或k12(seqidno:6)處包含替代。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體的變體hvr-h1和hvr-h3包含選自表11中列出的組的序列：tftst(hvr-h1)和lyvd(hvr-h3)，tftst(hvr-h1)和tydn(hvr-h3)，tftst(hvr-h1)和iygg(hvr-h3)，tftst(hvr-h1)和tyde(hvr-h3)，pftsl(hvr-h1)和iyek(hvr-h3)，pftsq(hvr-h1)和tydk(hvr-h3)，pftst(hvr-h1)和tydm(hvr-h3)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體包含選自由seqidno:13-44中描述的序列組成的組的hvr-h2序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體包含選自由seqidno:45-50中描述的序列組成的組的hvr-h2序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiib(seqidno:51和52)，fgfr2-iiic(seqidno:53和54)，fgfr3-iiib(seqidno:55和56)，和/或fgfr3-iiic(seqidno:57和58)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiib，fgfr2-iiic，fgfr3-iiib，和fgfr3-iiic。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體結(jié)合選自由fgfr2-iiib，fgfr2-iiic，fgfr3-iiib，和fgfr3-iiic組成的組的一種fgfr。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體結(jié)合選自由fgfr2-iiib，fgfr2-iiic，fgfr3-iiib，和fgfr3-iiic組成的組的兩種fgfr。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體結(jié)合選自由fgfr2-iiib，fgfr2-iiic，fgfr3-iiib，和fgfr3-iiic組成的組的三種fgfr。本發(fā)明的抗體可包含任何合適的可變域框架序列，前提是對(duì)fgfr3和fgfr2的結(jié)合親和力得到實(shí)質(zhì)性保留。例如，在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含人亞組iii重鏈框架共有序列。在這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述框架共有序列包含第71位，第73位和/或第78位處的替代。在這些抗體的有些實(shí)施方案中，第71位是a，第73位是t，和/或第78位是a。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體包含humab4d5-8(genentech，inc.，southsanfrancisco，ca，usa)(在美國(guó)專利no.6,407,213&5,821,337，及l(fā)eeetal.，j.mol.biol.(2004)，340(5):1073-1093中也有提及)的重鏈可變域框架序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體進(jìn)一步包含人κi輕鏈框架共有序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這些抗體包含humab4d5-8的輕鏈hvr序列，如美國(guó)專利no.6,407,213和5,821,337中所記載的。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體包含humab4d5-8(genentech，inc.，southsanfrancisco，ca，usa)(在美國(guó)專利no.6,407,213&5,821,337，及l(fā)eeetal.，j.mol.biol.(2004)，340(5):1073-1093中也有提及)的輕鏈可變域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:59。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:60。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:61。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:62。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:63。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:64。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:65。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的氨基酸序列包含seqidno:66。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:75。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:76。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:77。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:78。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:79。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:80。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:81。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的氨基酸序列包含seqidno:82。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:59的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:75的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:60的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:76的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:61的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:77的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:62的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:78的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:63的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:79的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:64的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:60的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:65的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:81的重鏈氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:66的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:82的重鏈氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:67。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:68。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:69。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:70。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:71。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:72。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:73。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的輕鏈的核酸序列包含seqidno:74。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:83。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:84。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:85。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:86。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:87。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:88。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:89。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的重鏈的核酸序列包含seqidno:90。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:67的輕鏈核酸序列和包含seqidno:83的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:68的輕鏈核酸序列和包含seqidno:84的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:69的輕鏈核酸序列和包含seqidno:85的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:70的輕鏈核酸序列和包含seqidno:86的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:71的輕鏈核酸序列和包含seqidno:87的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:72的輕鏈核酸序列和包含seqidno:88的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:73的輕鏈核酸序列和包含seqidno:89的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含包含seqidno:74的輕鏈核酸序列和包含seqidno:90的重鏈核酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體包含包含seqidno:65的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:81的重鏈核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體具有下述cdr：hvr-l1:rasqdvdtsla(seqidno:1)，hvr-l2:sasflys(seqidno:2)，hvr-l3:qqstghpqt(seqidno:3)，hvr-h1:gfpftsqgis(seqidno:4)，hvr-h2:rthlgdgstnyadsvkg(seqidno:5)，hvr-h3:artygiydtydkyteyvmdy(seqidno:6)。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體包含包含seqidno:66的輕鏈氨基酸序列和包含seqidno:82的重鏈核酸序列。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體具有下述cdr：hvr-l1:rasqdvdtsla(seqidno:7)hvr-l2:sasflys(seqidno:8)hvr-l3:qqstghpqt(seqidno:9)hvr-h1:gfpftstgis(seqidno:10)hvr-h2:rthlgdgstnyadsvkg(seqidno:11)hvr-h3:artygiydtydmyteyvmdy(seqidno:12)在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸153-251內(nèi)的區(qū)域：apywtntekmekrlhavpaantvkfrcpaggnpmptmrwlkngkefkqehriggykvrnqhwslimesvvpsdkgnytcvveneygsinhtyhldvver。在某些實(shí)施方案中該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3(seqidno:56和58)氨基酸150-248內(nèi)的區(qū)域：apywtrpermdkkllavpaantvrfrcpaagnptpsiswlkngrefrgehriggiklrhqqwslvmesvvpsdrgnytcvvenkfgsirqtytldvler。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸153-251內(nèi)的區(qū)域和在fgfr3(seqidno:56和58)氨基酸150-248內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸157-181(tntekmekrlhavpaantvkfrcpa)內(nèi)的區(qū)域(圖9)。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸207-220(ykvrnqhwslimes)內(nèi)的區(qū)域(圖9)。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiib中與seqidno:52對(duì)齊的區(qū)域。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiic中與seqidno:54對(duì)齊的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiib(seqidno:52)氨基酸157-181(tntekmekrlhavpaantvkfrcpa)。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiic(seqidno:54)氨基酸157-181。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸207-220(ykvrnqhwslimes)(圖9)。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiib(seqidno:52)氨基酸207-220。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2-iiic(seqidno:54)氨基酸207-220。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸157-181(tntekmekrlhavpaantvkfrcpa)內(nèi)的區(qū)域和在fgfr2-iiib(seqidno:52和54)氨基酸207-220(ykvrnqhwslimes)內(nèi)的區(qū)域。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2(seqidno:52和54)氨基酸157-181(tntekmekrlhavpaantvkfrcpa)和fgfr2-iiib(seqidno:52和54)氨基酸207-220(ykvrnqhwslimes)。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiib(seqidno:56)氨基酸154-178(trpermdkkllavpaantvrfrcpa)內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiic(seqidno:58)氨基酸154-178(trpermdkkllavpaantvrfrcpa)內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiib(seqidno:56)氨基酸204-217(iklrhqqwslvmes)內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiic(seqidno:58)氨基酸204-217(iklrhqqwslvmes)內(nèi)的區(qū)域。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3-iiib中與seqidno:56對(duì)齊的區(qū)域。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3-iiib中與seqidno:58對(duì)齊的區(qū)域。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3-iiib(seqidno:56)氨基酸154-178(trpermdkkllavpaantvrfrcpa)。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3-iiic(seqidno:58)氨基酸154-178(trpermdkkllavpaantvrfrcpa)。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3-iiib(seqidno:56)氨基酸204-217(iklrhqqwslvmes)。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3-iiic(seqidno:58)氨基酸204-217(iklrhqqwslvmes)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2的下述表位：tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和ykvrnqhwslimes(seqidno:92)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr3的下述表位：trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合下述表位：fgfr2:tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和ykvrnqhwslimes(seqidno:92)，和fgfr3:trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91-94。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91和92。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91-93。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91，93，和94。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91和94。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:92-94。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:92和93。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:92和94。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:93和91。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91，92，和94。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合seqidno:91-94中提供的任兩種或更多種表位的組合。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2-iiib(seqidno:52)氨基酸153-251內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2-iiic(seqidno:54)氨基酸153-251內(nèi)的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2-iiib(seqidno:52)和fgfr2-iiic(seqidno:54)氨基酸153-251內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiib(seqidno:56)氨基酸150-248內(nèi)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiib(seqidno:58)氨基酸150-248內(nèi)的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr3-iiib(seqidno:56)和fgfr3-iiic(seqidno:58)氨基酸150-248內(nèi)的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合在fgfr2-iiib(seqidno:52)和/或fgfr2-iiic(seqidno:54)氨基酸153-251內(nèi)的區(qū)域和在fgfr3-iiib(seqidno:56)和/或fgfr3-iiic(seqidno:58)氨基酸150-248內(nèi)的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含一個(gè)或多個(gè)選自fgfr2(例如seqidno:52和54)t157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181的氨基酸的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離4?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離4?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離3.5?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離3.5?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離3.0埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離3.0?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸t(yī)157，n158，t159，e160，k161，m162，e163，k164，r165，l166，h167，a168，v169，p170，a171，a172，n173，t174，v175，k176，f177，r178，c179，p180，和a181距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或該一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為約1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，和/或12個(gè)氨基酸和/或氨基酸殘基任一。在一些實(shí)施方案中，該表位是通過結(jié)晶學(xué)(例如實(shí)施例中描述的結(jié)晶學(xué)方法)測(cè)定的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合人fgfr2(hfgfr2)(例如seqidno:52和54)。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含一個(gè)或多個(gè)選自fgfr2(例如seqidno:52和54)y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220的氨基酸的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離4?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離4?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離3.5?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離3.5埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離3.0?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr2時(shí)與fgfr2(例如seqidno:52和54)氨基酸y207，k208，v209，r210，n211，q212，h213，w214，s215，l216，i217，m218，e219，和s220距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或該一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為約1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，和/或12個(gè)氨基酸和/或氨基酸殘基任一。在一些實(shí)施方案中，該表位是通過結(jié)晶學(xué)(例如實(shí)施例中描述的結(jié)晶學(xué)方法)測(cè)定的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合人fgfr2(hfgfr2)(例如seqidno:52和54)。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含一個(gè)或多個(gè)選自fgfr3(例如seqidno:56和58)t154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178的氨基酸的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離4?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離4埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離3.5?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離3.5?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離3.0埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸t(yī)154，r155，p156，e157，r158，m159，d160，k161，k162，l163，l164，a165，v166，p167，a168，a169，n170，t171，v172，r173，f174，r175，c176，p177，和a178距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或該一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為約1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，和/或12個(gè)氨基酸和/或氨基酸殘基任一。在一些實(shí)施方案中，該表位是通過結(jié)晶學(xué)(例如實(shí)施例中描述的結(jié)晶學(xué)方法)測(cè)定的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合人fgfr3(hfgfr3)(例如seqidno:56和58)。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含一個(gè)或多個(gè)選自fgfr3(例如seqidno:56和58)i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217的氨基酸的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合包含fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離4?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離4?；蚋佟Ｔ谝恍?shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離3.5埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離3.5埃或更少。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與一個(gè)或多個(gè)fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體在結(jié)合至fgfr3時(shí)與fgfr3(例如seqidno:56和58)氨基酸i204，k205，l206，r207，h208，q209，q210，w211，s212，l213，v214，m215，e216，和s217距離4.0，3.75，3.5，3.25，或3.0?；蚋?。在一些實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或該一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為約1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，和/或12個(gè)氨基酸和/或氨基酸殘基任一。在一些實(shí)施方案中，該表位是通過結(jié)晶學(xué)(例如實(shí)施例中描述的結(jié)晶學(xué)方法)測(cè)定的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合人fgfr3(hfgfr3)(例如seqidno:56和58)。在具體的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2上選自seqidno:91和92的一種表位和fgfr3上選自seqidno:93和94的一種表位。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2上包含seqidno:91和92的兩種表位和fgfr3上選自seqidno:93和94的一種表位。在某些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2上選自seqidno:91和92的一種表位和fgfr3上包含seqidno:93和94的兩種表位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體結(jié)合fgfr2上包含seqidno:91和92的兩種表位和fgfr3上包含seqidno:93和94的兩種表位(圖9)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抗fgfr2/3抗體，其結(jié)合包含下述氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成的多肽：tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和/或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抗fgfr2/3抗體，其結(jié)合包含下述氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成的多肽：trrermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和/或iklrhqqwslvmes(seqidno:94)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抗fgfr2/3抗體，其結(jié)合包含下述氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成的多肽：tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)和trrermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)或iklrhqqwslvmes(seqidno:94)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體特異性結(jié)合與序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和/或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體特異性結(jié)合與序列trrermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和/或iklrhqqwslvmes(seqidno:94)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體特異性結(jié)合與序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的氨基酸序列和與序列trrermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)或iklrhqqwslvmes(seqidno:94)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解如何比對(duì)fgfr3序列以鑒定各自fgfr3序列之間的對(duì)應(yīng)殘基。類似地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解如何比對(duì)fgfr2序列以鑒定各自fgfr2序列之間的對(duì)應(yīng)殘基。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抗fgfr2/3抗體，其與上文所述任何抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)fgfr3和/或fgfr2的結(jié)合。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抗fgfr2/3抗體，其與上文所述任何抗體結(jié)合fgfr3和/或fgfr2上相同或相似表位。如本領(lǐng)域所知道的，及如本文中更詳細(xì)描述的，描述抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可以有所變化，這取決于本領(lǐng)域中已知的背景和各種定義(如下文所述的)?？勺冇騼?nèi)的有些位置可以看作雜合高變位置，因?yàn)檫@些位置在一組標(biāo)準(zhǔn)下可認(rèn)為在高變區(qū)內(nèi)，而在不同的一組標(biāo)準(zhǔn)下被認(rèn)為在高變區(qū)外。在延伸的高變區(qū)中也能找到這些位置中的一處或多處(如下文進(jìn)一步定義的)。在有些實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。在其它實(shí)施方案中，該抗體是多克隆抗體。在有些實(shí)施方案中，該抗體選自下組：嵌合抗體，親和力成熟抗體，人源化抗體和人抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗體是抗體片段。在有些實(shí)施方案中，該抗體是fab，fab′，fab′-sh，f(ab′)2，或scfv。在一些實(shí)施方案中，該fgfr2/3抗體是包含fc區(qū)的單臂抗體(即重鏈可變域和輕鏈可變域形成單一抗原結(jié)合臂)，其中該fc區(qū)包含第一和第二fc多肽，其中該第一和第二fc多肽以復(fù)合物存在并形成與包含所述抗原結(jié)合臂的fab分子相比提高所述抗體片段的穩(wěn)定性的fc區(qū)。參見例如wo2006/015371。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是嵌合抗體，例如如下的抗體，其包含來自非人供體的抗原結(jié)合序列，且該序列被嫁接至異源的非人，人，或人源化序列(例如框架和/或恒定域序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該非人供體是小鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列是合成的，例如通過誘變得到的(例如噬菌體展示篩選等)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體具有鼠v區(qū)和人c區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鼠輕鏈v區(qū)是融合至人卡帕(κ)輕鏈的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該鼠重鏈v區(qū)是融合至人igg1c區(qū)的。本發(fā)明的人源化抗體包括那些在框架區(qū)(fr)中具有氨基酸替代的及在所嫁接的cdr中具有改變的親和力成熟變體。cdr或fr中的替代氨基酸不限于那些存在于供體或受體抗體中的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體進(jìn)一步包含fc區(qū)中的，導(dǎo)致改善的效應(yīng)器功能(包括增強(qiáng)的cdc和/或adcc功能和b細(xì)胞殺傷)的氨基酸殘基改變。本發(fā)明的其它抗體包括那些具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的特定改變的那些抗體。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含fc區(qū)中的，導(dǎo)致降低的效應(yīng)器功能(例如降低的cdc和/或adcc功能和/或降低的b細(xì)胞殺傷)的氨基酸殘基改變。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體以降低的對(duì)人補(bǔ)體因子c1q和/或天然殺傷(nk)細(xì)胞上人fc受體的結(jié)合為特征。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體以降低的對(duì)人fcγri，fcγriia，和/或fcγriiia的結(jié)合(諸如結(jié)合缺失)為特征。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是屬于igg類的(例如igg1或igg4)且包含e233，l234，g236，d265，d270，n297，e318，k320，k322，a327，a330，p331，和/或p329(編號(hào)方式依照eu索引)中的至少一處突變。在有些實(shí)施方案中，該抗體包含突變l234a/l235a或d265a/n297a。在該抗體包含fc區(qū)的情況中，可以改變其附著的碳水化合物。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)no.us2003/0157108中描述了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)附著于抗體fc區(qū)的抗體。還參見us2004/0093621。wo2003/011878和美國(guó)專利no.6,602,684中提到了附著于抗體fc區(qū)的碳水化合物中有兩分型n-乙?；咸前?glcnac)的抗體。wo1997/30087中報(bào)告了附著于抗體fc區(qū)的寡糖中有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有改變的碳水化合物附著于其fc區(qū)的抗體，還參見wo1998/58964和wo1999/22764。關(guān)于具有修飾的糖基化的抗原結(jié)合分子，還參見us2005/0123546。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本文中提供的任一抗原結(jié)合序列的fgfr3結(jié)合多肽，其中該fgfr3結(jié)合多肽特異性結(jié)合fgfr3，例如人和/或食蟹猴和/或小鼠fgfr3。本發(fā)明的抗體結(jié)合(諸如特異性結(jié)合)fgfr3(例如fgfr3-iiib和/或fgfr3-iiic)和fgfr2(例如fgfr2-iiib和/或fgfr2-iiic)，而且在一些實(shí)施方案中，可調(diào)控(例如抑制)fgfr3和/或fgfr2信號(hào)傳導(dǎo)(諸如fgfr3磷酸化)和/或任何生物學(xué)有關(guān)fgfr3和/或fgfr3配體生物學(xué)途徑的破壞和/或任何生物學(xué)有關(guān)fgfr2和/或fgfr2配體生物學(xué)途徑的破壞，和/或腫瘤，細(xì)胞增殖性病癥或癌癥的治療和/或預(yù)防；和/或與fgfr3和/或fgfr2表達(dá)和/或活性(諸如升高的fgfr3和/或fgfr2表達(dá)和/或活性)有關(guān)的病癥的治療或預(yù)防中的一個(gè)或多個(gè)方面。在一些實(shí)施方案中，該fgfr2/3抗體特異性結(jié)合由fgfr3(例如人或小鼠fgfr3)和/或fgfr2(例如人或小鼠fgfr3)組成或本質(zhì)上由其組成的多肽。在一些實(shí)施方案中，該抗體以1x10-7m的kd或更高親和力特異性結(jié)合fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該抗體以1x10-7m的kd或更高親和力特異性結(jié)合fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該抗體以1x10-7m的kd或更高親和力特異性結(jié)合fgfr3和fgf2。在一些實(shí)施方案中，該本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體不是美國(guó)專利申請(qǐng)no.2005/0147612中描述的抗fgfr3抗體(例如抗體mspro2，mspro12，mspro59，mspro11，mspro21，mspro24，mspro26，mspro28，mspro29，mspro43，mspro55)，rauchenbergeretal,jbiolchem278(40):38194-38205(2003)中描述的抗體；pct申請(qǐng)no.wo2006/048877中描述的抗體(例如抗體pro-001)，martinez-torrecuadradaetal,molcancerther(2008)7(4):862-873中描述的抗體(例如scfvαfgfr33c)，direnzo,retal(2007)proceedingsofaacrannualmeeting,abstractno.2080中描述的抗體(例如d11)，或wo2010/002862中描述的抗體(例如抗體15d8，27h2，4e7，2g4，20b4)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的抗體及載劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載劑是藥學(xué)可接受的。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了核酸，其編碼本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了載體，其包含本發(fā)明的核酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的核酸及載劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載劑是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的核酸或載體。載體可以是任何類型的，例如重組載體，諸如表達(dá)載體?？墒褂枚喾N宿主細(xì)胞中任一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如中國(guó)倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明抗體的方法。例如，本發(fā)明提供了制備抗fgfr2/3抗體(如本文中所定義的，其包括全長(zhǎng)抗體及其片段)的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的編碼該抗體的重組載體，并回收該抗體。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括培養(yǎng)包含編碼該抗體的核酸的宿主細(xì)胞，使得該核酸表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，上述方法進(jìn)一步包括自宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收該抗體。在一些實(shí)施方案中，自宿主細(xì)胞培養(yǎng)液回收該抗體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將回收的抗體與藥學(xué)可接受載劑，賦形劑，或載劑組合以制備包含人源化抗體的藥物配制劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制品，其包含容器；和裝在該容器內(nèi)的組合物，其中所述組合物包含一種或多種本發(fā)明的fgfr2/3抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含抗體的組合物進(jìn)一步包含載劑，所述載劑在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制品進(jìn)一步包含關(guān)于對(duì)個(gè)體施用組合物(例如抗體)的說明書(諸如關(guān)于本文中所描述的任何方法的說明書)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含裝有組合物的第一容器，所述組合物包含一種或多種本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體；和裝有緩沖液的第二容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含抗體的組合物進(jìn)一步包含載劑，所述載劑在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于對(duì)個(gè)體施用組合物(例如抗體)的說明書。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其作為藥物使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在治療或預(yù)防病癥，諸如與fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況中使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在治療或預(yù)防病癥，諸如與fgfr2活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況中使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在治療或預(yù)防病癥，諸如與fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況中使用。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在治療或預(yù)防病癥，諸如骨骼病癥中使用。在一些實(shí)施方案中，該病癥為軟骨發(fā)育不全(achondroplasia)，軟骨發(fā)育不良(hypochondroplasia)，侏儒癥(dwarfism)，異位發(fā)育不良(thantophoricdysplasi)(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征(craniosynostosissyndrome)。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在降低細(xì)胞增殖中使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在殺傷細(xì)胞中使用。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是通過adcc殺傷的。在一些實(shí)施方案中，該抗體為裸的抗體。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr2和fgfr3。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體，其在消減細(xì)胞，諸如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中使用。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是通過adcc殺傷的。在一些實(shí)施方案中，該抗體為裸的抗體。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體在制備用于病癥，諸如與fgfr3，fgfr2，或fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為骨骼病癥，例如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸在制備用于病癥，諸如與fgfr3，fgfr2，或fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為骨骼病癥，例如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達(dá)載體在制備用于病癥，諸如與fgfr3，fgfr2，或fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為骨骼病癥，例如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在還有另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備用于病癥，諸如與fgfr3，fgfr2，或fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為骨骼病癥，例如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在制備用于病癥，諸如與fgfr3，fgfr2，或fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為骨骼病癥，例如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的試劑盒在制備用于病癥，諸如與fgfr3，fgfr2，或fgfr2和fgfr3活化和/或表達(dá)(在一些實(shí)施方案中，過表達(dá))有關(guān)的病理狀況的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該病癥為癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在一些實(shí)施方案中，該癌癥，腫瘤，和/或細(xì)胞增殖性病癥為多發(fā)性骨髓瘤或膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌或肝癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為骨骼病癥，例如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體在制備用于抑制細(xì)胞增殖的藥物中的用途。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體在制備用于細(xì)胞殺傷的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是通過adcc殺傷的。在一些實(shí)施方案中，該抗體為裸的抗體。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3和fgfr2。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體在制備用于消減細(xì)胞，諸如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是通過adcc殺傷的。在一些實(shí)施方案中，該抗體為裸的抗體。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3和fgfr2。本發(fā)明提供了對(duì)于調(diào)控與fgfr3的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)，諸如升高的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)或不想要的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的病癥有用的方法和組合物。本發(fā)明提供了對(duì)于調(diào)控與fgfr2的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)，諸如升高的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)或不想要的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的病癥有用的方法和組合物。本發(fā)明提供了對(duì)于調(diào)控與fgfr3和fgfr2的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)，諸如升高的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)或不想要的表達(dá)和/或信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的病癥有用的方法和組合物。本發(fā)明的方法可用于影響任何合適病理狀態(tài)。本文中描述了例示性病癥，而且包括選自下組的癌癥：非小細(xì)胞肺癌，卵巢癌，甲狀腺癌，睪丸癌，子宮內(nèi)膜癌，頭頸癌，腦癌(例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤或腦膜瘤)，皮膚癌(例如黑素瘤，基底細(xì)胞癌，或鱗狀細(xì)胞癌)，膀胱癌(例如移行細(xì)胞癌)，乳腺癌，胃癌，結(jié)腸直腸癌(crc)，肝細(xì)胞癌，宮頸癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，和血液學(xué)惡性(例如t細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血病(t-all)，b細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血病(b-all)，急性髓性白血病(aml)，b細(xì)胞惡性，何杰金(hodgkin)淋巴瘤，和多發(fā)性骨髓瘤)。在一些實(shí)施方案中，該病癥為侵入性移行細(xì)胞癌。在一些實(shí)施方案中，該病癥為多發(fā)性骨髓瘤。另外的例示性病癥包括骨骼病癥，諸如軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3，擴(kuò)增的fgfr3，易位的fgfr3，和/或突變的fgfr3。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)活化的fgfr3。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)易位的fgfr3(例如t(4；14)易位)。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)組成性fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該組成性fgfr3包含酪氨酸激酶域和/或近膜域和/或配體結(jié)合域中的突變。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)配體不依賴性fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)配體依賴性fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibs248c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibs248c和/或fgfr3-iiics248c。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibk652e對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibk652e和/或fgfr3-iiick650e。fgfr3包含與fgfr3-iiibs249c對(duì)應(yīng)的突變。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibs249c和/或fgfr3-iiics249c。在一個(gè)方面，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibg372c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibg372c和/或fgfr3-iiicg370c。在一個(gè)方面，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiiby375c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiiby375c和/或fgfr3-iiicy373c。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibk652e和(b)fgfr3-iiibr248c，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3iiibg372c中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibr248c和(b)fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibg372c和(b)fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibr248c中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibr248c，fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)相對(duì)于對(duì)照樣品(例如正常組織的樣品)或水平升高水平的磷酸-fgfr3，磷酸-frs2和/或磷酸-mapk。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)活化的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)易位的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)組成性fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)配體不依賴性fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)配體依賴性fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)包含突變的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)：1)fgfr3，擴(kuò)增的fgfr3，易位的fgfr3，和/或突變的fgfr3和2)fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)活化的fgfr3和如上文描述的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)易位的fgfr3(例如t(4；14)易位)和如上文描述的fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)組成性fgfr3和如上文描述的fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該組成性fgfr3包含酪氨酸激酶域和/或近膜域和/或配體結(jié)合域中的突變。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)配體不依賴性fgfr3和如上文描述的fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)配體依賴性fgfr3和如上文描述的fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibs248c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibs248c和/或fgfr3-iiics248c和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibk652e對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibk652e和/或fgfr3-iiick650e和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibs249c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibs249c和/或fgfr3-iiics249c和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一個(gè)方面，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiibg372c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiibg372c和/或fgfr3-iiicg370c和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一個(gè)方面，該癌表達(dá)包含與fgfr3-iiiby375c對(duì)應(yīng)的突變的fgfr3和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)fgfr3-iiiby375c和/或fgfr3-iiicy373c和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibk652e和(b)fgfr3-iiibr248c，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3iiibg372c中的一種或多種和(c)如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibr248c和(b)fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c中的一種或多種和(c)如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibg372c和(b)fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibr248c中的一種或多種和(c)如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(a)fgfr3-iiibr248c，fgfr3-iiibk652e，fgfr3-iiiby375c，fgfr3-iiibs249c，和fgfr3-iiibg372c，和(b)如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在某些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)相對(duì)于對(duì)照樣品(例如正常組織的樣品)或水平升高水平的磷酸-fgfr3，磷酸-frs2和/或磷酸-mapk和如上文描述的fgfr2(例如fgfr2，擴(kuò)增的fgfr2，易位的fgfr2，和/或突變的fgfr2)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(例如在細(xì)胞表面上)約10,000個(gè)fgfr3分子每個(gè)細(xì)胞或更多(諸如11,000，12,000，13,000，14,000，15,000，16,000，17,000，18,000或更多個(gè)fgfr3受體)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)約13000個(gè)fgfr3分子。在其它實(shí)施方案中，該癌表達(dá)約5000，6000，7000，8000，或更多個(gè)fgfr3分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)少于約4000，3000，2000，1000，或更少個(gè)fgfr3分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)少于約1000個(gè)fgfr3分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(例如在細(xì)胞表面上)約10,000個(gè)fgfr2分子每個(gè)細(xì)胞或更多(諸如11,000，12,000，13,000，14,000，15,000，16,000，17,000，18,000或更多個(gè)fgfr2受體)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)約13000個(gè)fgfr2分子。在其它實(shí)施方案中，該癌表達(dá)約5000，6000，7000，8000，或更多個(gè)fgfr2分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)少于約4000，3000，2000，1000，或更少個(gè)fgfr2分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)少于約1000個(gè)fgfr2分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)(例如在細(xì)胞表面上)約10,000個(gè)fgfr3和10,000個(gè)fgfr2分子每個(gè)細(xì)胞或更多(諸如11,000，12,000，13,000，14,000，15,000，16,000，17,000，18,000或更多個(gè)fgfr3受體和11,000，12,000，13,000，14,000，15,000，16,000，17,000，18,000或更多個(gè)fgfr2受體)。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)約13000個(gè)fgfr3分子和13000個(gè)fgfr2分子。在其它實(shí)施方案中，該癌表達(dá)約5000，6000，7000，8000，或更多個(gè)fgfr3分子和約5000，6000，7000，8000，或更多個(gè)fgfr2分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)少于約4000，3000，2000，1000，或更少個(gè)fgfr3分子和少于約4000，3000，2000，1000，或更少個(gè)fgfr2分子。在一些實(shí)施方案中，該癌表達(dá)少于約1000個(gè)fgfr3分子和少于約1000個(gè)fgfr2分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法所靶向的細(xì)胞是癌細(xì)胞。例如，癌細(xì)胞可以是選自下組的癌細(xì)胞：乳腺癌細(xì)胞，結(jié)腸直腸癌細(xì)胞，肺癌細(xì)胞(例如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，甲狀腺癌細(xì)胞，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，睪丸癌細(xì)胞，乳頭狀癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞，骨源性肉瘤細(xì)胞，腎癌細(xì)胞，肝細(xì)胞癌細(xì)胞，膀胱癌細(xì)胞(例如移行細(xì)胞癌細(xì)胞)，胃癌細(xì)胞，頭頸鱗癌細(xì)胞，黑素瘤細(xì)胞，白血病細(xì)胞，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(例如包含t(4:14)fgfr3易位的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)和結(jié)腸腺瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法所靶向的細(xì)胞是高度增殖性和/或增生性細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法所靶向的細(xì)胞是發(fā)育異常細(xì)胞。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法所靶向的細(xì)胞是轉(zhuǎn)移性細(xì)胞。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在受試者中抑制細(xì)胞增殖的方法，該方法包含對(duì)該受試者施用有效量的抗fgfr2/3抗體以降低細(xì)胞增殖。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在受試者中殺傷細(xì)胞的方法，該方法包含對(duì)該受試者施用有效量的抗fgfr2/3抗體以殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是通過adcc殺傷的。在一些實(shí)施方案中，該抗體是裸的抗體。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr2。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr3和fgfr2。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在受試者中消減細(xì)胞(諸如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)的方法，該方法包含對(duì)該受試者施用有效量的抗fgfr2/3抗體以殺傷細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是通過adcc殺傷的。在一些實(shí)施方案中，該抗體是裸的抗體。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞過表達(dá)fgfr2/3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防骨骼病癥的方法。在一些實(shí)施方案中，該病癥是軟骨發(fā)育不全，軟骨發(fā)育不良，侏儒癥，異位發(fā)育不良(td；臨床形式td1和tdii)，或顱縫早閉綜合征。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包含另外的治療步驟。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包含將被靶定的細(xì)胞和/或組織(例如癌細(xì)胞)暴露于輻射處理(radiationtreatment)或化療劑的步驟。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如下的方法，其包括與有效量的另一種治療劑組合地施用有效量的抗fgfr2/3抗體，所述另一種治療劑諸如抗血管發(fā)生劑，另一種抗體，化療劑，細(xì)胞毒劑，免疫抑制劑，前體藥物，細(xì)胞因子，細(xì)胞毒性放療，類固醇，止吐藥，癌癥疫苗，鎮(zhèn)痛藥，或生長(zhǎng)抑制劑。例如，與抗癌劑或抗血管發(fā)生劑組合地使用抗fgfr2/3抗體以治療各種贅生性或非贅生性疾患。在特定的例子中，該抗fgfr2/3抗體與velcade，revlimid，他莫昔芬(tamoxifen)，來曲唑(letrozole)，依西美坦(exemestane)，阿那曲唑(anastrozole)，伊立替康(irinotecan)，西妥昔單抗(cetuximab)，氟維司群(fulvestrant)，長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)，貝伐單抗(bevacizumab)，長(zhǎng)春新堿(vincristine)，順鉑(cisplatin)，吉西他濱(gemcitabine)，甲氨蝶呤(methotrexate)，長(zhǎng)春堿(vinblastine)，卡鉑(carboplatin)，帕利他賽(paclitaxel)，多西他賽(docetaxel)，培美曲塞(pemetrexed)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，多柔比星(doxorubicin)，硼替佐米(bortezomib)，來那度胺(lenalidomide)，地塞米松(dexamethasone)，美法侖(melphalin)，潑尼松(prednisone)，長(zhǎng)春新堿(vincristine)，和/或沙利度胺(thalidomide)組合使用。根據(jù)要治療的具體癌癥適應(yīng)證，本發(fā)明的組合療法可以與另外的治療劑諸如化療劑或另外的療法諸如放療或手術(shù)組合。許多已知的化療劑可以在本發(fā)明的組合療法中使用。優(yōu)選地，會(huì)使用那些作為具體適應(yīng)證的標(biāo)準(zhǔn)治療的化療劑。要組合使用的每種治療劑的劑量或頻率優(yōu)選與相應(yīng)藥劑在沒有其它藥劑的情況中使用時(shí)的劑量或頻率相同，或小于相應(yīng)藥劑在沒有其它藥劑的情況中使用時(shí)的劑量或頻率。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本文中描述的抗fgfr2/3抗體任一，其中該抗fgfr2/3抗體包含可檢測(cè)標(biāo)記物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本文中描述的抗fgfr2/3抗體任一和fgfr2/3的復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，該復(fù)合物在體內(nèi)或在體外。在一些實(shí)施方案中，該復(fù)合物包含癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該抗fgfr2/3抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的。本公開文本還提供了結(jié)合β-klotho(klb)的抗體和結(jié)合klb和fgfr2和/或fgfr3二者的雙特異性抗體(“fgfr2/3+klb雙特異性抗體”)，及其使用方法。在具體的實(shí)施方案中，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于治療代謝疾病和病癥，包括重量減輕和改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝。在某些實(shí)施方案中，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于在對(duì)肝沒有顯著影響且骨量沒有顯著損失的情況下治療代謝病癥或疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體用于治療非酒精性脂肪性肝炎(nash)。在某些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體是一種分離的抗體。在某些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體能結(jié)合klb和fgfr2，klb和fgfr3二者，或klb，fgfr2，和fgfr3所有三者，其中該抗體結(jié)合klb的c端域。在某些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體結(jié)合包括氨基酸序列ssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitas(seqidno:103)的klb片段。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還結(jié)合在包括氨基酸序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)的fgfr2片段內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還結(jié)合在包括氨基酸序列trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)的fgfr3片段內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還結(jié)合在包括氨基酸序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)的fgfr2片段內(nèi)的表位并結(jié)合在包括氨基酸序列trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)的fgfr3片段內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還結(jié)合在與氨基酸序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和/或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的fgfr2片段內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還結(jié)合在與氨基酸序列trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的fgfr3片段內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還結(jié)合在與氨基酸序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和/或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的fgfr2片段內(nèi)的表位且還結(jié)合在與氨基酸序列trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性或相似性的fgfr3片段內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還在seqidno:52或54的157至181的氨基酸序列范圍內(nèi)結(jié)合fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還在seqidno:52或54的207至220的氨基酸序列范圍內(nèi)結(jié)合fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb的雙特異性抗體還在seqidno:52或54的157至181和207至220的氨基酸序列范圍內(nèi)結(jié)合fgfr2。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合klb和fgfr2/3的雙特異性抗體抑制組成性fgfr2和/或fgfr3活性。在某些實(shí)施方案中，該組成性fgfr2/3活性為配體依賴性組成性fgfr2/3活性。在某些實(shí)施方案中，該組成性fgfr2/3活性為配體不依賴性組成性fgfr2/3活性。在某些實(shí)施方案中，該組成性fgfr2/3活性為fgfr2和fgfr3活性。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體在體內(nèi)降低血液葡萄糖水平。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體并不顯著影響骨密度。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體對(duì)肝沒有顯著影響。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體以比fgf21誘導(dǎo)顯著更低水平在肝中誘導(dǎo)erk和mek磷酸化。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體以10-8m至10-13m的kd結(jié)合klb。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體能以10-8m至10-13m的kd結(jié)合fgfr2和/或fgfr3蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體能以10-8m至10-13m的kd結(jié)合fgfr2和/或fgfr3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體結(jié)合klb上存在的表位。例如，而且并非為了限制，本公開文本提供了一種fgfr2/3+klb雙特異性抗體，它能與圖11a和11b中所示抗體結(jié)合klb上的相同表位。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體能與12a11或8c5抗體結(jié)合相同表位。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體能結(jié)合在klb的c端域內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體能結(jié)合由氨基酸序列ssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitas(seqidno:103)組成的klb片段。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體任一的klb臂是us20150218276(將其完整收入本文)中描述的任何klb抗體的臂。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體任一的fgfr2/3臂是本文中描述的任何fgfr2/3抗體的臂。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:104中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:105中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，第二抗體或其抗原結(jié)合部分包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與表1第2欄中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與表1第3欄中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。表1：例示性fgfr2/3抗體的hc和lc序列抗體hcseqidno:lcseqidno:2b.1.375592b.1.9576602b.1.7377612b.1.3278622b.1.8879632b.1.180642b.1.3.1081652b.1.3.128266在某些實(shí)施方案中，本公開文本的抗klb/抗fgfr1雙特異性抗體包括第一抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中該重鏈區(qū)包括具有與seqidno:106中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈區(qū)包括具有與seqidno:107中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，第二抗體或其抗原結(jié)合部分包括重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)，其中該重鏈區(qū)包括具有與表1第2欄中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈區(qū)包括具有與表1第3欄中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:104中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:105中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸；和第二抗fgfr2/3抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:66中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:82中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:106中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:107中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸；和第二抗fgfr2/3抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:82中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:66中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:106中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:107中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸；和第二抗fgfr2/3抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈包括具有與seqidno:282中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈包括具有與seqidno:283中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:106中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:107中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸；和第二抗fgfr2/3抗體或其抗原結(jié)合部分，其中輕鏈上的cdr包含具有與seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸，且其中重鏈上的cdr包含具有與seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3)至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:106中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸，且該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:107中所列序列至少95％相同的序列的氨基酸；和第二抗fgfr2/3抗體或其抗原結(jié)合部分，其中輕鏈上的cdr包含具有與seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸，且其中重鏈上的cdr包含具有與seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3)至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含選自由seqidno:230-232和236-247組成的組的氨基酸序列的hvr-h3，(b)包含選自由seqidno:123-137組成的組的氨基酸序列的hvr-l3，和(c)包含選自組由seqidno:142和248-262成的組的氨基酸序列的hvr-h2。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含選自由seqidno:230-232和236-247組成的組的氨基酸序列的hvr-h1，(b)包含選自由seqidno:142和248-262組成的組的氨基酸序列的hvr-h2，和(c)包含選自由seqidno:263-278組成的組的氨基酸序列的hvr-h3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含選自由seqidno:279-293組成的組的氨基酸序列的hvr-l1，(b)包含選自由seqidno:294-309組成的組的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含選自由seqidno:310-324組成的組的氨基酸序列的hvr-l3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含seqidno:119的氨基酸序列的hvr-h1，(b)包含seqidno:150的氨基酸序列的hvr-h2，(c)包含seqidno:166的氨基酸序列的hvr-h3，(d)包含seqidno:181的氨基酸序列的hvr-l1，(e)包含seqidno:197的氨基酸序列的hvr-l2，和(f)包含seqidno:212的氨基酸序列的hvr-l3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含seqidno:122的氨基酸序列的hvr-h1，(b)包含seqidno:153的氨基酸序列的hvr-h2，(c)包含seqidno:169的氨基酸序列的hvr-h3，(d)包含seqidno:184的氨基酸序列的hvr-l1，(e)包含seqidno:200的氨基酸序列的hvr-l2，和(f)包含seqidno:215的氨基酸序列的hvr-l3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括來自抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分的一個(gè)臂和本文中公開的fgfr2/3抗體的一個(gè)臂，該抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分選自本文中或us20150218276(將其完整收入本文)中公開的抗klb抗體任一。在具體的實(shí)施方案中，該fgfr2/3+klb雙特異性的臂選自下述組合：a)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:82(重鏈)和seqidno:66(輕鏈))的一個(gè)臂；b)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:82(重鏈)和seqidno:66(輕鏈))的一個(gè)臂；c)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；d)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；e)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:282(重鏈)和seqidno:283(輕鏈))的一個(gè)臂；f)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:282(重鏈)和seqidno:283(輕鏈))的一個(gè)臂；g)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；和h)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含seqidno:104的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和(b)包含seqidno:105的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)包含seqidno:106的氨基酸序列的重鏈和(b)包含seqidno:107的氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)方面，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含：(a)與seqidno:104的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重鏈可變區(qū)；(b)與seqidno:105的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的輕鏈可變區(qū)；和(c)(a)中的重鏈可變區(qū)和(b)中的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體是單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗體是人，人源化，或嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗體具有降低的效應(yīng)器功能。在另一個(gè)方面，本公開文本提供了一種分離的核酸，其編碼本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種宿主細(xì)胞，其包含編碼本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體的核酸。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種生成fgfr2/3+klb雙特異性抗體的方法，其包括培養(yǎng)本公開文本的宿主細(xì)胞，使得該抗體生成。在某些實(shí)施方案中，此方法進(jìn)一步包括自該宿主細(xì)胞回收該fgfr2/3+klb雙特異性抗體。本公開文本進(jìn)一步提供了一種藥物配制劑，其包含一種或多種本發(fā)明的抗體和藥學(xué)可接受載劑。具體而言，本公開文本提供了一種藥物配制劑，其包含本文中描述的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，該藥物配制劑包含另外的治療劑。在另一個(gè)方面，本公開文本提供了本發(fā)明的fgfr2/3+klb雙特異性抗體，其作為藥物使用。在某些實(shí)施方案中，該抗klb/抗fgfr1雙特異性抗體在治療代謝病癥，例如多囊卵巢綜合征(pcos)，代謝綜合征(mets)，肥胖癥，非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝病(nafld)，高脂血癥，高血壓，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，潛伏性自身免疫性糖尿病(lad)，和年輕人成熟期發(fā)作糖尿病(mody)中使用。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體在治療2型糖尿病中使用。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體在治療肥胖癥中使用。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了fgfr2/3+klb雙特異性抗體，其在治療巴爾得-別德爾綜合征，普拉德-威利綜合征，阿耳斯特雷姆綜合征，科恩綜合征，奧爾布賴特氏遺傳性骨營(yíng)養(yǎng)不良(假甲狀旁腺功能減退癥)，木匠綜合征，momo綜合征，魯賓斯坦-泰比綜合征，脆弱x綜合征和伯-福-萊三氏綜合征中使用。在某些實(shí)施方案中，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體在治療nash中使用。在另一個(gè)方面，本公開文本提供了本文中公開的fgfr2/3+klb雙特異性抗體在制造用于治療代謝病癥，例如多囊卵巢綜合征(pcos)，代謝綜合征(mets)，肥胖癥，非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝病(nafld)，高脂血癥，高血壓，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，潛伏性自身免疫性糖尿病(lad)，和年輕人成熟期發(fā)作糖尿病(mody)，和衰老及相關(guān)疾病諸如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和als的藥物中的用途。在某些實(shí)施方案中，該代謝病癥為2型糖尿病。在某些實(shí)施方案中，該代謝病癥為nash。在另一個(gè)方面，本公開文本提供了治療具有選自由多囊卵巢綜合征(pcos)，代謝綜合征(mets)，肥胖癥，非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝病(nafld)，高脂血癥，高血壓，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，潛伏性自身免疫性糖尿病(lad)，和年輕人成熟期發(fā)作糖尿病(mody)，和衰老及相關(guān)疾病諸如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和als組成的組的疾病的個(gè)體的方法，該方法包括對(duì)該個(gè)體施用有效量的一種或多種本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，該疾病為糖尿病，例如2型糖尿病。在某些實(shí)施方案中，該疾病為肥胖癥。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了治療具有選自由巴爾得-別德爾綜合征，普拉德-威利綜合征，阿耳斯特雷姆綜合征，科恩綜合征，奧爾布賴特氏遺傳性骨營(yíng)養(yǎng)不良(假甲狀旁腺功能減退癥)，木匠綜合征，momo綜合征，魯賓斯坦-泰比綜合征，脆弱x綜合征和伯-福-萊三氏綜合征組成的組的疾病和/或病癥的個(gè)體的方法，該方法包括對(duì)該個(gè)體施用有效量的一種或多種本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將另外的治療劑施用于該個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，使用一種或多種本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體的方法不影響個(gè)體中的肝功能。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于誘導(dǎo)重量減輕的方法，其包括對(duì)個(gè)體施用有效量的一種或多種本公開文本的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可作為藥物使用且包括來自抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分的一個(gè)臂和本文中公開的fgfr2/3抗體一個(gè)臂，該抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分選自本文中或us20150218276(將其完整收入本文)中公開的抗klb抗體任一。在具體的實(shí)施方案中，該能作為藥物使用的fgfr2/3+klb雙特異性抗體的臂選自下述組合：a)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:82(重鏈)和seqidno:66(輕鏈))的一個(gè)臂；b)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:82(重鏈)和seqidno:66(輕鏈))的一個(gè)臂；c)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；d)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；e)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:282(重鏈)和seqidno:283(輕鏈))的一個(gè)臂；f)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:282(重鏈)和seqidno:283(輕鏈))的一個(gè)臂；g)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；和h)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于治療代謝疾病(例如nash或相關(guān)疾病)且包括來自抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分的一個(gè)臂和本文中公開的fgfr2/3抗體的一個(gè)臂，該抗klb抗體或其抗原結(jié)合部分選自本文中或us20150218276(將其完整收入本文)中公開的抗klb抗體任一。在具體的實(shí)施方案中，該可用于治療代謝疾病(例如nash或相關(guān)疾病)的fgfr2/3+klb雙特異性抗體的臂選自下述組合：a)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:82(重鏈)和seqidno:66(輕鏈))的一個(gè)臂；b)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:82(重鏈)和seqidno:66(輕鏈))的一個(gè)臂；c)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；d)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.3.12抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:7-9(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:10-12(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；e)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:282(重鏈)和seqidno:283(輕鏈))的一個(gè)臂；f)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:282(重鏈)和seqidno:283(輕鏈))的一個(gè)臂；g)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:104(hcvr)和seqidno:105(lcvr))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂；和h)來自8c5.k4.m4l.h3.knv抗klb抗體(包含seqidno:106(重鏈)和seqidno:107(輕鏈))的一個(gè)臂和來自2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體(包含seqidno:276-278(cdrl1，cdrl2，和cdrl3)和seqidno:279-281(cdrh1，cdrh2，和cdrh3))的一個(gè)臂。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示改造的2b.1抗體對(duì)fgf7刺激的mcf-7細(xì)胞增殖的抑制效果。誤差棒代表sem。圖2a-2c顯示fgfr2d2域和mab2b.1.3的fab片段之間的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。圖2a顯示復(fù)合物的總體結(jié)構(gòu)。fgfr2-d2著色為品紅色，fab2b.1.3的重鏈綠色而輕鏈藍(lán)色。圖2b顯示fgfr2-d2:2b.1.3和fgfr3-d2d3:r3mab的結(jié)構(gòu)的覆蓋圖。前一種復(fù)合物著色與圖2a相同。fgfr3-d2d3著色為黃色，而r3mab灰色。圖2c顯示圖2b中帶框區(qū)域的放大呈現(xiàn)，顯示兩種復(fù)合物之間的結(jié)構(gòu)差異。著色方案與圖2b相同。圖3a-3d顯示r3mab變體對(duì)fgf配體的差異阻斷。圖3a顯示阻斷fgf-7結(jié)合人fgfr2-iiib。圖3b顯示阻斷fgf-1結(jié)合人fgfr2-iiic。圖3c顯示阻斷fgf-1結(jié)合人fgfr3-iiib。圖3d顯示阻斷fgf-1結(jié)合人fgfr3-iiic。圖3e顯示阻斷fgf-19結(jié)合人fgfr4。圖4a-4c顯示2b.1變體在體外抑制fgfr2信號(hào)傳導(dǎo)且在體內(nèi)阻抑異種移植物生長(zhǎng)。圖4a顯示胃癌細(xì)胞系snu-16中2b.1變體阻斷fgf7刺激的fgfr2信號(hào)傳導(dǎo)。圖4b顯示2b.1.3.10和2b.1.3.12對(duì)fgfr2依賴性snu-16異種移植物的生長(zhǎng)的影響，與對(duì)照抗體比較。圖4c顯示2b.1.3.10和2b.1.3.12對(duì)fgfr3依賴性rt112膀胱癌異種移植物的生長(zhǎng)的影響。圖5顯示fgfr3-iiib上受到r3mab接觸的表面區(qū)域(pdb3grw)。fgfr3-iiib的d2和d3域的表面以灰色顯示。r3mab的個(gè)別cdr環(huán)的接觸區(qū)域著色。每個(gè)cdr的接觸面積和它們占總體接觸面積的百分比以括弧中的數(shù)字標(biāo)注。圖6顯示使用weblogo3(crooks,g.e.,g.hon,j.m.chandoniaands.e.brenner(2004)."weblogo:asequencelogogenerator."genomeres14(6):1188-1190)制備的自噬菌體文庫為結(jié)合fgfr2-iiib選擇的cdrh2的序列標(biāo)識(shí)。圖7顯示fgfr2-d2:2b.1.3和fgfr3-d2d3:r3mab的復(fù)合物的總體結(jié)構(gòu)比對(duì)。圖8a顯示乳腺癌細(xì)胞系mfm-223x2.2中2b.1變體阻斷fgf7刺激的fgfr2信號(hào)傳導(dǎo)。圖8b顯示2b.1.3.10和2b.1.3.12對(duì)fgfr2依賴性mfm-223x2.2乳腺癌異種移植物的生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)中的小鼠顯示雌激素毒性。n＝10只每組；誤差棒代表sem。圖9a-9d顯示2b.1.3.10(即1.3.10)和2b.1.3.12(即1.3.12)抗fgfr2/3抗體的表位。圖9a顯示fgfr2-iiib序列，抗fgfr2/31.3.10和1.3.12抗體的表位為下劃線和粗體。圖9b顯示fgfr2-iiic序列，抗fgfr2/31.3.10和1.3.12抗體的表位為下劃線和粗體。圖9c顯示fgfr3-iiib序列，抗fgfr2/31.3.10和1.3.12抗體的表位為下劃線和粗體。圖9d顯示fgfr3-iiic序列，抗fgfr2/31.3.10和1.3.12抗體的表位為下劃線和粗體?？贵w2b.1.3.10結(jié)合fgfr2上由依照seqidno:52和54的殘基編號(hào)157-181和207-220的兩條β鏈構(gòu)成的表位(表位序列還見seqidno:91和92)?？贵w2b.1.3.10還結(jié)合fgfr3上由依照seqidno:56和58的殘基編號(hào)154-178和204-217的兩條β鏈構(gòu)成的表位(表位序列還見seqidno:93和94)。2b.1.3.12與2b.1.3.10結(jié)合相同表位。特別是，2b.1.3.12結(jié)合fgfr2上由殘基編號(hào)157-181和207-220的兩條β鏈構(gòu)成的表位。2b.1.3.12還結(jié)合fgfr3上由殘基編號(hào)154-178和204-217的兩條β鏈構(gòu)成的表位。圖10顯示與抗fgfr2/3抗體1.3，1.95，1.73，1.32，1.88，1.1，1.3.10，和1.3.12對(duì)應(yīng)的核酸和氨基酸seqidno的圖表。圖11a描繪17種抗klb抗體的輕鏈可變區(qū)序列。cdrl1序列依次為seqidno:279-293；cdrl2序列依次為seqidno:294-309；而cdhl3序列依次為seqidno:123-137。輕鏈可變區(qū)序列依次為seqidno:111-127。圖11b描繪17種抗klb抗體的重鏈可變區(qū)序列?？贵w的cdrh1序列依次(11f1-8c5)為seqidno:230-232和236-247；cdrh2序列依次為seqidno:142和248-262；cdrh3序列依次為seqidno:263-278?？贵w的重鏈可變區(qū)序列依次為seqidno:216-232。圖12描繪在以0.8μg/ml測(cè)量多種抗klb抗體對(duì)表達(dá)hklb的293細(xì)胞的結(jié)合的facs圖中觀察到的中值位移。圖13描繪多種抗klb抗體對(duì)hklb-ecd-his蛋白質(zhì)的相對(duì)結(jié)合。圖14a顯示小鼠klb蛋白質(zhì)的n端氨基酸序列(seqidno:165)，而且顯示由ko小鼠中的klb等位基因編碼的相應(yīng)氨基酸序列(seqidno:166)。klb基因中的一處錯(cuò)義突變導(dǎo)致ko等位基因中第二個(gè)氨基酸之后的移碼，如以紅色字母顯示的。圖14b顯示野生型(+/+)和klb敲除(-/-)小鼠中的附睪白色脂肪組織中的klb蛋白質(zhì)表達(dá)。圖14c顯示klb對(duì)于bsab20影響葡萄糖代謝是重要的。以3mpk接受4次每周注射bsab20或?qū)φ読gg的dio小鼠中的葡萄糖耐受測(cè)試(gtt)。在第23天，最后一次注射后3天，進(jìn)行g(shù)tt。在gtt之前小鼠處于hfd達(dá)20周。*p<0.05。圖15a和15b顯示snu-16異種移植物腫瘤中人fgfr2(圖15a)和fgfr3(圖15b)的檢測(cè)。裂解腫瘤樣品并提交針對(duì)人fgfr2和fgfr3蛋白質(zhì)的western印跡分析。自當(dāng)前研究收集的腫瘤顯示fgfr3的信號(hào)(圖15b，5-24道)。另外，自先前snu-16研究收集的腫瘤(圖15b，3道)和體外培養(yǎng)的snu-16細(xì)胞(圖b，4道)也顯示可檢測(cè)但更弱的fgfr3表達(dá)。圖16a-16c顯示表達(dá)并測(cè)試激動(dòng)劑活性和fgfr2，fgfr3，和fgfr4結(jié)合的7種2b1.1變體。圖16a顯示詳述抗fgfr2/3抗體變體，每種變體的cdrh1-h3的序列，和通過biacor測(cè)定法和elisa測(cè)量的fgfr3親和力的圖表。圖16b顯示變體對(duì)fgfr3的結(jié)合親和力，如通過elisa測(cè)量的。圖16c顯示變體對(duì)fgfr4的結(jié)合親和力，如通過elisa測(cè)量的。圖17a和17b顯示抗fgfr2/3抗體變體針對(duì)fgfr的活性的比較，使用螢光素酶測(cè)定法。圖17a顯示fgfr3和fgfr4活性。圖17b顯示fgfr2和fgfr1活性。圖18顯示用于選擇哪些抗fgfr2/3抗體應(yīng)當(dāng)用于fgfgr2/3+klb雙特異性抗體的抗fgfr2/3抗體變體決策矩陣。圖19a-19c顯示選定的抗fgfr2/3抗體變體的fgfr活性。圖19a顯示fgfr3活性。圖19b顯示fgfr2活性。圖19c顯示fgfr4活性。發(fā)明詳述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)及其酪氨酸激酶受體(fgfr)在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間的特定途徑，以及成年動(dòng)物中的多種多樣組織的穩(wěn)態(tài)，傷口愈合過程和某些代謝功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在人中，有4種高度同源的fgfr(fgfr1-4)和22種fgf(fgf1-14和fgf16-23)(goetzr&mohammadim(2013)exploringmechanismsoffgfsignallingthroughthelensofstructuralbiology.natrevmolcellbiol14(3):166-180；turnern&groser(2010)fibroblastgrowthfactorsignalling:fromdevelopmenttocancer.natrevcancer10(2):116-129；beenkena&mohammadim(2009)thefgffamily:biology,pathophysiologyandtherapy.natrevdrugdiscov8(3):235-253；weschej,haglundk,&haugstenem(2011)fibroblastgrowthfactorsandtheirreceptorsincancer.biochemj437(2):199-213)。fgfr包含胞外區(qū)(其具有3個(gè)免疫球蛋白域(d1，d2和d3))，單次跨膜區(qū)和分裂胞質(zhì)激酶模塊(goetzr&mohammadim(2013)exploringmechanismsoffgfsignallingthroughthelensofstructuralbiology.natrevmolcellbiol14(3):166-180；mohammadim,olsensk,&ibrahimioa(2005)structuralbasisforfibroblastgrowthfactorreceptoractivation.cytokinegrowthfactorrev16(2):107-137)?？勺兗艚赢a(chǎn)生fgfr1-3的兩種主要變體，稱作同種型iiib和iiic，它們的區(qū)別在于第二半d3及繼而配體結(jié)合特異性(chang,h.,stewart,a.k.,qi,x.y.,li,z.h.,yi,q.l.,andtrudel,s.2005.immunohistochemistryaccuratelypredictsfgfr3aberrantexpressionandt(4；14)inmultiplemyeloma.blood106:353-355)。失調(diào)的fgfr1-4信號(hào)傳導(dǎo)與數(shù)種癌癥類型中的發(fā)病機(jī)理有關(guān)(l′hote,c.g.,andknowles,m.a.2005.cellresponsestofgfr3signalling:growth,differentiationandapoptosis.expcellres304:417-431；dailey,l.,ambrosetti,d.,mansukhani,a.,andbasilico,c.2005.mechanismsunderlyingdifferentialresponsestofgfsignaling.cytokinegrowthfactorrev16:233-247)?；蚪Mfgfr改變(包括基因擴(kuò)增，染色體易位和活化性突變)能驅(qū)動(dòng)fgf途徑的異?；罨按龠M(jìn)正常細(xì)胞的致瘤轉(zhuǎn)化。在約10％的胃和約4％的三重陰性乳腺癌中發(fā)生fgfr2基因擴(kuò)增(chesi,m.,nardini,e.,brents,l.a.,schrock,e.,ried,t.,kuehl,w.m.,andbergsagel,p.l.1997.frequenttranslocationt(4；14)(p16.3；q32.3)inmultiplemyelomaisassociatedwithincreasedexpressionandactivatingmutationsoffibroblastgrowthfactorreceptor3.natgenet16:260-264；fonseca,r.,blood,e.,rue,m.,harrington,d.,oken,m.m.,kyle,r.a.,dewald,g.w.,vanness,b.,vanwier,s.a.,henderson,k.j.,etal.2003.clinicalandbiologicimplicationsofrecurrentgenomicaberrationsinmyeloma.blood101:4569-4575；moreau,p.,facon,t.,leleu,x.,morineau,n.,huyghe,p.,harousseau,j.l.,bataille,r.,andavet-loiseau,h.2002.recurrent14q32translocationsdeterminetheprognosisofmultiplemyeloma,especiallyinpatientsreceivingintensivechemotherapy.blood100:1579-1583)，而fgfr3擴(kuò)增與膀胱癌的特定子集有關(guān)(moreau,p.,facon,t.,leleu,x.,morineau,n.,huyghe,p.,harousseau,j.l.,bataille,r.,andavet-loiseau,h.2002.recurrent14q32translocationsdeterminetheprognosisofmultiplemyeloma,especiallyinpatientsreceivingintensivechemotherapy.blood100:1579-1583；pollett,j.b.,trudel,s.,stern,d.,li,z.h.,andstewart,a.k.2002.overexpressionofthemyeloma-associatedoncogenefibroblastgrowthfactorreceptor3confersdexamethasoneresistance.blood100:3819-3821)。錯(cuò)義fgfr突變也見于多種類型的癌癥(l′hote,c.g.,andknowles,m.a.2005.cellresponsestofgfr3signalling:growth,differentiationandapoptosis.expcellres304:417-431；agazie,y.m.,movilla,n.,ischenko,i.,andhayman,m.j.2003.thephosphotyrosinephosphataseshp2isacriticalmediatoroftransformationinducedbytheoncogenicfibroblastgrowthfactorreceptor3.oncogene22:6909-6918)。具體而言，d2和d3之間的接頭區(qū)中的氨基酸替代，例如fgfr2中的s252w和fgfr3中的s249c，提升fgf驅(qū)動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤細(xì)胞增殖并代表體細(xì)胞突變的熱點(diǎn)(agazie,y.m.,movilla,n.,ischenko,i.,andhayman,m.j.2003.thephosphotyrosinephosphataseshp2isacriticalmediatoroftransformationinducedbytheoncogenicfibroblastgrowthfactorreceptor3.oncogene22:6909-6918；ronchetti,d.,greco,a.,compasso,s.,colombo,g.,dell′era,p.,otsuki,t.,lombardi,l.,andneri,a.2001.deregulatedfgfr3mutantsinmultiplemyelomacelllineswitht(4；14):comparativeanalysisofy373c,k650eandthenovelg384dmutations.oncogene20:3553-3562)。活化性突變也在fgfr的酪氨酸激酶區(qū)中發(fā)生(chesi,m.,brents,l.a.,ely,s.a.,bais,c.,robbiani,d.f.,mesri,e.a.,kuehl,w.m.,andbergsagel,p.l.2001.activatedfibroblastgrowthfactorreceptor3isanoncogenethatcontributestotumorprogressioninmultiplemyeloma.blood97:729-736)。靶向fgf-fgfr途徑是癌癥藥物開發(fā)的一個(gè)主要焦點(diǎn)區(qū)域。這種努力包括小分子酪氨酸激酶抑制劑(tki)，阻斷性抗體，以及配體陷阱(moreau,p.,facon,t.,leleu,x.,morineau,n.,huyghe,p.,harousseau,j.l.,bataille,r.,andavet-loiseau,h.2002.recurrent14q32translocationsdeterminetheprognosisofmultiplemyeloma,especiallyinpatientsreceivingintensivechemotherapy.blood100:1579-1583)。當(dāng)前的高效能fgfrtki對(duì)不同fgfr具有有限的選擇性(moreau,p.,facon,t.,leleu,x.,morineau,n.,huyghe,p.,harousseau,j.l.,bataille,r.,andavet-loiseau,h.2002.recurrent14q32translocationsdeterminetheprognosisofmultiplemyeloma,especiallyinpatientsreceivingintensivechemotherapy.blood100:1579-1583)，這可能影響它們的治療窗。例如，經(jīng)由fgfr1和共同受體klothoβ的異源復(fù)合物的fgf23信號(hào)傳導(dǎo)的破壞能在患者中導(dǎo)致高磷血癥和組織鈣化(plowright,e.e.,li,z.,bergsagel,p.l.,chesi,m.,barber,d.l.,branch,d.r.,hawley,r.g.,andstewart,a.k.2000.ectopicexpressionoffibroblastgrowthfactorreceptor3promotesmyelomacellproliferationandpreventsapoptosis.blood95:992-998；chen,j.,williams,i.r.,lee,b.h.,duclos,n.,huntly,b.j.,donoghue,d.j.,andgilliland,d.g.2005.constitutivelyactivatedfgfr3mutantssignalthroughplcgamma-dependentand-independentpathwaysforhematopoietictransformation.blood106:328-337)，而經(jīng)由fgfr4與klothoβ的異源復(fù)合物的fgf19信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷能破壞膽汁酸代謝(li,z.,zhu,y.x.,plowright,e.e.,bergsagel,p.l.,chesi,m.,patterson,b.,hawley,t.s.,hawley,r.g.,andstewart,a.k.2001.themyeloma-associatedoncogenefibroblastgrowthfactorreceptor3istransforminginhematopoieticcells.blood97:2413-2419)。已經(jīng)開發(fā)了更多選擇性抗體來拮抗經(jīng)由個(gè)別fgfr(包括fgfr1(trudel,s.,ely,s.,farooqi,y.,affer,m.,robbiani,d.f.,chesi,m.,andbergsagel,p.l.2004.inhibitionoffibroblastgrowthfactorreceptor3inducesdifferentiationandapoptosisint(4；14)myeloma.blood103:3521-3528)，fgfr2(trudel,s.,li,z.h.,wei,e.,wiesmann,m.,chang,h.,chen,c.,reece,d.,heise,c.,andstewart,a.k.2005.chir-258,anovel,multitargetedtyrosinekinaseinhibitorforthepotentialtreatmentoft(4；14)multiplemyeloma.blood105:2941-2948)和fgfr3(chen,j.,lee,b.h.,williams,i.r.,kutok,j.l.,mitsiades,c.s.,duclos,n.,cohen,s.,adelsperger,j.,okabe,r.,coburn,a.,etal.2005.fgfr3asatherapeutictargetofthesmallmoleculeinhibitorpkc412inhematopoieticmalignancies.oncogene24:8259-8267))的配體信號(hào)傳導(dǎo)。然而，識(shí)別超過一種fgfr的抗體至今尚無報(bào)告。先前描述的單特異性抗fgfr3抗體r3mab有效阻斷fgf1和fgf9對(duì)野生型fgfr3的iiib和iiic同種型二者，以及對(duì)fgfr3的某些癌癥相關(guān)突變體形式的結(jié)合(chen,j.,lee,b.h.,williams,i.r.,kutok,j.l.,mitsiades,c.s.,duclos,n.,cohen,s.,adelsperger,j.,okabe,r.,coburn,a.,etal.2005.fgfr3asatherapeutictargetofthesmallmoleculeinhibitorpkc412inhematopoieticmalignancies.oncogene24:8259-8267；paterson,j.l.,li,z.,wen,x.y.,masih-khan,e.,chang,h.,pollett,j.b.,trudel,s.,andstewart,a.k.2004.preclinicalstudiesoffibroblastgrowthfactorreceptor3asatherapeutictargetinmultiplemyeloma.brjhaematol124:595-603)。x射線結(jié)構(gòu)分析揭示r3mab結(jié)合fgfr3上的特定表位，它是配體結(jié)合所需要的。r3mab在小鼠中針對(duì)人膀胱癌和多發(fā)性骨髓瘤腫瘤異種移植物展示有力的抗腫瘤活性。在本研究中，反復(fù)使用結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的噬菌體展示將r3mab再改造成攜帶針對(duì)fgfr3和fgfr2而舍棄fgfr1和fgfr4的雙重特異性的衍生抗體。此研究的實(shí)際目標(biāo)是拓寬潛在治療范圍，超出親本分子的治療范圍，同時(shí)避免增加安全性風(fēng)險(xiǎn)。再改造的抗體展示在體外對(duì)fgf刺激的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制和在體內(nèi)針對(duì)過表達(dá)fgfr2或fgfr3的人癌異種移植物的顯著功效。本文中的發(fā)明提供了抗fgfr2/3抗體，其對(duì)于例如與fgfr2和/或fgfr3的表達(dá)和/或活性(諸如升高的表達(dá)和/或活性或不想要的表達(dá)和/或活性)有關(guān)的疾病狀態(tài)的治療或預(yù)防是有用的。在具體的實(shí)施方案中，本文中的發(fā)明提供了抗fgfr2/3抗體，其對(duì)于例如與fgfr2和fgfr3的表達(dá)和/或活性(諸如升高的表達(dá)和/或活性或不想要的表達(dá)和/或活性)有關(guān)的疾病狀態(tài)的治療或預(yù)防是有用的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于治療腫瘤，癌癥，和/或細(xì)胞增殖性病癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體作為用于fgfr2和/或fgfr3的檢測(cè)和/或分離，諸如各種組織和細(xì)胞類型中fgfr3的檢測(cè)的試劑找到了效用。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體作為用于fgfr2和fgfr3的檢測(cè)和/或分離，諸如各種組織和細(xì)胞類型中fgfr2和fgfr3的檢測(cè)的試劑找到了效用。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備和使用抗fgfr2/3抗體的方法，及編碼抗fgfr2/3抗體的多核苷酸。通用技術(shù)本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如下列文獻(xiàn)中記載的廣泛應(yīng)用的方法：sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual3rd.edition(2001)coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.eds.,(2003))；叢書methodsinenzymology(academicpress,inc.):pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hamesandg.r.tayloreds.(1995))；harlowandlane,eds.(1988)antibodies,alaboratorymanual；及animalcellculture(r.i.freshney,ed.(1987))。定義“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶，激素，和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)lowry法的測(cè)定，抗體重量超過95％，最優(yōu)選重量超過99％，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的n-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的sds-page(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)及使用coomassie藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備。與參照抗體“競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的抗體”指在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中將參照抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50％或更多的抗體，且相反，參照抗體在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中將該抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50％或更多。一種例示性的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法描述于“antibodies,”harlowandlane(coldspringharborpress,coldspringharbor,ny)。抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型?？贵w有5大類：iga，igd，ige，igg，和igm，并且這些中的幾種可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1，和iga2。與不同類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α，δ，ε，γ，和μ。如本文中使用的，術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒劑包括但不限于：放射性同位素(例如at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素)；化學(xué)治療劑或藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，長(zhǎng)春花生物堿類(vincaalkaloids)(長(zhǎng)春新堿(vincristine)，長(zhǎng)春堿(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法侖(melphalan)，絲裂霉素(mitomycin)c，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑)；生長(zhǎng)抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑。藥劑(例如藥物配制劑)的“有效量”指在必需的劑量和時(shí)段上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防結(jié)果的量。例如，而且并非為了限制，“有效量”可以指本文中公開的抗體能夠減輕，最小化和/或預(yù)防疾病和/或病癥的癥狀，延長(zhǎng)存活和/或延長(zhǎng)疾病和/或病癥復(fù)發(fā)前的時(shí)段的量。術(shù)語“全長(zhǎng)抗體”，“完整抗體”，和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結(jié)構(gòu)具有基本上類似的結(jié)構(gòu)或者具有含有如本文中所限定的fc區(qū)的重鏈的抗體。如本文中可互換使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞系”，和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”指已經(jīng)導(dǎo)入外源核酸的細(xì)胞，包括此類細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括原代的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及自其衍生的后代而不考慮傳代的次數(shù)。后代在核酸內(nèi)容物上可以與親本細(xì)胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的相同功能或生物學(xué)活性的突變體后代。如本文中可互換使用的，“個(gè)體”或“受試者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于馴養(yǎng)的動(dòng)物(例如，牛，綿羊，貓，犬，和馬)，靈長(zhǎng)類(例如，人和非人靈長(zhǎng)類諸如猴)，家兔，和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體或受試者是人。在用于本文時(shí)，術(shù)語“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制備物的生成期間發(fā)生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。如此，修飾語“單克隆”指示抗體自一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的特性，而不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多種技術(shù)來生成要依照當(dāng)前公開的主題使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法，重組dna方法，噬菌體展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法?！奥憧贵w”指未與異源模塊(例如細(xì)胞毒性模塊)或放射性標(biāo)記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物配制劑中。“天然抗體”指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構(gòu)成。從n至c端，每條重鏈具有一個(gè)可變區(qū)(vh)，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是三個(gè)恒定域(ch1，ch2，和ch3)。類似地，從n至c端，每條輕鏈具有一個(gè)可變區(qū)(vl)，又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個(gè)恒定輕(cl)域。根據(jù)其恒定域氨基酸序列，抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。如本文中使用的，術(shù)語“包裝插頁”指治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中通常包含的用法說明書，其含有關(guān)于涉及此類治療產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)癥，用法，劑量，施用，聯(lián)合療法，禁忌癥和/或警告的信息?！胺蛛x的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該核酸(例如抗體編碼核酸)的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)?！熬幋a抗體的分離的核酸”(包括提到具體抗體，例如抗klb抗體)指編碼抗體重和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括單一載體或不同載體中的此類核酸分子，和存在于宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)位置的此類核酸分子。術(shù)語“依照kabat的可變域殘基編號(hào)方式”或“依照kabat的氨基酸位置編號(hào)方式”及其變體指kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變域fr或cdr的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含h2殘基52后的單一氨基酸插入(依照kabat為殘基52a)及重鏈fr殘基82后的插入殘基(例如依照kabat為殘基82a，82b和82c等)。給定抗體的kabat殘基編號(hào)方式可通過將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”kabat編號(hào)序列比對(duì)同源區(qū)來確定。短語“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值(通常一個(gè)涉及本發(fā)明的抗體而另一個(gè)涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值(例如kd值)所測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為參照/比較抗體該數(shù)值的函數(shù)，所述兩個(gè)數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50％，優(yōu)選小于約40％，優(yōu)選小于約30％，優(yōu)選小于約20％，或優(yōu)選小于約10％。“結(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子x對(duì)其配偶體y的親和力通常可用解離常數(shù)(kd)來表述。希望kd是1x10-7，1x10-8，5x10-8，1x10-9，3x10-9，5x10-9，或甚至1x10-10或更高親和力。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測(cè)量，包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速地結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的“kd”或“kd值”是通過如下測(cè)定法所述使用fab型式的感興趣抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定法(ria)來測(cè)量的：通過在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的125i標(biāo)記抗原平衡fab，然后用抗fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來測(cè)量fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(chen等,jmolbiol293:865-881(1999))。為了確定測(cè)定條件，用50mm碳酸鈉(ph9.6)中的5μg/ml捕捉用抗fab抗體(cappellabs)包被微量滴定板(dynex)過夜，隨后用pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室溫(約23℃)封閉2-5小時(shí)。在非吸附平板(nunc#269620)中，將100pm或26pm[125i]-抗原與連續(xù)稀釋的感興趣fab混合(例如與presta等,cancerres.57:4593-4599(1997)中抗vegf抗體，fab-12的評(píng)估一致)。然后將感興趣fab保溫過夜；不過，保溫可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如65個(gè)小時(shí))以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進(jìn)行室溫保溫(例如1小時(shí))。然后除去溶液，并用含0.1％tween-20的pbs洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔閃爍液(microscint-20；packard)，然后在topcount伽馬計(jì)數(shù)器(packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇各fab給出小于或等于最大結(jié)合之20％的濃度用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。依照另一實(shí)施方案，kd或kd值是通過表面等離振子共振測(cè)定法使用biacoretm-2000或biacoretm-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)在25℃使用固定化抗原cm5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(cm5,biacoreinc.)。用10mm乙酸鈉ph4.8將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μm)，然后以5μl/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1m乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25℃以約25μl/分鐘的流速注入在含0.05％tween20的pbs(pbst)中兩倍連續(xù)稀釋的fab(0.78nm至500nm)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)表面等離振子共振測(cè)定法使用下述修改：將抗體固定化至cm5生物傳感器芯片以實(shí)現(xiàn)大約400ru，并為了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，以約30ul/min的流速注射靶蛋白(例如fgfr3-iiib或-iiic)在25℃的pbst緩沖液中的兩倍連續(xù)稀釋液(始于67nm)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(langmuir)結(jié)合模型(biacoreevaluationsoftware3.2版)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。平衡解離常數(shù)(kd)以比率koff/kon計(jì)算。參見例如chen,y.等,jmolbiol293:865-881(1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過106m-1s-1，那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(astop-flowequippedspectrophometer)(avivinstruments)或8000系列slm-aminco分光光度計(jì)(thermospectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量pbs,ph7.2中的20nm抗抗原抗體(fab形式)在25℃的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的升高或降低。依照本發(fā)明的“結(jié)合速率”(on-rate,rateofassociation,associationrate)或“kon”也可通過上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)使用biacoretm-2000或biacoretm-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)在25℃使用固定化抗原cm5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)來測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(cm5,biacoreinc.)。用10mm乙酸鈉ph4.8將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μm)，然后以5μl/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1m乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25℃以約25μl/分鐘的流速注入在含0.05％tween20的pbs(pbst)中兩倍連續(xù)稀釋的fab(0.78nm至500nm)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)表面等離振子共振測(cè)定法使用下述修改：將抗體固定化至cm5生物傳感器芯片以實(shí)現(xiàn)大約400ru，并為了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，以約30ul/min的流速注射靶蛋白(例如fgfr3-iiib或-iiic)在25℃的pbst緩沖液中的兩倍連續(xù)稀釋液(始于67nm)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(langmuir)結(jié)合模型(biacoreevaluationsoftware3.2版)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。平衡解離常數(shù)(kd)以比率koff/kon計(jì)算。參見例如chen,y.等,jmolbiol293:865-881(1999)。然而，如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過106m-1s-1，那么結(jié)合速率優(yōu)選使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(avivinstruments)或8000系列slm-aminco分光光度計(jì)(thermospectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量pbs,ph7.2中的20nm抗抗原抗體(fab形式)在25℃的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的升高或降低。術(shù)語“載體”在用于本文時(shí)意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！?，指其中可連接另外的dna區(qū)段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的dna區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱為“重組載體”)。通常，在重組dna技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷痹诒疚闹锌苫Q使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基，和/或其類似物，或者是可通過dna或rna聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物綴合。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯，磷酸三酯，磷酰胺酯(phosphoamidate)，氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendantmoiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶，毒素，抗體，信號(hào)肽，聚l-賴氨酸等)的修飾，具有嵌入劑(例如吖啶，補(bǔ)骨脂素等)的修飾，含有螯合劑(例如金屬，放射性金屬，硼，氧化性金屬等)的修飾，含有烷化劑的修飾，具有經(jīng)修飾連接(例如α端基異構(gòu)核酸(anomericnucleicacid)等)的修飾，以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)，磷酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可綴合至固體或半固體支持物。5′和3′末端oh可磷酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-氟-或2′-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖，木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用p(o)s(“硫代酸酯”(thioate))，p(s)s(“二硫代酸酯”(dithioate))，(o)nr2(“酰胺酯”(amidate))，p(o)r，p(o)or′，co或ch2(“甲縮醛”(formacetal))替代，其中r或r′各自獨(dú)立為h或者取代的或未取代的烴基(1-20個(gè)c)，任選含有醚(-o-)連接，芳基，烯基，環(huán)烴基，環(huán)烯基或芳烴基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。“寡核苷酸”在用于本文時(shí)一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長(zhǎng)度一般但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述同樣且完全適用于寡核苷酸。關(guān)于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的比對(duì)可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如blast，blast-2，align或megalign(dnastar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量比對(duì)的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長(zhǎng)獲得最大比對(duì)所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序align-2獲得的，其中下文表中提供了align-2程序的完整源代碼。align-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由genentech公司編寫，源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(uscopyrightoffice,washingtond.c.,20559)，并以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)txu510087注冊(cè)。公眾可通過genentech公司(southsanfrancisco,california)得到align-2程序，或者可以自例如wo2007/001851中提供的源代碼來匯編。align2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在unix操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼unixv4.0d上使用。所有序列比較參數(shù)由align-2程序設(shè)定且不變。在采用align-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列a相對(duì)于(to)，與(with)，或針對(duì)(against)給定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于，與，或針對(duì)給定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列a)如下計(jì)算：分?jǐn)?shù)x/y乘100其中x是由序列比對(duì)程序align-2在該程序的a和b比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中y是b中的氨基酸殘基總數(shù)。可以領(lǐng)會(huì)，若氨基酸序列a的長(zhǎng)度與氨基酸序列b的長(zhǎng)度不相等，則a相對(duì)于b的％氨基酸序列同一性將不等于b相對(duì)于a的％氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種氨基酸序列是至少50％，60％，70％，80％，或90％相同的。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種氨基酸序列是至少95％，97％，98％，99％，或甚至100％相同的。除非另有具體說明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用align-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。如本文中所使用的，除非另有明確的或上下文說明，術(shù)語“fgfr3”指任何天然的或變異(無論天然的或合成的)的fgfr3多肽(例如fgfr3-iiib同等型或fgfr3-iiic同等型)。術(shù)語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列或跨膜亞基序列)，天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語“野生型fgfr3”通常指包含天然存在fgfr3蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型fgfr3序列”通常指在天然存在fgfr3中找到的氨基酸序列。如本文中所使用的，除非另有明確的或上下文說明，術(shù)語“fgfr3配體”(可互換稱作“fgf”)指任何天然的或變異(無論天然的或合成的)的fgfr3配體(例如fgf1，fgf2，fgf4，fgf8，fgf9，fgf17，fgf18，fgf23)多肽。術(shù)語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列或跨膜亞基序列)，天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語“野生型fgfr3配體”通常指包含天然存在fgfr3配體蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型fgfr3配體序列”通常指在天然存在fgfr3配體中找到的氨基酸序列。術(shù)語“fgfr3活化”指fgfr3受體的活化或磷酸化。一般而言，fgfr3活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由fgfr3受體的細(xì)胞內(nèi)激酶域引起的，磷酸化fgfr3或底物多肽中的酪氨酸殘基)。fgfr3活化可以由fgfr配體結(jié)合感興趣fgfr3受體來介導(dǎo)。fgfr3配體(例如諸如fgf1或fgf9)對(duì)fgfr3的結(jié)合可活化fgfr3的激酶域并由此導(dǎo)致fgfr3中酪氨酸殘基的磷酸化和/或另外的底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化。如本文中所使用的，除非另有明確的或上下文說明，術(shù)語“fgfr2”指任何天然的或變異(無論天然的或合成的)的fgfr2多肽(例如fgfr2-iiib同等型或fgfr2-iiic同等型)。術(shù)語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列或跨膜亞基序列)，天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語“野生型fgfr2”通常指包含天然存在fgfr2蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型fgfr2序列”通常指在天然存在fgfr2中找到的氨基酸序列。如本文中所使用的，除非另有明確的或上下文說明，術(shù)語“fgfr2配體”(可互換稱作“fgf2”)指任何天然的或變異(無論天然的或合成的)的fgfr2配體。術(shù)語“天然序列”明確涵蓋天然存在的截短形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列或跨膜亞基序列)，天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語“野生型fgfr2配體”通常指包含天然存在fgfr2配體蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型fgfr2配體序列”通常指在天然存在fgfr2配體中找到的氨基酸序列。術(shù)語“fgfr2活化”指fgfr2受體的活化或磷酸化。fgfr2活化可以由fgfr配體結(jié)合感興趣fgfr2受體來介導(dǎo)。fgfr2配體對(duì)fgfr2的結(jié)合可活化fgfr2的激酶域并由此導(dǎo)致fgfr2中酪氨酸殘基的磷酸化和/或另外的底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化。術(shù)語“fgfr2/3抗體”指結(jié)合fgfr2和fgfr3的雙重特異性抗體。fgfr2/3抗體的非限制性例子包括本文中描述的雙重特異性單克隆抗體2b.1.3.10和2b.1.3.12。術(shù)語fgfr2/3和“fgfr2和fgfr3”和“fgfr3和fgfr2”在本文中可互換使用。如本文中所使用的，如例如應(yīng)用于受體激酶活性，術(shù)語“組成性”指受體不依賴配體或其它活化性分子的存在的持續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)活性。根據(jù)受體的性質(zhì)，所有活性可以是組成性的，或者受體的活性可以通過其它分子(例如配體)的結(jié)合而進(jìn)一步活化。導(dǎo)致受體活化的細(xì)胞事件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。例如，活化可包括寡聚化(例如二聚化，三聚化，等)成高級(jí)受體復(fù)合物。復(fù)合物可包含單一種類的蛋白質(zhì)，即同聚復(fù)合物?；蛘撸瑥?fù)合物可包含至少兩種不同蛋白質(zhì)種類，即異聚復(fù)合物。可以通過例如正?；蛲蛔凅w形式的受體在細(xì)胞表面上的過表達(dá)來引起復(fù)合物形成。也可以通過受體中的一處或多處特定突變來引起復(fù)合物形成。如本文中使用的，如例如應(yīng)用于受體信號(hào)傳導(dǎo)活性，術(shù)語“配體不依賴性的”指不依賴配體的存在的信號(hào)傳導(dǎo)活性。具有配體依賴性激酶活性的受體不會(huì)必然排除配體結(jié)合該受體以產(chǎn)生額外的激酶活性活化。如本文中使用的，如例如應(yīng)用于受體信號(hào)傳導(dǎo)活性，術(shù)語“配體依賴性的”指依賴配體的存在的信號(hào)傳導(dǎo)活性。短語“基因擴(kuò)增”指在特定細(xì)胞或細(xì)胞系中形成多拷貝的基因或基因片段的過程。復(fù)制區(qū)(擴(kuò)增的dna的區(qū)段)常常稱作“擴(kuò)增子”。通常，所產(chǎn)生的信使rna(mrna)的量，即基因表達(dá)的水平，也按由所表達(dá)特定基因形成的拷貝數(shù)的比例增加?！袄野彼峒っ敢种苿敝敢欢ǔ潭纫种评野彼峒っ?諸如fgfr2和fgfr3受體)的酪氨酸激酶活性的分子?！罢故境鰂gfr3表達(dá)，擴(kuò)增，或活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中表達(dá)(包括過表達(dá))fgfr3，擴(kuò)增了fgfr3基因，和/或以其它方式表明fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鰂gfr2表達(dá)，擴(kuò)增，或活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中表達(dá)(包括過表達(dá))fgfr2，擴(kuò)增了fgfr2基因，和/或以其它方式表明fgfr2活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鰂gfr2/3表達(dá)，擴(kuò)增，或活化”或“展示出fgfr2和fgfr3表達(dá)，擴(kuò)增，或活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中表達(dá)(包括過表達(dá))fgfr2和fgfr3，擴(kuò)增了fgfr2和fgfr3基因，和/或以其它方式表明fgfr2和fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。如本文中使用的，“klotho-β”，“klb”和“β-klotho”指來自任何脊椎動(dòng)物來源，包括哺乳動(dòng)物諸如靈長(zhǎng)類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然β-klotho，除非另有說明。該術(shù)語涵蓋“全長(zhǎng)”，未加工的klb以及klb因細(xì)胞中的加工所致的任何形式。該術(shù)語還涵蓋klb的天然存在變體，例如剪接變體或等位變體。本公開文本的抗體所靶向的人klb氨基酸序列(排除信號(hào)序列)的一個(gè)非限制性例子如下：fsgdgraiwsknpnftpvnesqlflydtfpknffwgigtgalqvegswkkdgkgpsiwdhfihthlknvsstngssdsyiflekdlsaldfigvsfyqfsiswprlfpdgivtvanakglqyystlldalvlrniepivtlyhwdlplalqekyggwkndtiidifndyatycfqmfgdrvkywitihnpylvawhgygtgmhapgekgnlaavytvghnlikahskvwhnynthfrphqkgwlsitlgshwiepnrsentmdifkcqqsmvsvlgwfanpihgdgdypegmrkklfsvlpifseaekhemrgtadffafsfgpnnfkplntmakmgqnvslnlrealnwikleynnpriliaengwftdsrvktedttaiymmknflsqvlqairldeirvfgytawslldgfewqdaytirrglfyvdfnskqkerkpkssahyykqiirengfslkestpdvqgqfpcdfswgvtesvlkpesvasspqfsdphlyvwnatgnrllhrvegvrlktrpaqctdfvnikkqlemlarmkvthyrfaldwasvlptgnlsavnrqalryyrcvvseglklgisamvtlyypthahlglpepllhadgwlnpstaeafqayaglcfqelgdlvklwitinepnrlsdiynrsgndtygaahnllvahalawrlydrqfrpsqrgavslslhadwaepanpyadshwraaerflqfeiawfaeplfktgdypaamreyiaskhrrglsssalprlteaerrllkgtvdfcalnhfttrfvmheqlagsrydsdrdiqflqditrlssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitasgiddqaleddrlrkyylgkylqevlkaylidkvrikgyyafklaeekskprfgfftsdfkakssiqfynkvissrgfpfensssrcsqtqentectvclflvqkkpliflgccffstlvlllsiaifqrqkrrkfwkaknlqhiplkkgkrvvs(seqidno:233)。在某些實(shí)施方案中，klb蛋白質(zhì)可包括具有氨基酸序列mkpgcaagspgnewiffstdeittryrntmsngglqrsvilsalillravtg(seqidno:234)的n端信號(hào)序列。術(shù)語“klb的c端域”指klb的羧基端糖苷酶樣域。例如，seqidno:233中顯示的例示性klb蛋白質(zhì)的c端域包含下述氨基酸序列：fpcdfswgvtesvlkpesvasspqfsdphlyvwnatgnrllhrvegvrlktrpaqctdfvnikkqlemlarmkvthyrfaldwasvlptgnlsavnrqalryyrcvvseglklgisamvtlyypthahlglpepllhadgwlnpstaeafqayaglcfqelgdlvklwitinepnrlsdiynrsgndtygaahnllvahalawrlydrqfrpsqrgavslslhadwaepanpyadshwraaerflqfeiawfaeplfktgdypaamreyiaskhrrglsssalprlteaerrllkgtvdfcalnhfttrfvmheqlagsrydsdrdiqflqditrlssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitasgiddqaleddrlrkyylgkylqevlkaylidkvrikgyyafklaeekskprfgfftsdfkakssiqfynkvissrgfpfensssr(seqidno:235)。術(shù)語“抗klb抗體”和“結(jié)合klb的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合klb，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向klb的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，如例如通過放射性免疫測(cè)定法(ria)測(cè)量的，抗klb抗體結(jié)合無關(guān)的，非klb的蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對(duì)klb的結(jié)合的約10％。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合klb的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中，抗klb抗體結(jié)合在來自不同物種的klb中保守的klb表位。在某些實(shí)施方案中，抗klb抗體結(jié)合klb上的在該蛋白的c端部分中的表位。術(shù)語“藥物配制劑”指處于如下的形式，使得容許其中含有的活性組分的生物學(xué)活性是有效的，且不含對(duì)會(huì)接受配制劑施用的受試者具有不可接受的毒性的別的成分的制劑。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受載體”指藥物配制劑中與活性組分不同的，且對(duì)受試者無毒的組分。藥學(xué)可接受載體包括但不限于緩沖劑，賦形劑，穩(wěn)定劑，或防腐劑。如本文中使用的，“治療”(及其語法變化形式，諸如“處理”或“處置”)指試圖改變所治療個(gè)體的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥狀，削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果，預(yù)防轉(zhuǎn)移，減緩疾病進(jìn)展的速率，改善或減輕疾病狀態(tài)，及免除或改善預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的抗體可用于延遲疾病的發(fā)生或減緩疾病的進(jìn)展?！疤幚怼焙汀爸委煛?treatment)指治療性處理和預(yù)防性措施二者。當(dāng)它涉及fgfr2/3抗體時(shí)，那些需要治療的包括那些早就患有良性，癌前，或非轉(zhuǎn)移性腫瘤的以及那些要預(yù)防癌癥發(fā)生或復(fù)發(fā)的?！罢故境鰂gfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過elisa來測(cè)量fgfr3磷酸化)或間接測(cè)定?！罢故境鰂gfr2活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出fgfr2活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境鰂gfr2和fgfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出fgfr2和fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境鼋M成性fgfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出組成性fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過elisa來測(cè)量c-fgfr3磷酸化)或間接測(cè)定?！罢故境鼋M成性fgfr2活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出組成性fgfr2活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境鼋M成性fgfr2和fgfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出組成性fgfr2和fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定。“展示出fgfr3擴(kuò)增”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有擴(kuò)增的fgfr3基因的癌或生物學(xué)樣品。“展示出fgfr2擴(kuò)增”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有擴(kuò)增的fgfr2基因的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鰂gfr2和fgfr3擴(kuò)增”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有擴(kuò)增的fgfr2和fgfr3基因的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鰂gfr3易位”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有易位的fgfr3基因的癌或生物學(xué)樣品。fgfr3易位的一個(gè)例子是t(4；14)易位，它在一些多發(fā)性骨髓瘤腫瘤中發(fā)生。“展示出fgfr2易位”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有易位的fgfr2基因的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鰂gfr2和fgfr3易位”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有易位的fgfr2和fgfr3基因的癌或生物學(xué)樣品?！傲姿?elisa測(cè)定法”(phosho-elisaassay)在本文中指在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)中評(píng)估一種或多種fgfr(例如fgfr2和fgfr3)，底物或下游信號(hào)分子的磷酸化的測(cè)定法，其中使用檢測(cè)磷酸化的fgfr(例如fgfr2和fgfr3)，底物，或下游信號(hào)分子的試劑(通常是抗體)。在一些實(shí)施方案中，使用檢測(cè)磷酸化的fgfr2，fgfr3，或pmapk的抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用檢測(cè)磷酸化的fgfr2和fgfr3的抗體。該測(cè)定法可以對(duì)細(xì)胞溶胞物，優(yōu)選來自新鮮的或冷凍的生物學(xué)樣品的細(xì)胞溶胞物進(jìn)行?！罢故境雠潴w不依賴性fgfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體不依賴性fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過elisa來測(cè)量fgfr3磷酸化)或間接測(cè)定。“展示出配體不依賴性fgfr2活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體不依賴性fgfr2活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w不依賴性fgfr2/3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體不依賴性fgfr2和fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w依賴性fgfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體依賴性fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過elisa來測(cè)量fgfr3磷酸化)或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w依賴性fgfr2活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體依賴性fgfr2活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w依賴性fgfr2/3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體依賴性fgfr2/3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w不依賴性fgfr3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體不依賴性fgfr3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過elisa來測(cè)量fgfr3磷酸化)或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w不依賴性fgfr2活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體不依賴性fgfr2活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定?！罢故境雠潴w不依賴性fgfr2/3活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出配體不依賴性fgfr2/3活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接或間接測(cè)定。具有“fgfr3過表達(dá)或擴(kuò)增”的癌細(xì)胞指與同一組織類型的非癌性細(xì)胞相比，具有顯著更高水平的fgfr3蛋白質(zhì)或基因的癌細(xì)胞。此類過表達(dá)可以是由基因擴(kuò)增或者是由轉(zhuǎn)錄或翻譯提高引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測(cè)定法中通過評(píng)估細(xì)胞表面上存在的fgfr3蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組織化學(xué)測(cè)定法；ihc)來確定fgfr3過表達(dá)或擴(kuò)增?；蛘?另外，可測(cè)量細(xì)胞中fgfr3編碼核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(fish；參見1998年10月公布的wo98/45479)，southern印跡，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)，諸如定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)。除了上述測(cè)定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用各種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者身體內(nèi)的細(xì)胞暴露于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估抗體與患者中的細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自先前暴露于抗體的患者的活檢。具有“fgfr2過表達(dá)或擴(kuò)增”的癌細(xì)胞指與同一組織類型的非癌性細(xì)胞相比，具有顯著更高水平的fgfr2蛋白質(zhì)或基因的癌細(xì)胞。此類過表達(dá)可以是由基因擴(kuò)增或者是由轉(zhuǎn)錄或翻譯提高引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測(cè)定法中通過評(píng)估細(xì)胞表面上存在的fgfr2蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組織化學(xué)測(cè)定法；ihc)來確定fgfr2過表達(dá)或擴(kuò)增。或者/另外，可測(cè)量細(xì)胞中fgfr2編碼核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(fish；參見1998年10月公布的wo98/45479)，southern印跡，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)，諸如定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)。除了上述測(cè)定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用各種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者身體內(nèi)的細(xì)胞暴露于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估抗體與患者中的細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自先前暴露于抗體的患者的活檢。具有“fgfr2/3過表達(dá)或擴(kuò)增”的癌細(xì)胞指與同一組織類型的非癌性細(xì)胞相比，具有顯著更高水平的fgfr2和fgfr3蛋白質(zhì)或基因的癌細(xì)胞。此類過表達(dá)可以是由基因擴(kuò)增或者是由轉(zhuǎn)錄或翻譯提高引起的。可在診斷或預(yù)后測(cè)定法中通過評(píng)估細(xì)胞表面上存在的fgfr2和fgfr3蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組織化學(xué)測(cè)定法；ihc)來確定fgfr2和fgfr3過表達(dá)或擴(kuò)增?；蛘?另外，可測(cè)量細(xì)胞中fgfr2和fgfr3編碼核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(fish；參見1998年10月公布的wo98/45479)，southern印跡，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)，諸如定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)。除了上述測(cè)定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用各種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者身體內(nèi)的細(xì)胞暴露于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估抗體與患者中的細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自先前暴露于抗體的患者的活檢。如本文中使用的，術(shù)語“突變”指特定蛋白質(zhì)或核酸(基因，rna)分別相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)或核酸的氨基酸或核酸序列的差異。突變的蛋白質(zhì)或核酸可以由基因的一個(gè)等位基因(雜合的)或兩個(gè)等位基因(純合的)表達(dá)或者在其中找到，而且它可以是體細(xì)胞的或種系的。在本發(fā)明中，突變一般是體細(xì)胞的。突變包括序列重排，諸如插入，刪除，和點(diǎn)突變(包括單核苷酸/氨基酸多態(tài)性)?！耙种啤敝概c參照相比減小或降低活性，功能，和/或量。當(dāng)藥劑模擬感興趣多肽(例如fgfr配體，諸如fgf1或fgf9)的至少一項(xiàng)功能性活性時(shí)，該藥劑擁有“激動(dòng)性活性或功能”。如本文中使用的，“激動(dòng)性抗體”指模擬感興趣多肽(例如fgfr配體，諸如fgf1或fgf9)的至少一項(xiàng)功能性活性的抗體。蛋白質(zhì)“表達(dá)”指基因中編碼的信息轉(zhuǎn)換成信使rna(mrna)，然后轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)。在本文中，“表達(dá)”感興趣蛋白質(zhì)(諸如fgf受體或fgf受體配體)的樣品或細(xì)胞指其中測(cè)定出存在編碼該蛋白質(zhì)的mrna或蛋白質(zhì)(包括其片段)的樣品或細(xì)胞?！懊庖呔Y合物”(可互換地稱作“抗體-藥物綴合物”或“adc”)指抗體綴合至一種或多種細(xì)胞毒劑，諸如化療劑，藥物，生長(zhǎng)抑制劑，毒素(例如蛋白質(zhì)毒素，細(xì)菌，真菌，植物，或動(dòng)物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射綴合物)。如本文中所使用的，術(shù)語“fc區(qū)”一般指包含免疫球蛋白重鏈c端多肽序列的二聚體復(fù)合物，其中c端多肽序列是通過木瓜蛋白酶消化完整抗體可獲得的。fc區(qū)可包含天然或變體fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈的fc序列的邊界可以有所變化，但是人igg重鏈fc序列通常定義為fc序列自位于大約位置cys226的氨基酸殘基，或自大約位置pro230，至羧基端的區(qū)段。免疫球蛋白的fc序列一般包含兩個(gè)恒定域，ch2域和ch3域，且任選包含ch4域。fc區(qū)的c-末端賴氨酸(依照eu編號(hào)系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化抗體的過程中或者通過重組改造編碼抗體的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有fc區(qū)的抗體的組合物可包含具有k447的抗體，消除了所有k447的抗體，或具有與沒有k447殘基的抗體的混合物?！癴c多肽”在本文中指構(gòu)成fc區(qū)的多肽之一?？梢宰匀魏魏线m的免疫球蛋白獲得fc多肽，諸如igg1，igg2，igg3，或igg4亞型，iga，ige，igd或igm。在一些實(shí)施方案中，fc多肽包含部分或整個(gè)野生型鉸鏈序列(一般位于其n端)。在一些實(shí)施方案中，fc多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列。“阻斷性”抗體或抗體“拮抗劑”指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性的抗體。優(yōu)選的阻斷性抗體或拮抗性抗體完全抑制抗原的生物學(xué)活性?！奥憧贵w(裸露的抗體)”指未綴合異源分子諸如細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物的抗體。具有指定抗體的“生物學(xué)特征”的抗體指擁有該指定抗體區(qū)別于其它結(jié)合相同抗原的抗體的一項(xiàng)或多項(xiàng)生物學(xué)特征的抗體。為了篩選結(jié)合抗原上感興趣抗體所結(jié)合的表位的抗體，可以實(shí)施常規(guī)交叉阻斷測(cè)定法，諸如antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,edharlowanddavidlane(1988)中所記載的。為了延長(zhǎng)包含本發(fā)明氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期，可如例如美國(guó)專利no.5,739,277中所記載的將補(bǔ)救受體結(jié)合表位附著于抗體(尤其是抗體片段)。例如，可以將編碼補(bǔ)救受體結(jié)合表位的核酸分子與編碼本發(fā)明多肽序列的核酸在同一讀碼框內(nèi)相連接，使得由改造后的核酸分子表達(dá)的融合蛋白包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位和本發(fā)明的多肽序列。在用于本文時(shí)，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指igg分子(例如igg1，igg2，igg3或igg4)的fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)igg分子體內(nèi)血清半衰期的表位(例如ghetieetal.,ann.rev.immunol.18:739-766(2000),表1)。其fc區(qū)中有替代且血清半衰期延長(zhǎng)的抗體還記載于wo00/42072；wo02/060919；shieldsetal.,j.biol.chem.276:6591-6604(2001)；hinton,j.biol.chem.279:6213-6216(2004))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可以通過例如附著其它多肽序列來延長(zhǎng)血清半衰期。例如，可以將在本發(fā)明的方法中有用的抗體或其它多肽附著于血清清蛋白或血清清蛋白中結(jié)合fcrn受體或血清清蛋白結(jié)合肽的那部分，使得血清清蛋白結(jié)合該抗體或多肽，例如此類多肽序列披露于wo01/45746。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，待附著的血清清蛋白肽包含氨基酸序列diclprwgclw(seqidno:183)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fab的半衰期通過這些方法得到了延長(zhǎng)。血清清蛋白結(jié)合肽序列還可參見dennisetal.,j.biol.chem.277:35035-35043(2002)。“片段”指多肽和核酸分子的一部分，其優(yōu)選含有參比核酸分子或多肽全長(zhǎng)的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，或更多。所述片段可含有10，20，30，40，50，60，70，80，90，或100，200，300，400，500，600，或更多個(gè)核苷酸，或者10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，190，200或更多個(gè)氨基酸。如本文中使用的，短語“很少的至無激動(dòng)劑功能”就本發(fā)明的抗體而言表示該抗體不引發(fā)生物學(xué)上有意義量的激動(dòng)劑活性，例如在施用于受試者后。正如本領(lǐng)域會(huì)理解的，活性的量可以定量或定性測(cè)定，只要能進(jìn)行本發(fā)明的抗體和參照對(duì)應(yīng)物之間的比較。可以依照本領(lǐng)域知道的任何測(cè)定法或技術(shù)測(cè)量或檢測(cè)活性，包括例如本文中描述的。可以平行地或在分開的運(yùn)行中測(cè)定本發(fā)明的抗體及其參照對(duì)應(yīng)物的活性的量。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的二價(jià)抗體不擁有實(shí)質(zhì)性的激動(dòng)劑功能。術(shù)語“凋亡”和“凋亡活性”以廣義使用，指哺乳動(dòng)物中有序或受控形式的細(xì)胞死亡，通常伴隨著一種或多種特征性細(xì)胞變化，包括細(xì)胞質(zhì)濃縮，質(zhì)膜微絨毛喪失，細(xì)胞核節(jié)段化，染色體dna降解或線粒體功能喪失。此活性可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來測(cè)定和測(cè)量，例如通過細(xì)胞生存力測(cè)定法，facs分析或dna電泳，更具體的是通過膜聯(lián)蛋白v結(jié)合，dna斷裂，細(xì)胞收縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞碎裂和/或膜囊(稱為凋亡小體)形成。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長(zhǎng)或完整單克隆抗體)，多克隆抗體，多價(jià)抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述的)?？贵w可以是人的，人源化的和/或親和力成熟的。術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)或高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)fr，它們大多采取β-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)cdr連接。每條鏈中的cdr通過fr非常接近地保持在一起，并與另一條鏈的cdr一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,nationalinstituteofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的(細(xì)胞)毒性中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及剩余的“fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生f(ab′)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?！癴v”是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈fv種類中，此區(qū)由緊密，非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈fv種類中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價(jià)相連，使得輕鏈和重鏈能在與雙鏈fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個(gè)cdr相互作用而在vh-vl二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)cdr共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)cdr的半個(gè)fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(ch1)。fab′片段與fab片段的不同之處在于重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。fab′-sh是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的fab′的稱謂。f(ab′)2抗體片段最初是作為在fab′片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)fab′片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類：iga，igd，ige，igg和igm，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α，δ，ε，γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)，優(yōu)選大多數(shù)或所有功能。抗體片段的例子包括fab，fab′，f(ab′)2和fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含fc區(qū)的抗體片段，保留與fc區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸如fcrn結(jié)合，抗體半衰期調(diào)控，adcc功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的fc序列相連。術(shù)語“高變區(qū)”，“hvr”或“hv”在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)高變區(qū)：三個(gè)在vh中(h1，h2，h3)，三個(gè)在vl中(l1，l2，l3)。本文中使用且涵蓋許多高變區(qū)的敘述。kabat互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。abm高變區(qū)代表kabatcdr與chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到oxfordmolecular的abm抗體建模軟件的使用?！敖佑|(contact)”高變區(qū)是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些高變區(qū)中每一個(gè)的殘基。高變區(qū)可包括如下“延伸的高變區(qū)”：vl中的24-36或24-34(l1)，46-56或50-56(l2)和89-97(l3)及vh中的26-35(h1)，50-65或49-65(h2)和93-102，94-102或95-102(h3)。對(duì)于這些定義中的每一個(gè)，可變區(qū)殘基是依照kabat等,見上文編號(hào)的?！翱蚣堋被颉癴r”殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性，親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻(xiàn)：vaswani和hamilton,ann.allergy,asthma&immunol.1:105-115(1998)；harris,biochem.soc.transactions23:1035-1038(1995)；hurle和gross,curr.op.biotech.5:428-433(1994)。“嵌合”抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利no.4,816,567；morrison等,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個(gè)子集?！皢捂渇v”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scfv多肽在vh與vl結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scfv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scfv的綜述參見pluckthun,在rosenburg和moore編的《thepharmacologyofmonoclonalantibodies》第113卷中,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)?！翱乖敝缚贵w可選擇性結(jié)合的預(yù)定抗原。靶抗原可以是多肽，碳水化合物，核酸，脂質(zhì)，半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。優(yōu)選地，靶抗原是多肽。術(shù)語“雙抗體(diabody)”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(vh-vl)中包含相連的重鏈可變域(vh)和輕鏈可變域(vl)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如ep404,097；wo93/11161；及hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)?！叭丝贵w”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！坝H和力成熟的”抗體指在抗體的一個(gè)或多個(gè)cdr中具有一處或多處改變，導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。marks等,bio/technology10:779-783(1992)記載了通過vh和vl結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了cdr和/或框架殘基的隨機(jī)誘變：barbas等,pnas(usa)91:3809-3813(1994)；schier等,gene169:147-155(1995)；yelton等,j.immunol.155:1994-2004(1995)；jackson等,j.immunol.154(7):3310-9(1995)；及hawkins等,j.mol.biol.226:889-896(1992)?？贵w“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體fc區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如b細(xì)胞受體)下調(diào)；和b細(xì)胞活化?！翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“adcc”指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(nk)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的fc受體(fcr)上的分泌型ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體“武裝”(arm)細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且是此類殺傷作用絕對(duì)要求的。介導(dǎo)adcc的主要細(xì)胞，nk細(xì)胞，只表達(dá)fcγriii，而單核細(xì)胞表達(dá)fcγri，fcγrii和fcγriii。ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的fcr表達(dá)。為了評(píng)估感興趣分子的adcc活性，可進(jìn)行體外adcc測(cè)定法，諸如美國(guó)專利no.5,500,362或5,821,337或presta美國(guó)專利no.6,737,056中所記載的。可用于此類測(cè)定法的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞。或者/另外，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的adcc活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如clynes等,proc.natl.acad.sci.usa95:652-656(1998)中所披露的?！叭诵?yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種fcr并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)fcγriii并行使adcc效應(yīng)器功能。介導(dǎo)adcc的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，天然殺傷(nk)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒性t細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選pbmc和nk細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源例如血液分離?！癴c受體”或“fcr”描述結(jié)合抗體fc區(qū)的受體。優(yōu)選的fcr是天然序列人fcr。此外，優(yōu)選的fcr是結(jié)合igg抗體的fcr(γ受體)，包括fcγri，fcγrii和fcγriii亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。fcγrii受體包括fcγriia(“活化受體”)和fcγriib(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中?；罨荏wfcγriia在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(itam)。抑制受體fcγriib在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(itim)(參見綜述annu.rev.immunol.15:203-234(1997))。fcr的綜述參見ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)；capel等,immunomethods4:25-34(1994)；dehaas等,j.lab.clin.med.126:330-41(1995)。術(shù)語“fcr”在本文中涵蓋其它fcr，包括那些未來將會(huì)鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體，fcrn，它負(fù)責(zé)將母體igg轉(zhuǎn)移給胎兒(guyer等,j.immunol.117:587(1976)及kim等,j.immunol.24:249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的穩(wěn)態(tài)。wo00/42072(presta)記載了對(duì)fcr的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入該專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見shields等,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)。測(cè)量對(duì)fcrn的結(jié)合的方法是已知的(參見例如ghetie1997,hinton2004)?？蓽y(cè)定人fcrn高親和力結(jié)合多肽與人fcrn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人fcrn的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或者在施用了fc變體多肽的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中?！把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“cdc”指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(c1q)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類的)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行cdc測(cè)定法，例如如gazzano-santoroetal.,j.immunol.methods202:163(1996)中所記載的。具有更改的fc區(qū)氨基酸序列及提高或降低的c1q結(jié)合能力的多肽變體記載于美國(guó)專利no.6,194,551b1和wo99/51642。在此明確收入那些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見idusogie等,j.immunol.164:4178-4184(2000)。術(shù)語“含fc區(qū)多肽”指包含fc區(qū)的多肽，諸如抗體或免疫粘附素。fc區(qū)的c-末端賴氨酸(依照eu編號(hào)系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過程中或者通過重組改造編碼多肽的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有fc區(qū)的多肽的組合物可包含具有k447的多肽，消除了所有k447的多肽，或具有與沒有k447殘基的多肽的混合物。就本文目的而言，“受體人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的vl或vh框架之氨基酸序列的框架?！把苌浴比嗣庖咔虻鞍卓蚣芑蛉斯灿锌蚣艿氖荏w人框架可包含與之相同的氨基酸序列，或者可包含預(yù)先存在的氨基酸序列變化。當(dāng)存在預(yù)先存在的氨基酸變化時(shí)，優(yōu)選存在不超過5個(gè)，優(yōu)選4個(gè)或更少，或者3個(gè)或更少預(yù)先存在的氨基酸變化。當(dāng)vh中存在預(yù)先存在的氨基酸變化時(shí)，優(yōu)選那些變化只位于71h，73h和78h中的三個(gè)，兩個(gè)，或一個(gè)位置；例如，位于那些位置的氨基酸殘基可以是71a，73t，和/或78a。在一個(gè)實(shí)施方案中，vl受體人框架在序列上與vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同?！叭斯灿锌蚣堋敝复砣嗣庖咔虻鞍譾l或vh框架序列選集中最常見的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列選集來自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如kabat等的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于vl，所述亞組是如kabat等的亞組κi。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于vh，所述亞組是如kabat等的亞組iii?！皏h亞組iii共有框架”包含從kabat等的可變重鏈亞組iii中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，vh亞組iii共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個(gè)：evqlvesggglvqpggslrlscaas(seqidno:95)-h1-wvrqapgkglewv(seqidno:96)-h2-rftisrdnskntlylqmnslraedtavyyc(seqidno:97)-h3-wgqgtlvtvss(seqidno:98)?！皏l亞組i共有框架”包含從kabat等的可變輕鏈κ亞組i中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，vl亞組i共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個(gè)：diqmtqspsslsasvgdrvtitc(seqidno:99)-l1-wyqqkpgkapklliy(seqidno:100)-l2-gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc(seqidno:101)-l3-fgqgtkveik(seqidno:102)。在用于本文時(shí)，“抗體突變體”或“抗體變體”指抗體的氨基酸序列變體，其中物種依賴性抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了修飾。此類突變體與物種依賴性抗體必然具有小于100％的序列同一性或相似性。在一個(gè)的實(shí)施方案中，抗體突變體所具有的氨基酸序列與物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對(duì)序列并在必要時(shí)引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見下文)的氨基酸殘基的百分比。n-末端，c-末端，或?qū)勺冇?區(qū))之外的抗體序列內(nèi)部的延伸，刪除，或插入都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。“病癥”或“疾病”指任何會(huì)受益于本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；癌瘤，母細(xì)胞瘤和肉瘤。術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防疾病或病癥的治療劑量。在癌癥的情況中，治療有效量的治療劑可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小原發(fā)性腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥狀。根據(jù)藥物可阻止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥療法，體內(nèi)功效可以通過例如評(píng)估存活持續(xù)時(shí)間，距疾病進(jìn)展的時(shí)間(ttp)，響應(yīng)率(rr)，響應(yīng)持續(xù)時(shí)間，和/或生活質(zhì)量來測(cè)量。術(shù)語“癌(癥)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳動(dòng)物中典型的以不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的生理疾患。此定義中包括良性和惡性癌癥。“早期癌癥”或“早期腫瘤”指非侵入性的或轉(zhuǎn)移性的，或者歸為0期，i期，或ii期癌癥的癌癥。癌癥的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤(包括髓母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)，肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤)，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括類癌瘤，胃泌素瘤和胰島細(xì)胞癌)，間皮瘤，施旺氏細(xì)胞瘤(包括聽神經(jīng)瘤)，腦膜瘤，腺癌，黑素瘤，和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌包括小細(xì)胞肺癌(sclc)，非小細(xì)胞肺癌(nsclc)，肺的腺癌和肺的鱗癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃的癌或胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤，乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌或腎的癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌，肛門癌，陰莖癌，睪丸癌，食道癌，膽管腫瘤，及頭和頸癌和多發(fā)性骨髓瘤。術(shù)語“癌前”指典型地在癌之前或發(fā)展成癌的疾患或生長(zhǎng)。“癌前”生長(zhǎng)會(huì)具有以異常細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，增殖，或分化為特征的細(xì)胞，這些可通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖，或分化的標(biāo)志物來測(cè)定。“發(fā)育異?！敝附M織，器官，或細(xì)胞的任何異常生長(zhǎng)或發(fā)育。優(yōu)選的是，發(fā)育異常是高級(jí)的或癌前的?！稗D(zhuǎn)移”指癌自其原發(fā)部位傳播至身體中的其它位置。癌細(xì)胞能脫離原發(fā)性腫瘤，滲透入淋巴和血管，經(jīng)由血流而循環(huán)和在身體中其它地方的正常組織中的遠(yuǎn)端病灶(轉(zhuǎn)移)中生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)移可以是當(dāng)?shù)氐幕蜻h(yuǎn)端的。轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)過程，視腫瘤細(xì)胞自原發(fā)性腫瘤脫落，經(jīng)由血流而傳播，并在遠(yuǎn)端部位停止而定。在新的部位，該細(xì)胞建立血供且能生長(zhǎng)至形成危及生命的團(tuán)塊。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的刺激性和抑制性分子途徑調(diào)節(jié)這種行為，而且腫瘤細(xì)胞與遠(yuǎn)端部位中的宿主細(xì)胞之間的相互作用也是重要的?！胺寝D(zhuǎn)移的”指良性的或保留在原發(fā)部位且尚未滲透入淋巴或血管系統(tǒng)或滲透至原發(fā)部位以外的組織的癌癥。一般而言，非轉(zhuǎn)移性癌癥指作為0期，i期，或ii期癌癥和偶爾的iii期癌癥的任何癌癥。“原發(fā)性腫瘤”或“原發(fā)性癌”指初始的癌癥，而不是位于受試者身體中另一組織，器官，或位置中的轉(zhuǎn)移病灶?！傲夹阅[瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且沒有能力滲透，侵入，或轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位的腫瘤?！澳[瘤載荷”指身體中癌細(xì)胞的數(shù)目，腫瘤的尺寸，或癌的量。腫瘤載荷也稱作腫瘤負(fù)荷?！澳[瘤數(shù)目”指腫瘤的數(shù)目?！笆茉囌摺敝覆溉閯?dòng)物，包括但不限于人或非人哺乳動(dòng)物，諸如牛，馬，犬，綿羊，或貓。優(yōu)選地，受試者是人。術(shù)語“抗癌療法”指在治療癌癥中有用的療法?？拱┲委焺┑睦影ǖ幌抻诶缁焺?，生長(zhǎng)抑制劑，細(xì)胞毒劑，放射療法中所使用的藥劑，抗血管發(fā)生劑，凋亡劑，抗微管蛋白劑，和其它治療癌癥的藥劑，抗cd20抗體，血小板衍生生長(zhǎng)因子抑制劑(例如gleevectm(imatinibmesylate))，cox-2抑制劑(例如celecoxib)，干擾素，細(xì)胞因子，結(jié)合一種或多種以下靶物的拮抗劑(例如中和性抗體)(erbb2，erbb3，erbb4，pdgfr-β，blys，april，bcma或vegf受體，trail/apo2)，和其它生物活性和有機(jī)化學(xué)劑，等。本發(fā)明還包括它們的組合?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?；焺┑睦影捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents)，諸如塞替派(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯類(alkylsulfonates)，諸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撐硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；cc-1065(包括其阿多來新(adozelesin)，卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)，美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥膽甾醇(phenesterine)，潑尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亞硝脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1i和加利車霉素ωi1(參見例如agnew(1994)chem.intl.ed.engl.33:183-186)；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicina；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放線菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮絲氨酸(azaserine)，博來霉素(bleomycin)，放線菌素c(cactinomycin)，carabicin，洋紅霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放線菌素d(dactinomycin)，柔紅霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-l-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星，氰基嗎啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，麻西羅霉素(marcellomycin)，絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素c，霉酚酸(mycophenolicacid)，諾拉霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin)，鏈佐星(streptozocin)，殺結(jié)核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，蝶羅呤(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(frolinicacid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidainine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖復(fù)合物(jhsnaturalproducts,eugene,or)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2′,2”-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是t-2毒素，疣孢菌素(verracurin)a，桿孢菌素(roridin)a和蛇行菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“ara-c”)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)，abraxanetm不含克列莫佛(cremophor)，清蛋白改造納米顆粒劑型帕利他塞(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,illinois)和多西他塞(doxetaxel)(-poulencrorer,antony,france)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長(zhǎng)春堿(vinblastine)；鉑(platinum)；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長(zhǎng)春新堿(vincristine)；長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(dá)(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(camptosar,cpt-11)(包括伊立替康及5-fu和亞葉酸的治療方案)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoicacid)；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；velcadebortezomib；revlimidlenalidomide；亞葉酸(leucovorin)(lv)；奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(folfox)；pkc-α，raf，h-ras，egfr(例如erlotinib(tarcevatm))和vegf-a的，降低細(xì)胞增殖的抑制劑；及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽，酸或衍生物。該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(serm)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，ly117018，奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑，氨魯米特(aminoglutethimide)，醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)，依西美坦(exemestane)，福美坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)，伏羅唑(vorozole)，來曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡米特(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)，和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常(abherant)細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如pkc-α，raf和h-ras；核酶，諸如vegf表達(dá)抑制劑(例如核酶)和her2表達(dá)抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如疫苗，疫苗和疫苗；ril-2；拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；rmrh；長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)和埃斯波霉素(esperamicins)(見美國(guó)專利no.4,675,187)；及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽，酸或衍生物。術(shù)語“前體藥物”在用于本申請(qǐng)時(shí)指與母藥(parentdrug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)的前體和衍生物形式。參見例如wilman,“prodrugsincancerchemotherapy”,biochemicalsocietytransactions,14,pp.375-382,615thmeetingbelfast(1986)和stellaetal.,“prodrugs:achemicalapproachtotargeteddrugdelivery”,directeddrugdelivery,borchardtetal.,(ed.),pp.247-267,humanapress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物，含硫代磷酸鹽/酯前體藥物，含硫酸鹽/酯前體藥物，含肽前體藥物，d-氨基酸修飾前體藥物，糖基化前體藥物，含β-內(nèi)酰胺前體藥物，含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物，可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑?！胺派浏煼ā被颉胺暖煛敝甘褂枚ㄏ蛸ゑR射線或貝塔射線來誘發(fā)對(duì)細(xì)胞的足夠損傷，以限制細(xì)胞正常發(fā)揮功能的能力或全然破壞細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，本領(lǐng)域知道許多方式來確定治療的劑量和持續(xù)時(shí)間。典型的治療作為一次施用來給予，而典型的劑量范圍為每天10-200個(gè)單位(戈瑞(gray))?！吧飳W(xué)樣品”(可互換地稱作“樣品”或“組織或細(xì)胞樣品”)涵蓋自個(gè)體獲得的且可用于診斷或監(jiān)測(cè)測(cè)定法的多種樣品類型。該定義涵蓋血液和生物學(xué)起源的其它液體樣品，固體組織樣品諸如活檢標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或自其衍生的細(xì)胞，及其后代。該定義還涵蓋在獲得它們后已經(jīng)進(jìn)行過操作的樣品，諸如用試劑處理，增溶，或富集某些成分諸如蛋白質(zhì)或多核苷酸，或?yàn)榍衅康亩癫卦诎牍腆w或固體基質(zhì)中。術(shù)語“生物學(xué)樣品”涵蓋臨床樣品，而且還包括培養(yǎng)中的細(xì)胞，細(xì)胞上清液，細(xì)胞溶胞物，血清，血漿，生物學(xué)流體，和組織樣品。生物學(xué)樣品的來源可以是實(shí)體組織，像來自新鮮的，冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液，羊水，腹膜液，或間質(zhì)液；來自妊娠或個(gè)體發(fā)育中任何時(shí)間的細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤獲得的。生物學(xué)樣品可含有在自然界中不與該組織天然混和的化合物，諸如防腐劑，抗凝劑，緩沖劑，固定劑，營(yíng)養(yǎng)物，抗生素，諸如此類。為本發(fā)明目的，組織樣品的“切片”指一塊或一片組織樣品，例如從組織樣品上切下來的一薄片組織或細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)了解，可以制作多片組織樣品切片并依照本發(fā)明進(jìn)行分析。在有些實(shí)施方案中，將組織樣品的同一切片用于形態(tài)學(xué)和分子兩個(gè)水平的分析或者針對(duì)蛋白質(zhì)和核酸二者進(jìn)行分析。術(shù)語“標(biāo)記物”在用于本文時(shí)指與試劑諸如核酸探針或抗體直接或間接綴合或融合，以便于檢測(cè)它所綴合或融合的試劑的化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變?？筬gfr2/3抗體組合物和使用抗fgfr2/3抗體的方法本發(fā)明涵蓋組合物(包括藥物組合物)，其包含抗fgfr2/3抗體；和包含編碼抗fgfr2/3抗體的序列的多核苷酸。如本文中所使用的，組合物包含一種或多種結(jié)合fgfr2和fgfr3的抗體，和/或一種或多種包含編碼一種或多種結(jié)合fgfr2和fgfr3的抗體的序列的多核苷酸。這些組合物可進(jìn)一步包含合適的載體，諸如藥學(xué)可接受的賦形劑，包括緩沖劑，它們是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明還涵蓋分離的抗體和多核苷酸的實(shí)施方案。本發(fā)明還涵蓋基本上純的抗體和多核苷酸的實(shí)施方案。本發(fā)明還涵蓋使用抗fgfr2/3抗體(如本文中描述的或如本領(lǐng)域已知的)治療病癥，例如多發(fā)性骨髓瘤或過渡階段癌瘤(例如侵入性過渡階段癌瘤)的方法?？筬gfr2/3抗體組合物本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體優(yōu)選是單克隆的。本發(fā)明的范圍還涵蓋本文中所提供的抗fgfr2/3抗體的fab，fab′，fab′-sh和f(ab′)2片段。這些抗體片段可通過傳統(tǒng)手段來制備，諸如酶促消化，或者可以通過重組技術(shù)來生成。此類抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段可用于下文所列的診斷和治療目的。單克隆抗體是由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變。如此，修飾語“單克隆”指明抗體的特征，即不是不同抗體的混合物。本發(fā)明的抗fgfr2/3單克隆抗體可使用最初由kohler等,nature256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組dna方法(美國(guó)專利no.4,816,567)來制備。在雜交瘤方法中，免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體會(huì)特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。fgfr2/3的抗體可以通過在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射fgfr2/3和佐劑來生成。fgfr2/3可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來制備，其中有些方法在本文中有進(jìn)一步描述。例如，人和小鼠fgfr2/3的重組生產(chǎn)在下文中有描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，將動(dòng)物用融合至免疫球蛋白重鏈fc部分的fgfr2/3免疫。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將動(dòng)物用fgfr2/3-igg1融合蛋白免疫。通常將動(dòng)物針對(duì)fgfr2/3的免疫原性綴合物或衍生物和單磷酰脂質(zhì)a(mpl)/二棒分枝菌酸海藻糖(trehalosedicrynomycolate,tdm)ribiimmunochem.research,inc.,hamilton,mt)進(jìn)行免疫，將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位。2周后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，并對(duì)血清測(cè)定抗fgfr2/3滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到平臺(tái)(plateaus)?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,pp.59-103,academicpress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt或hprt)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃嘌呤，氨基喋呤和胸苷(hat培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止hgprt缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合，支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體，并對(duì)諸如hat培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,california,usa)獲得的mopc-21和mpc-11小鼠腫瘤及可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection,rockville,maryland,usa)獲得的sp-2或x63-ag8-653細(xì)胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已描述用于生成人單克隆抗體(kozbor,j.immunol.133:3001(1984)；brodeur等,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63,marceldekker,inc.,newyork,1987)?？蓪?duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)液測(cè)定針對(duì)fgfr2/3的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如munson等,anal.biochem.107:220(1980)的scatchard分析來測(cè)定。在鑒定得到生成具有期望特異性，親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,pp.59-103,academicpress,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如d-mem或rpmi-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白a-sepharose，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)液，腹水或血清適當(dāng)分開。本發(fā)明的抗fgfr2/3抗體可以通過使用組合文庫篩選具有期望活性的合成抗體克隆來制備。在原理上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成抗體克隆，所述噬菌體文庫含有展示融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(qū)片段(fv)的噬菌體。通過針對(duì)期望抗原的親和層析淘選此類噬菌體文庫。表達(dá)能夠結(jié)合期望抗原的fv片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫中不結(jié)合的克隆分開。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進(jìn)一步富集。本發(fā)明的任何抗fgfr2/3抗體可以如下獲得，即設(shè)計(jì)合適的抗原篩選規(guī)程來選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來自感興趣的噬菌體克隆的fv序列和kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,nihpublication91-3242,bethesdamd(1991),卷1-3中記載的合適的恒定區(qū)(fc)序列構(gòu)建全長(zhǎng)抗fgfr2/3抗體克隆?？贵w的抗原結(jié)合域由兩個(gè)約110個(gè)氨基酸的可變(v)區(qū)形成，分別來自重鏈(vl)和輕鏈(vh)，都呈現(xiàn)三個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。可變域可以功能性的展示在噬菌體上，或是作為單鏈fv(scfv)片段(其中vh和vl通過短的，柔性的肽共價(jià)相連)，或者作為fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共價(jià)相互作用)，如winter等,ann.rev.immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文時(shí)，編碼scfv的噬菌體克隆和編碼fab的噬菌體克隆統(tǒng)稱為“fv噬菌體克隆”或“fv克隆”。vh和vl基因的全集可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)分開克隆，并在噬菌體文庫中隨機(jī)重組，然后可以搜索抗原結(jié)合克隆，如winter等,ann.rev.immunol.,12:433-455(1994)所述。來自經(jīng)免疫來源的文庫能提供對(duì)免疫原有高親和力的抗體，無需構(gòu)建雜交瘤?；蛘?，可以克隆未免疫的全集，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗體來源，無需任何免疫，如griffiths等,emboj,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文庫還可以以合成方式來構(gòu)建，即從干細(xì)胞克隆未重排的v基因片段，使用包含隨機(jī)序列的pcr引物來編碼高度可變的cdr3區(qū)并在體外實(shí)現(xiàn)重排，如hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)所述。通過與次要外殼蛋白piii融合，使用絲狀噬菌體來展示抗體片段?？贵w片段可以展示為單鏈fv片段，其中vh與vl結(jié)構(gòu)域通過柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例如如marks等,j.mol.biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示為fab片段，其中一條鏈與piii融合，而另一條鏈分泌到細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中，在此裝配fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過取代一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面上，例如如hoogenboom等,nucl.acidsres.,19:4133-4137(1991)所述。一般而言，從收獲自人或動(dòng)物的免疫細(xì)胞獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果希望文庫偏向抗fgfr2/3克隆，那么可以給個(gè)體免疫fgfr2/3以產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并回收脾細(xì)胞和/或循環(huán)b細(xì)胞或其它外周血淋巴細(xì)胞(pbl)用于文庫構(gòu)建。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下得到了偏向抗fgfr2/3克隆的人抗體基因片段文庫，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體生成系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗fgfr2/3抗體應(yīng)答，使得fgfr2/3免疫產(chǎn)生生成針對(duì)fgfr2/3的人抗體的b細(xì)胞。生成人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生在下文中有描述?？梢匀缦芦@得抗fgfr2/3反應(yīng)性細(xì)胞群的進(jìn)一步富集，即使用合適的篩選規(guī)程來分離表達(dá)fgfr2/3特異性膜結(jié)合抗體的b細(xì)胞，例如通過用fgfr2/3親和層析或者細(xì)胞對(duì)熒光染料標(biāo)記的fgfr2/3的吸附及后續(xù)的流動(dòng)激活細(xì)胞分選(facs)進(jìn)行的細(xì)胞分離?；蛘?，來自未免疫供體的脾細(xì)胞和/或b細(xì)胞或其它pbl的使用提供了可能的抗體全集的更佳展現(xiàn)，而且還容許使用fgfr2/3在其中沒有抗原性的任何動(dòng)物(人或非人的)物種構(gòu)建抗體文庫。為了體外摻入抗體基因的文庫構(gòu)建，從個(gè)體收獲干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸?？梢詮亩喾N動(dòng)物物種(諸如人，小鼠，大鼠，兔類，luprine，犬，貓，豬，牛，馬，和鳥類等)獲得感興趣的免疫細(xì)胞。從感興趣的細(xì)胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括vh和vl區(qū)段)的核酸并擴(kuò)增。就重排的vh和vl基因文庫而言，可以如下獲得所需dna，即從淋巴細(xì)胞分離基因組dna或mrna，接著用與重排的vh和vl基因的5′和3′末端匹配的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，如orlandi等,proc.natl.acad.sci.usa,86:3833-3837(1989)所述，由此構(gòu)建多樣性v基因全集供表達(dá)?？梢詮腸dna和基因組dna擴(kuò)增v基因，反向引物位于編碼成熟v結(jié)構(gòu)域的外顯子的5′末端，正向引物基于j區(qū)段內(nèi)部，如orlandi等(1989)和ward等,nature,341:544-546(1989)所述。然而，為了從cdna進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物還可基于前導(dǎo)外顯子(leaderexon)內(nèi)，如jones等,biotechnol.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定區(qū)內(nèi)，如sastry等,proc.natl.acad.sci.(usa),86:5728-5732(1989)所述。為了使互補(bǔ)性最大化，引物中可以摻入簡(jiǎn)并性，如orlandi等(1989)或sastry等(1989)所述。優(yōu)選的是，如下將文庫多樣性最大化，即使用靶向每個(gè)v基因家族的pcr引物來擴(kuò)增免疫細(xì)胞核酸樣品中存在的所有可獲得的vh和vl排列，例如如marks等,j.mol.biol.,222:581-597(1991)或orum等,nucleicacidsres.,21:4491-4498(1993)的方法所述。為了將所擴(kuò)增的dna克隆到表達(dá)載體中，可以在pcr引物的一端引入罕見的限制性位點(diǎn)作為標(biāo)簽，如orlandi等(1989)所述，或者用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行進(jìn)一步的pcr擴(kuò)增，如clackson等,nature,352:624-628(1991)所述。人工合成的重排的v基因全集可以在體外從v基因區(qū)段衍生。大多數(shù)人vh基因區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(tomlinson等,j.mol.biol.,227:776-798(1992))，并定位(matsuda等,naturegenet.,3:88-94(1993))；這些克隆的區(qū)段(包括h1和h2環(huán)的所有主要構(gòu)型)可用于生成多樣性vh基因全集，用到編碼序列和長(zhǎng)度多樣性的h3環(huán)的pcr引物，如hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)所述。vh全集還可如下生成，所有序列多樣性集中于單一長(zhǎng)度的長(zhǎng)h3環(huán)，如barbas等,proc.natl.acad.sci.usa,89:4457-4461(1992)所述。人vκ和vλ區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(williams和winter,eur.j.immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的輕鏈全集?；谝幌盗衯h和vl折疊及l(fā)3和h3長(zhǎng)度的合成的v基因全集會(huì)編碼具有可觀結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。擴(kuò)增編碼v基因的dna后，依照hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在體外重排種系v基因區(qū)段?？贵w片段全集可以如下構(gòu)建，即以數(shù)種方式將vh與vl基因全集聯(lián)合在一起。可以在不同載體中創(chuàng)建各個(gè)全集，并在體外重組載體，例如如hogrefe等,gene,128:119-126(1993)所述，或者在體內(nèi)通過組合感染來重組載體，例如waterhouse等,nucl.acidsres.,21:2265-2266(1993)中記載的loxp系統(tǒng)。體內(nèi)重組方法利用fab片段的雙鏈性質(zhì)來克服因大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率施加的庫容量限制。分別克隆未免疫的vh和vl全集，一個(gè)克隆入噬菌粒，另一個(gè)克隆入噬菌體載體。然后通過用噬菌體感染含噬菌粒的細(xì)菌使得每個(gè)細(xì)胞包含不同的組合來聯(lián)合兩種文庫，庫容量只受細(xì)胞存在數(shù)的限制(約1012個(gè)克隆)。兩種載體都包含體內(nèi)重組信號(hào)，使得vh與vl基因重組到單一復(fù)制子上，并共包裝成噬菌體病毒粒。這些巨型文庫提供了大量的具有優(yōu)良親和力(kd-1為約10-8m)的多樣性抗體?；蛘?，可以將全集依次克隆入同一載體，例如如barbas等,proc.natl.acad.sci.usa,88:7978-7982(1991)所述，或者通過pcr裝配到一起，然后克隆，如clackson等,nature,352:624-628(1991)所述。pcr裝配還可用于將vh和vldna與編碼柔性肽間隔物的dna連接以形成單鏈fv(scfv)全集。在另一種技術(shù)中，“細(xì)胞內(nèi)pcr裝配”用于通過pcr在淋巴細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合vh與vl基因，然后克隆所連接基因的全集，如embleton等,nucl.acidsres.,20:3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(naivelibrary)(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力(kd-1為約106-107m-1)，但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構(gòu)建和再次選擇次生文庫，如winter等(1994),見上文所述。例如，在hawkins等,j.mol.biol.,226:889-896(1992)的方法或gram等,proc.natl.acad.sciusa,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易錯(cuò)聚合酶在體外隨機(jī)引入突變(leung等,technique,1:1230-232和236-247(1989))。另外，可以通過隨機(jī)突變一個(gè)或多個(gè)cdr來進(jìn)行親和力成熟，例如在選定的個(gè)別fv克隆中使用攜帶跨越感興趣cdr的隨機(jī)序列的引物進(jìn)行pcr并篩選更高親和力的克隆。wo96/07754(公布于1996年3月14日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)中誘導(dǎo)誘變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫的方法。另一種高效方法是將通過噬菌體展示選出的vh或vl結(jié)構(gòu)域與得自未免疫供體的天然存在v結(jié)構(gòu)域變體組合，并在數(shù)輪鏈重新改組中篩選更高親和力，如marks等,biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技術(shù)容許生成親和力在10-9m范圍的抗體和抗體片段。fgfr2和fgfr3核酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的?？梢允褂孟胍膄gfr2和fgfr3區(qū)的氨基酸序列來設(shè)計(jì)編碼fgfr2和fgfr3的核酸序列。例如，可以使用r3mab的氨基酸序列來設(shè)計(jì)fgfr3。正如本領(lǐng)域公知的，fgfr3有兩種主要剪接同種型(isoform)，fgfr3iiib和fgfr3iiic。fgfr3序列是本領(lǐng)域公知的，而且可以包括uniprokb/swiss-prot登錄號(hào)p22607(fgfr3iiic)或p22607_2(fgfr3iiib)的序列。已經(jīng)鑒定了fgfr2和fgfr3突變，而且是本領(lǐng)域公知的，包括下述突變(參考uniprokb/swiss-prot登錄號(hào)p22607(fgfr3iiic)或p22607_2(fgfr3iiib)中顯示的序列)：編碼fgfr2和/或fgfr3的核酸可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法來制備。這些方法包括但不限于通過engels等,agnew.chem.int.ed.engl.,28:716-734(1989)中記載的任何方法，諸如三酯，亞磷酸酯，磷酰胺酯(phosphoramidite)和h-膦酸酯法進(jìn)行的化學(xué)合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼fgfr2和/或fgfr3的dna的設(shè)計(jì)中使用表達(dá)宿主細(xì)胞所優(yōu)選的密碼子?；蛘?，編碼fgfr2和/或fgfr3的dna可以從基因組或cdna文庫分離。構(gòu)建編碼fgfr2和/或fgfr3的dna分子后，將該dna分子與表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒中的表達(dá)控制序列可操作連接，其中所述控制序列受到該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的識(shí)別。一般而言，質(zhì)粒載體包含復(fù)制和控制序列，其衍生自與宿主細(xì)胞相容的物種。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及編碼能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的蛋白質(zhì)的序列。適于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域已知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述?？梢允褂谜婧松矬w，諸如酵母或衍生自多細(xì)胞生物體諸如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。任選的是，編碼fgfr2和/或fgfr3的dna與分泌前導(dǎo)序列可操作連接，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導(dǎo)序列的例子包括stii，ecotin，lamb，皰疹gd，lpp，堿性磷酸酶，轉(zhuǎn)化酶，和α-因子。適用于此處的還有蛋白a的36個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列(abrahmsen等,emboj.,4:3901(1985))。宿主細(xì)胞用上文所述本發(fā)明的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選轉(zhuǎn)化，并在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基可以為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子，或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)修改。轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，無論任何編碼序列事實(shí)上是否表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道許多轉(zhuǎn)染方法，例如capo4沉淀和電穿孔。若宿主細(xì)胞內(nèi)存在此載體運(yùn)轉(zhuǎn)的任何指示，則一般認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。用于轉(zhuǎn)染的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述。轉(zhuǎn)化指將dna導(dǎo)入生物體，使得dna可進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件，或是通過染色體整合。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述。用于生成fgfr2和/或fgfr3的原核宿主細(xì)胞可以如sambrook等,見上文一般所述進(jìn)行培養(yǎng)。用于生成fgfr2和/或fgfr3的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。本公開文本提到的宿主細(xì)胞涵蓋體外培養(yǎng)物中的細(xì)胞以及宿主動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞。fgfr2和/或fgfr3的純化可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來實(shí)現(xiàn)，本文描述了其中一些。純化的fgfr2和/或fgfr3可以附著于合適的基質(zhì)，諸如瓊脂糖珠，丙烯酰胺珠，玻璃珠，纖維素，各種丙烯酸共聚物，羥基甲基丙烯酸酯凝膠，聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物，尼龍，中性和離子載體，諸如此類，用于噬菌體展示克隆的親和層析分離。fgfr2和/或fgfr3蛋白對(duì)基質(zhì)的附著可以通過methodsinenzymology,卷44(1976)中記載的方法來實(shí)現(xiàn)。將蛋白質(zhì)配體附著于多糖基質(zhì)，例如瓊脂糖，右旋糖苷或纖維素的常用技術(shù)涉及用鹵化氰活化載體，隨后將肽配體的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶聯(lián)至活化后的基質(zhì)。或者，fgfr2和/或fgfr3可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細(xì)胞上表達(dá)，或用于細(xì)胞分選，或者綴合至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于本領(lǐng)域已知的用于淘選噬菌體展示庫的任何其它方法。在適于至少部分噬菌體顆粒結(jié)合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫樣品接觸固定化的fgfr2和/或fgfr3。正常情況下，選擇包括ph，離子強(qiáng)度，溫度等等的條件來模擬生理?xiàng)l件。對(duì)結(jié)合至固相的噬菌體進(jìn)行清洗，然后用酸洗脫，例如如barbas等,proc.natl.acad.sciusa,88:7978-7982(1991)所述，或者用堿洗脫，例如如marks等,j.mol.biol.,222:581-597(1991)所述，或者通過fgfr3抗原競(jìng)爭(zhēng)洗脫，例如在與clackson等,nature,352:624-628(1991)的抗原競(jìng)爭(zhēng)法類似的規(guī)程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌體可以在細(xì)菌培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過程中解離的動(dòng)力學(xué)，及單個(gè)噬菌體上的多個(gè)抗體片段是否能同時(shí)結(jié)合抗原。具有較快解離動(dòng)力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體可以通過使用短時(shí)間的清洗，多價(jià)噬菌體展示，及固相中的高抗原包被密度來保留。高密度不僅通過多價(jià)相互作用而穩(wěn)定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結(jié)合。具有較慢解離動(dòng)力學(xué)(和強(qiáng)結(jié)合親和力)的抗體的選擇可以通過使用長(zhǎng)時(shí)間的清洗和單價(jià)噬菌體展示(如bass等,proteins,8:309-314(1990)和wo92/09690所述)及低抗原包被密度(如marks等,biotechnol.,10:779-783(1992)所述)來促進(jìn)。有可能在對(duì)fgfr2和/或fgfr3具有不同親和力的噬菌體抗體之間進(jìn)行選擇，甚至是親和力略有差異的。然而，選定抗體的隨機(jī)突變(例如如有些上文所述親和力成熟技術(shù)進(jìn)行)有可能產(chǎn)生許多突變體，多數(shù)結(jié)合抗原，少數(shù)具有更高的親和力。通過限制fgfr2和/或fgfr3，罕見的高親和力噬菌體能競(jìng)爭(zhēng)勝出。為了保留所有較高親和力的突變體，可以將噬菌體與過量的生物素化fgfr2和/或fgfr3一起溫育，但是生物素化fgfr2和/或fgfr3的摩爾濃度低于fgfr2和/或fgfr3的目標(biāo)摩爾親和常數(shù)。然后用鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結(jié)合噬菌體。此類“平衡捕捉”容許依照結(jié)合親和力來選擇抗體，其靈敏性容許從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力只有原值2倍的突變體克隆。還可以操作清洗結(jié)合至固相的噬菌體的條件來進(jìn)行基于解離動(dòng)力學(xué)的區(qū)分。fgfr2/3克隆可以進(jìn)行活性選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供阻斷fgfr3受體與它的配體(諸如fgf1和/或fgf9)和fgfr2與它的配體之間的結(jié)合的fgfr2/3抗體。對(duì)應(yīng)于此類fgfr2/3抗體的fv克隆可以如下選擇：(1)如上所述自噬菌體文庫分離fgfr2/3克隆，并任選通過在合適的細(xì)菌宿主中培養(yǎng)所述群體來擴(kuò)增所分離的噬菌體克隆群體；(2)對(duì)想要阻斷活性的fgfr2/3和想要不阻斷活性的第二蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇；(3)將抗fgfr2/3噬菌體克隆吸附至固定化的fgfr2/3；(4)使用過量的所述第二蛋白質(zhì)洗脫任何不想要的克隆，它們識(shí)別與所述第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇交疊或共享的fgfr2/3結(jié)合決定簇；并(5)洗脫在步驟(4)后保持吸附的克隆。任選地，具有期望的阻斷/不阻斷特性的克隆可通過一次或多次重復(fù)本文所述選擇規(guī)程來進(jìn)一步富集。本發(fā)明的編碼雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示fv克隆的dna易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如通過使用設(shè)計(jì)成自雜交瘤或噬菌體dna模板特異性擴(kuò)增感興趣的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將dna置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞，猿cos細(xì)胞，中國(guó)倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得期望單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的dna在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括skerra等,curr.opinioninimmunol.,5:256(1993)及pluckthun,immunol.rev.,130:151(1992)。本發(fā)明的編碼fv克隆的dna可以聯(lián)合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的已知dna序列(例如適宜的dna序列可得自kabat等,見上文)以形成編碼全長(zhǎng)或部分重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)都可用于此目的，包括igg，igm，iga，igd和ige恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以得自任何人或動(dòng)物物種。衍生自一種動(dòng)物(諸如人)物種的可變域dna，然后與另一動(dòng)物物種的恒定區(qū)dna融合以形成“雜合的”全長(zhǎng)重鏈和/或輕鏈的編碼序列的fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“雜合”抗體的定義中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生自人可變dna的fv克隆與人恒定區(qū)dna融合以形成完全人的，全長(zhǎng)或部分重鏈和/或輕鏈的編碼序列。還可以修飾本發(fā)明的編碼衍生自雜交瘤的抗fgfr2/3抗體的dna，例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替衍生自雜交瘤克隆的同源鼠序列(例如如morrison等,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984)中的方法)。通過共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列，可以進(jìn)一步修飾編碼雜交瘤或fv克隆衍生抗體或片段的dna?？梢砸栽摲绞街苽渚哂斜景l(fā)明的fv克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜合”抗體。雙特異性抗體在一個(gè)方面，本發(fā)明部分基于結(jié)合klb和fgfr2/3二者的雙特異性抗體(“fgfr2/3+klb雙特異性抗體”)的發(fā)現(xiàn)。在某些方面，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于治療代謝疾病和病癥，此類治療在對(duì)肝沒有顯著影響且骨量沒有顯著損失的情況下導(dǎo)致重量減輕和/或改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝。在某些方面，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于治療nash。在某些實(shí)施方案中，本文中公開的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包含本文中公開的抗fgfr2/3抗體任一的第一臂和本文中公開的或us20150218276(將其完整收入本文)中公開的任何抗klb抗體的第二臂。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體對(duì)肝，例如肝功能沒有顯著影響。在某些實(shí)施方案中，與fgf21蛋白質(zhì)對(duì)肝中fgfr/klb受體復(fù)合物的調(diào)控相比，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體不調(diào)控肝中fgfr/klb受體復(fù)合物的活性。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體不導(dǎo)致對(duì)fgfr4/klb復(fù)合物的抑制和/或不導(dǎo)致肝酶諸如但不限于alt，ast，alp和gldh的升高。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體在肝中不發(fā)揮作為fgfr2c/klb復(fù)合物和/或fgfr3c/klb復(fù)合物的激動(dòng)劑的功能，那能導(dǎo)致肝中活化的mapk信號(hào)傳導(dǎo)和/或改變的spry4和dusp6表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，與fgf21蛋白質(zhì)對(duì)mapk信號(hào)傳導(dǎo)的活化相比，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體不導(dǎo)致肝中mapk信號(hào)傳導(dǎo)的活化。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體在肝中不發(fā)揮作為fgfr4/klb復(fù)合物的激動(dòng)劑的功能。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可以是人源化的。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體包含受體人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可以是單克隆抗體，包括嵌合，人源化或人抗體。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可以是抗體片段，例如fv，fab，fab’，scfv，雙抗體，或f(ab’)2片段。在某些實(shí)施方案中，該fgfr2/3+klb雙特異性抗體是全長(zhǎng)抗體，例如完整igg1抗體，或本文中定義的其它抗體類或亞型。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可以并入單獨(dú)的或組合的下文詳細(xì)描述的任何特征。本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體例如對(duì)于代謝病癥的診斷或治療是有用的。代謝病癥的非限制性例子包括多囊卵巢綜合征(pcos)，代謝綜合征(mets)，肥胖癥，非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝病(nafld)，高脂血癥，高血壓，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，潛伏性自身免疫性糖尿病(lad)，年輕人成熟期發(fā)作糖尿病(mody)，和衰老及相關(guān)疾病諸如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和als。在優(yōu)選的方面，該代謝疾病為nash。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于例如代謝病癥的診斷或治療。代謝病癥的非限制性例子包括多囊卵巢綜合征(pcos)，代謝綜合征(mets)，肥胖癥，非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝病(nafld)，高脂血癥，高血壓，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，潛伏性自身免疫性糖尿病(lad)，年輕人成熟期發(fā)作糖尿病(mody)，和衰老及相關(guān)疾病諸如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和als。在優(yōu)選的方面，該代謝疾病為nash。例示性抗klb抗體在一個(gè)方面，本公開文本提供了一種分離的結(jié)合klb蛋白質(zhì)的抗體。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的抗klb抗體結(jié)合klb的c端域。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的抗klb抗體結(jié)合包含氨基酸序列ssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitas(seqidno:103)的klb片段。在某些實(shí)施方案中，該抗體與抗klb抗體，例如本文中描述的8c5結(jié)合相同表位。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的抗klb抗體包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:230-232和236-247任一的氨基酸序列的hvr-h1，例如seqidno:244或247；(b)包含seqidno:142和248-262任一的氨基酸序列的hvr-h2，例如seqidno:259或262；(c)包含seqidno:263-278任一的氨基酸序列的hvr-h3，例如seqidno:166或169；(d)包含seqidno:279-293任一的氨基酸序列的hvr-l1，例如seqidno:171或184；(e)包含seqidno:294-309任一的氨基酸序列的hvr-l2，例如seqidno:197或200；和(f)包含seqidno:310-324任一的氨基酸序列的hvr-l3，例如seqidno:212或215。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種抗klb抗體，其包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:119的hvr-h1；(b)包含seqidno:150的hvr-h2；(c)包含seqidno:166的hvr-h3；(d)包含seqidno:171的hvr-l1；(e)包含seqidno:197的hvr-l2；和(f)包含seqidno:212的hvr-l3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種抗klb抗體，其包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:122的hvr-h1；(b)包含seqidno153的hvr-h2；(c)包含seqidno:169的hvr-h3；(d)包含seqidno184的hvr-l1；(e)包含seqidno:200的hvr-l2；和(f)包含seqidno:215的hvr-l3。本公開文本進(jìn)一步提供了一種抗klb抗體，其包含與seqidno:104的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重鏈可變域(vh)序列。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的vh序列相對(duì)于參照序列含有替代(例如下文公開的保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗klb抗體保留結(jié)合klb的能力。在某些實(shí)施方案中，在seqidno:104中替代，插入和/或刪除了總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該替代，插入，或刪除發(fā)生在hvr以外的區(qū)域中(即在fr中)?；蛘呋蛄硗猓摽筴lb抗體包含seqidno:104中的vh序列，包括下文公開的該序列的翻譯后修飾。在某些實(shí)施方案中，該vh包含一種，兩種或三種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:122的氨基酸序列的hvr-h1，(b)包含seqidno:153的氨基酸序列的hvr-h2，和(c)包含seqidno:169的氨基酸序列的hvr-h3。在另一個(gè)方面，本公開文本提供了一種抗klb抗體，其中該抗體包含與seqidno:105的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的輕鏈可變域(vl)。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的vl序列相對(duì)于該參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的抗klb抗體保留結(jié)合klb的能力。在某些實(shí)施方案中，在seqidno:105中替代，插入和/或刪除了總共1至10氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該替代，插入，或刪除發(fā)生在hvr以外的區(qū)域中(即在fr中)?；蛘呋蛄硗猓摽筴lb抗體包含seqidno:105中的vl序列，包括該序列的翻譯后修飾。在某些實(shí)施方案中，該vl包含一種，兩種或三種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:184的氨基酸序列的hvr-l1；(b)包含seqidno:200的氨基酸序列的hvr-l2；和(c)包含seqidno:215的氨基酸序列的hvr-l3。本公開文本進(jìn)一步提供了一種抗klb抗體，其中該抗體包含上文提供的實(shí)施方案任一中的vh和上文提供的實(shí)施方案任一中的vl。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含分別在seqidno:104和seqidno:105中的vh和vl序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在某些實(shí)施方案中，抗klb抗體結(jié)合由氨基酸序列ssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitas(seqidno:103)組成的klb片段。雙特異性抗fgfr2/3抗體本公開文本進(jìn)一步提供了結(jié)合klb和fgfr2/3二者的雙特異性抗體(即fgfr2/3+klb雙特異性抗體)。雙特異性抗體具有兩種不同結(jié)合特異性，參見例如美國(guó)專利no.5,922,845和5,837,243；zeilder(1999)j.immunol.163:1246-1252；somasundaram(1999)hum.antibodies9:47-54；keler(1997)cancerres.57:4008-4014。例如，而且并非為了限制，當(dāng)前公開的主題提供了雙特異性抗體具有針對(duì)klb上存在的第一表位的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(例如抗原結(jié)合位點(diǎn))和針對(duì)fgfr2/3上存在的第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)。例如，而且并非為了限制，本公開文本提供了一種抗體，其中一個(gè)臂結(jié)合klb且包含本文中描述的抗klb抗體序列任一且第二臂結(jié)合fgfr2/3且包含本文中描述的抗fgfr2/3抗體序列任一。在某些實(shí)施方案中，本公開文本的fgfr2/3+klb雙特異性抗體具有針對(duì)klb上存在的第一表位的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和針對(duì)fgfr2/3上存在的第二表位的第二結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分包括重鏈和輕鏈區(qū)。在某些實(shí)施方案中，全長(zhǎng)重鏈包括具有與seqidno:106中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，全長(zhǎng)輕鏈包括具有與seqidno:107中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，全長(zhǎng)重鏈包括具有seqidno:106中所列序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該全長(zhǎng)輕鏈包括具有seqidno:107中所列序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:104中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:105中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)包括具有seqidno:104中所列序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)包括具有seqidno:105中所列序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:230-232和236-247任一的氨基酸序列的hvr-h1，例如seqidno:244或247；(b)包含seqidno:142和248-262任一的氨基酸序列的hvr-h2，例如seqidno:259或262；(c)包含seqidno:263-278任一的氨基酸序列的hvr-h3，例如seqidno:275或278；(d)包含seqidno:279-293任一的氨基酸序列的hvr-l1，例如seqidno:280或293；(e)包含seqidno:294-309任一的氨基酸序列的hvr-l2，例如seqidno:306或309；和(f)包含seqidno:310-324任一的氨基酸序列的hvr-l3，例如seqidno:321或324。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:119的hvr-h1；(b)包含seqidno:150的hvr-h2；(c)包含seqidno:166的hvr-h3；(d)包含seqidno:171的hvr-l1；(e)包含seqidno:197的hvr-l2；和(f)包含seqidno:212的hvr-l3。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種抗klb抗體，其包含至少一種，兩種，三種，四種，五種，或六種選自下述的hvr：(a)包含seqidno:122的hvr-h1；(b)包含seqidno:153的hvr-h2；(c)包含seqidno:169的hvr-h3；(d)包含seqidno:184的hvr-l1；(e)包含seqidno:200的hvr-l2；和(f)包含seqidno:215的hvr-l3。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括包含cdr1，cdr2，和cdr3域的重鏈可變區(qū)，和包含cdr1，cdr2，和cdr3域的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)cdr1域包括具有seqidno:230-232和236-247中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)cdr2域包括具有seqidno:142和248-262中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)cdr3域包括具有與seqidno:263-278至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)cdr1域包括具有與seqidno:279-293至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)cdr2域包括具有與seqidno:294-309至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)cdr3域包括具有與seqidno:310-324至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括包含cdr1，cdr2，和cdr3域的重鏈可變區(qū)，和包含cdr1，cdr2，和cdr3域的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)cdr1域包括具有seqidno:230-232和236-247中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)cdr2域包括具有seqidno:103和248-262中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該重鏈可變區(qū)cdr3域包括具有seqidno:263-278中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)cdr1域包括具有seqidno:279-293中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)cdr2域包括具有seqidno:294-309中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈可變區(qū)cdr3域包括具有seqidno:310-324中所列序列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括具有seqidno:122中所列序列的重鏈可變區(qū)cdr1；具有seqidno:153中所列序列的重鏈可變區(qū)cdr2；具有seqidno:169中所列序列的重鏈可變區(qū)cdr3；具有seqidno:184中所列序列的輕鏈可變區(qū)cdr1；具有seqidno:200中所列序列的輕鏈可變區(qū)cdr2；和具有seqidno:215中所列序列的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方案中，fgfr2/3+klb雙特異性抗體包括第一抗體或其抗原結(jié)合部分，且包括第二抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該第一抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合klb上存在的表位，且該第二抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合fgfr2/3上存在的表位。例如，而且并非為了限制，該第一抗體或其抗原結(jié)合部分可包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；且該第二抗體或其抗原結(jié)合部分可包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該第一抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:104中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該第一抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈可變區(qū)包括具有與seqidno:105中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該第二抗體(抗fgfr2/3抗體)或其抗原結(jié)合部分的重鏈包括具有與seqidno:282中所列序列至少60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該第二抗體(抗fgfr2/3抗體)或其抗原結(jié)合部分的輕鏈包括具有與seqidno:283中所列序列至少60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，本文中提供了與抗klb抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了與包含seqidno:104的vh序列和seqidno:105的vl序列的抗klb抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合由氨基酸序列ssptrlavipwgvrkllrwvrrnygdmdiyitas(seqidno:103)組成的klb片段的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合如下klb片段的fgfr2/3+klb雙特異性抗體，該klb片段具有與seqidno:103中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本文中提供了與抗klb抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了與包含seqidno:106的全長(zhǎng)重鏈序列和seqidno:107的全長(zhǎng)輕鏈序列的抗klb抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種fgfr2/3+klb雙特異性抗體，其與本文中提供的抗fgfr2/3抗體結(jié)合相同表位。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了與包含seqidno:82的vh序列和seqidno:66的vl序列的抗fgfr2/3抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合fgfr2上的包含氨基酸序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和/或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)的表位和/或還結(jié)合fgfr3上的包含氨基酸序列trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和/或iklrhqqwslvmes(seqidno:94)的表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了與本文中提供的抗fgfr2/3抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了與本文中公開的2b.1.3.12，2b.1.3.10，或該2b.1.1.6抗fgfr2/3抗體結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了與抗fgfr2/3抗體2b.1.3.10和2b.1.3.12結(jié)合相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體(即與2b.1.3.10和2b.1.3.12結(jié)合fgfr2上的包含氨基酸序列tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和/或ykvrnqhwslimes(seqidno:92)的相同表位和/或還結(jié)合fgfr3上的包含氨基酸序列trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和/或iklrhqqwslvmes(seqidno:94)的相同表位的fgfr2/3+klb雙特異性抗體)。在某些實(shí)施方案中，本公開文本提供了與本文中提供的2b.1.3.10和2b.1.3.12抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合fgfr2/3的fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了fgfr2/3+klb雙特異性抗體，其結(jié)合具有與seqidno:103中所列序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的氨基酸序列的klb片段，且結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合選自tntekmekrlhavpaantvkfrcpa(seqidno:91)和ykvrnqhwslimes(seqidno:92)的fgfr2表位且結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合選自trpermdkkllavpaantvrfrcpa(seqidno:93)和iklrhqqwslvmes(seqidno:94)的fgfr3表位。在某些實(shí)施方案中，提供了抗klb/抗fgfr1雙特異性抗體，其結(jié)合具有seqidno:103中所列氨基酸序列的klb片段且結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合seqidno:91和92中提供的fgfr2表位且結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合seqidno:93和94中提供的fgfr3表位?？贵w片段本發(fā)明涵蓋抗體片段。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優(yōu)勢(shì)。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于接近實(shí)體瘤。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如morimoto等,journalofbiochemicalandbiophysicalmethods24:107-117(1992)；brennan等,science229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。fab，fv和scfv抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)及由大腸桿菌分泌，如此容許容易的生成大量的這些片段?？蓮纳衔挠懻摰氖删w抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收fab′-sh片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成f(ab′)2片段(carter等,bio/technology10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離f(ab′)2片段。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基，具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的fab和f(ab′)2片段記載于美國(guó)專利no.5,869,046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈fv片段(scfv)(參見例如wo93/16185；美國(guó)專利no.5,571,894；及5,587,458)。fv和sfv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)，缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時(shí)降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sfv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在sfv的氨基或羧基末端的融合物。參見antibodyengineering,borrebaeck編,見上文?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國(guó)專利no.5,641,870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個(gè)或多個(gè)從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域。基本上可遵循winter及其同事的方法進(jìn)行人源化(jones等,nature321:522-525(1986)；riechmann等,nature332:323-327(1988)；verhoeyen等,science239:1534-1536(1988))，即用(非人)高變區(qū)序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利no.4,816,567)，其中顯著少于完整的人可變域用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些fr殘基用嚙齒類抗體類似位點(diǎn)的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變域的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對(duì)已知人可變域序列的整個(gè)文庫進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(sims等,j.immunol.151:2296(1993)；chothia等,j.mol.biol.196:901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(carter等,proc.natl.acad.sci.usa89:4285(1992)；presta等,j.immunol.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出fr殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)性地涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。人抗體本發(fā)明的人抗fgfr2/3抗體可以通過如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫的fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來構(gòu)建?；蛘撸梢酝ㄟ^雜交瘤方法來生成本發(fā)明的人單克隆抗fgfr2/3抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已有記載，例如kozborj.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987)；及boerner等,j.immunol.,147:86(1991)。現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因會(huì)導(dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如jakobovits等,proc.natl.acad.sci.usa90:2551(1993)；jakobovits等,nature362:255-258(1993)；bruggermann等,yearinimmunol.7:33(1993)?；蚋慕M也可用于自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為“表位印記”(epitopeimprinting)，如上所述通過噬菌體展示技術(shù)得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)用人v結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈/人鏈scfv或fab嵌合物群。用抗原進(jìn)行的選擇導(dǎo)致非人鏈/人鏈嵌合scfv或fab的分離，其中人鏈恢復(fù)了在一級(jí)噬菌體展示克隆中消除相應(yīng)的非人鏈后遭到破壞的抗原結(jié)合位點(diǎn)，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。在重復(fù)該過程以替換剩余非人鏈時(shí)，得到人抗體(參見pctwo93/06213，公布于1993年4月1日)。與傳統(tǒng)的通過cdr移植進(jìn)行的非人抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含非人起源的fr或cdr殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一針對(duì)fgfr3，另一結(jié)合特異性針對(duì)fgfr2。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)fgfr3，fgfr2，或fgfr2/3的細(xì)胞?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如f(ab′)2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。在傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(millstein和cuello,nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于wo93/08829,公布于1993年5月13日及traunecker等,emboj.10:3655(1991)。依照一種不同且更優(yōu)選的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈，ch2和ch3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(ch1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的dna插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相等比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比例沒有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于wo94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如suresh等,methodsinenzymology121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定域ch3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源綴合”抗體。例如，異源綴合物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利no.4,676,980)，及用于治療hiv感染(wo91/00360；wo92/00373；和ep03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源綴合抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國(guó)專利no.4,676,980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。brennan等,science229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成f(ab′)2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫化物的形成。然后將產(chǎn)生的fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?tnb)衍生物。然后將fab′-tnb衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成fab′-硫醇，并與等摩爾量的另一種fab′-tnb衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收fab′-sh片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。shalaby等,j.exp.med.175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體f(ab′)2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種fab′片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)her2受體的細(xì)胞和正常人t細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。kostelny等,j.immunol.148(5):1547-1553(1992)。將來自fos和jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的fab′部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(vh)和輕鏈可變域(vl)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因而，迫使一個(gè)片段上的vh和vl結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)vl和vh結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈fv(sfv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見gruber等,j.immunol.152:5368(1994)。涵蓋具有超過兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。tutt等,j.immunol.147:60(1991)。多價(jià)抗體多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快的受到表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞的內(nèi)在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達(dá)而生成的，具有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如四價(jià)抗體)的多價(jià)抗體(igm類別以外的)。多價(jià)抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體會(huì)包含fc區(qū)及fc區(qū)氨基末端的三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文中優(yōu)選的多價(jià)抗體包含(或由其組成)三個(gè)至約八個(gè)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變域。例如，多肽鏈可包含vd1-(x1)n-vd2-(x2)n-fc，其中vd1是第一可變域，vd2是第二可變域，fc是fc區(qū)的一條多肽鏈，x1和x2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，所述多肽鏈可包含：vh-ch1-柔性接頭-vh-ch1-fc區(qū)鏈；或vh-ch1-vh-ch1-fc區(qū)鏈。本文中的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價(jià)抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進(jìn)一步包含cl域?？贵w變體在有些實(shí)施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性?？贵w的氨基酸序列變體是通過將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或通過肽合成而制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。可進(jìn)行任何刪除，插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物，倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征?？稍谥苽湫蛄袝r(shí)將氨基酸改變引入受試抗體氨基酸序列?？捎糜阼b定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如cunningham和wells,science244:1081-1085(1989)中所述。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸，天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲那些對(duì)替代展示出功能敏感性的氨基酸位置。如此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，然而突變本身的本質(zhì)不必預(yù)先決定。例如，為了分析指定位點(diǎn)處突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長(zhǎng)度范圍由一個(gè)殘基至包含上百或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有n末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括將抗體的n或c端與酶(例如用于adept)或延長(zhǎng)抗體血清半衰期的多肽融合。多肽的糖基化典型的或是n-連接的或是o-連接的。n-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸(其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這些三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。o-連接的糖基化指將糖類n-乙酰半乳糖胺，半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列而便利地完成(用于n-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行(用于o-連接的糖基化位點(diǎn))。若抗體包含fc區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)us2003/0157108(presta,l.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)附著于抗體fc區(qū)的抗體。還可參見us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd.)。wo2003/011878(jean-mairet等人)和美國(guó)專利no.6,602,684(umana等人)中提到了在附著于抗體fc區(qū)的碳水化合物中有等分n-乙酰葡糖胺(glcnac)的抗體。wo1997/30087(patel等人)中報(bào)告了在附著于抗體fc區(qū)的寡糖中有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有更改的碳水化合物附著于其fc區(qū)的抗體還可參見wo1998/58964(raju,s.)和wo1999/22764(raju,s.)。關(guān)于具有改良糖基化的抗原結(jié)合分子還可參見us2005/0123546(umana等)。本文中的優(yōu)選糖基化變體包含fc區(qū)，其中附著于fc區(qū)的碳水化合物結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。此類變體具有改進(jìn)的adcc功能。任選的是，fc區(qū)還包含進(jìn)一步改進(jìn)adcc的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，例如fc區(qū)位置298，333和/或334處的替代(eu殘基編號(hào)方式)。涉及“脫巖藻糖型”或“巖藻糖缺乏型”抗體的出版物的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；okazaki等j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等biotech.bioeng.87:614(2004)。生成脫巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖化缺陷的lec13cho細(xì)胞(ripka等arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)杣s2003/0157108a1,presta,l；及wo2004/056312a1,adams等,尤其是實(shí)施例11)和敲除細(xì)胞系，諸如α-1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，fut8，敲除的cho細(xì)胞(yamane-ohnuki等biotech.bioeng.87:614(2004))。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸(至少兩個(gè)，至少三個(gè)，至少四個(gè)或更多個(gè))殘基用不同殘基替代。最有興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也涵蓋fr改變。下文表中“優(yōu)選替代”欄顯示了保守替代。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可導(dǎo)入下文表中稱為“例示替代”的更多實(shí)質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。原始?xì)埢咎娲鷥?yōu)選替代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp；lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾可通過選擇對(duì)維持以下方面的效果差異顯著的替代來實(shí)現(xiàn)：(a)替代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如(折疊)片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組：(1)疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性，親水性的：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性的：asp，glu；(4)堿性的：his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly，pro；及(6)芳香族的：trp，tyr，phe。非保守替代會(huì)需要用這些類別之一的成員替換另一個(gè)類別的。一類替代變體涉及替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體會(huì)具有改良的生物學(xué)特性。用于生成此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。將如此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的m13基因iii產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。或者/另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域知道的多種方法來制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然發(fā)生氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對(duì)較早制備的變體或非變體型式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，pcr誘變和盒式誘變來制備?？赡芟Ｍ诒景l(fā)明的免疫球蛋白多肽的fc區(qū)中引入一處或多處氨基酸修飾，由此生成fc區(qū)變體。fc區(qū)變體可包括在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含氨基酸修飾(例如替代)的人fc區(qū)序列(例如人igg1，igg2，igg3或igg4fc區(qū))。依照此描述和本領(lǐng)域的教導(dǎo)，涵蓋在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的抗體與野生型對(duì)應(yīng)抗體相比可在例如fc區(qū)中包含一處或多處改變。與它們的野生型對(duì)應(yīng)物相比，這些抗體仍會(huì)基本上保留治療功效所需要的相同特性。例如，認(rèn)為可在fc區(qū)中進(jìn)行將會(huì)導(dǎo)致c1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)改變(即或是增強(qiáng)或是削弱)的某些改變，例如wo99/51642中所述。還可參見關(guān)注fc區(qū)變體其它例子的duncan和winter,nature322:738-40(1988)；美國(guó)專利no.5,648,260；美國(guó)專利no.5,624,821；及wo94/29351。wo00/42072(presta)和wo2004/056312(lowman)記載了對(duì)fcr的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見shields等j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延長(zhǎng)且對(duì)新生兒fc受體(fcrn)(它負(fù)責(zé)將母體igg轉(zhuǎn)移給胎兒)(guyer等,j.immunol.117:587(1976)及kim等,j.immunol.24:249(1994))的結(jié)合改良的抗體記載于us2005/0014934a1(hinton等)。這些抗體包含具有一處或多處改進(jìn)fc區(qū)與fcrn結(jié)合的替代的fc區(qū)。具有改變的fc區(qū)氨基酸序列且c1q結(jié)合能力升高或降低的多肽變體記載于美國(guó)專利no.6,194,551b1,wo99/51642。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見idusogie等j.immunol.164:4178-4184(2000)?？贵w衍生物可進(jìn)一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領(lǐng)域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)模塊。優(yōu)選的是，適于抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(peg)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊環(huán)，聚-1,3,6-三烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢(shì)。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了一個(gè)以上的聚合物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據(jù)下列考慮來確定用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型，包括但不限于待改進(jìn)抗體的具體特性或功能，抗體衍生物是否會(huì)用于指定條件下的治療等。篩選具有期望特性的抗體本發(fā)明的抗體可以用本領(lǐng)域已知的各種測(cè)定法(本文中公開了其中一些)對(duì)其物理/化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能進(jìn)行表征。在一些實(shí)施方案中，抗體表征為如下任一項(xiàng)或多項(xiàng)：減弱或者阻斷fgf(諸如fgf1和/或fgf9)結(jié)合，減弱或者阻斷fgfr3活化，減弱或者阻斷fgfr3下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，破壞或阻斷fgfr3結(jié)合配體(例如fgf1，fgf9)，減弱或阻斷fgfr3二聚化，促進(jìn)單體fgfr3形成，結(jié)合單體fgfr3，和/或治療和/或預(yù)防腫瘤，細(xì)胞增殖性病癥或癌癥，和/或治療或預(yù)防與fgfr3表達(dá)和/或活性(諸如升高的fgfr3表達(dá)和/或活性)有關(guān)的病癥。在一些實(shí)施方案中，對(duì)抗體篩選升高的fgfr3活化，升高的fgfr3下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，凋亡活性，fgfr3下調(diào)，和效應(yīng)器功能(例如adcc活性)。在一些實(shí)施方案中，抗體表征為如下任一項(xiàng)或多項(xiàng)：減弱或者阻斷fgfr2活化，減弱或者阻斷fgfr2下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，破壞或阻斷fgfr2結(jié)合配體，減弱或阻斷fgfr2二聚化，促進(jìn)單體fgfr2形成，結(jié)合單體fgfr2，和/或治療和/或預(yù)防腫瘤，細(xì)胞增殖性病癥或癌癥，和/或治療或預(yù)防與fgfr2表達(dá)和/或活性(諸如升高的fgfr2表達(dá)和/或活性)有關(guān)的病癥。在一些實(shí)施方案中，對(duì)抗體篩選升高的fgfr2活化，升高的fgfr2下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，fgfr2下調(diào)，和效應(yīng)器功能(例如adcc活性)。在一些實(shí)施方案中，抗體表征為如下任一項(xiàng)或多項(xiàng)：減弱或者阻斷fgfr2和fgfr3活化，減弱或者阻斷fgfr2和fgfr3下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，破壞或阻斷fgfr2和fgfr3結(jié)合配體(例如fgf1，fgf9)，減弱或阻斷fgfr2和fgfr3二聚化，促進(jìn)單體fgfr2和fgfr3形成，結(jié)合單體fgfr2和單體fgfr3，和/或治療和/或預(yù)防腫瘤，細(xì)胞增殖性病癥或癌癥，和/或治療或預(yù)防與fgfr2和fgfr3表達(dá)和/或活性(諸如升高的fgfr2和fgfr3表達(dá)和/或活性)有關(guān)的病癥。在一些實(shí)施方案中，對(duì)抗體篩選升高的fgfr2和fgfr3活化，升高的fgfr2和fgfr3下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，凋亡活性，fgfr2和fgfr3下調(diào)，和效應(yīng)器功能(例如adcc活性)。純化的抗體還可以通過一系列測(cè)定法進(jìn)行表征，包括但不限于n端測(cè)序，氨基酸分析，非變性大小排阻高壓液相層析(hplc)，質(zhì)譜，離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，對(duì)此處制備的抗體分析它們的生物學(xué)活性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的抗體檢驗(yàn)它們的抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)域已知的并且可以在本文中使用的抗原結(jié)合測(cè)定法包括但不限于利用諸如以下技術(shù)的任何直接的或競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合測(cè)定法：western印跡，放射免疫測(cè)定法，elisa(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)，“夾心式/三明治式”免疫測(cè)定法，免測(cè)沉淀測(cè)定法，熒光免疫測(cè)定法和蛋白a免疫測(cè)定法。在下面的實(shí)施例部分提供例示性的抗原結(jié)合和其它測(cè)定法。如果想要抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的抗fgfr2/3抗體，那么可以在測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的體外和/或體內(nèi)測(cè)定法中測(cè)試候選抗體。如果想要促進(jìn)或不促進(jìn)凋亡的抗fgfr2/3抗體，那么可以在測(cè)量凋亡的測(cè)定法中測(cè)試候選抗體。用于檢查癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖或測(cè)定癌細(xì)胞凋亡的方法是本領(lǐng)域公知的，而且本文中描述和例示了一些。用于測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖和/或凋亡的例示性方法包括例如brdu摻入測(cè)定法，mtt，[3h]-胸苷摻入(例如topcount測(cè)定法(perkinelmer))，細(xì)胞存活力測(cè)定法(例如celltiter-glo(promega))，dna片段化測(cè)定法，胱天蛋白酶活化測(cè)定法，臺(tái)盼藍(lán)(tryptanblue)排斥，染色質(zhì)形態(tài)測(cè)定法，等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋具有效應(yīng)器功能的抗體。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量抗體的fc活性?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定法以證實(shí)cdc和/或adcc活性的降低/消除。例如，可以進(jìn)行fc受體(fcr)結(jié)合測(cè)定法以確保抗體缺失fcγr結(jié)合(因此可能缺失adcc活性)，但保留fcrn結(jié)合能力。介導(dǎo)adcc的主要細(xì)胞，nk細(xì)胞，只表達(dá)fcγriii，而單核細(xì)胞表達(dá)fcγri，fcγrii和fcγriii。在ravetch和kinet,annu.rev.immunol9:457-92(1991)第464頁的表3概述了造血細(xì)胞上的fcr表達(dá)。美國(guó)專利no.5,500,362或5,821,337描述了用于評(píng)估感興趣分子的adcc活性的體外測(cè)定法的一個(gè)例子。本文中也例示了用于檢測(cè)adcc活性的一種測(cè)定法?？捎糜谶@些測(cè)定法的有用效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞?；蛘?另外，可以在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的adcc活性，例如在諸如clynes等pnas(usa)95:652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中。也可以進(jìn)行c1q結(jié)合測(cè)定法以證實(shí)抗體不能結(jié)合c1q從而缺失cdc活性。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行cdc測(cè)定法，例如gazzano-santoro等,j.immunol.methods202:163(1996)所述。也可以利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行fcrn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測(cè)定，例如實(shí)施例部分中描述的那些。如果想要結(jié)合單體fgfr2和/或fgfr3的抗fgfr2/3抗體，那么可以在測(cè)量對(duì)單體fgfr2和/或fgfr3的結(jié)合和對(duì)單體fgfr2和/或fgfr3形成的促進(jìn)的測(cè)定法(諸如體外測(cè)定法)中測(cè)試候選抗體。諸如本領(lǐng)域知道的測(cè)定法，而且本文中描述并例示了一些測(cè)定法。如果想要抑制fgfr2和/或fgfr3二聚化的抗fgfr2/3抗體，那么可以在二聚化測(cè)定法中測(cè)試候選抗體，例如本文中描述的。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定候選抗體的fgfr2和/或fgfr3激動(dòng)劑功能。用于評(píng)估fgfr2和/或fgfr3抗體的激動(dòng)劑功能或活性的方法是本領(lǐng)域知道的，而且本文中還描述了一些。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定fgfr2/3抗體促進(jìn)fgfr2和/或fgfr3受體下調(diào)的能力，例如使用本文中描述和例示的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將fgfr2/3抗體與合適的測(cè)試細(xì)胞，例如膀胱癌細(xì)胞系(例如rt112)一起溫育，并在合適的時(shí)間段后收獲細(xì)胞裂解物并檢查總fgfr2和fgfr3水平。也可以使用facs分析來檢查在與候選fgfr2/3抗體一起溫育之后的表面fgfr2和fgfr3受體水平。載體，宿主細(xì)胞，和重組方法為了重組生產(chǎn)本發(fā)明抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(dna擴(kuò)增)或表達(dá)?？墒褂贸Ｒ?guī)規(guī)程容易的分離編碼抗體的dna并測(cè)序(例如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因性特異結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體的選擇部分取決于將要使用的宿主細(xì)胞。通常，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核或真核(通常是哺乳動(dòng)物)起源的。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)可用于此目的，包括igg，igm，iga，igd和ige恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以從任何人或動(dòng)物物種獲得。a.使用原核宿主細(xì)胞生成抗體：i.載體構(gòu)建可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來獲得編碼本發(fā)明抗體多肽構(gòu)件的多核苷酸序列。可從抗體生成細(xì)胞諸如雜交瘤細(xì)胞分離期望的多核苷酸序列并測(cè)序?；蛘?，可使用核苷酸合成儀或pcr技術(shù)合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體。為了本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。根據(jù)其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細(xì)胞的相容性，每種載體含有多種構(gòu)件。載體構(gòu)件通常包括但不限于：復(fù)制起點(diǎn)，選擇標(biāo)志基因，啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)，信號(hào)序列，異源核酸插入片段，和轉(zhuǎn)錄終止序列。一般而言，與宿主細(xì)胞一起使用的質(zhì)粒載體包含衍生自與這些宿主相容物種的復(fù)制子和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)志序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pbr322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pbr322包含編碼氨芐青霉素(amp)和四環(huán)素(tet)抗性的基因，如此提供輕松鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。pbr322，其衍生物，或其它微生物質(zhì)粒或噬菌體還可包含或經(jīng)修飾而包含可被微生物生物體用于表達(dá)內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。carter等人，美國(guó)專利no.5,648,237中詳細(xì)記載了用于表達(dá)特定抗體的pbr322衍生物的例子。另外，可將包含與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，可使用噬菌體諸如λgemtm-11來構(gòu)建可用于轉(zhuǎn)化易感宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌le392的重組載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可包含兩種或更多啟動(dòng)子-順反子對(duì)，它們編碼每一種多肽構(gòu)件。啟動(dòng)子是位于順反子上游(5′)的非翻譯調(diào)控序列，它調(diào)控順反子的表達(dá)。原核啟動(dòng)子通常分成兩類，誘導(dǎo)型的和組成性的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子指響應(yīng)培養(yǎng)條件的變化(例如營(yíng)養(yǎng)物的存在與否或溫度變化)而啟動(dòng)受其控制的順反子的升高水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。眾所周知受到多種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的大量啟動(dòng)子。通過限制酶消化切下源dna中的啟動(dòng)子并將分離的啟動(dòng)子序列插入本發(fā)明載體，由此可將選擇的啟動(dòng)子與編碼輕鏈或重鏈的順反子dna可操作連接。天然啟動(dòng)子序列和許多異源啟動(dòng)子都可用于指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，使用異源啟動(dòng)子，因?yàn)榕c天然靶多肽啟動(dòng)子相比，它們通常容許所表達(dá)靶基因的更高轉(zhuǎn)錄和更高產(chǎn)量。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括phoa啟動(dòng)子，β-半乳糖苷酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，和雜合啟動(dòng)子諸如tac或trc啟動(dòng)子。然而，在細(xì)菌中有功能的其它啟動(dòng)子(諸如其它已知的細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制性位點(diǎn)的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(siebenlist等,cell20:269(1980))。在本發(fā)明的一個(gè)方面，重組載體內(nèi)的每個(gè)順反子都包含指導(dǎo)所表達(dá)多肽穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌信號(hào)序列構(gòu)件。一般而言，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入載體的靶多肽dna的一部分。為了本發(fā)明而選擇的信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的信號(hào)序列。對(duì)于不識(shí)別并加工異源多肽的天然信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，將信號(hào)序列用選自例如下組的原核信號(hào)序列替代：堿性磷酸酶，青霉素酶，ipp，或熱穩(wěn)定的腸毒素ii(stii)前導(dǎo)序列，lamb，phoe，pelb，ompa，和mbp。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)順反子中都使用的信號(hào)序列是stii信號(hào)序列或其變體。在另一方面，依照本發(fā)明的免疫球蛋白的生成可在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，因此不需要在每個(gè)順反子內(nèi)存在分泌信號(hào)序列。在那點(diǎn)上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxb-菌株)提供有利于二硫鍵形成的細(xì)胞質(zhì)條件，從而容許所表達(dá)蛋白質(zhì)亞基的正確折疊和裝配。proba和pluckthun,gene159:203(1995))。適于表達(dá)本發(fā)明抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(archaebacteria)和真細(xì)菌(eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細(xì)菌的例子包括埃希氏菌屬(escherichia)(例如大腸埃希氏菌(e.coli))，芽孢桿菌屬(bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(b.subtilis))，腸桿菌屬(enterobacteria)，假單胞菌屬(pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌(p.aeruginosa))物種，鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)，粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescans)，克雷伯氏菌屬(klebsiella)，變形菌屬(proteus)，志賀氏菌屬(shigella)，根瘤菌屬(rhizobia)，透明顫菌屬(vitreoscilla)，或副球菌屬(paracoccus)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用大腸桿菌細(xì)胞作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌株的例子包括菌株w3110(bachmann,cellularandmolecularbiology，第2卷，washington,d.c.，美國(guó)微生物學(xué)學(xué)會(huì)，1987，第1190-1219頁；atcc保藏號(hào)27,325)及其衍生物，包括具有基因型w3110δfhua(δtona)ptr3laciqlacl8δomptδ(nmpc-fepe)degp41kanr的菌株33d3(美國(guó)專利no.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(atcc31,446)，大腸桿菌b，大腸桿菌λ1776(atcc31,537)和大腸桿菌rv308(atcc31,608)也是合適的。這些例子只是例示而非限制。本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建具有指定基因型的任何上述細(xì)菌衍生物的方法，參見例如bass等,proteins8:309-314(1990)。通常必需考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中的可復(fù)制性來選擇適宜的細(xì)菌。例如，在使用眾所周知的質(zhì)粒諸如pbr322，pbr325，pacyc177或pkn410來提供復(fù)制子時(shí)，大腸桿菌，沙雷氏菌屬，或沙門氏菌屬物種可能適于用作宿主。通常，宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細(xì)胞培養(yǎng)中摻入額外的蛋白酶抑制劑。ii.抗體生成用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化即將dna導(dǎo)入原核宿主，使得dna能夠進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件或是通過染色體成分。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法采用聚乙二醇/dmso。使用的還有一種技術(shù)是電穿孔。在本領(lǐng)域知道的且適于培養(yǎng)選定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞。合適培養(yǎng)基的例子包括添加了必需營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物的lb培養(yǎng)基(luriabroth)。在有些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還含有根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包含表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，向用于培養(yǎng)表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素。除了碳，氮，和無機(jī)磷酸鹽來源以外，還可含有適當(dāng)濃度的任何必需補(bǔ)充物，或是單獨(dú)加入或是作為與另一種補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物，諸如復(fù)合氮源。任選的是，培養(yǎng)基可含有一種或多種選自下組的還原劑：谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，巰基乙酸鹽/酯，二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。例如，對(duì)于培養(yǎng)大腸桿菌，優(yōu)選的溫度范圍是約20℃至約39℃，更優(yōu)選約25℃至約37℃，甚至更優(yōu)選約30℃。主要取決于宿主生物體，培養(yǎng)基的ph可以是范圍為約5至約9的任何ph。對(duì)于大腸桿菌，ph優(yōu)選約6.8至約7.4，更優(yōu)選約7.0。如果本發(fā)明的表達(dá)載體中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么在適于激活啟動(dòng)子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用phoa啟動(dòng)子來控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因而，為了誘導(dǎo)，在磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，磷酸鹽限制培養(yǎng)基是c.r.a.p培養(yǎng)基(參見例如simmons等,j.immunol.methods263:133-147(2002))。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可采用多種其它誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域所知道的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所表達(dá)的本發(fā)明多肽分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中并從中回收。蛋白質(zhì)回收通常涉及破壞微生物，通常通過諸如滲透壓震擾(osmoticshock)，超聲處理或裂解等手段。一旦細(xì)胞遭到破壞，可通過離心或過濾清除細(xì)胞碎片或整個(gè)細(xì)胞?？梢酝ㄟ^例如親和樹脂層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)?；蛘?，蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)液中并從中分離。可從培養(yǎng)液清除細(xì)胞，并將培養(yǎng)物上清液過濾和濃縮，用于進(jìn)一步純化所生成蛋白質(zhì)?？墒褂闷毡橹赖姆椒ㄖT如聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)和western印跡測(cè)定法進(jìn)一步分離和鑒定所表達(dá)多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過發(fā)酵過程大量進(jìn)行抗體生產(chǎn)。多種大規(guī)模補(bǔ)料-分批發(fā)酵規(guī)程可用于生產(chǎn)重組蛋白。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1,000至100,000升的容量。這些發(fā)酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養(yǎng)分，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī)模發(fā)酵通常指在體積容量不超過約100升的發(fā)酵罐中進(jìn)行的發(fā)酵，范圍可以是約1升至約100升。在發(fā)酵過程中，通常在將細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)至期望密度(例如od550約180-220，在此階段細(xì)胞處于早期穩(wěn)定期)后啟動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可使用多種誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域知道的和上文描述的?？稍谡T導(dǎo)前將細(xì)胞培養(yǎng)較短的時(shí)間。通常將細(xì)胞誘導(dǎo)約12-50小時(shí)，但是可使用更長(zhǎng)或更短的誘導(dǎo)時(shí)間。為了提高本發(fā)明多肽的產(chǎn)量和質(zhì)量，可修改多項(xiàng)發(fā)酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊，可使用過度表達(dá)伴侶蛋白諸如dsb蛋白(dsba，dsbb，dsbc，dsbd，和/或dsbg)或fkpa(具有伴侶活性的一種肽基脯氨酰-順式,反式-異構(gòu)酶)的額外載體來共轉(zhuǎn)化宿主原核細(xì)胞。已經(jīng)證明伴侶蛋白促進(jìn)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成的異源蛋白質(zhì)的正確折疊和溶解度。chen等,j.biol.chem.274:19601-19605(1999)；georgiou等人，美國(guó)專利no.6,083,715；georgiou等人，美國(guó)專利no.6,027,888；bothmann和plückthun,j.biol.chem.275:17100-17105(2000)；ramm和plückthun,j.biol.chem.275:17106-17113(2000)；arie等,mol.microbiol.39:199-210(2001))。為了將所表達(dá)異源蛋白質(zhì)(尤其是對(duì)蛋白水解敏感的異源蛋白質(zhì))的蛋白水解降至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發(fā)明。例如，可修飾宿主細(xì)胞菌株，在編碼已知細(xì)菌蛋白酶的基因中進(jìn)行遺傳突變，諸如蛋白酶iii，ompt，degp，tsp，蛋白酶i，蛋白酶mi，蛋白酶v，蛋白酶vi，及其組合?？梢垣@得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株，參見例如joly等,(1998)見上文；georgiou等人，美國(guó)專利no.5,264,365；georgiou等人，美國(guó)專利no.5,508,192；hara等,microbialdrugresistance2:63-72(1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中使用蛋白水解酶缺陷且經(jīng)過過度表達(dá)一種或多種伴侶蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株作為宿主細(xì)胞。iii.抗體純化可采用本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。下面的規(guī)程是合適純化規(guī)程的例示：免疫親和或離子交換柱上的分級(jí)，乙醇沉淀，反相hplc，硅土或陽離子交換樹脂諸如deae上的層析，層析聚焦，sds-page，硫酸銨沉淀，和使用例如sephadexg-75的凝膠過濾。在一個(gè)方面，將固定化在固相上的蛋白a用于本發(fā)明全長(zhǎng)抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白a是來自金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureas)的41kd細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，它以高親和力結(jié)合抗體fc區(qū)。lindmark等,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。蛋白a固定化其上的固相優(yōu)選具有玻璃或石英表面的柱子，更優(yōu)選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應(yīng)用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異性粘附。作為純化的第一步，將衍生自如上所述細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白a固定化固相上，使得感興趣抗體特異性結(jié)合蛋白a。然后清洗固相以清除與固相非特異性結(jié)合的污染物。最后通過洗脫從固相回收感興趣抗體。b.使用真核宿主細(xì)胞生成抗體：載體構(gòu)件通常包括但不限于如下一種或多種：信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一種或多種標(biāo)志基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號(hào)序列構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的載體還可在感興趣成熟蛋白質(zhì)或多肽的n端包含信號(hào)序列或具有特異性切割位點(diǎn)的其它多肽。優(yōu)選受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的異源信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)，例如單純皰疹病毒gd信號(hào)。將這些前體區(qū)的dna連接到編碼抗體的dna的讀碼框中。(ii)復(fù)制起點(diǎn)通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件。例如，sv40起點(diǎn)通常可能只因包含早期啟動(dòng)子才使用。(iii)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)：(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，例如氨芐青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。選擇方案的一個(gè)例子利用藥物來阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。經(jīng)異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，如此幸免于選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素，霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個(gè)例子是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如dhfr，胸苷激酶，金屬硫蛋白i和ii優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉(zhuǎn)化子在含有甲氨蝶呤(mtx，dhfr的一種競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)dhfr選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型dhfr時(shí)，適宜的宿主細(xì)胞是dhfr活性缺陷的中國(guó)倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞系(例如atcccrl-9096)?；蛘?，可通過在含有針對(duì)選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素，新霉素或g418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來選擇經(jīng)編碼抗體，野生型dhfr蛋白，和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(aph)的dna序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源dhfr的野生型宿主)。參見美國(guó)專利no.4,965,199。(iv)啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含at區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的另一種序列是cncaat區(qū)，其中n可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′端是aataaa序列，它可能是向編碼序列的3′端添加聚腺苷酸(polya)尾的信號(hào)。所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體中。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(諸如2型腺病毒)，牛乳頭瘤病毒，禽類肉瘤病毒，巨細(xì)胞病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，乙肝病毒，和猿病毒40(sv40))基因組獲得的，來自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)的，來自熱休克啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的控制，倘若這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便地以sv40限制性片段的形式獲得sv40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還包含sv40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便地以hindiiie限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國(guó)專利no.4,419,446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)dna的系統(tǒng)。美國(guó)專利no.4,601,978中記載了該系統(tǒng)的一種修改形式?；蛘撸墒褂脛谑先饬霾《鹃L(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。(v)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過在載體中插入增強(qiáng)子序列來提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明抗體多肽的dna的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶，清蛋白，α-胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括sv40復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參見yaniv,nature297:17-18(1982)。增強(qiáng)子可剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5′或3′位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5′位點(diǎn)。(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體通常還包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mrna所必需的序列。此類序列通?？蓮恼婧嘶虿《綿na或cdna非翻譯區(qū)的5′端和偶爾的3′端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mrna的非翻譯區(qū)中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見wo94/11026及其中公開的表達(dá)載體。(vii)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的dna的宿主細(xì)胞包括本文描述的高等真核細(xì)胞，包括脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞。脊椎動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子有經(jīng)sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1系(cos-7，atcccrl1651)，人胚腎系(293細(xì)胞或?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，graham等,j.gen.virol.36:59(1977))，幼倉鼠腎細(xì)胞(bhk，atccccl10)，中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞/-dhfr(cho，urlaub等,proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))，小鼠塞托利(sertoli)細(xì)胞(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))，猴腎細(xì)胞(cv1，atccccl70)，非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76，atcccrl1587)，人宮頸癌細(xì)胞(hela，atccccl2)，犬腎細(xì)胞(mdck，atccccl34)，牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(brl3a，atcccrl1442)，人肺細(xì)胞(w138，atccccl75)，人肝細(xì)胞(hepg2，hb8065)，小鼠乳瘤(mmt060562，atccccl51)，tri細(xì)胞(mather等,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))，mrc5細(xì)胞，fs4細(xì)胞和人肝肉瘤(hepatoma)系(hepg2)。為了生成抗體，用上文所述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(viii)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如ham氏f10(sigma)，極限必需培養(yǎng)基(mem，sigma)，rpmi-1640(sigma)，和dulbecco氏修改eagle氏培養(yǎng)基(dmem，sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基：ham等,meth.enz.58:44(1979)；barnes等,anal.biochem.102:255(1980)；美國(guó)專利no.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；wo90/03430；wo87/00195；或美國(guó)專利re.30,985。任何這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素，運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(諸如氯化鈉，鈣，鎂和磷酸鹽)，緩沖劑(諸如hepes)，核苷酸(諸如腺苷和胸苷)，抗生素(諸如gentamycintm藥物)，痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件諸如溫度，ph等即為表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞先前所用的，這對(duì)于普通技術(shù)人員是顯然的。(ix)抗體的純化在使用重組技術(shù)時(shí)，可在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么首先通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細(xì)胞或是裂解片段。如果抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如amicon或milliporepellicon超濾單元)濃縮來自這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液。可在任何上述步驟中包括蛋白酶抑制劑諸如pmsf以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長(zhǎng)?？墒褂美缌u磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析(優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析)來純化從細(xì)胞制備的抗體組合物。蛋白a作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白a可用于純化基于人γ1，γ2，或γ4重鏈的抗體(lindmark等,j.immunol.meth.62:1-13(1983))。蛋白g推薦用于所有小鼠同種型和人γ3(guss等,emboj.5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。若抗體包含ch3結(jié)構(gòu)域，則可使用bakerbondabxtm樹脂(j.t.baker，phillipsburg，nj)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分級(jí)，乙醇沉淀，反相hplc，硅土上的層析，肝素sepharosetm上的層析，陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析，層析聚焦，sds-page和硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟之后，可將含有感興趣抗體和污染物的混合物進(jìn)行低ph疏水相互作用層析，使用ph約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25m鹽)進(jìn)行。免疫綴合物本發(fā)明還提供了包含綴合有細(xì)胞毒劑的本文所述任何抗fgfr2/3抗體的免疫綴合物(可互換的稱為“抗體-藥物綴合物”或“adc”)，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑，藥物，生長(zhǎng)抑制劑，毒素(例如細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射綴合物)?？贵w-藥物綴合物在癌癥治療中用于局部投遞細(xì)胞毒劑或細(xì)胞抑制劑(即用于殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物)的用途(syrigos和epenetos,anticancerresearch19:605-614(1999)；niculescu-duvaz和springer,adv.drugdel.rev.26:151-172(1997)；美國(guó)專利no.4,975,278)容許將藥物模塊靶向投遞至腫瘤，并在那兒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)積累，而系統(tǒng)施用這些未經(jīng)綴合的藥物試劑可能在試圖消除的腫瘤細(xì)胞以外導(dǎo)致不可接受的對(duì)正常細(xì)胞的毒性水平(baldwin等,lancet603-05(1986年3月15日)；thorpe，“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”，在《monoclonalantibodies′84:biologicalandclinicalapplications》中，a.pinchera等人編，第475-506頁，1985)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報(bào)導(dǎo)可用于這些策略(rowland等,cancerimmunol.immunother.21:183-87(1986))。這些方法中所使用的藥物包括道諾霉素(daunomycin)，多柔比星(doxorubicin)，甲氨蝶呤(methotrexate)和長(zhǎng)春地辛(vindesine)(rowland等,1986,見上文)。抗體-毒素綴合物中所使用的毒素包括細(xì)菌毒素諸如白喉毒素，植物毒素諸如蓖麻毒蛋白，小分子毒素諸如格爾德霉素(geldanamycin)(mandler等,jour.ofthenat.cancerinst.92(19):1573-1581(2000)；mandler等,bioorganic&med.chem.letters10:1025-1028(2000)；mandler等,bioconjugatechem.13:786-791(2002))，美登木素生物堿類(ep1391213；liu等,proc.natl.acad.sci.usa93:8618-8623(1996))，和加利車霉素(lode等,cancerres.58:2928(1998)；hinman等,cancerres.53:3336-3342(1993))。毒素可通過包括微管蛋白結(jié)合，dna結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制發(fā)揮其細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制性的效果。有些細(xì)胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質(zhì)受體配體綴合時(shí)趨于失活或活性降低。(ibritumomabtiuxetan，biogen/idec)是由針對(duì)在正常和惡性b淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的cd20抗原的鼠igg1κ單克隆抗體與通過硫脲接頭-螯合劑所結(jié)合的111in或90y放射性同位素構(gòu)成的抗體-放射性同位素綴合物(wiseman等,eur.jour.nucl.med.27(7):766-77(2000)；wiseman等,blood99(12):4336-42(2002)；witzig等,j.clin.oncol.20(10):2453-63(2002)；witzig等,j.clin.oncol.20(15):3262-69(2002))。盡管zevalin具有針對(duì)b細(xì)胞非何杰金氏(hodgkin)淋巴瘤(nhl)的活性，然而施藥在大多數(shù)患者中導(dǎo)致嚴(yán)重且長(zhǎng)時(shí)間的血細(xì)胞減少。mylotargtm(gemtuzumabozogamicin，wyethpharmaceuticals)，即由人cd33抗體與加利車霉素連接而構(gòu)成的抗體-藥物綴合物，在2000年批準(zhǔn)用于經(jīng)注射治療急性骨髓性白血病(drugsofthefuture25(7):686(2000)；美國(guó)專利no.4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。cantuzumabmertansine(immunogeninc.)，即由huc242抗體經(jīng)二硫化物接頭spp與美登木素生物堿藥物模塊dm1連接而構(gòu)成的抗體-藥物綴合物，正在進(jìn)行用于治療表達(dá)canag的癌癥諸如結(jié)腸癌，胰腺癌，胃癌和其它癌的ii期試驗(yàn)。mln-2704(millenniumpharm.,bzlbiologics,immunogeninc.)，即由抗前列腺特異性膜抗原(psma)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物模塊dm1連接而構(gòu)成的抗體-藥物綴合物，正在進(jìn)行用于前列腺腫瘤潛在治療的開發(fā)。將多拉司他汀(dolastatin)的合成類似物奧瑞司他汀(auristatin)肽，奧瑞司他汀e(ae)和單甲基奧瑞司他汀(mmae)與嵌合單克隆抗體cbr96(對(duì)癌瘤上的lewisy特異)和cac10(對(duì)血液學(xué)惡性腫瘤上的cd30特異)綴合(doronina等,naturebiotechnology21(7):778-784(2003))，且正在進(jìn)行治療性開發(fā)。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫綴合物的化療劑。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素a鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)a鏈，相思豆毒蛋白(abrin)a鏈，蒴蓮根毒蛋白(modeccin)a鏈，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(aleuritesfordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陸(phytolacaamericana)毒蛋白(papi，papii和pap-s)，苦瓜(momordicacharantia)抑制物，麻瘋樹毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物，白樹毒蛋白(gelonin)，絲林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的wo93/21232。多種放射性核素可用于生成放射綴合抗體。例子包括212bi，131i，131in，90y和186re?？贵w和細(xì)胞毒劑的綴合物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，諸如n-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)，亞氨基硫烷(it)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)，活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)，醛類(諸如戊二醛)，雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯甲?；?己二胺)，雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯甲?；?乙二胺)，二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)，和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如vitetta等,science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參見wo94/11026。本文還涵蓋抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)，美登木素生物堿類(maytansinoids)，多拉司他汀類(dolastatins)，奧瑞司他汀類(aurostatins)，單端孢霉素(trichothecene)和cc1065及這些毒素具有毒素活性的衍生物的綴合物。i.美登素和美登木素生物堿類在有些實(shí)施方案中，免疫綴合物包含綴合有一個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿分子的本發(fā)明抗體(全長(zhǎng)或片段)。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(maytenusserrata)分離得到(美國(guó)專利no.3,896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和c-3美登醇酯(美國(guó)專利no.4,151,042)。例如下列美國(guó)專利公開了合成美登醇及其衍生物和類似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。美登木素生物堿類藥物模塊在抗體藥物綴合物中是有吸引力的藥物模塊，因?yàn)樗鼈儯?i)相對(duì)易于通過發(fā)酵或發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)修飾，衍生化來制備；(ii)易于用適于通過非二硫化物接頭的綴合抗體的官能團(tuán)衍生化；(iii)在血漿中穩(wěn)定；且(iv)有效針對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系。例如下列專利公開了包含美登木素生物堿類的免疫綴合物及其制備方法和治療用途：美國(guó)專利no.5,208,020；5,416,064；及歐洲專利ep0425235b1，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。liu等,proc.natl.acad.sci.usa93:8618-8623(1996)記載了包含與針對(duì)人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體c242連接的稱為dm1的美登木素生物堿的免疫綴合物。發(fā)現(xiàn)該綴合物具有針對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定法中顯示抗腫瘤活性。chari等,cancerresearch52:127-131(1992)記載了其中美登木素生物堿經(jīng)二硫化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上抗原的鼠抗體a7或結(jié)合her-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體ta.1綴合的免疫綴合物。在體外在人乳癌細(xì)胞系sk-br-3上測(cè)試了ta.1-美登木素生物堿綴合物的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞系每個(gè)細(xì)胞表達(dá)3x105個(gè)her-2表面抗原。藥物綴合物達(dá)到了與游離美登木素生物堿藥物程度相似的細(xì)胞毒性，這可通過增加每個(gè)抗體分子綴合的美登木素生物堿分子數(shù)目來提高。a7-美登木素生物堿綴合物在小鼠中顯示低系統(tǒng)性細(xì)胞毒性?？贵w-美登木素生物堿綴合物可通過將抗體與美登木素生物堿分子化學(xué)連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學(xué)活性來制備。參見例如美國(guó)專利no.5,208,020，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。每個(gè)抗體分子綴合平均3-4個(gè)美登木素生物堿分子在增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中顯示功效，且對(duì)抗體的功能或溶解度沒有負(fù)面影響，盡管預(yù)計(jì)甚至一個(gè)分子的毒素/抗體也將較之裸抗體的使用增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素生物堿類在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可通過已知技術(shù)合成或從天然來源分離。例如美國(guó)專利no.5,208,020和上文提及的其它專利及非專利發(fā)表物中公開了合適的美登木素生物堿類。優(yōu)選的美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于制備抗體-美登木素生物堿綴合物，包括例如美國(guó)專利no.5,208,020或歐洲專利0425235b1；chari等,cancerresearch52:127-131(1992)；2004年10月8日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)no.10/960,602中所公開的，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。包含接頭構(gòu)件smcc的抗體-美登木素生物堿類綴合物可以如2004年10月8日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)no.10/960,602中所披露的來制備。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)，硫醚基團(tuán)，酸不穩(wěn)定基團(tuán)，光不穩(wěn)定基團(tuán)，肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)，或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上文所述專利中所公開的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)。本文中描述和例示了別的連接基團(tuán)?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿的綴合物，諸如n-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp),琥珀酰亞氨基-4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc),亞氨基硫烷(it),亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)，活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)，醛類(諸如戊二醛)，雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯甲酰基)己二胺)，雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)，和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括n-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)(carlsson等,biochem.j.173:723-737(1978))和n-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(spp)，由此提供二硫化物連接。根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個(gè)位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基的反應(yīng)來形成酯連接。反應(yīng)可發(fā)生在具有羥基的c-3位置，經(jīng)羥甲基修飾的c-14位置，經(jīng)羥基修飾的c-15位置，和具有羥基的c-20位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登醇或美登醇類似物的c-3位置形成連接。ii.auristatin和多拉司他汀在有些實(shí)施方案中，免疫綴合物包含與多拉司他汀類(dolastatins)或多拉司他汀肽類似物及衍生物，奧瑞司他汀類綴合的本發(fā)明抗體(美國(guó)專利no.5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀類和奧瑞司他汀類已經(jīng)顯示出干擾微管動(dòng)力學(xué)，gtp水解，及核和細(xì)胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(美國(guó)專利no.5,663,149)和抗真菌活性(pettitetal(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或奧瑞司他汀藥物模塊可經(jīng)由肽藥物模塊的n(氨基)末端或c(羧基)末端附著于抗體(wo02/088172)。例示性的奧瑞司他汀實(shí)施方案包括n-末端連接的單甲基奧瑞司他汀藥物模塊de和df，披露于“monomethylvalinecompoundscapableofconjugationtoligands”,2004年11月5日提交的美國(guó)流水號(hào)10/983,340，明確將其公開內(nèi)容完整收入本文作為參考。典型的是，基于肽的藥物模塊可通過在兩個(gè)或更多氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法來制備(參見e.和k.lübke,thepeptides,卷1,pp76-136,1965,academicpress)。奧瑞司他汀/多拉司他汀藥物模塊可依照以下文獻(xiàn)中的方法來制備：美國(guó)專利no.us5,635,483和5,780,588；pettit等(1989)j.am.chem.soc.111:5463-5465；pettit等(1998)anti-cancerdrugdesign13:243-277；pettit等synthesis,1996,719-725；pettit等(1996)j.chem.soc.perkintrans.15:859-863；及doronina(2003)nat.biotechnol.21(7):778-784；“monomethylvalinecompoundscapableofconjugationtoligands”,2004年11月5日提交的美國(guó)流水號(hào)10/983,340，將其完整收入本文作為參考(披露了例如制備諸如mmae和mmaf綴合至接頭的單甲基纈氨酸化合物的接頭和方法)。iii.加利車霉素在其它實(shí)施方案中，免疫綴合物包含綴合有一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子的本發(fā)明抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈dna斷裂。關(guān)于加利車霉素家族綴合物的制備參見美國(guó)專利no.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；和5,877,296(都授予美國(guó)cyanamid公司)。可用的加利車霉素結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1i，α2i，α3i，n-乙?；?γ1i，psag和θi1(hinman等,cancerresearch53:3336-3342(1993)；lode等,cancerresearch58:2925-2928(1998)；及上述授予美國(guó)cyanamid公司的美國(guó)專利)?？膳c抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是qfa，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和qfa都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且不易穿過質(zhì)膜。因此，這些試劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)了它們的細(xì)胞毒效果。iv.其它細(xì)胞毒劑可與本發(fā)明抗體綴合的其它抗腫瘤劑包括bcnu，鏈佐星(streptozoicin)，長(zhǎng)春新堿(vincristine)，5-氟尿嘧啶，美國(guó)專利no.5,053,394和5,770,710中記載的統(tǒng)稱為ll-e33288復(fù)合物的試劑家族，及埃斯波霉素類(esperamicins)(美國(guó)專利no.5,877,296)。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素a鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)a鏈，相思豆毒蛋白(abrin)a鏈，蒴蓮根毒蛋白(modeccin)a鏈，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(aleuritesfordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陸(phytolacaamericana)毒蛋白(papi，papii和pap-s)，苦瓜(momordicacharantia)抑制物，麻瘋樹毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物，白樹毒蛋白(gelonin)，絲林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的wo93/21232。本發(fā)明還涵蓋抗體和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或dna內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；dna酶)之間形成的免疫綴合物。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射綴合抗體。例子包括at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素。在將綴合物用于檢測(cè)時(shí)，它可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如tc99m或i123，或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(nmr)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123，碘-131，銦-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，釓，錳或鐵?？梢砸阎绞綄⒎派湫詷?biāo)記物或其它標(biāo)記物摻入綴合物。例如，可生物合成肽，或是通過化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體?？梢越?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來附著標(biāo)記物，諸如tc99m或i123，re186，re188和in111?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來附著釔-90。iodogen法(fraker等,biochem.biophys.res.commun.80:49-57(1978))可用于摻入碘-123?！秏onoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy》(chatal,crcpress,1989)詳細(xì)記載了其它方法?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細(xì)胞毒劑的綴合物，諸如n-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)，琥珀酰亞氨基-4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)，亞氨基硫烷(it)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)，活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)，醛類(諸如戊二醛)，雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯甲酰基)己二胺)，雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異硫氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)，和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如vitetta等,science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參見wo94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭，肽酶敏感接頭，光不穩(wěn)定接頭，二甲基接頭，或含二硫化物接頭(chari等,cancerresearch52:127-131(1992)；美國(guó)專利no.5,208,020)。本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯(lián)劑制備的adc：商品化(例如購自piercebiotechnologyinc.,rockford,il,u.s.a.)的bmps，emcs，gmbs，hbvs，lc-smcc，mbs，mpbh，sbap，sia，siab，smcc，smpb，smph，sulfo-emcs，sulfo-gmbs，sulfo-kmus，sulfo-mbs，sulfo-siab，sulfo-smcc和sulfo-smpb，和svsb(琥珀酰亞氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。見2003-2004年度應(yīng)用手冊(cè)和產(chǎn)品目錄(applicationshandbookandcatalog)第467-498頁。v.抗體-藥物綴合物的制備在本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(adc)中，將抗體(ab)經(jīng)接頭(l)與一個(gè)或多個(gè)藥物模塊(d)綴合，例如每個(gè)抗體綴合約1個(gè)至約20個(gè)藥物模塊。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，條件和試劑通過數(shù)種路徑來制備通式i的adc，包括：(1)抗體的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成ab-l，隨后與藥物模塊d反應(yīng)；和(2)藥物模塊的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成d-l，隨后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。本文中描述了用于制備adc的別的方法。ab-(l-d)pi接頭可以由一種或多種接頭構(gòu)件構(gòu)成。例示性的接頭構(gòu)件包括6-馬來酰亞氨基己?；?"mc")，馬來酰亞氨基丙?；?"mp")，纈氨酸-瓜氨酸("val-cit")，丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")，對(duì)氨基芐氧羰基("pab")，n-琥珀酰亞氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯("spp")，n-琥珀酰亞氨基4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1羧酸酯("smcc′)，和n-琥珀酰亞氨基(4-碘-乙?；?氨基苯甲酸酯("siab")。本領(lǐng)域知道別的接頭構(gòu)件，本文也描述了一些。還可參見“monomethylvalinecompoundscapableofconjugationtoligands”,2004年11月5日提交的美國(guó)流水號(hào)10/983,340，將其完整內(nèi)容收入本文作為參考。在有些實(shí)施方案中，接頭可包含氨基酸殘基。例示性的氨基酸接頭構(gòu)件包括二肽，三肽，四肽或五肽。例示性的二肽包括：纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構(gòu)成氨基酸接頭構(gòu)件的氨基酸殘基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸。氨基酸接頭構(gòu)件可以在它們的特定酶(例如腫瘤相關(guān)蛋白酶，組織蛋白酶b，c和d，或纖溶酶蛋白酶)的酶促切割的選擇性方面進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化。抗體的親核基團(tuán)包括但不限于：(i)n末端氨基；(ii)側(cè)鏈氨基，如賴氨酸；(iii)側(cè)鏈硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基，硫醇基，和羥基是親核的，能夠與接頭模塊上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括：(i)活性酯類，諸如nhs酯，hobt酯，鹵代甲酸酯，和酸性鹵化物；(ii)烴基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類，酮類，羧基和馬來酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋。可通過還原劑諸如dtt(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應(yīng)性。每個(gè)半胱氨酸橋理論上會(huì)如此形成兩個(gè)反應(yīng)性硫醇親核體?？山?jīng)由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(traut氏試劑)的反應(yīng)，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼迹瑥亩鴮㈩~外親核基團(tuán)引入抗體?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，或更多個(gè)半胱氨酸殘基(例如制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變型抗體)而將反應(yīng)性硫醇基導(dǎo)入抗體。還可通過修飾抗體來生成本發(fā)明的抗體-藥物綴合物，即引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應(yīng)的親電子模塊?？捎美绺叩馑猁}氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可與接頭試劑或藥物模塊的胺基團(tuán)反應(yīng)的醛或酮基團(tuán)。所得亞胺schiff堿基可形成穩(wěn)定的連接，或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩(wěn)定的胺連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可在蛋白質(zhì)中生成羰(醛和酮)基團(tuán)，它可與藥物上的適宜基團(tuán)反應(yīng)(hermanson，bioconjugatetechniques)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含n末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)可與偏高碘酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致在第一個(gè)氨基酸處生成醛(geoghegan和stroh,bioconjugatechem.3:138-146(1992)；美國(guó)專利no.5,362,852)。此類醛可與藥物模塊或接頭親核體反應(yīng)。同樣，藥物模塊上的親核基團(tuán)包括但不限于：胺，硫醇，羥基，酰肼，肟，肼，縮氨基硫脲，肼羧酸酯，和芳基酰肼基團(tuán)，它們能夠與接頭模塊上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括：(i)活性酯類，諸如nhs酯，hobt酯，鹵代甲酸酯，和酸性鹵化物；(ii)烴基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類，酮類，羧基，和馬來酰亞胺基團(tuán)。或者，可通過例如重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。dna的長(zhǎng)度可包含各自編碼綴合物兩個(gè)部分的區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開，該接頭肽不破壞綴合物的期望特性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)綴合從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)個(gè)體施用抗體-受體綴合物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的綴合物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如親合素)。使用抗fgfr2/3抗體的方法本發(fā)明的特色在于fgfr2/3抗體的使用，作為旨在自這種治療劑的活性提供有益效應(yīng)的特定治療方案的一部分。本發(fā)明在治療各種階段的，各種類型的癌癥中特別有用。術(shù)語癌癥涵蓋增殖性病癥的集合，包括但不限于癌前生長(zhǎng)，良性腫瘤，和惡性腫瘤。良性腫瘤仍然局限于起源部位且沒有能力滲透，侵入，或轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位。惡性腫瘤會(huì)侵入并損害它們周圍的其它組織。它們還能獲得脫離起源部位并傳播至身體其它部分(轉(zhuǎn)移)(通常經(jīng)由血流或在淋巴結(jié)所處位置經(jīng)由淋巴系統(tǒng))的能力。原發(fā)性腫瘤以發(fā)生它們的組織類型來分類；轉(zhuǎn)移性腫瘤以衍生癌細(xì)胞的組織類型來分類。隨著時(shí)間消逝，惡性腫瘤的細(xì)胞變得越來越異常，而且表現(xiàn)出更不像正常細(xì)胞。癌細(xì)胞外觀的這種變化稱作腫瘤等級(jí)(tumorgrade)，而且將癌細(xì)胞描述為完全分化的(well-differentiated)(低級(jí))，中度分化的(moderately-differentiated)，不良分化的(poorly-differentiated)，或未分化的(undifferentiated)(高級(jí))。完全分化的細(xì)胞相當(dāng)正常，表現(xiàn)為和類似它們起源的正常細(xì)胞。未分化的細(xì)胞指已經(jīng)變得如此異常以致于不再可能確定其起源的細(xì)胞。癌癥分期系統(tǒng)描述癌癥在解剖學(xué)上已經(jīng)傳播了多遠(yuǎn)，而且試圖將具有相似預(yù)后和處理的患者置于相同分期組中。可實(shí)施數(shù)項(xiàng)測(cè)試來幫助癌癥分期，包括活檢和某些影像檢測(cè)諸如胸部x-射線，乳房x射線照片，骨掃描，ct掃描，和mri掃描。驗(yàn)血和臨床評(píng)估也用于評(píng)估患者的整體健康和檢測(cè)癌癥是否已經(jīng)傳播至某些器官。為了對(duì)癌癥分期，美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(americanjointcommitteeoncancer)首先使用tnm分類系統(tǒng)將癌癥(特別是實(shí)體瘤)置于字母分類中。給癌癥指派字母t(腫瘤大小)，n(可觸知的結(jié)節(jié))，和/或m(轉(zhuǎn)移)。t1，t2，t3，和t4描述漸增的原發(fā)性病灶尺寸；n0，n1，n2，n3指示漸進(jìn)發(fā)展中的結(jié)節(jié)累及；而m0和m1反映遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的存在與否。在第二種分期方法中，也稱作整體階段分組(overallstagegrouping)或羅馬數(shù)字分期(romannumeralstaging)，將癌癥分成0期至iv期，摻入了原發(fā)性病癥的尺寸以及結(jié)節(jié)傳播和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的存在。在這種系統(tǒng)中，將癌癥分組成四期，以羅馬數(shù)字i至iv表示，或者歸類為“復(fù)發(fā)”。對(duì)于有些癌癥，0期稱作“原位”或“tis”，諸如乳腺癌的原位導(dǎo)管癌或原位小葉癌。高級(jí)腺瘤也可歸類為0期。一般而言，i期癌癥是小的局限性癌癥，其通常是可治愈的，而iv期通常代表不能手術(shù)治療的或轉(zhuǎn)移性的癌癥。ii期和iii期癌癥通常是局部高級(jí)的和/或展現(xiàn)出涉及局部淋巴結(jié)。一般而言，較高期數(shù)指示更嚴(yán)重的(extensive)疾病，包括更大的腫瘤尺寸和/或癌癥傳播至鄰近原發(fā)性腫瘤的附近淋巴結(jié)和/或器官。這些階段有精確定義，但是定義對(duì)每一種癌癥是不同的，而且是熟練技術(shù)人員已知的。許多癌癥登記諸如nci的“監(jiān)視流行病學(xué)和最終結(jié)果程序”(surveillance,epidemiology,andendresultsprogram)(seer)使用概括分期(summarystaging)。這種系統(tǒng)用于所有類型的癌癥。它將癌癥病歷分成五大類：“原位”指只存在于它開始的細(xì)胞層中的早期癌癥?！熬窒扌缘摹敝赴┌Y限于它開始的器官，沒有傳播的證據(jù)。“區(qū)域性的”指癌癥已經(jīng)傳播超出起源(原發(fā)性)部位至附近的淋巴結(jié)或器官和組織?！斑h(yuǎn)端的”指癌癥自原發(fā)性部位傳播至遠(yuǎn)端器官或遠(yuǎn)端淋巴結(jié)?！拔粗摹庇糜诿枋鰶]有足夠信息來指明階段的情況。另外，癌癥在原發(fā)性腫瘤被清除后幾個(gè)月或幾年復(fù)現(xiàn)是常見的。在所有可見的腫瘤都被根除后復(fù)現(xiàn)的癌癥稱作復(fù)發(fā)性疾病。在原發(fā)性腫瘤的區(qū)域中復(fù)現(xiàn)的疾病是局部復(fù)發(fā)的，而作為轉(zhuǎn)移復(fù)現(xiàn)的疾病稱作遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)。腫瘤可以是實(shí)體瘤或者是非實(shí)體瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤的例子包括白血病(例如慢性髓細(xì)胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia)，急性髓細(xì)胞性白血病(acutemyelogenousleukemia)，成人急性成淋巴細(xì)胞性白血病(adultacutelymphoblasticleukemia)，急性髓細(xì)胞性白血病(acutemyelogenousleukemia)，成熟b細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血病(matureb-cellacutelymphoblasticleukemia)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia)，多形核細(xì)胞性白血病(polymphocyticleukemia)，或毛細(xì)胞性白血病(hairycellleukemia))或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤，皮膚t細(xì)胞淋巴瘤，或何杰金氏病(hodgkin’sdisease))。實(shí)體瘤包括血液，骨髓，或淋巴系統(tǒng)以外的身體組織的任何癌癥。實(shí)體瘤可進(jìn)一步分成上皮細(xì)胞起源的那些和非上皮細(xì)胞起源的那些。上皮細(xì)胞實(shí)體瘤的例子包括胃腸道，結(jié)腸，乳腺，前列腺，肺，腎，肝，胰腺，卵巢，頭和頸，口腔，胃，十二指腸，小腸，大腸，肛門，膽囊，唇(labium)，鼻咽，皮膚，子宮，男性生殖器官，泌尿器官，膀胱，和皮膚的腫瘤。非上皮起源的實(shí)體瘤包括肉瘤，腦瘤，和骨瘤。定義部分中描述了腫瘤的其它例子在一些實(shí)施方案中，本文中的患者進(jìn)行診斷測(cè)試，例如在治療之前和/或期間和/或之后。一般而言，如果進(jìn)行診斷測(cè)試，那么可以從需要治療的患者獲得樣品。若受試者患有癌癥，則樣品可以是腫瘤樣品或其它生物學(xué)樣品，諸如生物學(xué)流體，包括但不限于血液，尿液，唾液，腹水或衍生物諸如血清和血漿等等。本文中的生物學(xué)樣品可以是固定的樣品，例如福爾馬林固定，石蠟包埋的(ffpe)樣品，或者是冷凍的樣品。用于測(cè)定mrna或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法有多種，包括但不限于基因表達(dá)概況分析，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)包括定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)，微陣列分析，基因表達(dá)系列分析(serialanalysisofgeneexpression,sage)，massarray，通過大量平行簽名測(cè)序(massiveparallelsignituresequencing,mpss)進(jìn)行的基因表達(dá)分析，蛋白質(zhì)組學(xué)，免疫組化(ihc)等。優(yōu)選對(duì)mrna定量。所述mrna分析優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)或通過微陣列分析來進(jìn)行。若采用pcr，則優(yōu)選的pcr形式是定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果上文提到的一種或多種基因的表達(dá)處于中值或高于中值，例如與相同腫瘤類型的其它樣品相比，那么認(rèn)為是陽性表達(dá)?？梢栽谂c基因表達(dá)的測(cè)量基本上同時(shí)測(cè)定中值表達(dá)水平，或者可以事先測(cè)定。多篇已發(fā)表的期刊論文(例如godfrey等,j.molec.diagnostics2:84-91(2000)；specht等,am.j.pathol.158:419-29(2001))中給出了使用固定的，石蠟包埋的組織作為rna來源的代表性基因表達(dá)概況分析方案的步驟：包括mrna分離，純化，引物延伸和擴(kuò)增。簡(jiǎn)單的說，一種代表性方法首先將石蠟包埋的腫瘤組織樣品切成約10微米厚的切片。然后提取rna并除去蛋白質(zhì)和dna。分析rna濃度后，如果需要可以包括rna修復(fù)和/或擴(kuò)增步驟，并使用基因特異性啟動(dòng)子逆轉(zhuǎn)錄rna，然后pcr。最后分析數(shù)據(jù)，根據(jù)所檢驗(yàn)?zāi)[瘤樣品中鑒定的特征性基因表達(dá)模式來確定患者可用的最佳治療選項(xiàng)?？梢灾苯拥鼗蜷g接地測(cè)定基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)。可以(直接地或間接地)測(cè)定癌癥中的fgfr2和/或fgfr3表達(dá)或易位或擴(kuò)增。多種診斷/預(yù)后測(cè)定法可用于此目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過ihc來分析fgfr3過表達(dá)?？蓪碜阅[瘤活檢的石蠟包埋組織切片進(jìn)行ihc測(cè)定法并對(duì)照如下fgfr2和/或fgfr3蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：得分0：未觀察到染色或者在少于10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到膜染色。得分1+：在超過10％的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到微弱的/剛剛可察覺的膜染色。所述細(xì)胞只在其部分膜中有染色。得分2+：在超過10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到微弱至中等的完全膜染色。得分3+：在超過10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到中等至強(qiáng)烈的完全膜染色。在一些實(shí)施方案中，那些fgfr2和fgfr3中每一項(xiàng)過表達(dá)評(píng)估得分為0或1+的腫瘤可表征為fgfr2和fgfr3未過表達(dá)，而那些得分為2+或3+的腫瘤可表征為fgfr2和fgfr3中每一項(xiàng)過表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，fgfr2和fgfr3中每一項(xiàng)過表達(dá)的腫瘤可根據(jù)對(duì)應(yīng)于每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的fgfr2和fgfr3分子中每一項(xiàng)拷貝數(shù)的免疫組化得分進(jìn)行定級(jí)，并且可通過生化方法測(cè)定：0＝0-90個(gè)拷貝/細(xì)胞，1+＝至少約100個(gè)拷貝/細(xì)胞，2+＝至少約1000個(gè)拷貝/細(xì)胞，3+＝至少約10,000個(gè)拷貝/細(xì)胞。或者/另外，可對(duì)福爾馬林固定，石蠟包埋的腫瘤組織進(jìn)行fish測(cè)定法以測(cè)定腫瘤中fgfr2和/或fgfr3擴(kuò)增或易位的存在和/或程度(如果有的話)?？梢灾苯拥?例如通過磷酸elisa測(cè)試，或其它檢測(cè)磷酸化受體的手段)或間接地(例如通過檢測(cè)活化的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑成分，檢測(cè)受體二聚體(例如同二聚體，異二聚體)，檢測(cè)基因表達(dá)序型等等)測(cè)定fgfr2和fgfr3活化。類似地，可以直接地或間接地(例如通過檢測(cè)與組成性活性有關(guān)的受體突變，檢測(cè)與組成性活性有關(guān)的受體擴(kuò)增等等)檢測(cè)組成性fgfr2和fgfr3和/或配體不依賴或配體依賴性fgfr2和fgfr3的存在。檢測(cè)核酸突變的方法是本領(lǐng)域公知的。通常而非必需的是，擴(kuò)增樣品中的靶核酸以提供所希望的材料量，來確定是否存在突變。擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。例如，擴(kuò)增產(chǎn)物可以涵蓋或不涵蓋所有編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸序列，只要該擴(kuò)增產(chǎn)物包含懷疑突變所在的特定氨基酸/核酸序列位置。在一個(gè)實(shí)施例中，通過將來自樣品的核酸與能夠與編碼突變核酸的核酸特異性雜交的核酸探針接觸，并檢測(cè)所述雜交，由此確定突變的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記探針成可檢測(cè)的，例如用放射性同位素(3h，32p，33p等)，熒光劑(若丹明，熒光素等)或發(fā)色劑標(biāo)記。在有些實(shí)施方案中，探針是反義寡聚物，例如pna，嗎啉代-氨基磷酸酯，lna或2’-烷氧基烷氧基。探針可以有約8個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸，或約10個(gè)至約75個(gè)，或約15個(gè)至約50個(gè)，或約20個(gè)至約30個(gè)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的核酸探針在試劑盒中提供，用以鑒定樣品中的fgfr2和/或fgfr3突變，所述試劑盒包含特異雜交于或臨近于編碼fgfr2和/或fgfr3的核酸中的突變位點(diǎn)的寡核苷酸。試劑盒可進(jìn)一步包括說明根據(jù)使用試劑盒的雜交測(cè)試的結(jié)果，用fgfr2和/或fgfr3拮抗劑治療患包含fgfr2和/或fgfr3突變的腫瘤患者的說明書。也可通過比較擴(kuò)增的核酸的電泳遷移率和相應(yīng)編碼野生型fgfr2和/或fgfr3的核酸的電泳遷移率，由此來檢測(cè)突變。遷移率差異表明擴(kuò)增的核酸序列中存在突變。可通過任何合適的分子分離技術(shù)，例如在聚丙烯酰胺凝膠上，來確定電泳遷移率。利用酶突變檢測(cè)(emd)，也可分析核酸來檢測(cè)突變(deltitoetal.,clinicalchemistry44,731-739,1998)。emd使用噬菌體解離酶t4內(nèi)切核酸酶vii，其掃描雙鏈dna直到它檢測(cè)并裂解了由堿基對(duì)錯(cuò)配造成的結(jié)構(gòu)變形，所述錯(cuò)配由核酸改變諸如點(diǎn)突變，插入和缺失造成。例如通過凝膠電泳，檢測(cè)到兩個(gè)由解離酶裂解形成的短片段，表明存在突變。emd方法的益處是以單個(gè)方案直接從擴(kuò)增反應(yīng)中鑒定出所檢驗(yàn)的點(diǎn)突變，缺失，和插入，不需要純化樣品，縮短了雜交時(shí)間，并提高了信噪比。包含比正常至多過量20倍的核酸的混合樣品和大小至多4kb的片段可進(jìn)行測(cè)試?？墒?，emd掃描不能鑒定在突變陽性樣品中發(fā)生的特定堿基改變，所以如果需要，通常要額外的測(cè)序規(guī)程來鑒定特定的突變。如美國(guó)專利no.5,869,245所證實(shí)的，相似地可用celi酶替代解離酶t4內(nèi)切核酸酶vii。另一種用于檢測(cè)突變的簡(jiǎn)單試劑盒是反向雜交測(cè)試條，其與用于檢測(cè)hfe，tfr2和fpn1基因中造成血色病的多重突變的血色病stripassaytm(viennalabshttp://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)相似。這種測(cè)試基于pcr擴(kuò)增后的序列特異性雜交。對(duì)于單突變測(cè)試，可使用基于微板的檢測(cè)系統(tǒng)，而對(duì)于多重突變測(cè)試，可使用測(cè)試條作為“宏陣列”。試劑盒可包括可供樣品制備，擴(kuò)增和突變檢測(cè)即時(shí)使用的試劑。多重?cái)U(kuò)增方案提供了便利，并允許以非常有限的體積來測(cè)試樣品。利用直接stripassay形式，可以在不超過5小時(shí)內(nèi)完成二十個(gè)及更多突變的測(cè)試，而無需昂貴設(shè)備。從樣品中分離dna并體外擴(kuò)增靶核酸(例如通過pcr)，并用生物素標(biāo)記，一般可在單個(gè)(“多重”)擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行。然后，擴(kuò)增產(chǎn)物選擇性地與固定在諸如測(cè)試條的固體支持物上的寡核苷酸探針(野生型和突變體特異的)雜交，其中探針固定為平行線或條帶。利用鏈霉親合素-堿性磷酸酶和有色底物，來檢測(cè)結(jié)合的生物素化的擴(kuò)增子。這樣的測(cè)試能檢測(cè)本發(fā)明的所有突變或其任意子集。對(duì)于特定的突變體探針條帶，三種信號(hào)傳導(dǎo)模式之一是有可能的：(i)僅針對(duì)野生型探針的條帶，表明是正常的核酸序列，(ii)針對(duì)野生型和突變體探針的條帶，表明是雜合基因型和(iii)僅針對(duì)突變體探針的條帶，表明是純合突變體基因型。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)本發(fā)明突變的方法，其包括從樣品中分離和/或擴(kuò)增靶fgfr2和/或fgfr3核酸序列，使得擴(kuò)增產(chǎn)物包含配體，使擴(kuò)增產(chǎn)物與包含該配體的可檢測(cè)結(jié)合配偶體的探針接觸，而且該探針能夠與本發(fā)明的突變特異性雜交，然后檢測(cè)所述探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體是生物素，而結(jié)合配偶體包括親合素或鏈霉親合素。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體包括鏈霉親合素-堿性磷酸酶，其可用有色底物檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針固定于例如測(cè)試條上，其中與不同突變互補(bǔ)的探針彼此分開。可選地，擴(kuò)增的核酸用放射性同位素標(biāo)記，在該情況中，探針不必包含可檢測(cè)標(biāo)記物。野生型基因的改變涵蓋所有形式的突變，諸如插入，倒位，缺失，和/或點(diǎn)突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變是體細(xì)胞的。體細(xì)胞突變是僅發(fā)生于某些組織中(例如在腫瘤組織中)且不在種系中遺傳的那些。種系突變可以在任何身體組織中找到。包含靶核酸的樣品可通過本領(lǐng)域公知的方法獲得，而且它們適于特定類型和位置的腫瘤。組織活檢通常用于獲得有代表性的腫瘤組織片。可選地，可以已知或認(rèn)為包含感興趣的腫瘤細(xì)胞的組織/流體的形式間接獲取腫瘤細(xì)胞。例如，肺癌損傷的樣品可通過切除術(shù)，支氣管鏡檢，細(xì)針抽吸，支氣管刷檢，或從痰/唾液，胸膜液或血液中獲得?？蓮哪[瘤或從其它身體樣品諸如尿，痰或血清中檢測(cè)出突變的基因或基因產(chǎn)物。上述用于檢測(cè)腫瘤樣品中突變的靶基因或基因產(chǎn)物的同樣技術(shù)可用于其它身體樣品。癌細(xì)胞從腫瘤上脫落下來，并出現(xiàn)在這些身體樣品中。通過篩選這些身體樣品，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于諸如癌的疾病的簡(jiǎn)單早期診斷。另外，通過對(duì)這些身體樣品測(cè)試突變的靶基因或基因產(chǎn)物，可監(jiān)測(cè)治療的進(jìn)程。對(duì)組織制備物富集腫瘤細(xì)胞的手段是本領(lǐng)域已知的。例如，可以從石蠟或低溫保存的切片中分離組織。癌細(xì)胞也可通過流式細(xì)胞術(shù)或激光捕捉顯微解剖而與正常細(xì)胞分開。這些以及其它從正常細(xì)胞中分離腫瘤的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。如果腫瘤組織被正常細(xì)胞高度污染，那么檢測(cè)突變可能較為困難，然而最小化污染和/或假陽/陰性結(jié)果的技術(shù)是已知的，其中一些在下文有描述。例如，也可以對(duì)樣品評(píng)估生物標(biāo)志物(包括突變)的存在情況，所述標(biāo)志物已知與感興趣的腫瘤細(xì)胞有關(guān)而與相應(yīng)的正常細(xì)胞無關(guān)，反之亦然?？赏ㄟ^用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來分子克隆靶核酸并測(cè)序該核酸，由此來完成靶核酸中點(diǎn)突變的檢測(cè)?？蛇x地，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的擴(kuò)增技術(shù)可用于直接從腫瘤組織的基因組dna制備物中擴(kuò)增出靶核酸序列。然后確定擴(kuò)增序列的核酸序列并鑒定其突變。擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，例如描述于saikietal.,science,239,487,1988；美國(guó)專利no.4,683,203和4,683,195中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。應(yīng)當(dāng)注意，設(shè)計(jì)并選擇合適的引物是非常成熟的現(xiàn)有技術(shù)。本領(lǐng)域已知的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也可用于擴(kuò)增靶核酸序列。參見例如wuetal.,genomics,4,560-569,1989。另外，稱為等位基因特異性pcr的技術(shù)也可使用。參見例如ruano和kidd,nucleicacidsresearch,17,8392,1989。根據(jù)該技術(shù)，使用的引物在其3’端與特定靶核酸突變雜交。如果不存在特定的突變，那么不會(huì)觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。也可以使用耐擴(kuò)增突變系統(tǒng)(arms)，其如歐洲專利申請(qǐng)公開第0332435號(hào)和newtonetal.,nucleicacidsresearch,17,7,1989所公開的?；虻牟迦牒腿笔б部赏ㄟ^克隆，測(cè)序和擴(kuò)增來檢測(cè)。另外，基因或周圍標(biāo)志基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)探針可用于對(duì)等位基因的改變或多態(tài)性片段的插入來評(píng)分。也可用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)分析來檢測(cè)等位基因的堿基變化變體。參見例如oritaetal.,proc.natl.acad.sci.usa,86,2766-2770,1989和genomics,5,874-879,1989。也可用其它用于檢測(cè)插入和缺失的本領(lǐng)域已知技術(shù)。根據(jù)基因野生型表達(dá)產(chǎn)物的改變，也可檢測(cè)野生型基因的改變。這些表達(dá)產(chǎn)物包括mrna以及蛋白質(zhì)產(chǎn)物。通過擴(kuò)增和測(cè)序mrna或由mrna分子克隆制備的cdna，來檢測(cè)點(diǎn)突變。利用本領(lǐng)域公知的dna測(cè)序技術(shù)，來確定克隆的cdna的序列。cdna也可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)來測(cè)序。錯(cuò)配是并不100％互補(bǔ)的雜交核酸雙鏈。缺乏完全的互補(bǔ)性可以是因?yàn)槿笔В迦?，倒位，替代或移碼突變?cè)斐傻?。可用錯(cuò)配檢測(cè)來檢測(cè)靶核酸中的點(diǎn)突變。盡管這些技術(shù)可能不如測(cè)序靈敏，然而對(duì)大量組織樣品來說更容易實(shí)施。錯(cuò)配裂解技術(shù)的實(shí)例是rna酶保護(hù)方法，其在winteretal.,proc.natl.acad.sci.usa,82,7575,1985和meyersetal.,science,230,1242,1985中有詳細(xì)描述。例如，本發(fā)明的方法可包括使用標(biāo)記的核糖核酸探針，其與人野生型靶核酸互補(bǔ)。衍生自組織樣品的核糖核酸探針和靶核酸在一起退火(雜交)，然后用rna酶a消化，其能夠檢測(cè)雙鏈rna結(jié)構(gòu)中的一些錯(cuò)配。如果rna酶a檢測(cè)到錯(cuò)配，那么它在錯(cuò)配位點(diǎn)裂解。因此，當(dāng)在電泳凝膠基質(zhì)上分離退火的rna制備物時(shí)，如果rna酶a檢測(cè)到錯(cuò)配并裂解，那么將見到比核糖核酸探針與mrna或dna的全長(zhǎng)雙鏈rna小的rna產(chǎn)物?？紤]到它涵蓋了懷疑突變了的位置，核糖核酸探針不需要是全長(zhǎng)的靶核酸mrna或基因，但可以是靶核酸的一部分。如果核糖核酸探針僅包含靶核酸mrna或基因的一個(gè)區(qū)段，如果希望，那么可能希望使用大量這些探針來篩選整個(gè)靶核酸序列的錯(cuò)配。以相似的方式，可用dna探針檢測(cè)錯(cuò)配，例如通過酶或化學(xué)裂解進(jìn)行。參見例如cottonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,85,4397,1988；和shenketal.,proc.natl.acad.sci.usa,72,989,1975?？蛇x地，通過錯(cuò)配雙鏈體相對(duì)于匹配雙鏈體的電泳遷移率變化，可檢測(cè)錯(cuò)配。參見例如cariello,humangenetics,42,726,1988。用核糖核酸探針或dna探針，可以在雜交前擴(kuò)增可能包含突變的靶核酸mrna或dna。尤其是如果改變是總的重排，諸如缺失和插入，那么利用southern雜交也可檢測(cè)靶核酸dna中的改變。擴(kuò)增出的靶核酸dna序列也可用等位基因特異性探針篩選。這些探針是核酸寡聚物，每一個(gè)都包含靶核酸基因中包含已知突變的區(qū)域。例如，一個(gè)寡聚物的長(zhǎng)度可以為約30個(gè)核苷酸，對(duì)應(yīng)于部分靶基因序列。通過使用一組這樣的等位基因特異性探針，可篩選靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，以鑒定靶基因中以前鑒定出的突變的存在?？梢岳缭谀猃埬ど线M(jìn)行擴(kuò)增的靶核酸序列與等位基因特異性探針的雜交。在嚴(yán)格雜交條件下與特定探針的雜交表明腫瘤組織中存在與等位基因特異性探針中相同的突變。通過篩選相應(yīng)野生型蛋白的改變，可檢測(cè)野生型靶基因的改變。例如，與靶基因產(chǎn)物有免疫反應(yīng)性的單克隆抗體可用于篩選組織，例如用已知與基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的特定突變位置結(jié)合的抗體。例如，所用的抗體可以是結(jié)合缺失的外顯子的抗體或結(jié)合包含靶蛋白缺失部分的構(gòu)象表位的抗體。缺少關(guān)聯(lián)抗原將表示有突變。突變等位基因產(chǎn)物的特異性抗體也可用于檢測(cè)突變基因產(chǎn)物?？梢詮氖删w展示文庫中鑒定抗體。這些免疫學(xué)測(cè)定法可以以本領(lǐng)域已知的任何便利形式進(jìn)行。這些包括western印跡，免疫組織化學(xué)測(cè)定法和elisa測(cè)定法。任何檢測(cè)改變的蛋白質(zhì)的方法都可用于檢測(cè)野生型靶基因的改變。利用核酸擴(kuò)增技術(shù)，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，引物對(duì)可用于確定靶核酸的核苷酸序列。單鏈dna引物對(duì)可以與靶核酸序列之內(nèi)或周圍的序列退火，從而引發(fā)靶序列的擴(kuò)增。也可使用等位基因特異性引物。該引物僅與特定的突變靶序列退火，因此僅在存在突變的靶序列作為模板的情況下才會(huì)擴(kuò)增出產(chǎn)物。為了便于接下來克隆擴(kuò)增的序列，引物可具有限制酶位點(diǎn)序列，該序列附加在這些引物的末端。這些酶和位點(diǎn)是本領(lǐng)域公知的。可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來合成引物本身。一般而言，可用寡核苷酸合成儀制造引物，所述儀器可從商業(yè)渠道獲得。設(shè)計(jì)特定引物完全在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。核酸探針可用于許多目的。它們可用于對(duì)基因組dna的southern雜交中，并可用于rna酶保護(hù)方法中以檢測(cè)上文已經(jīng)討論過的點(diǎn)突變。探針可用于檢測(cè)靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。利用其它技術(shù)，它們也可用于檢測(cè)野生型基因或mrna的錯(cuò)配。利用酶(例如s1核酸酶)，化學(xué)藥品(例如羥胺或四氧化鋨和哌啶)，或錯(cuò)配雜交體相對(duì)于完全匹配雜交體的電泳遷移率變化，可檢測(cè)錯(cuò)配。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見novacketal.,proc.natl.acad.sci.usa,83,586,1986。一般而言，探針與激酶結(jié)構(gòu)域外的序列互補(bǔ)。整組核酸探針可用于組成試劑盒來檢測(cè)靶核酸中的突變。試劑盒容許進(jìn)行對(duì)感興趣的靶序列的大區(qū)域的雜交。探針可彼此交疊或毗鄰。如果用核糖核酸探針來檢測(cè)mrna的錯(cuò)配，那么它一般與靶基因的mrna互補(bǔ)。因此，核糖核酸探針是反義探針，因?yàn)樗痪幋a相應(yīng)的基因產(chǎn)物，因?yàn)樗c有義鏈互補(bǔ)。核糖核酸探針一般會(huì)用放射性，比色，或熒光材料來標(biāo)記，這可以通過任何本領(lǐng)域已知方法來實(shí)現(xiàn)。如果用核糖核酸探針來檢測(cè)dna的錯(cuò)配，它可以是任一極性，即有義的或反義的。相似地，也可用dna探針來檢測(cè)錯(cuò)配。在一些情況中，癌癥過表達(dá)或不過表達(dá)fgfr2和/或fgfr3。可在診斷或預(yù)后測(cè)定法中通過評(píng)估細(xì)胞表面上存在的受體蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組化測(cè)定法；ihc)來測(cè)定受體過表達(dá)?；蛘?另外，可測(cè)量細(xì)胞中編碼受體的核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(fish；參見1998年10月公布的wo98/45479)，southern印跡或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)，諸如實(shí)時(shí)定量pcr(rt-pcr)。在上述測(cè)定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用多種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者身體內(nèi)的細(xì)胞暴露于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估該抗體對(duì)患者身體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活檢?；焺┍景l(fā)明的聯(lián)合療法可進(jìn)一步包含一種或多種化療劑。組合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用或同時(shí)施用和任一次序的序貫施用，其中優(yōu)選有一段時(shí)間所有活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。如果施用的話，由于藥物的組合作用或可歸于抗代謝物化療劑施用的消極副作用，通常以關(guān)于它們已知的或任選降低的劑量施用化療劑?？梢勒罩圃焐痰恼f明書或根據(jù)從業(yè)人員憑經(jīng)驗(yàn)確定的那樣使用此類化療劑的制備和劑量給藥日程。本文中公開了可組合的多種化療劑。在一些實(shí)施方案中，要組合的化療劑選自下組：來那度胺(lenalidomide)(revlimid)，蛋白酶體抑制劑(諸如硼替佐米(bortezomib)(velcade)和ps342)，bora類紫杉烷(taxoid)(包括多西他塞(docetaxel)和帕利他塞(paclitaxel))，長(zhǎng)春藥(vinca)(諸如長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)或長(zhǎng)春堿(vinblastine))，鉑化合物(諸如卡鉑(carboplatin)或順鉑(cisplatin))，芳香酶抑制劑(諸如來曲唑(letrozole)，阿那曲唑(anastrazole)，或依西美坦(exemestane))，抗雌激素(例如氟維司群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))，依托泊苷(etoposide)，塞替哌(thiotepa)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，培美曲塞(pemetrexed)，甲氨蝶呤(methotrexate)，脂質(zhì)體多柔比星(liposomaldoxorubicin)，peg化脂質(zhì)體多柔比星(pegylatedliposomaldoxorubicin)，卡培他濱(capecitabine)，吉西他濱(gemcitabine)，美法侖(melthalin)，多柔比星(doxorubicin)，長(zhǎng)春新堿(vincristine)，cox-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))，或類固醇(例如地塞米松(dexamethasone)和潑尼松(prednisone))。在一些實(shí)施方案(例如涉及治療t(4；14)+多發(fā)性骨髓瘤的實(shí)施方案)中，組合地塞米松和來那度胺，或地塞米松，或硼替佐米，或長(zhǎng)春新堿，多柔比星和地塞米松，或沙利度胺和地塞米松，或脂質(zhì)體多柔比星，長(zhǎng)春新堿和地塞米松，或來那度胺和地塞米松，或硼替佐米和地塞米松，或硼替佐米，多柔比星，和地塞米松。在一些實(shí)施方案(例如涉及膀胱癌的實(shí)施方案)中，組合吉西他濱和順鉑，或紫杉烷(例如帕利他賽，多西他賽)，或培美曲塞，或甲氨蝶呤，長(zhǎng)春堿，多西他賽和順鉑，或卡鉑，或絲裂霉素c組合以5-氟尿嘧啶，或順鉑，或順鉑和5-氟尿嘧啶。配制，劑量和施用會(huì)以與優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制，劑量給藥和施用本發(fā)明中所使用的治療劑。在此內(nèi)容中考慮的因素包括所治療的具體病癥，所治療的具體受試者，患者個(gè)體的臨床狀況，病癥的起因，投遞藥劑的部位，施藥的方法，施藥的日程安排，要組合的藥劑的藥物-藥物相互作用，和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法通過將具有期望純度的活性成分與任選的生理學(xué)可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備治療用配制劑(remington’spharmaceuticalsciences(第20版),a.gennaro編,2000,lippincott,williams&wilkins,philadelphia,pa)?？山邮艿妮d體包括鹽水，或緩沖劑，諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，諸如edta；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如tweentm，pluronicstm或peg。任選但優(yōu)選的是，配制劑含有藥學(xué)可接受鹽，優(yōu)選氯化鈉，且優(yōu)選大約為生理濃度。任選的是，本發(fā)明的配制劑可含有藥學(xué)可接受防腐劑。在一些實(shí)施方案中，防腐劑的濃度范圍為0.1-2.0％，典型的是v/v。合適的防腐劑包括藥學(xué)領(lǐng)域已知的那些。苯甲醇，酚，間甲酚，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，和對(duì)羥基苯甲酸丙酯是優(yōu)選的防腐劑。任選的是，本發(fā)明的配制劑可包括藥學(xué)可接受表面活性劑，其濃度為0.005-0.02％。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的那些。合適的是，此類分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合。活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體，清蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于remington’spharmaceuticalsciences,見上文?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有本發(fā)明抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯，水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國(guó)專利no.3,773,919)，l-谷氨酸和l-谷氨酸γ-乙酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-d-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持時(shí)，它們可能由于暴露于37℃的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？筛鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計(jì)穩(wěn)定化理性策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間s-s鍵，那么可通過修飾巰基殘基，自酸性溶液凍干，控制濕度，采用適宜添加劑，和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。依照已知方法給人類患者施用本發(fā)明的治療劑，諸如靜脈內(nèi)施用(像推注或通過一段時(shí)間里的連續(xù)輸注)，通過肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦脊髓內(nèi)，皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，鞘內(nèi)，口服，表面，或吸入路徑?；伢w(exvivo)策略也可用于治療性應(yīng)用?；伢w策略涉及用編碼fgfr2，fgfr3，或fgfr2/3拮抗劑的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)自受試者獲得的細(xì)胞。然后將經(jīng)過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞返回受試者。細(xì)胞可以是極其多種類型之任一，包括但不限于造血細(xì)胞(例如，骨髓細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹突細(xì)胞，t細(xì)胞，或b細(xì)胞)，成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，或肌肉細(xì)胞。例如，如果fgfr2/3拮抗劑是抗體，那么通過任何合適手段施用抗體，包括胃腸外，皮下，腹膜內(nèi)，肺內(nèi)，和鼻內(nèi)，及(如果想要局部免疫抑制治療的話)病灶內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，或皮下施用。另外，合適的是，通過脈沖輸注來施用抗體，特別是使用遞減劑量的抗體。優(yōu)選的是，通過注射給予劑量給藥，最優(yōu)選的是，通過靜脈內(nèi)或皮下注射給予劑量給藥，這部分取決于施藥是短期的還是長(zhǎng)期的。在另一個(gè)例子中，在病癥或腫瘤位置允許時(shí)，局部施用fgfr2/3拮抗性化合物，例如通過直接注射，而且可以周期性重復(fù)注射。也可以在手術(shù)切除腫瘤后系統(tǒng)地/全身地將fgfr2/3拮抗劑投遞至受試者或直接投遞至腫瘤細(xì)胞，例如腫瘤或腫瘤床，用以預(yù)防或降低局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。組合中的治療劑的施用通常在規(guī)定的時(shí)間段里進(jìn)行(通常是數(shù)分鐘，數(shù)小時(shí)，數(shù)天或數(shù)周，這取決于所選擇的組合)。聯(lián)合療法旨在涵蓋這些治療劑以序貫方式的施用(也就是說，其中在不同時(shí)間施用每一種治療劑)，以及這些治療劑或治療劑中至少兩種以基本上同時(shí)的方式的施用?？梢酝ㄟ^相同路徑或不同路徑來施用治療劑。例如，可以通過靜脈內(nèi)注射來施用組合中的抗fgfr2/3抗體，同時(shí)可以口服施用所述組合中的化療劑?；蛘撸?，可以口服施用這兩種治療劑，或者可以通過靜脈內(nèi)注射來施用這兩種治療劑，這取決于具體的治療劑。治療劑的施用次序也隨著具體藥劑而變化。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，施用于患者的初始候選劑量是約1μg/kg至100mg/kg每種治療劑，例如或是通過一次或多次分開施藥或是通過連續(xù)輸注。根據(jù)上文所述因素，典型日劑量的范圍可以是約1μg/kg至約100mg/kg或更多。對(duì)于持續(xù)數(shù)天或更長(zhǎng)的重復(fù)施藥，根據(jù)狀況，持續(xù)治療直至根據(jù)上文所述方法的測(cè)量，癌癥得到治療。然而，其它劑量方案也可能是有用的。本申請(qǐng)涵蓋通過基因療法來施用fgfr2/3抗體。參見例如1996年3月14日公布的wo96/07321，其關(guān)注使用基因療法來產(chǎn)生胞內(nèi)抗體。制品在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含可用于治療，預(yù)防和/或診斷上文所述病癥的物質(zhì)的制品。制品包括容器和貼在所述容器上或與其相聯(lián)的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子，小管，注射器等。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有其自身或在聯(lián)合其它組合物時(shí)有效治療，預(yù)防和/或診斷疾患的組合物，而且可具有無菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁指示該組合物用于治療選擇的疾患，諸如癌癥。此外，制品可包括(a)其中裝有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)其中裝有組合物的第二容器，其中所述組合物包含別的細(xì)胞毒劑。本發(fā)明此實(shí)施方案中的制品還可包括指示第一和第二抗體組合物可用于治療特定疾患例如癌癥的包裝插頁?；蛘?另外，制品還可包括第二(或第三)容器，其中裝有藥學(xué)可接受的緩沖劑，諸如注射用抑菌水(bwfi)，磷酸鹽緩沖鹽水，林格氏(ringer)溶液和右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和用戶立場(chǎng)上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑，稀釋劑，濾器，針頭和注射器。下面是本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文提供的一般描述，可實(shí)施各種其它實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1。擴(kuò)寬抗fgfr3抗體的特異性。實(shí)施了實(shí)驗(yàn)來擴(kuò)寬抗fgfr2/3抗體的結(jié)合特異性。具體而言，實(shí)施了實(shí)驗(yàn)來開發(fā)用于癌癥療法的具有針對(duì)fgfr3和fgfr2的雙重特異性，不結(jié)合高度相關(guān)的受體fgfr1和fgfr4的抗體。出發(fā)點(diǎn)為以亞納摩爾親和力結(jié)合fgfr3iiib和iiic同種型的單特異性抗體r3mab(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)。r3mab在體內(nèi)顯示強(qiáng)健的對(duì)fgfr3信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤生長(zhǎng)的抑制(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)，而且已經(jīng)在i期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究?？贵w重新設(shè)計(jì)策略受到先前測(cè)定的與fgfr3-iiib復(fù)合的r3mabfab片段的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)(pdb3grw)的指導(dǎo)(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)。此結(jié)構(gòu)指示r3mab與fgfr3-iiib的d2和d3域二者相互作用。雖然本文中隨后發(fā)現(xiàn)d2對(duì)于r3mab結(jié)合是足夠的，但是初始分析基于這種原始結(jié)構(gòu)上的接觸。fgfr3-iiib抗原上的大部分接觸表面是由抗體互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)h3(46％)，h1(23％)和l2(22％)貢獻(xiàn)的，還有來自cdrh2和框架區(qū)(fr)殘基的小貢獻(xiàn)(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)(圖5)。比較了fgfr3-iiib和該意圖的另外的fgfr2-iiib抗原之間的相似性。這兩種同系物的d2d3區(qū)共享68％蛋白質(zhì)序列同一性，而它們的d2域共享76％同一性(表2)。表2顯示相同fgfr的兩種同種型(粗體)，包括d3中的同種型依賴性區(qū)域的d2d3域的完整序列(下劃線)，和缺乏同種型依賴性區(qū)的d2d3域(粗體和下劃線)之間的百分比同一性。由于r3mab結(jié)合的fgfr3-iiib的d3具有與所有其它fgfr結(jié)構(gòu)相比不同的幾何學(xué)(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)，那么將fgfr2-iiib和fgfr3-iiib的結(jié)構(gòu)疊加在它們的d2區(qū)上，得到α-碳的計(jì)算均方根偏差(rmsd)為基于這項(xiàng)分析，設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來重新改造r3mab以同樣結(jié)合并抑制fgfr2。表2：fgfr蛋白質(zhì)之間的序列同一性fgfr的同一性(％)為了構(gòu)建噬菌體展示文庫，設(shè)計(jì)了覆蓋每個(gè)個(gè)別重鏈cdr的大多數(shù)殘基和所有cdr上的接觸殘基的選集的突變(表3)。在表3中，n＝g，a，t或c；k＝g或t。針對(duì)對(duì)fgfr2-iiib的結(jié)合選擇在噬菌體顆粒上作為fab片段展示的r3mab變體。我們?cè)谶@個(gè)階段沒有在fgfr3上實(shí)施選擇，因?yàn)槲覀兿胍谝胄碌膄gfr2特異性時(shí)保持較低的選擇嚴(yán)格性。在第一輪淘選之后，組合來自個(gè)別文庫噬菌體輸出并提交進(jìn)一步的3輪選擇。通過elisa篩選95個(gè)克隆(稱作2b.1系列)。在這些中，81個(gè)克隆(呈現(xiàn)32種獨(dú)特序列)結(jié)合fgfr2-iiib。所有結(jié)合性克隆顯然衍生自h2文庫，因?yàn)樗鼈兒衏drh2中的而非其它區(qū)域的突變(表4)。表4以下劃線鑒定與r3mab中的那些相同的殘基。表4以斜體鑒定與r3mab中那些不同的殘基。如表4中使用的，“nd”指檢測(cè)不到而“na”指因蛋白質(zhì)聚集而不可得。所有選定抗體均顯示相對(duì)于r3mab實(shí)質(zhì)性改善的對(duì)fgfr2-iiib的結(jié)合，kd值的范圍為0.3至17nm(表4)。值得注意的是，突變的h2序列含有顯著的變異，缺乏明確的共有且在4或5個(gè)位置處不同于r3mab(表4，圖6)。如此，有多種可能的解決方案來將fgfr2-iiib的高親和力結(jié)合賦予r3mab。表3：用于募集fgfr2結(jié)合特異性的文庫設(shè)計(jì)cdrh1殘基252627282930313233密碼子tctggcttcaccttcactagtactggg氨基酸sgftftstgh1文庫nnknnknnknnknnknnknnkh2文庫h3文庫組合文庫nntnnknnccdrh2殘基515252a5354密碼子atttatcctactaac氨基酸iyptnh1文庫h2文庫nnknnknnknnknnkh3文庫組合文庫nnkcdrh3殘基96979899100100a密碼子tacggcatctacgacctg氨基酸ygiydlh1文庫h2文庫h3文庫nnknnknnknncnnknnk組合文庫nncnnknnkcdrl2殘基525354密碼子tccttcctc氨基酸sflh1文庫h2文庫h3文庫組合文庫nnc表4：與r3mab中的那些不同的殘基接下來基于它們對(duì)fgfr2的親和力(<3nm)和序列多樣性選擇了六種變體來測(cè)量對(duì)fgfr3的結(jié)合。所有變體均顯示改善的對(duì)fgfr3-iiib的親和力(表5)。為了進(jìn)一步評(píng)估它們抑制受體依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，在有或無fgf7(fgfr2-iiib的一種特異性配體)的情況下測(cè)定mcf7乳腺癌細(xì)胞的增殖(goetz,r.andm.mohammadi(2013)."exploringmechanismsoffgfsignallingthroughthelensofstructuralbiology."natrevmolcellbiol14(3):166-180；bai,a.,k.meetze,n.y.vo,s.kollipara,e.k.mazsa,w.m.winston,s.weiler,l.l.poling,t.chen,n.s.ismail,j.jiang,l.lerner,j.gyurisandz.weng(2010)."gp369,anfgfr2-iiib-specificantibody,exhibitspotentantitumoractivityagainsthumancancersdrivenbyactivatedfgfr2signaling."cancerresearch70(19):7630-7639)。與顯示較少或無抑制，或甚至展示刺激性效果的其它變體相比，變體2b.1.3展現(xiàn)最大的拮抗活性(圖2)。因而，作為功能性抗體結(jié)轉(zhuǎn)2b.1.3用于進(jìn)一步表征。表5：選定2b.1.3變體對(duì)fgfr2-iiib和fgfr3-iiib的結(jié)合親和力克隆cdrh2fgfr2-iiibkd(nm)fgfr3-iiibkd(nm)r3mabiyptnnd0.242b.1.3thlgd2.60.092b.1.95lifft1.80.192b.1.73mifyn1.40.092b.1.32wvgft1.20.062b.1.88iwmft0.640.052b.1.1ywawd0.290.09*與r3mab中的那些相同的殘基標(biāo)有下劃線。由于所有fgfr同系物彼此之間均共享接近70％序列同一性(表2)，因而評(píng)估再改造的變體2b.1.3對(duì)其它fgfr的結(jié)合。mab2b.1.3以與fgfr2-iiib相似的親和力結(jié)合fgfr2-iiic(表6)。mab2b.1.3還顯示比r3mab高數(shù)倍的對(duì)fgfr3-iiib和fgfr3-iiic的親和力，盡管所使用的選擇策略基于對(duì)fgfr2-iiib的結(jié)合。所測(cè)試的所有其它選定變體一致展現(xiàn)升高的對(duì)fgfr3的親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，mab2b.1.3還以32nm的kd值結(jié)合fgfr4，但顯示沒有對(duì)fgfr1的可檢測(cè)結(jié)合(表6)。因此，變體2b.1.3是三特異性的，結(jié)合fgfr2，fgfr3和fgfr4，但不結(jié)合fgfr1。表6：r3mab及其變體對(duì)所有fgfr同系物的結(jié)合親和力kd(nm)*nd：在500nm檢測(cè)不到。實(shí)施例2。測(cè)定mab2b.1和fgfr2-iiib復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。具體而言，為了獲得關(guān)于再改造的變體2b.1.3如何獲取針對(duì)fgfr2的特異性的直接見解，測(cè)定了它與fgfr2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(圖2a，表7)。首先，通過大腸桿菌中的表達(dá)和包涵體的重折疊生成了fgfr2-iiibd2d3，并通過sds-page和質(zhì)譜術(shù)判斷是完整的。然而，在晶體中，這種蛋白質(zhì)只含有同種型不依賴性d2域，提示結(jié)晶過程期間d2和d3之間的蛋白水解。先前測(cè)定的fgfr3-iiib:r3mab復(fù)合物結(jié)構(gòu)含有fgfr3-iiib的d2和d3域二者。將fgfr2-d2:mab2b.1.3的整個(gè)復(fù)合物緊密疊加到fgfr3-iiib:r3mab結(jié)構(gòu)上(圖7)，總體α-碳rmsd為指示再改造保留了與原始抗體r3mab相同的結(jié)合幾何學(xué)。fgfr3:r3mab晶體結(jié)構(gòu)提示fgfr3d3和cdrh1環(huán)之間的可觀相互作用。因此，為了調(diào)查d3在結(jié)合中的參與，制備了fgfr2和fgfr3的d2域的蛋白質(zhì)并測(cè)量了它們對(duì)r3mab和mab2b.1.3的結(jié)合親和力。對(duì)兩種受體均只觀察到非常輕微的單獨(dú)的d2和d2d3域之間的結(jié)合親和力差異(表8)。如此，d2主要負(fù)責(zé)r3mab及其衍生物的結(jié)合，而d3發(fā)揮微小作用。表7：2b.1.3和fgfr2-d2之間的親和力的數(shù)據(jù)收集和細(xì)化統(tǒng)計(jì)學(xué)*括弧中的數(shù)值是分辨率最高的殼的。表8：fgfr2和fgfr3的單獨(dú)的d2和d2d3域?qū)3mab或mab2b.1.3的結(jié)合親和力的比較。kd(nm)fgfr2-d2fgfr2-iiib(d2d3)fgfr3-d2fgfr3-iiib(d2d3)r3mabnd*nd*0.260.242b.1.31.00.71<0.1**0.09*nd：在200nm檢測(cè)不到；**達(dá)到biacore的擬合極限。mab2b.1.3中的cdrh2序列，thlgd，完全不同于r3mab中的親本h2序列，iyptn。正如預(yù)期的，兩種單抗中cdrh2環(huán)的構(gòu)象實(shí)質(zhì)性不同(圖2c)。在將mab2b.1.3的可變域比對(duì)到r3mab的可變域上時(shí)(圖2b)，h3環(huán)也看來扭曲了幾度，導(dǎo)致這兩種結(jié)構(gòu)中h3尖端殘基y100b的cα原子之間的距離(圖2c)。因而，fgfr2d2域總體的位置相對(duì)于fgfr3d2域的位置位移變體和fgfr抗原之間的界面的比較揭示mab2b.1.3中h2和h3cdr環(huán)的此類改組顯著改善針對(duì)fgfr2表面的擠壓。在親本結(jié)構(gòu)中，r3mab和fgfr3-d2之間的形狀互補(bǔ)性(sc)得分為0.731。如果將fgfr2的d2域比對(duì)到fgfr3d2上并替換fgfr3d2的話，r3mab和fgfr2d2之間的sc下降至0.685。這可以解釋r3mab缺乏對(duì)fgfr2的結(jié)合(表6)。然而，在新的晶體結(jié)構(gòu)中，2b.1.3和fgfr2-d2之間的sc得分劇烈升高至0.768，與經(jīng)由再改造r3mab獲取對(duì)fgfr2的高親和力結(jié)合一致。由于fgfr之間的顯著相似性，2b.1.3與該家族中的多種同系物交叉反應(yīng)。雖然沒有與fgfr2結(jié)合一起獲取fgfr1結(jié)合，但是獲取了fgfr4相互作用。考慮到fgfr4抑制具有升高的毒性風(fēng)險(xiǎn)(pai,r.,d.french,n.ma,k.hotzel,e.plise,l.salphati,k.d.setchell,j.ware,v.lauriault,l.schutt,d.hartleyandd.dambach(2012)."antibody-mediatedinhibitionoffibroblastgrowthfactor19resultsinincreasedbileacidssynthesisandilealmalabsorptionofbileacidsincynomolgusmonkeys."toxicolsci126(2):446-456)，進(jìn)行了第二輪再改造來消除fgfr4結(jié)合。實(shí)施例3。實(shí)施了fgfr3抗體的進(jìn)一步再改造以去除fgfr4結(jié)合。為了生成結(jié)合fgfr2和fgfr3但不結(jié)合fgfr4的mab2b.1.3衍生物，假設(shè)mab2b.1.3以與它與fgfr2的相互作用類似的模式識(shí)別所有fgfr，鑒定了很可能與抗體相互作用但在各種fgfr之間不同的抗原殘基(表9)。基于2b.1.3模板構(gòu)建了三個(gè)噬菌體展示文庫，隨機(jī)誘變?cè)诮佑|cdrh1，h3和l2上的選定位置處(表10)。在改造期間，我們?cè)噲D聚焦于對(duì)fgfr2的結(jié)合，代替我們?cè)谙惹暗母脑熘凶龅哪菢泳S持fgfr2和fgfr3二者。因此，在淘選期間用固定化的單獨(dú)的fgfr2-iiib進(jìn)行選擇。為了反選擇fgfr4結(jié)合物，將噬菌體顆粒與過量的可溶性fgfr4-fc蛋白質(zhì)一起溫育。對(duì)于連續(xù)多輪選擇，將fgfr4-fc的濃度升高至0.46μm(見方法)。通過elisa用fgfr2-iiib和fgfr4測(cè)定來自第4輪的個(gè)別克隆(n＝96)，并通過fgfr2與fgfr4結(jié)合elisa值的比值排序。對(duì)具有最高fgfr2/fgfr4結(jié)合比值的六個(gè)克隆測(cè)序列，作為igg表達(dá)并表征對(duì)fgfr2-iiib和fgfr4的結(jié)合(表11)。所表征的來自h3/l2文庫的克隆2b.1.3.2，2b.1.3.4和2b.1.3.6只含有cdrh3中的突變，不含有cdrl2中的突變，而所表征的來自h1/h3文庫的克隆2b.1.3.8，2b.1.3.10和2b.1.3.12含有cdrh1和h3二者中的突變。雖然h3中l(wèi)100a至d100d的4個(gè)殘基是完全隨機(jī)化的，但是y100b保持不變，提示y100b與fgfr2的相互作用對(duì)于結(jié)合是至關(guān)緊要的。另外，l100a保守突變成thr或ile，而v100c大多突變成asp。含有另外的h1突變t28p的h1/h3突變體展示略微更高的對(duì)fgfr2的親和力。這些抗體以1.4至6.6nm的kd值結(jié)合fgfr2，但是在使用高達(dá)1μm的濃度進(jìn)行測(cè)量時(shí)顯示最低限度的對(duì)fgfr4的結(jié)合，例外是克隆2b.1.3.8仍然保留可檢測(cè)但較弱的對(duì)fgfr4的親和力(表11)。與r3mab中的那些相同的殘基標(biāo)有下劃線，而與中r3mab的那些不同的殘基為粗體(表11)。2b.1.3變體的序列和親和力二者的收斂指示最后幾輪噬菌體選擇已經(jīng)達(dá)到了具有期望功能(即消除fgfr4結(jié)合和保留緊密fgfr2結(jié)合)的結(jié)合物的富集極限。表9：fgfr2和fgfr4之間與2b.1.3進(jìn)行潛在接觸的位置處的殘基變異.*接觸距離的截留為表10：用于自改造的抗體2b.1.3去除fgfr4結(jié)合特異性的文庫設(shè)計(jì)cdrh1殘基2829303132密碼子accttcactagtact氨基酸t(yī)ftst文庫h1+h3nnknnk文庫h1+l2nnknnk文庫h3+l2cdrh2殘基100a100b100c100d密碼子ctgtacgtggac氨基酸lyvd文庫h1+h3nnknnknnknnk文庫h1+l2文庫h3+l2nnknnknnknnkcdrh1n＝g，a，t或c；k＝g或t表11：具有最低限度fgfr4結(jié)合并維持fgfr2結(jié)合的2b.1.3變體克隆cdrh1cdrh3fgfr2-iiibkd(nm)fgfr4kd(nm)2b.1.3tftstlyvd2.6322b.1.3.2tftsttydn6.6>1,0002b.1.3.4tftstiygg5.8>1,0002b.1.3.6tftsttyde5.9>1,0002b.1.3.8pftsliyek1.4～3002b.1.3.10pftsqtydk2.9>1,0002b.1.3.12pftsttydm3.0>1,000考慮到對(duì)fgfr2和fgfr4的結(jié)合的較大差異以及較少的突變是優(yōu)選的，選擇mab2b.1.3.10和2b.1.3.12用于進(jìn)一步表征。這兩種抗體均顯示不結(jié)合fgfr1且保留對(duì)fgfr3的強(qiáng)結(jié)合，親和力比2b.1.3略微更弱(表6)。因此，在第二步改造之后，2b.1.3衍生物mab2b.1.3.10和2b.1.3.12與fgfr2和fgfr3交叉反應(yīng)，但是不識(shí)別fgfr4。我們接下來檢查r3mab變體阻斷fgf配體結(jié)合特定fgfr的能力。r3mab阻斷fgf配體結(jié)合fgfr3-iiib和-iiic同種型二者。由于它們對(duì)不同fgfr的不同特異性，每種新抗體的阻斷譜是不同的(圖3)。所有改造的抗體均顯示針對(duì)fgfr2和fgfr3二者的阻斷活性，而r3mab不抑制fgf7結(jié)合fgfr2-iiib或fgf1結(jié)合fgfr2-iiic。盡管2b.1.3強(qiáng)烈抑制fgf19結(jié)合fgfr4，然而由于實(shí)質(zhì)性消除的fgfr4親和力，2b.1.3.10和2b.1.3.12不阻斷后一種相互作用。實(shí)施例4。再改造的mab變體抑制fgfr2或fgfr3依賴性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。新改造的變體2b.1.3.10和2b.1.3.12展示針對(duì)fgfr2和fgfr3的雙重特異性。為了調(diào)查它們的生物學(xué)活性，我們檢查了它們對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞中的受體依賴性信號(hào)傳導(dǎo)和增殖的影響。首先在體外對(duì)新變體評(píng)估對(duì)fgfr2過表達(dá)性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制。snu-16胃癌和mfm-223x2.2三重陰性乳腺癌細(xì)胞系均具有fgfr2擴(kuò)增，表現(xiàn)為升高的fgfr2基因拷貝數(shù)和蛋白質(zhì)過表達(dá)(kunii,k.,l.davis,j.gorenstein,h.hatch,m.yashiro,a.dibacco,c.elbiandb.lutterbach(2008)."fgfr2-amplifiedgastriccancercelllinesrequirefgfr2anderbb3signalingforgrowthandsurvival."cancerresearch68(7):2340-2348)。在snu-16細(xì)胞中，2b.1.3.10和2b.1.3.12實(shí)質(zhì)性阻抑fgf7誘導(dǎo)的fgfr2磷酸化。另外，這兩種2b.1.3變體顯著降低下游信號(hào)傳導(dǎo)分子frs2α，mapk，plcγ1和akt的磷酸化(圖4a)。類似地，這兩種變體降低fgf7處理的mfm-223x2.2細(xì)胞中fgfr2，frs2α，mapk和her3的磷酸化(圖8)。接下來，調(diào)查雙重特異性單抗2b.1.3.10和2b.1.3.12在體內(nèi)抑制fgfr2依賴性或fgfr3依賴性腫瘤異種移植物生長(zhǎng)的能力。對(duì)于fgfr2特異性處理，對(duì)注射人胃癌細(xì)胞snu-16的小鼠給藥非特異性igg對(duì)照抗體和雙重特異性單抗2b.1.3.10和2b.1.3.12。與對(duì)照抗體相比，雙重特異性抗體展示約67％和57％的腫瘤生長(zhǎng)抑制(圖4b)。在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，2b.1.3.10和2b.1.3.12還遲滯小鼠中mfm-223x2.2腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)(圖8)。因此，這兩種改造的抗體顯示抑制fgfr2依賴性腫瘤生長(zhǎng)方面的效力。既然它們?cè)诟脑旌蟊Ａ翎槍?duì)fgfr3的親本特異性，那么調(diào)查對(duì)fgfr3依賴性腫瘤生長(zhǎng)的抑制。正如預(yù)期的，單抗2b.1.3.10和2b.1.3.12均阻抑rt112腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)(圖4c)?？傊?，改造的抗體能充當(dāng)有效抑制fgfr2和fgfr3依賴性癌細(xì)胞二者生長(zhǎng)的雙重藥劑。然而，改造的變體在rt112模型中的效力與親本r3mab相比降低，可能是由于改善的藥動(dòng)學(xué)。rt112細(xì)胞系表達(dá)fgfr3但不表達(dá)fgfr2。正如預(yù)期的，單抗2b.1.3.10和2b.1.3.12(在改造后保留針對(duì)fgfr3的親本特異性)二者以及親本抗體r3mab阻抑fgfr3過表達(dá)性rt112腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)(圖4b)。這些研究中改造的變體2b.1.3.10和2b.1.3.12(腫瘤生長(zhǎng)抑制(tgi)值為48％和64％)展示比親本r3mab(tgi82％)更弱的效力，這可以是可能是由于改善的藥動(dòng)學(xué)。對(duì)于基于fgfr2的功效，我們轉(zhuǎn)向snu-16細(xì)胞系，它表達(dá)輕易可檢測(cè)的fgfr2連同很低的fgfr3水平。對(duì)攜帶snu-16異種移植物的小鼠給藥非特異性igg對(duì)照抗體，親本r3mab，或改造的變體2b.1.3.10或2b.1.3.12。改造的變體展示相似的tgi值，分別為63％和61％(圖4c)。令人驚訝的是，雖然不結(jié)合fgfr2，但是r3mab也顯示44％的可測(cè)量tgi。然后收集腫瘤樣品并分析fgfr2和fgfr3表達(dá)(圖15)。fgfr3在體內(nèi)在snu-16腫瘤異種移植物中上調(diào)，這可以解釋在這種模型中觀察到的r3mab的抑制效果。不管怎樣，改造的變體顯示與r3mab相比顯著更強(qiáng)的活性(p<0.001，第31天)。在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，2b.1.3.10和2b.1.3.12還遲滯小鼠中mfm-223x2.2腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)(圖8a和圖8b)?？傊脑斓目贵w能充當(dāng)有效抑制fgfr2和fgfr3依賴性癌細(xì)胞二者生長(zhǎng)的雙重藥劑。實(shí)施例5。通過噬菌體文庫選擇生成fgfr2結(jié)合性r3mab變體。先前描述了展示r3mabfab片段的噬菌粒(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)。引入三個(gè)連續(xù)終止密碼子以替換r3mab的h1，h2，h3或l2cdr環(huán)中每一個(gè)的3個(gè)殘基，充當(dāng)模板用于構(gòu)建噬菌體展示文庫。然后使用kunkel等人的方法(kunkelta,bebenekk,&mcclaryj(1991)efficientsite-directedmutagenesisusinguracil-containingdna.methodsenzymol204:125-139)將隨機(jī)突變引入上述cdr環(huán)中的每一個(gè)(表3)。然后通過電穿孔(btxecm630)將經(jīng)過純化的文庫dna轉(zhuǎn)化入ss320感受態(tài)細(xì)胞(clacksont&lowmanhb(2004)phagedisplay:apracticalapproach(oxforduniversitypress))。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的文庫細(xì)胞在2yt培養(yǎng)基中于37℃生長(zhǎng)過夜以容許噬菌體顆粒擴(kuò)增(clacksont&lowmanhb(2004)phagedisplay:apracticalapproach(oxforduniversitypress))。為了分選fgfr2結(jié)合物，在96孔maxisorp板上包被2μg/ml帶his標(biāo)簽的fgfr2-iiib。對(duì)于第一輪淘選，分開地將1od經(jīng)過純化的來自每個(gè)文庫的噬菌體懸浮液與固定化的抗原一起溫育。用磷酸鹽緩沖鹽水加0.05％tween20(pbst)簡(jiǎn)短清洗后，用低ph洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒。將自個(gè)別文庫收集的噬菌體合并到一起并在xl1-blue細(xì)胞中擴(kuò)增用于后續(xù)輪次的淘選。對(duì)于第四輪淘選，清洗步驟延長(zhǎng)至三次15分鐘清洗，間隔30分鐘pbst溫育，從而富集緊密結(jié)合者。用自第4輪回收的噬菌體顆粒感染xl1-blue細(xì)胞并在2yt瓊脂上鋪板。個(gè)別地培養(yǎng)96個(gè)隨機(jī)挑取的菌落用于噬菌體擴(kuò)增。通過噬菌體elisa測(cè)定上清液以驗(yàn)證fgfr2-iiib結(jié)合。同時(shí)，自每個(gè)克隆提取噬菌粒dna并測(cè)序。實(shí)施例6。構(gòu)建文庫并選擇不結(jié)合fgfr4的fgfr2結(jié)合者?；谡故究贵w2b.1.3的fab片段的噬菌粒構(gòu)建噬菌體展示文庫。用于kunkel誘變的終止模板在cdrh1或h3環(huán)任一或二者中包括3個(gè)終止密碼子。對(duì)cdrh1，h3或l2環(huán)中的選定位置進(jìn)行隨機(jī)誘變(表10)。文庫制備規(guī)程與上文描述相同。為了選擇fgfr4結(jié)合降低而fgfr2特異性保留的克隆，在第一輪中，混合1.5od噬菌體文庫與0.5nmfgfr4-fc蛋白質(zhì)。將混合物在用2μg/mlfgfr2-iiib預(yù)包被的在maxisorp板中于4℃溫育過夜。簡(jiǎn)短清洗結(jié)合的噬菌體顆粒，洗脫并擴(kuò)增用于下一輪選擇。在第二輪中，混合1.5od噬菌體制備物與10nmfgfr4-fc并于4℃溫育過夜。對(duì)于第三和第四輪，混合0.5od噬菌體制備物與460nmfgfr4-fc蛋白質(zhì)，并于室溫(rt)搖動(dòng)20分鐘，之后與包被的fgfr2-iiib一起溫育。與fgfr2-iiib一起于室溫溫育30分鐘之后，清洗maxisorp板3次，間隔10分鐘pbst溫育。使用洗脫的噬菌體顆粒感染xl1-blue細(xì)胞并在2yt瓊脂上鋪板。培養(yǎng)隨機(jī)挑取的克隆用于噬菌體elisa測(cè)定法和dna測(cè)序，如上文描述的。實(shí)施例7。實(shí)施噬菌體elisa結(jié)合測(cè)定法。將384孔maxisorp板在每個(gè)象限中用30μl1μg/mle25(對(duì)照抗體)，fgfr2-iiib-his，fgfr2-iiic-his或fgfr4-his于4℃包被過夜。用含2％bsa的pbs于室溫封閉1小時(shí)之后，將30μl10倍稀釋的噬菌體上清液添加入象限。將板于室溫?fù)u動(dòng)2小時(shí)。為了檢測(cè)結(jié)合的噬菌體顆粒，將hrp綴合的抗m13單克隆抗體(gehealthcare)1:3000稀釋并在板中溫育15分鐘。將tmb過氧化物酶底物添加入每個(gè)孔以容許顯色。通過添加100μl1m磷酸來終止反應(yīng)，之后以450nm的吸光度讀板。實(shí)施例8。實(shí)施表面等離振子共振(spr)測(cè)定法。使用biacoret100(gehealthcare)測(cè)定r3mab變體對(duì)fgfr抗原的結(jié)合親和力。遵循產(chǎn)品說明書將飽和量的抗人fc單克隆抗體固定化到cm5生物傳感器芯片上。在每個(gè)流動(dòng)室中捕捉約500個(gè)共振單位的r3mab衍生抗體分子。以流速30μl/min注射多種濃度的fgfr抗原。在每個(gè)結(jié)合循環(huán)之后，使用3mmgcl2再生流動(dòng)室。使用t100評(píng)估軟件實(shí)施動(dòng)力學(xué)分析以獲得動(dòng)力學(xué)和親和力常數(shù)。實(shí)施例9。蛋白質(zhì)表達(dá)，純化和結(jié)構(gòu)測(cè)定。通過pcr擴(kuò)增人fgfr2-iiibecd(殘基140-369)并亞克隆入pet-21b(+)載體(novagen)。在大腸桿菌bl21(de3)plyss細(xì)胞中作為包涵體表達(dá)蛋白質(zhì)。用20mmtrisph7.5，5％甘油，1mmedta和2％tritonx-100清洗包涵體，之后在6m鹽酸胍，20mmtrisph8，10mmtcep中溶解。體外折疊后，迅速將包涵體稀釋入含有100mmtrisph8.0，0.4ml-精氨酸-hcl，2mmedta，3.7mm胱胺和6.6mm半胱胺的重折疊緩沖液中至50mg/l。4℃72小時(shí)后，濃縮折疊混合物并通過5ml肝素hp柱(gehealthcare)。用monos柱和superdex200柱進(jìn)一步純化樣品。如描述的那樣表達(dá)并純化2b.1.3fab(qing,j.,x.du,y.chen,p.chan,h.li,p.wu,s.marsters,s.stawicki,j.tien,k.totpal,s.ross,s.stinson,d.dornan,d.french,q.r.wang,j.p.stephan,y.wu,c.wiesmannanda.ashkenazi(2009)."antibody-basedtargetingoffgfr3inbladdercarcinomaandt(4；14)-positivemultiplemyelomainmice."thejournalofclinicalinvestigation119(5):1216-1229)。分開地針對(duì)10mmtrisph7.0，5mmnacl透析fgfr2和fab蛋白質(zhì)，之后以1:1的摩爾比混合到一起。將蛋白質(zhì)混合物稀釋至2mg/ml用于結(jié)晶。使用蒸氣擴(kuò)散方法，晶體于20％(w/v)peg3350，0.1m檸檬酸鈉ph5.5，0.2m硫酸銨生長(zhǎng)。由于晶體對(duì)防冷凍溶液敏感且一旦轉(zhuǎn)移出母液就破碎，因此最終自靜置四個(gè)月不觸動(dòng)的盤收獲可衍射晶體，其中peg3350的濃度高得足以提供防冷凍。因而直接自液滴取出晶體并在液氮中驟凍。在勞倫斯·伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的高級(jí)光源中心用的束波長(zhǎng)收集衍射數(shù)據(jù)。使用hkl2000和scalepack(otwinowskiz&minorw(1997)processingofx-raydiffractiondatacollectedinoscillationmode.methodsinenzymology276:307-326)進(jìn)行數(shù)據(jù)加工。使用ccp4suite中的程序phaser(mccoyaj,etal.(2007)phasercrystallographicsoftware.japplcrystallogr40(pt4):658-674.winnmd,etal.(2011)overviewoftheccp4suiteandcurrentdevelopments.actacrystallogrdbiolcrystallogr67(pt4):235-242)以分子置換解答結(jié)構(gòu)。fab和fgfr2-d2的搜索模型分別為pdb3grw和3cu1。在不對(duì)稱晶胞中找到兩種復(fù)合物。使用phenix(adamspd,etal.(2010)phenix:acomprehensivepython-basedsystemformacromolecularstructuresolution.actacrystallogrdbiolcrystallogr66(pt2):213-221)進(jìn)行剛體和模擬退火細(xì)化。用程序coot(emsleyp,lohkampb,scottwg,&cowtank(2010)featuresanddevelopmentofcoot.actacrystallogrdbiolcrystallogr66(pt4):486-501)實(shí)施手動(dòng)模型建構(gòu)。使用phenix進(jìn)行位置和原子位移參數(shù)的后續(xù)細(xì)化。以的距離截留添加水分子。通過程序molprobity(chenvb,etal.(2010)molprobity:all-atomstructurevalidationformacromolecularcrystallography.actacrystallogrdbiolcrystallogr66(pt1):12-21)驗(yàn)證最終的模型。沒有檢測(cè)到ramachandran離群值。實(shí)施例10。fgf配體阻斷elisa。將96孔maxisorp板用1.5μg/ml抗人fc抗體(jacksonimmunoresearchlab)于4℃包被過夜。用含2％bsa的pbs于室溫封閉1小時(shí)后，將0.25μg/mlfgfr-fc融合蛋白于室溫溫育2小時(shí)。清洗板5次，之后添加抗體和fgf配體混合物，是作為49μl100ng/mlfgf配體，1μl25mg/ml肝素(sigma-aldrich)和50μl抗體稀釋液制備的。于室溫?fù)u動(dòng)2小時(shí)后，清洗板5次。通過隨后于室溫與0.5μg/ml生物素化抗fgf抗體(r&dbiosystems)一起溫育0.5小時(shí)，與1:2,500稀釋的鏈霉親合素-hrp(invitrogen)一起溫育0.5小時(shí)并與tmb底物一起溫育直至顯色足夠來檢測(cè)結(jié)合的配體。實(shí)施例11。細(xì)胞系。snu16和mfm-223x2.2細(xì)胞系是自內(nèi)部細(xì)胞庫獲得的。細(xì)胞系rt112是自atcc獲得的。在補(bǔ)充有10％fbs的rpmi培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)所有細(xì)胞系測(cè)試支原體，交叉污染和遺傳指紋(在產(chǎn)生新的儲(chǔ)液時(shí))以確保質(zhì)量及確認(rèn)世系。細(xì)胞系指紋：snp指紋。每次為了冷凍保存而擴(kuò)充新的儲(chǔ)液時(shí)實(shí)施snp基因型。使用fluidigm多路測(cè)定法通過高通量snp基因型測(cè)定驗(yàn)證細(xì)胞系同一性。在商業(yè)性基因型測(cè)定平臺(tái)上基于次要等位基因頻率和存在選擇snp。將snp概況與來自可得內(nèi)部和外部數(shù)據(jù)(在可得時(shí))的snp調(diào)用比較以確定或確認(rèn)世系。在數(shù)據(jù)不可得或細(xì)胞系世系可疑的情況中，重新購買dna或細(xì)胞系來實(shí)施概況分析以確認(rèn)細(xì)胞系世系。snp。rs11746396，rs16928965，rs2172614，rs10050093，rs10828176，rs16888998，rs16999576，rs1912640，rs2355988，rs3125842，rs10018359，rs10410468，rs10834627，rs11083145，rs11100847，rs11638893，rs12537，rs1956898，rs2069492，rs10740186，rs12486048，rs13032222，rs1635191，rs17174920，rs2590442，rs2714679，rs2928432，rs2999156，rs10461909，rs11180435，rs1784232，rs3783412，rs10885378，rs1726254，rs2391691，rs3739422，rs10108245，rs1425916，rs1325922，rs1709795，rs1934395，rs2280916，rs2563263，rs10755578，rs1529192，rs2927899，rs2848745，rs10977980。短串聯(lián)重復(fù)(str)概況分析。使用promegapowerplex16系統(tǒng)為每種系測(cè)定str概況。這實(shí)施一次并與細(xì)胞系的外部str概況(在可得時(shí))比較以確定細(xì)胞系世系。分析的基因座。檢測(cè)16個(gè)基因座(15個(gè)str基因座和用于性別鑒定的amelogenin)，包括d3s1358，th01，d21s11，d18s51，pentae，d5s818，d13s317，d7s820，d16s539，csf1po，pentad，amel，vwa，d8s1179和tpox。實(shí)施例12。免疫印跡。在組織培養(yǎng)板上接種細(xì)胞達(dá)24小時(shí)，用10μg/mlfgfr阻斷性抗體或?qū)φ湛筭d抗體預(yù)處理，然后在20μg/ml肝素(sigma)存在下用25ng/mlfgf-7(r&dsystems)刺激15分鐘。將細(xì)胞置于冰上，并立即用ip裂解緩沖液(thermoscientific)收獲蛋白質(zhì)。使蛋白質(zhì)裂解物通過注射器，通過離心澄清，然后使用bca蛋白質(zhì)測(cè)定法(thermoscientific)量化。將蛋白質(zhì)在4-12％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上分開，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5％bsa或奶的tbst封閉30分鐘，然后用一抗于4℃印跡過夜。所使用的抗體：磷酸-fgfr(y653/654)，磷酸-frs2(y196)，磷酸-erk1/2(t202/y204)，erk1/2，磷酸-akt(s473)，akt，磷酸-her3(y1289)，her3，磷酸-plcγ1(y783)，plcγ1(cellsignaling)；fgfr2，frs2(santacruzbiotechnology)；β-肌動(dòng)蛋白(sigma)。清洗膜并與適宜的hrp綴合的二抗一起溫育1小時(shí)，然后清洗并用supersignalwestfemto化學(xué)發(fā)光底物(thermoscientific)檢測(cè)。用fluorchemq(alphainnotech)獲取發(fā)光信號(hào)。實(shí)施例13。異種移植物實(shí)驗(yàn)。所有規(guī)程得到genentech科研動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)且符合genentech科研動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)設(shè)立的方針和原則，而且是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)(aaalac)認(rèn)證的動(dòng)物房中進(jìn)行的。在細(xì)胞接種前1天皮下(s.c.)植入0.36mg雌激素藥丸。在6-8周齡雌性ncr裸小鼠(taconictm)的乳房脂肪墊#4中接種在含matrigel的hbss中懸浮的10x106個(gè)mfm-223x2.2乳腺癌細(xì)胞。將約15-30mm3的snu-16腫瘤碎片皮下植入6-8周齡雌性balb/c裸小鼠(shanghailaboratoryanimal)的右體側(cè)。在6-8周齡雌性c.b-17scid小鼠(charlesriverlab)中皮下植入在含matrigel的hbss中懸浮的7x106個(gè)rt-112膀胱癌細(xì)胞。當(dāng)均值腫瘤體積達(dá)到100-200mm3時(shí)(第0天)，將小鼠隨機(jī)化入6只(snu-16，rt112)或7只(mfm-223x2.2)的組，并在第1天開始用一周兩次腹膜內(nèi)(i.p.)注射2b1.3.10或2b1.3.12(10，30或50mg/kg)處理。用在pbs中稀釋的對(duì)照人igg1抗體(30mg/kg)處理對(duì)照組。使用ultracaliv測(cè)徑器(5410111型，fredv.fowlercompany)以兩個(gè)維度(長(zhǎng)度和寬度)測(cè)量腫瘤體積。使用下述公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積(mm3)＝(長(zhǎng)度×寬度2)×0.5。使用adventurerproav812天平(ohaus)測(cè)量動(dòng)物體重。使用下述公式計(jì)算百分比體重變化：體重變化(％)＝[(新日子的重量–第0天的重量)/第0天的重量]x100％。在研究期間對(duì)每只動(dòng)物跟蹤百分比體重，為每個(gè)組計(jì)算百分比體重變化并繪圖。實(shí)施例14。fgfr2/3+klb雙特異性抗體的鑒定。連同本文中描述的抗fgfr2/3抗體的抗腫瘤活性一起，可以生成針對(duì)fgfr2/3和klb的雙特異性抗體(“fgfr2/3+klb雙特異性抗體”)，其在治療與fgfr2和/或fgfr3表達(dá)有關(guān)的增殖性病癥和疾病(更具體的說是代謝疾病)中使用?？梢酝ㄟ^fgfr2/3+klb雙特異性抗體來治療的代謝疾病包括但不限于：多囊卵巢綜合征(pcos)，代謝綜合征(mets)，肥胖癥，非酒精性脂肪性肝炎(nash)，非酒精性脂肪性肝病(nafld)，高脂血癥，高血壓，2型糖尿病，非2型糖尿病，1型糖尿病，潛伏性自身免疫性糖尿病(lad)，年輕人成熟期發(fā)作糖尿病(mody)，2型糖尿病，肥胖癥，巴爾得-別德爾綜合征，普拉德-威利綜合征，阿耳斯特雷姆綜合征，科恩綜合征，奧爾布賴特氏遺傳性骨營(yíng)養(yǎng)不良(假甲狀旁腺功能減退癥)，木匠綜合征，momo綜合征，魯賓斯坦-泰比綜合征，脆弱x綜合征和伯-福-萊三氏綜合征。更具體的說，fgfr2/3+klb雙特異性抗體可用于治療nash。最初，實(shí)施了實(shí)驗(yàn)來比較抗fgfr2/3抗體變體的活性(圖17a和17b)。具體而言，在第1天，在96孔板中以0.9x106的密度接種239tfgfr1刪除細(xì)胞。在第2天，用包括fgfr，ff螢光素酶，renill螢光素酶(轉(zhuǎn)染效率對(duì)照)，和elk1的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在第3天，在無血清培養(yǎng)基中用抗fgfr2/3抗體變體2b1.3，2b1.3.12，2b1.1.2，2b1.1.4，2b1.1.6，2b1.1.8，2b1.1.10，2b1.1，和2b1.1.12刺激細(xì)胞。初始濃度為10μg/ml并以1/5實(shí)施連續(xù)稀釋。反應(yīng)進(jìn)行7.5小時(shí)，并通過自板去除培養(yǎng)基并添加1x被動(dòng)裂解緩沖液來終止。然后在添加螢光素酶底物之后使用wallaceenvision讀板儀分析板并針對(duì)renilla表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。在實(shí)施了但本文中未描述的其它測(cè)定法以外部分基于螢光素酶測(cè)定法，裝配抗fgfr2/3抗體變體決策矩陣(圖18)。2b1.3在mcf-7/fgf7測(cè)定法中顯示出阻斷生長(zhǎng)并顯示fgf19阻斷。2b1.3.12阻斷腫瘤進(jìn)展?；跊Q策矩陣，進(jìn)一步檢查變體2b1.3.12，2b1.1.6，和2b1.1(圖19a-19c)，并測(cè)試每一個(gè)的活性。而且，對(duì)2b1.1，2b1.3，和2b1.3.12檢測(cè)fgfr結(jié)合(表12)。在表12中，nb指無結(jié)合，而nd指未測(cè)定。通過捕捉igg并使fgfr4-6xhis流過來針對(duì)fgfr4測(cè)量2b.1.1(表12中以*標(biāo)示的實(shí)驗(yàn))。稍后，通過捕捉fgfr4-fc并使抗體fab片段流過來測(cè)定2b.1.3變體的kd(表12)。表12：r3mab變體對(duì)人fgfr的結(jié)合親和力克隆fgfr1-iiib，iiicfgfr2-iiibfgfr2-iiicfgfr3-iiibfgfr3-iiicfgfr4r3mabnbnbnb0.240.61nb2b.1.1nb0.292.8ndnd2.8*2b.1.3nb2.62.00.090.07322b.1.3.12nb3.06.10.500.72>1,000因此，表達(dá)七種2b1.1變體并測(cè)試fgfr2，fgfr3，和fgfr4結(jié)合的激動(dòng)活性(圖16a-16c)。所有2b1.1變體均使用biacore測(cè)定法顯示亞nm至低pm的對(duì)fgfr3的親和力范圍。由于fgfr4蛋白質(zhì)粘性，最好通過biacore以fab作為分析物來測(cè)定結(jié)合親和力。大多數(shù)變體通過elisa顯示對(duì)fgfr4的弱結(jié)合，2b1.1和2b1.1.4除外?；诖藢?shí)施例14中描述的實(shí)驗(yàn)，選擇變體2b1.3.12和2b1.1.6用于與抗klb抗體一起裝配雙特異性。實(shí)施例14：fgfr2/3+klb雙特異性抗體的生成?？梢允褂萌魏坞p特異性抗體生成方法來生成fgfr2/3+klb雙特異性抗體。在具體的例子中，可以使用節(jié)和穴技術(shù)來生成本發(fā)明的fgfr2/3+klb雙特異性抗體?？梢杂镁幋a抗fgfr2/3抗體變體2b1.3.12或2b1.1.6的重和輕鏈和本文中描述的抗klb抗體之一的重和輕鏈的四種表達(dá)載體的混合物共轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞(見例如表13和14)。表13：鼠抗klb單克隆抗體的cdrh序列表14：鼠抗klb單克隆抗體的cdrl序列可以分別給抗fgfr2/3和抗klb的重鏈帶上flag肽和oct-組氨酸的標(biāo)簽，使得可以通過序貫親和純化自條件化培養(yǎng)基純化異二聚體igg。然后可以在基于gal-elk1的螢光素酶測(cè)定法中分析部分純化的異二聚體igg以鑒定klb依賴性激動(dòng)劑。為了最小化重和輕鏈的錯(cuò)配，可以與人fab恒定區(qū)一起表達(dá)抗fgfr2/3，而且可以與小鼠fab恒定區(qū)一起表達(dá)抗klb。然后最初可以使用來自fgfr2/3抗體變體2b1.3.12或2b1.1.6任一的一個(gè)臂和來自本文中描述的klb抗體任一的一個(gè)臂的組合以粗制形式測(cè)試帶標(biāo)簽的雙特異性igg。具體而言，作為klb臂的來源的抗klb抗體可包含：8c5.k4.m4l.h3.knv重鏈可變區(qū)evqlvesggglvqpggslrlscaasdfslttygvhwvrqapgkglewlgviwsggstdynaafisrltiskdnskntvylqmnslraedtavyycardygstyvdaidywgqgtlvtvss(seqidno:104)8c5.k4.m4l.h3.knv完整重鏈evqlvesggglvqpggslrlscaasdfslttygvhwvrqapgkglewlgviwsggstdynaafisrltiskdnskntvylqmnslraedtavyycardygstyvdaidywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqygstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:106)8c5.k4.m4l.h3.knv輕鏈可變區(qū)divltqspdslavslgeratincrasesvesygnrymtwyqqkpgqppklliyraanlqsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpwtfgqgtkveik(seqidno:105)8c5.k4.m4l.h3.knv完整輕鏈divltqspdslavslgeratincrasesvesygnrymtwyqqkpgqppklliyraanlqsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqsnedpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:107)而且，可以與人igg1恒定區(qū)(野生型，具有效應(yīng)器功能)一起及與具有n297g突變以消除效應(yīng)器功能的人igg1恒定區(qū)一起，或與具有雙重[d265g/n297g]突變(dang)以消除效應(yīng)器功能的小鼠恒定區(qū)一起生成雙特異性抗體。實(shí)施例15：雙特異性抗體的測(cè)試?？梢陨?c5.k4h3.m4l.knv(見上文實(shí)施例14)和不同抗fgfr2/3臂的多種雙特異性抗體組合并在有或無klb的情況中在hek293細(xì)胞中的基于gal-elk1的螢光素酶測(cè)定法中測(cè)試。每種雙特異性抗體組合均能在表達(dá)重組fgfr2或3和klb的細(xì)胞以劑量依賴性方式誘導(dǎo)螢光素酶活性，但是在沒有klb表達(dá)的細(xì)胞中不然。此數(shù)據(jù)能確認(rèn)fgfr2/3+klb雙特異性保留親本抗體(例如2b1.3.12或2b1.1.6)的優(yōu)點(diǎn)。而且，可以關(guān)于klb結(jié)合，fgfr2結(jié)合，和fgfr3結(jié)合測(cè)定具有人源化8c5臂(8c5.k4.m4l.h3.knv)和2b1.3.12或2b1.1.6變體任一的臂的fgfr2/3+klb雙特異性抗體的結(jié)合親和力。在所描繪的和要求保護(hù)的各種實(shí)施方案以外，所公開的主題還針對(duì)具有本文中公開的和要求保護(hù)的特征的其它組合的其它實(shí)施方案。照此，本文中呈現(xiàn)的特定特征可以以在所公開的主題的范圍內(nèi)的其它方式彼此組合，使得所公開的主題包括本文中公開的特征的任何合適組合。已經(jīng)出于例示和描述目的呈現(xiàn)所公開的主題的具體實(shí)施方案的前述描述。它并非意圖是詳盡的或?qū)⑺_的主題限制于所公開的那些實(shí)施方案。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在不背離所公開的主題的精神和范圍的情況下在所公開的主題的組合物和方法中進(jìn)行各種修飾和變化。如此，所公開的主題意圖包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的修飾和變化及其等同方案。本文中應(yīng)用了多份出版物，專利和專利申請(qǐng)，據(jù)此通過援引完整收錄它們的內(nèi)容。序列seqidno:12b.1.3.10hvr-l1rasqdvdtslaseqidno:22b.1.3.10hvr-l2sasflysseqidno:32b.1.3.10hvr-l3qqstghpqtseqidno:42b.1.3.10hvr-h1gfpftsqgisseqidno:52b.1.3.10hvr-h2rthlgdgstnyadsvkgseqidno:62b.1.3.10hvr-h3artygiydtydkyteyvmdyseqidno:72b.1.3.12hvr-l1rasqdvdtslaseqidno:82b.1.3.12hvr-l2sasflysseqidno:92b.1.3.12hvr-l3qqstghpqtseqidno:102b.1.3.12hvr-h1gfpftstgisseqidno:112b.1.3.12hvr-h2rthlgdgstnyadsvkgseqidno:122b.1.3.12hvr-h3artygiydtydmyteyvmdyseqidno:132b.1.1hvr-h2ywawdseqidno:142b.1.88hvr-h2iwmftseqidno:152b.1.38hvr-h2fwaydseqidno:162b.1.20hvr-h2ldvfwseqidno:172b.1.32hvr-h2wvgftseqidno:182b.1.49hvr-h2lsffsseqidno:192b.1.86hvr-h2lsfwtseqidno:202b.1.9hvr-h2yhpylseqidno:212b.1.73hvr-h2mifynseqidno:222b.1.74hvr-h2yhpfrseqidno:232b.1.14hvr-h2lwyfdseqidno:242b.1.71hvr-h2vwmfdseqidno:252b.1.28hvr-h2fwawsseqidno:262b.1.95hvr-h2lifftseqidno:272b.1.50hvr-h2lnfysseqidno:282b.1.81hvr-h2vnnfyseqidno:292b.1.25hvr-h2whpwmseqidno:302b.1.3hvr-h2thlgdseqidno:312b.1.65hvr-h2ynaytseqidno:322b.1.94hvr-h2lvffsseqidno:332b.1.78hvr-h2lsfysseqidno:342b.1.72hvr-h2vhpfeseqidno:352b.1.44hvr-h2wwswgseqidno:362b.1.52hvr-h2fslgdseqidno:372b.1.30hvr-h2vsffsseqidno:382b.1.82hvr-h2inffsseqidno:392b.1.93hvr-h2idnywseqidno:402b.1.55hvr-h2vdvfwseqidno:412b.1.35hvr-h2whpfrseqidno:422b.1.33hvr-h2yhpfhseqidno:432b.1.80hvr-h2ywafsseqidno:442b.1.92hvr-h2wvafsseqidno:452b.1.3hvr-h2thlgdseqidno:462b.1.95hvr-h2lifftseqidno:472b.1.73hvr-h2mifynseqidno:482b.1.32hvr-h2wvgftseqidno:492b.1.88hvr-h2iwmftseqidno:502b.1.1hvr-h2ywawdseqidno:51fgfr2-iiib核酸序列atggtcagctggggtcgtttcatctgcctggtcgtggtcaccatggcaaccttgtccctggcccggccctccttcagtttagttgaggataccacattagagccagaagagccaccaaccaaataccaaatctctcaaccagaagtgtacgtggctgcgccaggggagtcgctagaggtgcgctgcctgttgaaagatgccgccgtgatcagttggactaaggatggggtgcacttggggcccaacaataggacagtgcttattggggagtacttgcagataaagggcgccacgcctagagactccggcctctatgcttgtactgccagtaggactgtagacagtgaaacttggtacttcatggtgaatgtcacagatgccatctcatccggagatgatgaggatgacaccgatggtgcggaagattttgtcagtgagaacagtaacaacaagagagcaccatactggaccaacacagaaaagatggaaaagcggctccatgctgtgcctgcggccaacactgtcaagtttcgctgcccagccggggggaacccaatgccaaccatgcggtggctgaaaaacgggaaggagtttaag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