本發(fā)明涉及用于在卵巢腫瘤中檢測惡性度極高的卵巢透明細(xì)胞腺癌的、組織因子途徑抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor2；tfpi2)蛋白的新的加工多肽(以下稱為“nt-tfpi2”)，以及以nt-tfpi2為測定對象的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測方法。更詳細(xì)而言，涉及利用計(jì)算nt-tfpi2和完整tfpi2的總計(jì)量的測定法來檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法、及用于檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的試劑。

背景技術(shù)：

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，在日本，每年罹患人數(shù)為約7000～8000人，每年死亡人數(shù)為約4000人，預(yù)期其數(shù)量將逐年增加。卵巢癌中，卵巢表層上皮性的惡性腫瘤約占85％，進(jìn)而根據(jù)組織型分為漿液性、類內(nèi)膜型、粘液性、透明細(xì)胞、未分化型。其中，關(guān)于透明細(xì)胞腺癌，有報(bào)道指出存在如下傾向：歐美人的罹患率為5％左右，而日本人的罹患率則高達(dá)20％～30％。卵巢透明細(xì)胞腺癌的特征是：stagei期病癥約占一半，對使用順鉑、紫杉醇等的化學(xué)療法具有抵抗性，惡性度極高。

目前，作為檢測卵巢癌的方法，使用的是經(jīng)陰道超聲波法、ct、mri等。

此外，作為由全血、血細(xì)胞、血清、血漿等血液成分檢測卵巢癌的方法，通常已知以癌抗原125(cancerantigen125、ca125)為檢測對象的方法。ca125是被1981年bast等人以卵巢癌細(xì)胞株(ovca433)為免疫原建立的單克隆抗體(oc125)所識(shí)別的抗原，血液成分中檢測ca125時(shí)，以高陽性率顯示為卵巢表層上皮性卵巢癌。因此，作為對卵巢癌的篩選、卵巢癌治療效果的評價(jià)、治療后的后續(xù)觀察等有效的檢查，而得到廣泛利用(非專利文獻(xiàn)1及2)。

但是，在全部卵巢癌中，ca125的陽性率為約80％左右，存在為假陰性的情況，因此約20％左右的卵巢癌不能通過ca125來判別。在惡性卵巢癌中的各組織型間進(jìn)行比較的結(jié)果是，漿液性癌中的ca125陽性率顯示為90％以上，而透明細(xì)胞腺癌中的ca125陽性率則極低，為約65％(非專利文獻(xiàn)3)。ca125還被用作屬于良性腫瘤的子宮內(nèi)膜異位癥的輔助標(biāo)志物，但難以明確區(qū)分良性卵巢腫瘤和惡性卵巢腫瘤，也難以鑒定惡性腫瘤的組織型。

如果能夠通過血液檢查，在具有多樣的組織型的卵巢腫瘤中僅鑒定惡性度極高的卵巢透明細(xì)胞腺癌，則不僅有助于卵巢癌篩選及提高后續(xù)觀察時(shí)的診斷精度，而且可期待未來有助于開發(fā)出包括術(shù)前化學(xué)療法在內(nèi)的透明細(xì)胞腺癌特征性的術(shù)前治療法。進(jìn)而，提出了卵巢透明細(xì)胞腺癌以卵巢子宮內(nèi)膜異位癥為發(fā)生土壤的惡變學(xué)說，為了闡明卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的后續(xù)觀察用途和其癌發(fā)生機(jī)制，也迫切需要鑒定卵巢透明細(xì)胞腺癌特征性標(biāo)志物分子以及該分子的檢測方法。

另外，組織因子途徑抑制物2(tfpi2)與胎盤蛋白5(placentalprotein5；pp5)為同一蛋白，為含有3個(gè)kunitz型蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域的來自胎盤的絲氨酸蛋白酶抑制劑(非專利文獻(xiàn)4)。據(jù)報(bào)道，tfpi2在各kunitz結(jié)構(gòu)域(kd)中具有3個(gè)二硫鍵，根據(jù)kunitz結(jié)構(gòu)域2及3所附加的天冬酰胺結(jié)合型糖鏈的結(jié)構(gòu)差異，在分子量30000da～35000da附近分級出多個(gè)種類(非專利文獻(xiàn)5)。

關(guān)于tfpi2與婦科疾病的關(guān)系，已經(jīng)獲得了如下知識(shí)：在先兆子癇中，子宮內(nèi)胎兒生長遲緩(iugr)增加，與正常孕婦相比，血中tfpi2量增加(非專利文獻(xiàn)6)；子宮內(nèi)膜異位癥患者中，血中tfpi2量增加(專利文獻(xiàn)1)等。關(guān)于與癌的關(guān)系，正在廣泛進(jìn)行基因水平的研究，已經(jīng)報(bào)道了：在子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌中，透明細(xì)胞腺癌包含于基因表達(dá)上調(diào)一定水平的組中(非專利文獻(xiàn)7)；在胃癌中基因表達(dá)上調(diào)(專利文獻(xiàn)2)；在癌中，作為tfpi2的剪接變體的astfpi2的基因表達(dá)上調(diào)(非專利文獻(xiàn)8)等。進(jìn)而，近年在各種癌中發(fā)現(xiàn)tfpi2啟動(dòng)子部cpg島發(fā)生過度甲基化，因此正在廣泛進(jìn)行表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物的研究(專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)9、10、11、12及13)。

另一方面，本發(fā)明的發(fā)明人荒川等已經(jīng)闡明：卵巢癌中，tfpi2由透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞株特異性產(chǎn)生，在卵巢癌患者中，僅透明細(xì)胞腺癌患者組織中的基因表達(dá)特異性上調(diào)(專利文獻(xiàn)4)；對健康人及子宮內(nèi)膜異位癥例中的血中tfpi2進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在透明細(xì)胞腺癌中顯著上調(diào)(專利文獻(xiàn)5、非專利文獻(xiàn)14)。

但是，迄今為止，并不知曉tfpi2加工多肽的存在，從而以該多肽作為測定對象來檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法、其效果也當(dāng)然是未知的。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:日本特表2007-506965號(hào)

專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-118915號(hào)

專利文獻(xiàn)3:wo2008/084219號(hào)

專利文獻(xiàn)4:日本專利公開2013-79979號(hào)

專利文獻(xiàn)5:日本專利公開2013-61321號(hào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1:j.clin.invest.,68,1331(1981)

非專利文獻(xiàn)2:humanreproduction,4,1(1989)

非專利文獻(xiàn)3:日本分子腫瘤標(biāo)志物研究會(huì)志,20,98(2005)

非專利文獻(xiàn)4:j.biochem.,116,939(1994)

非專利文獻(xiàn)5:int.j.cancer.may29；76(5)：749-56(1998)

非專利文獻(xiàn)6:placenta,28,224(2007)

非專利文獻(xiàn)7:clin.cancerres.,11,6422(2005)

非專利文獻(xiàn)8:mol.cancer.mar12；6：20.(2007)

非專利文獻(xiàn)9:cancergenet.cytogenet.,197,16(2010)

非專利文獻(xiàn)10:anticancerres.,30,1205(2010)

非專利文獻(xiàn)11:gynecol.oncol.,130(i)：132-9(2013)

非專利文獻(xiàn)12:j.invest.dermatol.,133(5)：1278-85(2013)

非專利文獻(xiàn)13:dig.dis.sci.,58(4)：1010-5(2013)

非專利文獻(xiàn)14:j.proteomeres.,2013,12(10),pp.4340-4350

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明的課題在于，提供在具有多樣的組織型的良性或惡性卵巢腫瘤中，以高靈敏度和特異度檢測惡性度極高的卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法，及可以用于上述方法的試劑。

用于解決問題的方案

為此，本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，建立了對來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組tfpi2蛋白及來自癌細(xì)胞的tfpi2蛋白顯示高親和性的抗體群并進(jìn)行了各抗體的性狀解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在完整tfpi2和新的tfpi2加工多肽(nt-tfpi2)。進(jìn)而，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，在卵巢腫瘤及子宮腫瘤中，使用識(shí)別tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗體測定完整tfpi2及nt-tfpi2時(shí)，與僅測定完整tfpi2時(shí)相比，卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢測特異度提高，因此nt-tfpi2可以成為卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢測標(biāo)志物，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明含有以下方式。

(1)一種組織因子途徑抑制物2(tfpi2)加工多肽，其具有以下(i)～(iii)的特征。

(i)含有序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至第131個(gè)殘基的組氨酸或第130個(gè)殘基的半胱氨酸為止的氨基酸序列、或與其具有80％以上的同源性的序列。

(ii)通過還原sds-page，在分子量約16000處被分級出。

(iii)通過還原sds-page，天冬酰胺結(jié)合型糖鏈切斷處理后的肽片段在分子量約12000處被分級出。

(2)一種檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法，其包括測定檢體中(1)所述的tfpi2加工多肽量的步驟。

(3)根據(jù)(2)所述的方法，其包括進(jìn)一步測定上述檢體中完整tfpi2量的步驟。

(4)根據(jù)(3)所述的方法，其中，在上述tfpi2加工多肽量和上述完整tfpi2量的總計(jì)超過由對照計(jì)算出的基準(zhǔn)值時(shí)，判定為檢測出卵巢透明細(xì)胞腺癌。

(5)根據(jù)(2)～(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用利用抗體的抗原抗體反應(yīng)來進(jìn)行上述測定，所述抗體與序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至第131個(gè)殘基的組氨酸或第130個(gè)殘基的半胱氨酸為止區(qū)域內(nèi)的抗原決定簇結(jié)合。

(6)根據(jù)(5)所述的方法，其中，上述抗體為識(shí)別tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗體。

(7)根據(jù)(2)～(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用質(zhì)譜法進(jìn)行上述測定。

(8)一種用于檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的試劑，其含有與序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至第131個(gè)殘基的組氨酸或第130個(gè)殘基的半胱氨酸為止區(qū)域內(nèi)的抗原決定簇結(jié)合的抗體。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，提供一種卵巢透明細(xì)胞腺癌的新的檢測標(biāo)志物，此外，提供一種在具有多樣的組織型的良性卵巢腫瘤及惡性卵巢腫瘤中、以高靈敏度和特異度將惡性度極高的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測為陽性、將良性卵巢腫瘤及透明細(xì)胞腺癌以外的其它惡性卵巢腫瘤檢測為陰性的方法。

附圖說明

圖1為示出導(dǎo)入有g(shù)pi錨定型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞的利用(a)抗flag抗體或者(b)作為陰性對照的抗bnc抗體的facs解析結(jié)果的圖。

圖2為示出分泌型tfpi2的elisa解析結(jié)果的圖?？v軸表示吸光度，橫軸表示每個(gè)孔的各溶液的添加量。

圖3為示出分泌型tfpi2的蛋白質(zhì)印跡(westenblotting)解析結(jié)果的圖(照片)。

圖4為示出基于利用了gpi錨定型tfpi2的celisa解析的各小鼠血清抗體效價(jià)測定結(jié)果的圖。縱軸表示吸光度。

圖5為示出基于利用了分泌型tfpi2的elisa解析的各小鼠血清抗體效價(jià)測定結(jié)果的圖?？v軸表示吸光度。

圖6為示出基于利用了gpi錨定型tfpi2的celisa解析的各單克隆抗體解析結(jié)果的圖?？v軸表示吸光度，橫軸表示抗體添加濃度。

圖7為示出基于利用了3種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的免疫沉淀-蛋白質(zhì)印跡(ip-wb)解析的各單克隆抗體解析結(jié)果的圖(照片)。圖表縱軸表示每單位面積的信號(hào)強(qiáng)度。

圖8-1為示出使用了2種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的3種單克隆抗體的ip-wb解析結(jié)果的圖(wb像)(照片)。

圖8-2為示出使用了2種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的3種單克隆抗體的ip-wb解析結(jié)果的圖(ruby染色像)(照片)。

圖8-3為示出使用了2種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的3種單克隆抗體的ip產(chǎn)物的氨基酸序列解析結(jié)果的圖。

圖9為示出利用2種aia測定試劑的各種卵巢癌培養(yǎng)上清解析結(jié)果的圖。縱軸的rate表示每單位時(shí)間的4-甲基傘形酮的生成量[nmol/(l·s)]。

圖10-1為示出有/無n型糖鏈消化處理的3種卵巢癌培養(yǎng)上清的aia解析結(jié)果的圖。

圖10-2為示出有/無n型糖鏈消化處理的3種卵巢癌培養(yǎng)上清的免疫沉淀回收率的圖。

圖10-3為示出有/無n型糖鏈消化處理的3種卵巢癌培養(yǎng)上清的wb像的圖。

圖11-1為示出2種卵巢癌培養(yǎng)上清中的tfpi2的經(jīng)時(shí)變化的aia解析結(jié)果的圖。

圖11-2為示出2種卵巢癌培養(yǎng)上清中的tfpi2的經(jīng)時(shí)變化的ip-wb解析結(jié)果的圖(照片)。

圖12-1為示出5種卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的tfpi2的aia解析結(jié)果的圖。

圖12-2為示出5種卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的tfpi2的ip-wb解析結(jié)果的圖(照片)。

圖13為示出與妊娠周期相伴隨的tfpi2經(jīng)時(shí)變化的aia解析結(jié)果的圖。

圖14為示出各種婦科腫瘤板的tfpi2及ca125的aia解析結(jié)果的圖。橫棒表示各疾病組的中位數(shù)。

圖15為示出各種婦科腫瘤板的tfpi2及ca125測定值的箱線圖(boxplot)。

圖16為示出tfpi2及ca125的cca及非cca卵巢腫瘤檢體的roc曲線的圖。

圖17-1為示出nt-tfpi2多肽的c末端序列解析結(jié)果的圖。a：抗體柱結(jié)合級分的sypro-ruby染色像(照片)，b：由條帶#1～#3鑒定出的序列信息的、定位(mapping)于tfpi2氨基酸序列上的結(jié)果。

圖17-2為示出nt-tfpi2多肽的c末端序列解析結(jié)果的圖。c：由條帶#3檢測出的代表性的來自tfpi2肽的前體離子的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

＜1＞本發(fā)明的組織因子途徑抑制物2(tfpi2)加工多肽

本發(fā)明的多肽為組織因子途徑抑制物2(tfpi2)加工多肽。

如后述實(shí)施例所示，nt-tfpi2不存在于癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)級分中，而僅存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清中，因此推測：其是完整tfpi2被分泌到癌細(xì)胞外后局部存在在細(xì)胞外基質(zhì)中、經(jīng)過某些特征性加工而出現(xiàn)的tfpi2的片段多肽。

nt-tfpi2是含有位于完整tfpi2的n末端側(cè)的kunitz結(jié)構(gòu)域1的片段。更具體而言，序列號(hào)1為基于人tfpi2的cdna的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸至第22個(gè)殘基的甘氨酸為信號(hào)肽。nt-tfpi2至少含有連接在信號(hào)肽之后的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至第131個(gè)殘基的組氨酸或第130個(gè)殘基的半胱氨酸為止的序列，或含有與上述序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。上述同源性優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上。此外，本發(fā)明的多肽也可以是由在上述序列中缺失、置換、插入、和/或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。需要說明的是，數(shù)個(gè)是指優(yōu)選2～20個(gè)、更優(yōu)選2～10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選2～5個(gè)。

nt-tfpi2也可以含有序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至比第131個(gè)殘基的組氨酸或第130個(gè)殘基的半胱氨酸更接近c(diǎn)末端側(cè)的氨基酸序列，例如還優(yōu)選具有作為第131個(gè)殘基的氨基酸的組氨酸或作為第132個(gè)殘基的氨基酸的精氨酸。此外，優(yōu)選不含tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域3部分。

此外，nt-tfpi2還可以在上述序列的兩側(cè)具有其它肽片段，優(yōu)選不具有識(shí)別tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域3的抗體的抗原決定簇。

需要說明的是，完整tfpi2為序列號(hào)1的氨基酸序列的第23個(gè)殘基～第235個(gè)殘基所示的肽。

此外，通過還原sds-page，在分子量約16000處分級出nt-tfpi2。更具體而言，例如使用10～20質(zhì)量％梯度的聚丙烯酰胺凝膠按照常規(guī)方法在還原條件下實(shí)施sds-page時(shí)，在與分子量標(biāo)志物、優(yōu)選fullrangerainbowmolecularweightmarker(gehealthcare公司制)的分子量17000相當(dāng)?shù)臈l帶位置的稍低分子量側(cè)檢測。

進(jìn)而，通過還原sds-page，在分子量約12000處分級出nt-tfpi2的、天冬酰胺結(jié)合型糖鏈切斷處理后的肽片段。天冬酰胺結(jié)合型糖鏈切斷處理可以通過n-聚糖酶等來進(jìn)行，對由此使天冬酰胺結(jié)合型糖鏈游離的多肽使用例如10～20質(zhì)量％的梯度的聚丙烯酰胺凝膠按照常規(guī)方法在還原條件下實(shí)施sds-page時(shí)，在與分子量標(biāo)志物、優(yōu)選fullrangerainbowmolecularweightmarker(gehealthcare公司制)的分子量12000相當(dāng)?shù)臈l帶位置檢測。

需要說明的是，nt-tfpi2中，在序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的n末端起第116個(gè)殘基的天冬酰胺上附加有天冬酰胺結(jié)合型糖鏈。

＜2＞本發(fā)明的檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法

本發(fā)明的檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法包括測定檢體中nt-tfpi2量的步驟。這是基于與其它組織型相比、在卵巢透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞的細(xì)胞外特征性存在nt-tfpi2的方法。通過該方法，如后述實(shí)施例所示，與測定目前已知的腫瘤標(biāo)志物(ca125)、單獨(dú)測定完整tfpi2的情況相比，可以以高靈敏度和特異度特異性檢測出卵巢透明細(xì)胞腺癌。

本發(fā)明的檢測方法中，除了測定檢體中nt-tfpi2量以外，還可以進(jìn)一步測定完整tfpi2量。原因在于，即使基于檢體中的nt-tfpi2和完整tfpi2的總計(jì)量來進(jìn)行卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢測判定，也可以得到充分的靈敏度和特異度。原因或者還在于，如后所述，由測定兩者而得的總計(jì)量和單獨(dú)的完整tfpi2測定量來間接地測定nt-tfpi2量，從而也可以進(jìn)行卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢測。

在本發(fā)明的檢測方法中，對測定nt-tfpi2量和/或完整tfpi2量的方法沒有特別限定。例如，可以例示出使用利用了識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的抗體的抗原抗體反應(yīng)的方法；利用質(zhì)譜法的方法。

作為利用了使用識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的抗體的抗原抗體反應(yīng)的測定方法的具體例子，可以列舉以下方法。

(a)使用識(shí)別標(biāo)記后的測定對象及測定對象的抗體，利用標(biāo)記后的測定對象及檢體中所含的測定對象與上述抗體競爭性結(jié)合的競爭法。

(b)使用表面等離子體共振的方法，所述表面等離子體共振使檢體與固定有識(shí)別測定對象的抗體的芯片接觸，對依賴于該抗體和測定對象的結(jié)合的信號(hào)進(jìn)行檢測。

(c)使用熒光標(biāo)記后的識(shí)別測定對象的抗體，利用該抗體和測定對象結(jié)合而使熒光偏振度上升的原理的熒光偏振免疫測定法。

(d)使用表位不同的2種識(shí)別測定對象的抗體(其中1個(gè)為標(biāo)記后的抗體)，形成該2個(gè)抗體和測定對象這3者的復(fù)合體的夾心法。

(e)作為前處理，通過識(shí)別測定對象的抗體而將檢體中的測定對象濃縮后，通過質(zhì)譜儀等檢測作為其結(jié)合蛋白的多肽的方法。

(d)、(e)的方法簡便且通用性高，在處理多檢體方面，(d)的方法的試劑及裝置的相關(guān)技術(shù)已經(jīng)充分建立，因此更為優(yōu)選。

關(guān)于利用抗原抗體反應(yīng)測定nt-tfpi2量和/或完整tfpi2量的方法，具體可以列舉以下方法。

(a)使用識(shí)別nt-tfpi2和完整tfpi2兩者的抗體來測定nt-tfpi2及完整tfpi2的總計(jì)量的方法(nt+i-tfpi2測定體系)。需要說明的是，上述識(shí)別nt-tfpi2和完整tfpi2兩者的抗體優(yōu)選與序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至第131個(gè)殘基的組氨酸或第130個(gè)殘基的半胱氨酸為止的區(qū)域內(nèi)的抗原決定簇結(jié)合的抗體，進(jìn)一步優(yōu)選具有識(shí)別tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體。此外，在該方法中使用上述夾心法時(shí)，通常使用表位不同的2種上述抗體。

(b)使用不識(shí)別nt-tfpi2、但識(shí)別完整tfpi2的抗體來測定完整tfpi2單獨(dú)的量的方法(i-tfpi2測定體系)。需要說明的是，上述不識(shí)別nt-tfpi2、但識(shí)別完整tfpi2的抗體優(yōu)選為具有識(shí)別tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域3的抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體。此外，在該方法中使用上述夾心法時(shí)，通常使用表位不同的2種上述抗體，其中至少1種使用不識(shí)別nt-tfpi2、但識(shí)別完整tfpi2的抗體，另一種可以是不識(shí)別nt-tfpi2、但識(shí)別完整tfpi2的抗體，也可以是識(shí)別nt-tfpi2和完整tfpi2兩者的抗體。

(c)從通過(a)的nt+i-tfpi2測定體系測定的nt-tfpi2及完整tfpi2的總計(jì)量中，減去通過(b)的i-tfpi2測定體系測定的完整tfpi2單獨(dú)量，從而計(jì)算nt-tfpi2單獨(dú)的量的方法。

(d)使用不識(shí)別完整tfpi2、但識(shí)別nt-tfpi2的抗體來測定nt-tfpi2單獨(dú)的量的方法。需要說明的是，上述不識(shí)別完整tfpi2、但識(shí)別nt-tfpi2的抗體可以列舉例如特異性識(shí)別nt-tfpi2的c末端部分的肽序列的抗體。在使用上述夾心法時(shí)，例如將該抗體作為固定抗體、將具有識(shí)別kunitz結(jié)構(gòu)域1的識(shí)別位點(diǎn)的抗體作為檢測抗體。

在本發(fā)明的檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法中，可以使用通過上述(c)、(d)的方法測定的nt-tfpi2單獨(dú)的量作為判定的基準(zhǔn)，使用通過(a)的方法測定的nt-tfpi2及完整tfpi2的總計(jì)量作為判定的基準(zhǔn)時(shí)也可得到充分的靈敏度和特異度，并且從抗體的容易取得程度、以一個(gè)階段來進(jìn)行測定從而簡便的角度出發(fā)，更優(yōu)選后者。

識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的抗體可以如下獲得：nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)本身、由nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)的部分區(qū)域構(gòu)成的寡肽、編碼nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)的完整或部分區(qū)域的多核苷酸等作為免疫原并對動(dòng)物進(jìn)行免疫，從而獲得。

免疫中使用的動(dòng)物只要具有抗體產(chǎn)生能力則沒有特別限定，可以是小鼠、大鼠、兔等通常在免疫中使用的哺乳動(dòng)物，也可以使用雞等禽類。

需要說明的是，使用nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)本身、或由nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)的部分區(qū)域構(gòu)成的寡肽作為免疫原時(shí)，在上述蛋白質(zhì)或上述寡肽的制備過程中，其結(jié)構(gòu)有可能發(fā)生變化。因此，得到的抗體有可能對于期望的抗原沒有高特異性、結(jié)合力，結(jié)果有可能無法準(zhǔn)確地對檢體中所含的tfpi2濃度進(jìn)行定量。另一方面，使用含有編碼nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)的完整或部分區(qū)域的多核苷酸的表達(dá)載體作為免疫原時(shí)，在免疫后的動(dòng)物體內(nèi)，不發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而是與導(dǎo)入一致的nt-tfpi2多肽或完整tfpi2蛋白質(zhì)的完整或部分區(qū)域被表達(dá)出，因此可得到對檢體中的nt-tfpi2多肽或完整tfpi2具有高特異性及結(jié)合力(即高親和性)的抗體，因此是優(yōu)選的。

識(shí)別tfpi2的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。

關(guān)于產(chǎn)生識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的抗體的雜交瘤細(xì)胞的建立，從技術(shù)已經(jīng)建立的方法中適當(dāng)選擇來進(jìn)行即可。作為一例，從用上述方法免疫的動(dòng)物采集b細(xì)胞，用電或者在聚乙二醇存在下使上述b細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，通過hat培養(yǎng)基選擇產(chǎn)生期望抗體的雜交瘤細(xì)胞，通過有限稀釋法對所選擇的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，從而可以建立產(chǎn)生識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

本發(fā)明的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測方法中使用的、識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的抗體、例如識(shí)別nt-tfpi2和/或完整tfpi2的單克隆抗體的選擇，可以基于對來自宿主表達(dá)體系的gpi(糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol))錨定型tfpi2或分泌型tfpi2的親和性來進(jìn)行。

需要說明的是，作為上述宿主，沒有特別限定，從本領(lǐng)域技術(shù)人員通常用于蛋白質(zhì)表達(dá)的大腸桿菌、酵母等微生物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞中適當(dāng)選擇即可，優(yōu)選使用能夠通過二硫鍵或糖鏈附加這樣的翻譯后修飾而能夠表達(dá)具有與天然型的nt-tfpi2和/或完整tfpi2接近的結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的哺乳細(xì)胞作為宿主。作為哺乳細(xì)胞的一例，可以列舉目前使用的來自人胚腎的細(xì)胞(hek)293t細(xì)胞株、猴腎細(xì)胞cos7株、中華倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞或由人分離出的癌細(xì)胞等。

關(guān)于本發(fā)明的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測方法中使用的抗體的純化，從技術(shù)已經(jīng)確立的方法中適當(dāng)選擇進(jìn)行即可。作為一例，可以在培養(yǎng)通過上述方法建立的產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞后，回收其培養(yǎng)上清，根據(jù)需要通過硫酸銨沉淀而進(jìn)行抗體濃縮后，通過使用固定有蛋白a、蛋白g、或蛋白l等的載體的親和層析和/或離子交換色譜來進(jìn)行抗體的純化。

需要說明的是，上述夾心法中，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)時(shí)使用的標(biāo)記后的抗體可以是將通過上述方法純化后的抗體用過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶進(jìn)行標(biāo)記，該標(biāo)記還可以使用技術(shù)已充分建立的方法來進(jìn)行。

以下，對在本發(fā)明的檢測方法中利用質(zhì)譜法測定nt-tfpi2量和/或完整tfpi2量的方法進(jìn)行具體說明。

在檢體為血液時(shí)，作為前處理工序，優(yōu)選通過agilenthuman14等除去血液中所大量包含的白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等蛋白后，進(jìn)一步通過離子交換、凝膠過濾或反相hplc等進(jìn)行分級。

測定可以通過串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)、液相色譜·串聯(lián)質(zhì)譜(lc/ms/ms)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry、maldi-tof/ms)、表面增強(qiáng)激光解吸電離質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorptionionizationmassspectrometry、seldi-ms)等來進(jìn)行。

在本發(fā)明的檢測方法中，優(yōu)選在測得的nt-tfpi2量超過由對照計(jì)算的基準(zhǔn)值(cutoff值)時(shí)，判定為檢測出卵巢透明細(xì)胞腺癌?；蛘?，優(yōu)選在測得的nt-tfpi2量和完整tfpi2量的總計(jì)超過由對照計(jì)算的基準(zhǔn)值(cutoff值)時(shí)，判定為檢測出卵巢透明細(xì)胞腺癌。

判定中使用的nt-tfpi2量及完整tfpi2量可以為測定值或換算濃度值中任一者。需要說明的是，換算濃度值是指基于以tfpi2為標(biāo)準(zhǔn)試樣制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線由測定值換算的值。

關(guān)于基準(zhǔn)值(cutoff值)，可以對透明細(xì)胞腺癌以外的卵巢腫瘤、子宮腫瘤或健康人等非卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢體、和卵巢透明細(xì)胞腺癌檢體分別進(jìn)行測定，通過受試者工作特征(roc)曲線解析來適宜設(shè)定顯示出最佳靈敏度和特異度的測定值。例如，具體而言，使用血清作為檢體時(shí)的nt-tfpi2量和完整tfpi2量的總計(jì)基準(zhǔn)值(cutoff值)可以設(shè)為由每單位時(shí)間內(nèi)堿性磷酸酶所致4-甲基傘形酮生成濃度計(jì)算的測定值(rate：nmol/(l·s))1.9。

＜3＞本發(fā)明的用于檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的試劑

本發(fā)明的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測用的試劑含有與序列號(hào)1所示的tfpi2氨基酸序列的由第23個(gè)殘基的氨基酸～第131個(gè)殘基或第130個(gè)殘基的氨基酸為止的區(qū)域內(nèi)的抗原決定簇結(jié)合的抗體。上述抗體優(yōu)選為識(shí)別tfpi2的kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗體。這些抗體可以識(shí)別nt-tfpi2及完整tfpi2兩者。

在將本發(fā)明的試劑用于上述夾心法時(shí)，優(yōu)選含有表位不同的2種抗體作為上述抗體。

本發(fā)明的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測試劑還可以進(jìn)一步含有包含識(shí)別卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物的抗體的、卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物的檢測試劑。作為卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物，可以列舉例如ca125等。

本發(fā)明的試劑中所含的抗體可以是抗體本身，也可以進(jìn)行了標(biāo)記，還可以固定在固相上。

以下具體說明本發(fā)明的試劑中用于作為上述夾心法的方式之一的2步夾心法的情況。但本發(fā)明不受該方法限定。

首先，可以通過以下(i)～(iii)所示的方法制作本發(fā)明的試劑。

(i)首先，使在夾心法中使用的、識(shí)別nt-tfpi2及完整tfpi2的、表位不同的2種抗體(以下記作“抗體1”及“抗體2”)中的抗體1與免疫板、磁性顆粒等能夠進(jìn)行b/f(bound/free)分離的載體結(jié)合。結(jié)合方法可以是利用疏水結(jié)合的物理結(jié)合，也可以是使用能夠使兩物質(zhì)間交聯(lián)的接頭試劑等的化學(xué)結(jié)合。

(ii)使上述抗體1與載體結(jié)合后，為了避免非特異性結(jié)合，將載體表面用牛血清白蛋白、脫脂奶粉、市售的免疫分析用封閉劑等進(jìn)行封閉處理，將其作為初級試劑。

(iii)對另一抗體2進(jìn)行標(biāo)記，準(zhǔn)備含有所得到的標(biāo)記抗體的溶液作為2次試劑。作為對抗體2進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)，優(yōu)選：過氧化物酶、堿性磷酸酶之類的酶，熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素等能夠通過檢測裝置檢測的物質(zhì)，或針對生物素的抗生物素蛋白等存在特異性結(jié)合對象的物質(zhì)等。此外，作為二級試劑的溶液，優(yōu)選可良好地進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的緩沖液，例如磷酸緩沖液、tris-hcl緩沖液等。

通過這種方式制作的本發(fā)明的試劑可以根據(jù)需要進(jìn)行冷凍干燥。

需要說明的是，在1步夾心法的情況下，可以與上述(i)～(ii)同樣地制作使抗體1與載體結(jié)合并進(jìn)行封閉處理的試劑，進(jìn)而對上述抗體固定化載體添加含有標(biāo)記后的抗體2的緩沖液，從而制作試劑。

然后，使用通過上述方法得到的試劑以2步夾心法來檢測、測定nt-tfpi2及完整tfpi2時(shí)，可以通過以下(iv)～(vi)所示的方法來進(jìn)行。

(iv)使(ii)所制作的初級試劑和檢體在一定溫度下接觸一定時(shí)間。關(guān)于反應(yīng)條件，可以在溫度4℃～40℃的范圍反應(yīng)5分鐘～180分鐘。

(v)將未反應(yīng)物質(zhì)通過b/f分離而除去，然后與(iii)所制作的二級試劑在一定溫度下接觸一定時(shí)間，形成夾心復(fù)合體。關(guān)于反應(yīng)條件，可以在溫度4℃～40℃的范圍反應(yīng)5分鐘～180分鐘。

(vi)將未反應(yīng)物質(zhì)通過b/f分離而除去，對標(biāo)記抗體的標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行定量，通過以已知濃度的tfpi2溶液為標(biāo)準(zhǔn)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來定量檢體中的人nt-tfpi2及完整tfpi2濃度。

上述關(guān)于tfpi2的檢測試劑的說明也可以適用到卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物的檢測試劑中。卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物的檢測試劑可以與上述本發(fā)明的試劑同樣制作，還可以是現(xiàn)有的市售試劑。

檢測試劑中所含的抗體等試劑成分的量可以根據(jù)檢體量、檢體的種類、試劑的種類、檢測手法等諸條件適當(dāng)設(shè)定。具體而言，例如，如后述那樣使用稀釋了2.5倍的血清、血漿50μl作為檢體并通過夾心法進(jìn)行nt-tfpi2量及完整tfpi2量的測定時(shí)，在抗體與50μl該檢體反應(yīng)的反應(yīng)體系中，與載體結(jié)合的抗體量可以為100ng～1000μg，標(biāo)記抗體量可以為2ng～20μg。

本發(fā)明的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測試劑可以用于手動(dòng)方法的檢測中，也可以用于使用自動(dòng)免疫診斷裝置的檢測中。特別是，使用自動(dòng)免疫診斷裝置的檢測可以不受檢體所含的內(nèi)源性測定妨礙因子、競爭酶影響地進(jìn)行檢測，且能夠在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢體中的nt-tfpi2及完整tfpi2以及卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物的濃度的定量，因此是優(yōu)選的。

關(guān)于成為本發(fā)明的卵巢透明細(xì)胞腺癌檢測方法及本發(fā)明的檢測試劑的對象的檢體(被檢試樣)，可以列舉全血、血細(xì)胞、血清、血漿等血液成分；細(xì)胞或組織的提取液、尿、腦脊髄液等。此外，還可以將卵巢組織活檢作為檢查對象，此時(shí)以活檢試樣的培養(yǎng)上清作為檢體。在使用血液成分、尿等體液作為檢體時(shí)，可以簡便且非侵襲地檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌，因此是優(yōu)選的；考慮到檢體采集的容易性、在其它檢查項(xiàng)目中的通用性，特別優(yōu)選使用血液成分作為檢體。檢體的稀釋倍率可以根據(jù)所使用的檢體的種類、狀態(tài)從未稀釋～稀釋100倍中適當(dāng)選擇，例如，在血清、血漿的情況下，可以使用50μl的2.5倍稀釋的檢體。

實(shí)施例

以下示出實(shí)施例，以具體地說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例是示出本發(fā)明的一例，本發(fā)明不受實(shí)施例限定。

＜實(shí)施例1＞dna免疫用載體的構(gòu)建

為了通過dna免疫有效地誘導(dǎo)體液免疫，優(yōu)選使對象抗原蛋白以膜結(jié)合型蛋白形式局部存在于細(xì)胞表面上。tfpi2本來是分泌蛋白，因此為了使tfpi2局部存在于細(xì)胞表面上，構(gòu)建能夠表達(dá)在tfpi2的c末端側(cè)附加有g(shù)pi(glycosylphosphatidylinositol，糖基磷脂酰肌醇)錨的蛋白(以下記作gpi錨定型tfpi2)的質(zhì)粒載體。

(1)使用下述(a)的引物，按照常規(guī)方法通過rt-pcr法對由tfpi2cdna(genbankno.nm＿006528)的73～705堿基所構(gòu)成的多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。

(a)gpi錨定型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca-3’(序列號(hào)2，3’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第73～87位的堿基序列相當(dāng))

反向：

5’-catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg-3’(序列號(hào)3，5’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第691～705位的堿基序列相當(dāng))

(2)在含有胎盤堿性磷酸酶(placentalalkalinephosphatase)的gpi錨的編碼區(qū)域和flag標(biāo)簽的編碼區(qū)域的質(zhì)粒pflag1(sigma公司制)的hindiii-ecori位點(diǎn)，使用in-fusion(clonetech公司制)按照說明書插入(1)所得到的rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建分別在n末端側(cè)附加有flag標(biāo)簽肽、c末端側(cè)附加有g(shù)pi錨的gpi錨定型tfpi2的表達(dá)質(zhì)粒。

(3)為了確認(rèn)插入到(2)所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒中的多核苷酸所表達(dá)的tfpi2是否按照設(shè)想局部存在于細(xì)胞表面，使用作為瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞的293t細(xì)胞株通過下述方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

(3-1)將(2)所構(gòu)建的gpi錨定型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒按照常規(guī)方法導(dǎo)入到293t細(xì)胞株。

(3-2)將導(dǎo)入了上述表達(dá)質(zhì)粒的293t細(xì)胞株在5％co2培養(yǎng)箱中用添加了10％fbs(胎牛血清)的d-mem培養(yǎng)基(和光純藥公司制)在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，使tfpi2瞬時(shí)表達(dá)。

(3-3)在(3-2)所得到的培養(yǎng)細(xì)胞中，添加與flag標(biāo)簽特異性結(jié)合的sigma公司制小鼠抗flagm2抗體、或作為陰性對照的不與flag標(biāo)簽結(jié)合的小鼠抗bnc抗體，并靜置30分鐘。需要說明的是，bnc是由bnp(腦鈉尿肽)的c末端側(cè)7個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽(日本特開2009-240300號(hào))。

(3-4)靜置后添加熒光標(biāo)記后的抗小鼠igg抗體(beckmancoulter公司制)，進(jìn)一步靜置30分鐘后，進(jìn)行facs(fluorescenceactivatedcellsorting，熒光激活細(xì)胞分選術(shù))解析。

將facs解析的結(jié)果示于圖1。解析的結(jié)果是，作為陰性對照的添加了抗bnc抗體的情況下(圖1的(b))，未確認(rèn)到由熒光標(biāo)記細(xì)胞所引起的信號(hào)增加、即所謂的位移(shift)。另一方面，添加抗flag抗體的情況下(圖1的(a))，確認(rèn)到由熒光標(biāo)記細(xì)胞所引起的位移。該結(jié)果表明：所表達(dá)的附加有flag標(biāo)簽肽的gpi錨定型tfpi2局部存在于細(xì)胞表面上。

＜實(shí)施例2＞免疫及采血

對小鼠的免疫如下進(jìn)行：將按照以dna量計(jì)含有40μg實(shí)施例1的(2)所構(gòu)建的gpi錨定型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒的方式制備的pbs溶液100μl對4只balb/c小鼠進(jìn)行給予。在首次免疫起7天后、14天后、21天后、28天后及35天后追加給予，在首次免疫開始后第42天采血，采集抗血清，分別作為抗血清a-1～a-4。

＜實(shí)施例3＞gpi錨定型tfpi2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的制作

作為抗血清評價(jià)用，通過以下方法制作能夠穩(wěn)定表達(dá)gpi錨定型tfpi2的來自中華倉鼠卵巢的cho-k1細(xì)胞株。

(1)將實(shí)施例1的(2)所構(gòu)建的tfpi2表達(dá)質(zhì)粒按照常規(guī)方法對cho-k1細(xì)胞株進(jìn)行基因?qū)牒?，?％co2培養(yǎng)箱中使用添加了10％fbs的hamsf12培養(yǎng)基(和光純藥公司制)在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。

(2)培養(yǎng)后，按照250μg/ml的量添加抗生素遺傳霉素溶液(invitrogen公司制)，進(jìn)一步培養(yǎng)3周。

(3)使用抗flag抗體，通過細(xì)胞分選儀獲得穩(wěn)定表達(dá)gpi錨定型tfpi2的cho-k1細(xì)胞。

＜實(shí)施例4＞分泌型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

在實(shí)施例1的(2)所構(gòu)建的tfpi2表達(dá)質(zhì)粒中，在所插入的tfpi2基因與存在于其3’末端側(cè)的gpi錨的編碼區(qū)域之間進(jìn)一步插入編碼由bnp(腦鈉尿肽)的c末端側(cè)7個(gè)氨基酸所構(gòu)成的bnc肽(專利文獻(xiàn)5)的寡核苷酸，從而制備能表達(dá)分別在n末端側(cè)附加有flag肽、c末端側(cè)附加有bnc肽且不具有g(shù)pi錨的分泌型tfpi2的質(zhì)粒。以下示出具體制備方法。

(1)使用下述(b)的引物，按照常規(guī)方法通過rt-pcr法對tfpi2cdna的除起始密碼子及終止密碼子之外的完整(genbankno.nm＿006528的第148～第780位的區(qū)域)的、在3’末端側(cè)附加有編碼bnc肽的寡核苷酸的多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。

(b)分泌型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca-3’(序列號(hào)4，3’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第73～87位的堿基序列相當(dāng))

反向：

5’-agcatcagtggtgaattctcattagtggcgacgcagaactttgcaaaattgcttcttccg-3’(序列號(hào)5，5’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第691～705位的堿基序列相當(dāng))

(2)在含有胎盤堿性磷酸酶的gpi錨定區(qū)域的質(zhì)粒pflag1(sigma公司制)的hindiii-ecori位點(diǎn)，使用in-fusion(clonetech公司制)按照說明書插入(1)的rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建分泌型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒。

(3)為了確認(rèn)插入到質(zhì)粒pflag1中的多核苷酸所表達(dá)的分泌型tfpi2在n末端側(cè)附加有flag標(biāo)簽、在c末端側(cè)附加有bnc標(biāo)簽這一點(diǎn)，使用作為瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞的293t細(xì)胞株通過下述方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

(3-1)與實(shí)施例1的記載同樣地將(2)所構(gòu)建的分泌型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入至293t細(xì)胞株并使其瞬時(shí)表達(dá)分泌型tfpi2，對培養(yǎng)72小時(shí)后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，回收上清并將其作為分泌型tfpi2溶液。

(3-2)使用分泌型tfpi2溶液作為試樣，進(jìn)行(a)酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa法)、及(b)蛋白質(zhì)印跡(wb)法。

(a)elisa法

(a-1)將兔抗flag多克隆抗體(rockland公司制)用碳酸鹽緩沖液(ph9.8)稀釋，以成為100ng/孔，固定化于maxisorp96孔板(nunc公司制)。

(a-2)在4℃反應(yīng)一晚后，用tbs(tris-bufferedsaline)洗滌3次，在各孔中添加250μl/孔的含有3％牛血清白蛋白(bsa；bovineserumalbumin)的tbs溶液，室溫下放置2小時(shí)。

(a-3)用tbs洗滌3次，添加50μl/孔的分泌型tfpi2溶液、及作為陰性對照的未導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒的293t細(xì)胞株的培養(yǎng)上清，室溫下放置1小時(shí)。

(a-4)用含有0.5％tween20的tbs(tbs-t)洗滌3次后，添加50μl/孔的用含有1％bsa的tbs-t(1％bsa/tbs-t)稀釋為1μg/ml的小鼠抗bnc單克隆抗體溶液，室溫下放置1小時(shí)。

(a-5)用tbs-t洗滌3次后，添加50μl/孔的用1％bsa/tbs-t稀釋10000倍的辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記抗小鼠免疫球蛋白g-fc抗體(sigma公司制)溶液，室溫下放置1小時(shí)。

(a-6)用tbs-t洗滌4次，添加tmbmicrowellperoxidasesubstrate(kpl公司制)后，用1mol/l磷酸溶液終止反應(yīng)，用吸光測定酶標(biāo)儀測定450nm的吸光值。

(b)蛋白質(zhì)印跡法

(b-1)將(3-1)所得到的分泌型tfpi2溶液、及作為陰性對照的未導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒的293t細(xì)胞株的培養(yǎng)上清按照常規(guī)方法用sds-page展開，轉(zhuǎn)印于pvdf膜(gehealthcare公司制)。

(b-2)用含有5％脫脂奶粉的tbs-t(封閉溶液)在室溫下反應(yīng)2小時(shí)而封閉后，在封閉溶液中以1μg/片添加堿性磷酸酶標(biāo)記抗bnc抗體，在4℃反應(yīng)一晚。

(b-3)用tbs-t洗滌后，使用westernlightningcdp-star(perkinelmer公司制)通過感光膜對所得到的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測。

將elisa法的解析結(jié)果示于圖2。分泌型tfpi2溶液(分泌型tfpi2培養(yǎng)上清)中，與陰性對照(293t培養(yǎng)上清)相比，可確認(rèn)到明顯的添加量依賴性信號(hào)，表明培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了分泌型tfpi2。

將蛋白質(zhì)印跡法的解析結(jié)果示于圖3。分泌型tfpi2溶液(分泌型tfpi2培養(yǎng)上清)在分子量約35kda附近檢測到了明顯的條帶，表明培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了n末端具有flag標(biāo)簽、c末端具有bnc標(biāo)簽的分泌型tfpi2。

＜實(shí)施例5＞小鼠抗血清的評價(jià)

使用實(shí)施例3所制作的gpi錨定型tfpi2表達(dá)cho-k1細(xì)胞通過細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附測定法(celisa)對實(shí)施例2所采集的小鼠抗血清進(jìn)行解析，及使用實(shí)施例4所得到的分泌型tfpi2溶液通過elisa對實(shí)施例2所采集的小鼠抗血清進(jìn)行解析。需要說明的是，為了研究特異性，基于公知的基因序列，與上述tfpi2表達(dá)質(zhì)粒同樣地構(gòu)建分別以gpi錨定型(n末端側(cè)具有flag標(biāo)簽、c末端側(cè)具有g(shù)pi錨)及分泌型(n末端側(cè)具有flag標(biāo)簽、c末端側(cè)具有bnc標(biāo)簽)表達(dá)與tfpi2不同的蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒，并導(dǎo)入293t細(xì)胞株、cho-k1細(xì)胞中而利用。以下也將該與tfpi2不同的蛋白質(zhì)稱為對照蛋白質(zhì)。

(1)celisa解析

(1-1)在96孔板的每孔中，添加5×10⁴個(gè)實(shí)施例3所制作的gpi錨定型tfpi2表達(dá)cho-k1細(xì)胞、及作為陰性對照細(xì)胞的以gpi錨定型表達(dá)上述對照蛋白質(zhì)的cho-k1細(xì)胞，使用添加了10％fbs的hamsf12培養(yǎng)基(和光純藥公司制)，在5％co2培養(yǎng)箱中、37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。

(1-2)對于gpi錨定型tfpi2表達(dá)細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞，分別添加2000倍稀釋的抗血清(a1～a4)或小鼠抗flagm2抗體(sigma公司制)作為一級抗體，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。

(1-3)反應(yīng)后洗滌板，添加辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記抗小鼠免疫球蛋白g-fc抗體(sigma公司制)作為二級抗體，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。

(1-4)反應(yīng)后洗滌板，添加tmbmicrowellperoxidasesubstrate(kpl公司制)后，用1mol/l磷酸溶液終止反應(yīng)，用吸光測定酶標(biāo)儀測定450nm的吸光值。

(2)elisa解析

除了使用作為陰性對照的以分泌型表達(dá)上述對照蛋白質(zhì)的293t細(xì)胞株的培養(yǎng)上清(以下也稱為分泌型對照蛋白質(zhì)溶液)以外，通過與實(shí)施例4的(a)同樣的方法評價(jià)各小鼠抗血清。

將celisa解析的結(jié)果示于圖4。在陰性對照細(xì)胞的情況下，任意的抗血清都幾乎未確認(rèn)到信號(hào)，tfpi2表達(dá)細(xì)胞則確認(rèn)到明顯的信號(hào)。結(jié)果表明：通過實(shí)施例2中實(shí)施的dna免疫，得到特異性高的抗tfpi2抗血清。

將elisa解析的結(jié)果示于圖5。與celisa的結(jié)果同樣地，在使用抗血清(a1～a4)的情況下，僅對于tfpi2確認(rèn)到明顯的信號(hào)，該方法也表明：通過實(shí)施例2中實(shí)施的dna免疫，得到特異性高的抗血清。

總結(jié)圖4及圖5的結(jié)果可知，實(shí)施例2所得到的小鼠抗血清無論是gpi錨定型tfpi2還是分泌型tfpi2，均為特異性高的抗血清。

＜實(shí)施例6＞雜交瘤的建立

通過以下方法建立能夠產(chǎn)生針對tfpi2的抗體的雜交瘤。

(1)從實(shí)施例2中已經(jīng)確認(rèn)由于dna免疫而抗體效價(jià)上升的小鼠采集脾臟細(xì)胞并回收脾細(xì)胞。

(2)用所回收的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞株sp2/0在聚乙二醇存在下按照常規(guī)方法實(shí)施細(xì)胞融合。

(3)用hat(sigma-aldrich公司制)/git培養(yǎng)基(和光純藥公司制)培養(yǎng)約10天，從而選擇抗體產(chǎn)生細(xì)胞雜交瘤。

(4)將所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞雜交瘤的培養(yǎng)上清供于實(shí)施例5的(1)中記載的celisa及實(shí)施例4的(a)中記載的elisa，進(jìn)行能夠產(chǎn)生針對tfpi2的抗體的雜交瘤的篩選。

(5)將通過篩選而選擇的孔中的細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行單克隆化，進(jìn)行由ht(sigma-aldrich公司制)/git培養(yǎng)基到git培養(yǎng)基的馴化培養(yǎng)，最終建立10種雜交瘤(ts-tf01～ts-tf10)。

＜實(shí)施例7＞抗原識(shí)別位點(diǎn)的鑒定

通過作為tfpi2的各kunitz結(jié)構(gòu)域的kd1、kd2及kd3的變體表達(dá)細(xì)胞來鑒定各抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)。以下示出各變體表達(dá)用質(zhì)粒的具體制備方法。

(1)使用下述(c)、(d)及(e)記載的引物，按照常規(guī)方法通過rt-pcr法對tfpi2的與kd1區(qū)域、kd2區(qū)域及kd3～c末端區(qū)域相當(dāng)?shù)亩嗪塑账徇M(jìn)行擴(kuò)增。

(c)gpi錨定型tfpi2-kd1用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca-3’(序列號(hào)6，3’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第73～87位的堿基序列相當(dāng))

反向：

5’-catcagtggtgaattctttttctatcctcca-3’(序列號(hào)7，5’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第259～273位的堿基序列相當(dāng))

(d)gpi錨定型tfpi2-kd2用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttgttcccaaagtttgc-3’(序列號(hào)8，3’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第274～288位的堿基序列相當(dāng))

反向：

5’-catcagtggtgaattctttctttggtgcgca-3’(序列號(hào)9，5’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第445～459位的堿基序列相當(dāng))

(e)gpi錨定型tfpi2-kd3用引物

正向：

5’-cgatgacgacaagcttattccatcattttgc-3’(序列號(hào)10，3’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第460～474位的堿基序列相當(dāng))

反向：

5’-catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg-3’(序列號(hào)11，5’末端側(cè)15個(gè)堿基與genbankno.nm＿006528的第691～705位的堿基序列相當(dāng))

(2)通過實(shí)施例1的(2)記載的方法構(gòu)建3種gpi型tfpi2表達(dá)質(zhì)粒。

(3)通過實(shí)施例3記載的方法制備上述3種瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞，鑒定實(shí)施例6記載的10種單克隆抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)。

將由facs解析結(jié)果判明的各抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)示于表1。

[表1]

表1

＜實(shí)施例8＞單克隆抗體制備和利用純化抗體的celisa解析

由實(shí)施例6所建立的10種雜交瘤，通過以下方法制備針對tfpi2的單克隆抗體(抗tfpi2單克隆抗體)并實(shí)施celisa解析。

(1)將實(shí)施例6所建立的雜交瘤培養(yǎng)上清300ml用50％硫酸銨分級，用tbs(tris-bufferedsaline；10mmtris-hcl+150mmnacl(ph7.4))透析后，使用hitrapproteinghp(gehealthcare公司制)通過以下方法進(jìn)行單克隆抗體的純化。

(1-1)將上述柱預(yù)先用pbs(phosphatebuffersaline；10mm磷酸+150mmnacl(ph7.4))進(jìn)行緩沖液置換后，使雜交瘤培養(yǎng)上清以流速10ml/min通過。

(1-2)用柱容量5倍以上的pbs充分洗滌柱，從而進(jìn)行未結(jié)合蛋白質(zhì)的除去。此時(shí)，確認(rèn)從柱中通過的緩沖液的od280下的吸光度為0.01以下，從而判斷沒有殘留未結(jié)合蛋白質(zhì)。

(1-3)洗滌柱后，用洗脫液(100mm甘氨酸(ph2.5))將結(jié)合抗體洗脫。需要說明的是，對于洗脫抗體，迅速添加1/10體積的1mtris(ph8.0)使其呈中性并利用tbs迅速進(jìn)行透析，通過吸光度計(jì)定量各純化抗體的蛋白濃度。

(2)對于作為陽性對照的小鼠抗flagm2抗體(sigma公司制)、作為比較對照的抗tfpi2p-2抗體(santacruz公司制)及上述10種抗tfpi2抗體，按照抗體添加量為200ng/孔～2.5ng/孔的方式用1％fbs/pbs溶液制備抗體稀釋溶液。

(2-1)對上述抗體稀釋溶液用實(shí)施例5的(1)記載的方法實(shí)施celisa解析。需要說明的是，僅在各抗體200ng/孔的情況下，用tfpi2表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞進(jìn)行解析，在66.6ng/孔以下的抗體稀釋溶液的情況下，僅用tfpi2表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行解析。將celisa解析結(jié)果示于圖6。關(guān)于作為陽性對照的抗flag抗體，在tfpi2表達(dá)細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞兩者中都確認(rèn)到明顯的信號(hào)。關(guān)于作為比較對照的抗tfpi2p-2抗體，在tfpi2表達(dá)細(xì)胞中完全未確認(rèn)到信號(hào)，但該抗體為wb用途、即所謂的變性蛋白檢測用，因此在使用具有天然型的高級結(jié)構(gòu)的tfpi2的本解析體系中未確認(rèn)到反應(yīng)性也是理所當(dāng)然的。另一方面，上述10種抗tfpi2抗體雖然確認(rèn)到抗體間差異，但總體上對tfpi2表達(dá)細(xì)胞確認(rèn)到特異性且濃度依賴性信號(hào)。

＜實(shí)施例9＞利用各種單克隆抗體固定化磁珠進(jìn)行的免疫沉淀性能評價(jià)

制備實(shí)施例8所制備的10種抗tfpi2單克隆抗體的抗體固定化磁性微粒，通過以下方法鑒定與各抗體特異性結(jié)合的卵巢透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白質(zhì)。需要說明的是，使用ovise、ovmana及ovsayo這3種作為卵巢透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞。

(1)將實(shí)施例8所得到的純化單克隆抗體的一部分按照常規(guī)方法固定于dynabeadsm-280tosylactivated磁性微粒(invitrogen公司制)后，用含有0.5％bsa的pbs封閉，制備抗體固定化磁性微粒。

(2)免疫沉淀-蛋白質(zhì)印跡法(ip-wb法)

(2-1)將上述3種癌細(xì)胞用含有10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基(和光純藥公司制)在100％鋪滿狀態(tài)下培養(yǎng)3天。

(2-2)對培養(yǎng)上清進(jìn)行離心后，對上清0.1ml分別添加通過實(shí)施例8記載的方法制備的10種抗體固定化磁性微粒，在室溫下攪拌、反應(yīng)1小時(shí)。

(2-3)用pbst-np40(0.1％tween20、1％np40)洗滌2次后，用不含表面活性劑的pbs洗滌3次。

(2-4)對結(jié)合于各抗體固定化磁性微粒的蛋白質(zhì)通過實(shí)施例4的(b)記載的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行解析。需要說明的是，分子量標(biāo)志物使用full-rangerainbowmolecularweightmarkers(ge公司制)，sds-page用凝膠使用10-20％梯度凝膠(marisol公司制)。關(guān)于蛋白質(zhì)印跡的檢測用抗體，將橫浜市立大婦科建立的識(shí)別完整tfpi2的n末端的抗tfpi2肽抗體(參照非專利文獻(xiàn)6)用堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒(同仁化學(xué)公司制)標(biāo)記，通過實(shí)施例4記載的方法進(jìn)行檢測。wb數(shù)據(jù)的解析用chemi-stage附帶的labo1d軟件(kurabo公司制)進(jìn)行，將確認(rèn)到各抗體的強(qiáng)信號(hào)的a或b中的每單位面積的信號(hào)強(qiáng)度數(shù)值化。需要說明的是，本研究實(shí)施3次，關(guān)于面積labo1d軟件解析結(jié)果，計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的信號(hào)平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差。

將ip-wb法的解析像及wb信號(hào)的labo1d軟件解析結(jié)果示于圖7。從培養(yǎng)上清中，在分子量約28000附近和分子量約16000附近檢測到了明顯信號(hào)。由于該wb解析中使用了tfpi2的n末端識(shí)別抗體，因此，分子量約28000附近的信號(hào)(a)與完整tfpi2相當(dāng)，推測分子量約16000附近的信號(hào)(b)為由于某種原因而低分子化的tfpi2片段多肽。此外，確認(rèn)其每單位面積的信號(hào)在抗體間存在差異，確認(rèn)到具有識(shí)別kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗原識(shí)別位點(diǎn)的ts-tf01抗體及ts-tf04抗體中該信號(hào)高的傾向。將含有kunitz結(jié)構(gòu)域1的該tfpi2片段多肽設(shè)為nt-tfpi2。

＜實(shí)施例10＞通過質(zhì)譜法進(jìn)行的單克隆抗體結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定

使用實(shí)施例9中確認(rèn)了與nt-tfpi2親和性高的ts-tf01抗體及ts-tf04抗體、以及作為對照的ts-tf05抗體的共計(jì)3種抗體固定化磁性微粒，進(jìn)行ip-wb的再檢驗(yàn)。此外，對與ts-tf01抗體及ts-tf04抗體結(jié)合的nt-tfpi2多肽，通過質(zhì)譜法進(jìn)行解析。作為卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用實(shí)施例9所制備的ovise及ovmana這2種，使用通過實(shí)施例9記載的方法制備的樣品實(shí)施ip-wb。僅對ovmana樣品如下制備樣品并用于質(zhì)譜。

(1)將ovmana樣品溶液用蒸發(fā)器濃縮后，用sds-page展開，通過ruby染色(invitrogen公司制)將所分離的蛋白質(zhì)染色。

(2)將確認(rèn)染色的分子量約16000附近的3種片段及未確認(rèn)染色的周邊的1種共計(jì)4種片段(ts-tf01：圖8的ruby染色的a及b中記載的片段、ts-tf04：圖8的ruby染色的c及d中記載的片段)切出，使用二硫蘇糖醇及碘乙酰胺還原烷基化后，用胰蛋白酶實(shí)施凝膠內(nèi)消化。

(3)將通過胰蛋白酶消化生成的肽片段，通過使用c18反相柱的1d納米lc系統(tǒng)(ultimate3000、thermofisherscientific公司制)進(jìn)行分離，通過ltqorbitrap質(zhì)譜儀(thermofisherscientific公司制)進(jìn)行ms/ms測定。得到的數(shù)據(jù)使用proteindiscoverer1.3軟件(thermofisherscientific公司制)進(jìn)行解析，相對于swiss-prot數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列進(jìn)行檢索，鑒定蛋白質(zhì)。

將由wb像及ruby染色像及ovmana的分子量約16000附近的ip產(chǎn)物鑒定出的蛋白質(zhì)示于圖8。wb像中，在ovise及ovmana兩者中，通過ts-tf01抗體及ts-tf04抗體兩者在分子量約16000附近確認(rèn)到推定為nt-tfpi2多肽的明顯信號(hào)。ruby染色像中，雖然確認(rèn)到推定為低分子化的tfpi2片段多肽的明顯條帶的分子量有一定上升，但推測是由于樣品濃縮使鹽濃度上升的影響，干擾了電泳。ovmanaip產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明，確認(rèn)明顯染色的a、b及c共3種分子量約16000附近的蛋白為nt-tfpi2。此外，根據(jù)其c末端側(cè)的鑒定肽信息(ffsggch；序列號(hào)12)及n末端識(shí)別抗體的結(jié)果，表明nt-tfpi2多肽是至少含有序列號(hào)1所示的tfpi2蛋白質(zhì)的氨基酸序列的從第23個(gè)殘基的天冬氨酸至第131個(gè)殘基的組氨酸殘基的多肽。

需要說明的是，由于本實(shí)施例中通過特征性消化精氨酸或賴氨酸殘基的胰蛋白酶實(shí)施凝膠內(nèi)消化，從而可以充分地認(rèn)為，本多肽也可以含有比第131個(gè)殘基的組氨酸更靠后的tfpi2蛋白質(zhì)的c末端側(cè)序列。即，本實(shí)施例不限于nt-tfpi2多肽的c末端序列。

＜實(shí)施例11＞tfpi2測定試劑的制備

在實(shí)施例9及實(shí)施例10已經(jīng)確認(rèn)到在透明細(xì)胞腺癌培養(yǎng)上清中存在完整tfpi2及nt-tfpi2兩者，因此按照下述制備了：作為固相側(cè)使用具有識(shí)別kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗原識(shí)別位點(diǎn)的ts-tf04抗體、作為檢測側(cè)使用具有識(shí)別kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗原識(shí)別位點(diǎn)的ts-tf01抗體、從而總括地以完整tfpi2和nt-tfpi2為測定對象的“nt+i-tfpi2測定體系”的測定試劑。此外，按照下述制備了：作為固相側(cè)使用具有識(shí)別kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗原識(shí)別位點(diǎn)的ts-tf04抗體、作為檢測側(cè)使用具有識(shí)別kunitz結(jié)構(gòu)域3的抗原識(shí)別位點(diǎn)的ts-tf05抗體且僅以完整tfpi2為測定對象的“i-tfpi2測定體系”的測定試劑。

(1)使水不溶性鐵素體載體在室溫下物理性吸附抗tfpi2單克隆抗體(ts-tf04)一晝夜而達(dá)到100ng/載體，然后用含有1％bsa的100mmtris緩沖液(ph8.0)在40℃進(jìn)行4小時(shí)封閉，從而制備抗tfpi2抗體固定化載體。

(2)對于抗tfpi2單克隆抗體(ts-tf01或ts-tf05)，用堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒(同仁化學(xué)公司制)制備2種抗tfpi2標(biāo)記抗體。

(3)在透磁性容器(容量1.2ml)中加入(1)所制備的12個(gè)抗體固定化載體后，添加含有0.5μg/ml的(2)所制備的標(biāo)記抗體的緩沖液(含有3％bsa的tris緩沖液、ph8.0)50μl，實(shí)施冷凍干燥，從而制作測定試劑a(使用了ts-tf04抗體/ts-tf01抗體的nt+i-tfpi2測定試劑)及測定試劑b(使用了ts-tf04抗體/ts-tf05抗體的i-tfpi2測定試劑)這2種tfpi2測定試劑。需要說明的是，所制作的tfpi2測定試劑在氮?dú)馓畛湎聦?shí)施密閉密封，在4℃下保管直至測定前。

＜實(shí)施例12＞tfpi2測定試劑的性能評價(jià)

將實(shí)施例4所制作的重組tfpi2上清、實(shí)施例9所制備的ovise及ovmana分別用fbs稀釋10倍而作為含有tfpi2的樣品，僅fbs作為不含tfpi2的樣品，分別制備共計(jì)4種模擬檢體樣品，使用實(shí)施例11所制作的2種tfpi2測定試劑進(jìn)行5個(gè)點(diǎn)的測定，從而對上述試劑進(jìn)行評價(jià)。

評價(jià)用裝置使用了全自動(dòng)酶免疫分析裝置aia-1800(東曹公司制：制造銷售申報(bào)編號(hào)13b3x90002000002)。利用全自動(dòng)酶免疫分析裝置aia-1800的測定如下進(jìn)行：

(1)將稀釋樣品20μl和含有表面活性劑的稀釋液80μl自動(dòng)分注到收容有實(shí)施例11所制作的tfpi2測定試劑的容器中，

(2)在37℃恒定溫度下進(jìn)行10分鐘的抗原抗體反應(yīng)，

(3)用含有表面活性劑的緩沖液進(jìn)行8次洗滌，

(4)添加4-甲基傘形酮磷酸鹽，

將每單位時(shí)間內(nèi)堿性磷酸酶所致的4-甲基傘形酮生成濃度作為測定值(nmol/(l·s))。

將各種模擬檢體樣品的測定值示于表2。除fbs以外的任意模擬檢體樣品的5個(gè)點(diǎn)測定的變異系數(shù)均顯示為3％以下，這證明利用實(shí)施例11所制作的tfpi2測定試劑得到的結(jié)果是可以信賴的。

[表2]

表2

＜實(shí)施例13＞通過各種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清板進(jìn)行的tfpi2測定試劑的檢驗(yàn)

發(fā)明人荒川等對于透明細(xì)胞性、漿液性及粘液性的各種卵巢癌培養(yǎng)細(xì)胞板，通過質(zhì)譜法解析培養(yǎng)上清，通過realtimepcr解析細(xì)胞中的基因表達(dá)，鑒定了tfpi2為僅在透明細(xì)胞性中特征性產(chǎn)生的分子(專利文獻(xiàn)4)。因此，如果實(shí)施例11記載的tfpi2測定試劑也同樣地僅在透明細(xì)胞腺癌培養(yǎng)上清的情況下tfpi2測定值顯示高值，則可以判斷本試劑的測定對象為tfpi2。通過tfpi2測定試劑解析了荒川等所使用的各種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清板。

1)用含有10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基(和光純藥公司制)，將以下細(xì)胞群在100％鋪滿狀態(tài)下培養(yǎng)3天。

透明細(xì)胞性：ovise、ovtoko、ovmana、ovsayo

漿液性：ovkate、ovsaho

粘液性：rmug-s、mcas

2)通過實(shí)施例12記載的方法，將總計(jì)8種培養(yǎng)上清用2種tfpi2測定試劑進(jìn)行解析。

將解析結(jié)果示于圖9。透明細(xì)胞性中，除ovtoko以外的3種均顯示高信號(hào)，而在漿液性及粘液性中則幾乎確認(rèn)不到信號(hào)。此外顯示，測定試劑間的相關(guān)性非常高。該結(jié)果表明，tfpi2測定試劑以tfpi2為測定對象。

＜實(shí)施例14＞通過n-聚糖酶處理進(jìn)行的nt-tfpi2多肽的分子量檢驗(yàn)

根據(jù)uniprot等一般的數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)等目前為止的公知信息可知，tfpi2中在序列號(hào)1所示的氨基酸序列的第116個(gè)殘基及第170個(gè)殘基這兩處天冬酰胺附加有天冬酰胺結(jié)合型糖鏈。因此，根據(jù)實(shí)施例10的結(jié)果可預(yù)測：nt-tfpi2多肽為含有第116個(gè)殘基的天冬酰胺結(jié)合型(n型)糖鏈的糖蛋白，因此使用實(shí)施例10記載的3種抗體以及n-聚糖酶處理區(qū)或未處理區(qū)的實(shí)施例9記載的ovise、ovmana及ovsayo上清進(jìn)行ip-wb，來檢驗(yàn)使用了n-聚糖酶的糖鏈消化處理所引起的nt-tfpi2多肽的分子量變化。同時(shí)，通過使用實(shí)施例11所制作的測定試劑計(jì)算的ip-aia，來檢驗(yàn)上清中tfpi2的ip效率。

(1)對400μl的ovise、ovmana及ovsayo上清設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)區(qū)，一個(gè)試驗(yàn)區(qū)中添加1000u的pngasef(neb公司制)作為n-聚糖酶處理區(qū)，剩余的一個(gè)試驗(yàn)區(qū)作為未處理區(qū)。兩試驗(yàn)區(qū)均在37℃下反應(yīng)16小時(shí)。

(2)使用每1抗體區(qū)100μl的(1)中處理后的上清，設(shè)置作為對照的僅添加磁性微粒的添加區(qū)、和3種抗體固定化磁性微粒添加區(qū)，總計(jì)4試驗(yàn)區(qū)，通過實(shí)施例9記載的方法實(shí)施ip。通過磁體將反應(yīng)后的溶液分離為上清及磁性微粒級分。

(3)用實(shí)施例10記載的2種測定試劑測定上清級分，計(jì)算n-聚糖酶處理對tfpi2測定值的影響及3種抗體的ip效率。ip效率(回收率(％))由100-((2)記載的上清的測定值/抗體未固定的磁性微粒反應(yīng)溶液測定值)計(jì)算。

(4)對于磁性微粒級分，通過實(shí)施例9記載的方法實(shí)施wb，檢測其發(fā)光信號(hào)。

將n-聚糖酶處理對tfpi2測定值的影響及ip回收率、以及wb像示于圖10。

tfpi2的測定值及ip效率在有無n-聚糖酶處理的情況下均沒有變動(dòng)，未確認(rèn)到n-聚糖酶處理引起的反應(yīng)體系的抑制。關(guān)于ip效率，ts-tf04及ts-tf01ip區(qū)中，3種上清和2種測定體系的任一結(jié)果中，回收率均高達(dá)97％以上，表明幾乎完全回收了tfpi2分子。另一方面，ts-tf05ip中，a)nt+i-tfpi2測定試劑的4點(diǎn)平均回收率為74.3％，而b)i-tfpi2測定試劑的4點(diǎn)平均回收率為91.3％，確認(rèn)到顯著性差異。表明ts-tf05識(shí)別不同于ts-tf04及ts-tf01的tfpi2的區(qū)域。

根據(jù)wb結(jié)果，在n-聚糖酶未處理的情況下，ts-tf01抗體及ts-tf04抗體兩者對于3種培養(yǎng)上清均在分子量約16000附近確認(rèn)到推定為nt-tfpi2多肽的明顯信號(hào)。另一方面，在n-聚糖酶處理區(qū)的情況下，3種培養(yǎng)上清中均在分子量約12000附近確認(rèn)到推定為nt-tfpi2多肽的明顯信號(hào)。推定為與ts-tf01抗體及ts-tf04抗體親和性高的、nt-tfpi2多肽的信號(hào)，由于糖鏈消化，分子量明顯減少，因此表明nt-tfpi2多肽受到n型糖鏈修飾。

＜實(shí)施例15＞nt-tfpi2多肽的經(jīng)時(shí)變化的檢驗(yàn)

以闡明nt-tfpi2多肽的產(chǎn)生機(jī)制為目標(biāo)，通過實(shí)施例9記載的ip-wb或?qū)嵤├?4記載的ip-aia法來檢驗(yàn)培養(yǎng)上清中的tfpi2的經(jīng)時(shí)性動(dòng)態(tài)。

(1)在15cm培養(yǎng)皿中對ovise、ovmana及ovsayo細(xì)胞進(jìn)行前培養(yǎng)，直至達(dá)到鋪滿狀態(tài)。

(2)在各培養(yǎng)皿中加入新鮮培養(yǎng)基20ml，對培養(yǎng)24、48、72、及144小時(shí)后的培養(yǎng)上清分別進(jìn)行經(jīng)時(shí)回收。

(3)對于(2)所回收的上述4個(gè)點(diǎn)的上清，每種抗體使用100μl的上清，通過實(shí)施例9記載的方法實(shí)施ip，通過磁體將3種含有抗體固定化磁性微粒的溶液分離成上清及磁性微粒級分。

(4)用實(shí)施例11記載的2種測定試劑對上清級分進(jìn)行測定，測定培養(yǎng)上清中的tfpi2量的經(jīng)時(shí)變化。

(5)由于tfpi2隨著培養(yǎng)時(shí)間而經(jīng)時(shí)提高，因此實(shí)施wb時(shí)需要將回收時(shí)間不同的總計(jì)4個(gè)點(diǎn)的tfpi2量平均化。因此，以(4)的24小時(shí)后的培養(yǎng)上清中的tfpi2測定值為基礎(chǔ)，對此后3個(gè)點(diǎn)的磁性微粒級分的sds-page添加量進(jìn)行適當(dāng)稀釋而調(diào)整各泳道的tfpi2添加量，實(shí)施實(shí)施例9記載的wb。將經(jīng)時(shí)回收的培養(yǎng)上清的tfpi2測定值及wb像示于圖11。

在nt+i-tfpi2測定體系及i-tfpi2測定體系兩者中，確認(rèn)到培養(yǎng)上清中的tfpi2經(jīng)時(shí)增加的傾向。根據(jù)wb結(jié)果，就培養(yǎng)144小時(shí)后回收的上清而言，在ovise及ovmana培養(yǎng)上清中，通過ts-tf01抗體及ts-tf04抗體兩者在分子量約16000附近確認(rèn)到推定為nt-tfpi2多肽的明顯信號(hào)。還明確了：該信號(hào)在ovise及ovmana兩者中均經(jīng)時(shí)增加；該信號(hào)在ovmana中從24小時(shí)后開始存在。

＜實(shí)施例16＞癌細(xì)胞內(nèi)tfpi2分子的檢驗(yàn)

實(shí)施例13及14表明：培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了完整tfpi2及nt-tfpi2多肽，還認(rèn)為該分子也局部存在于細(xì)胞內(nèi)。因此，通過ip-wb法對細(xì)胞內(nèi)的tfpi2分子進(jìn)行了檢驗(yàn)。

1)通過實(shí)施例13記載的方法培養(yǎng)作為透明細(xì)胞性的ovise、ovmana及ovsayo以及作為漿液性的ovkate及ovsaho。

2)制備2m硫脲、7m脲、3％chaps、1％tritonx-100溶液作為細(xì)胞增溶劑，從細(xì)胞培養(yǎng)板除去培養(yǎng)基并用pbs洗滌3次后，將細(xì)胞增溶劑添加于培養(yǎng)板。

3)通過細(xì)胞刮取器剝離細(xì)胞，以15000rpm離心分離20分鐘后，將其上清級分作為細(xì)胞提取液。

4)使用上述細(xì)胞提取液，實(shí)施利用實(shí)施例11記載的2種tfpi2測定試劑的測定、及實(shí)施利用實(shí)施例9記載的3種抗體的ip-wb。

將利用tfpi2測定試劑的解析結(jié)果及wb像示于圖12。表明即便在細(xì)胞內(nèi)，tfpi2的表達(dá)特異性也表現(xiàn)出與培養(yǎng)上清同樣的透明細(xì)胞性特異性。此外，細(xì)胞內(nèi)的情況下，在分子量24000到31000之間確認(rèn)到2條明顯信號(hào)。根據(jù)分子量，推測該信號(hào)為附加有糖鏈的完整tfpi2及未附加糖鏈的完整tfpi2。另一方面，與nt-tfpi2相當(dāng)?shù)姆肿恿?6000附近的信號(hào)在檢測限以下。該結(jié)果表明：細(xì)胞內(nèi)存在大量的完整tfpi2分子，但nt-tfpi2則可能是極微量的或不存在。

實(shí)施例14、15、16表明：nt-tfpi2多肽為由透明細(xì)胞腺癌產(chǎn)生的具有n型糖鏈的在分子量約16000附近分級出的糖蛋白多肽，產(chǎn)生到培養(yǎng)上清中并隨著時(shí)間而蓄積，在癌細(xì)胞內(nèi)與完整tfpi2相比極微量或者不表達(dá)。可以認(rèn)為，nt-tfpi2的產(chǎn)生機(jī)制是分泌到細(xì)胞外后由于某些原因而受到加工。

＜實(shí)施例17＞孕婦血清檢體的tfpi2測定

本實(shí)施例中使用的62例孕婦血清檢體(由promeddx公司購買的檢體)為包括孕早期～孕晚期的妊娠5周～40周的檢體，任一檢體均為簽訂了書面的知情同意書的歐美人血清檢體。

使用全自動(dòng)酶免疫分析裝置aia-1800(東曹公司制)作為評價(jià)用裝置，使用實(shí)施例11所制作的a)nt+i-tfpi2測定試劑及b)i-tfpi2測定試劑這2種進(jìn)行測定。

將tfpi2測定值的箱線圖(boxplot)示于圖13，將各測定試劑的孕早期、孕中期及孕晚期的最小值、25％、中位數(shù)、75％、最大值、95％置信區(qū)間的濃度范圍示于表3。tfpi2測定值與妊娠周數(shù)和血中濃度顯示高相關(guān)性，因此表明：實(shí)施例11所制作的2種測定試劑均以檢體中的tfpi2為測定對象。

[表3]

表3

＜實(shí)施例18＞卵巢癌檢體的tfpi2測定

將本實(shí)施例中使用的檢體板(123例)示于表4。該檢體為橫浜市立大婦科按照同一程序收集的血清檢體，均得到了知情同意且得到橫浜市立大學(xué)倫理委員會(huì)的許可。

[表4]

表4

使用全自動(dòng)酶免疫分析裝置aia-1800(東曹公司制)作為評價(jià)用裝置，使用實(shí)施例11所制作的2種tfpi2測定試劑及ca125測定試劑(東曹公司制、許可編號(hào)20700amz00504000)進(jìn)行測定。

將nt+i-tfpi2測定體系及i-tfpi2測定體系的tfpi2測定值及ca125測定值示于圖14。ca125在全部卵巢惡性腫瘤中均顯示為高值傾向，而nt+i-tfpi2測定體系及i-tfpi2測定體系的測定值在透明細(xì)胞腺癌中顯示高值傾向。

將該板解析結(jié)果分為良性卵巢腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、交界惡性腫瘤、透明細(xì)胞腺癌、其它惡性卵巢腫瘤這5類的結(jié)果示于圖15，將2種tfpi2測定值及ca125測定值的各組中的最小值、25％、中位數(shù)、75％、最大值、95％置信區(qū)間的濃度范圍示于表5。與良性卵巢腫瘤相比，ca125在子宮內(nèi)膜異位癥中顯示高值，進(jìn)而在全部惡性腫瘤中顯示出明顯的高值傾向。ca125為子宮內(nèi)膜異位癥的輔助標(biāo)志物，因此在作為良性腫瘤的子宮內(nèi)膜異位癥中顯示高值是合理的。由于在透明細(xì)胞腺癌和其它惡性卵巢腫瘤之間中位數(shù)幾乎相等，因此可以說ca125不能區(qū)分透明細(xì)胞腺癌。另一方面，nt+i-tfpi2測定體系及i-tfpi2測定體系的測定值僅在透明細(xì)胞腺癌中確認(rèn)到高值傾向，nt+i-tfpi2測定體系的測定值顯示出更高值傾向。

[表5-1]

表5-1

[表5-2]

表5-2

將卵巢透明細(xì)胞腺癌組及其它卵巢腫瘤組間的nt+i-tfpi2測定體系、i-tfpi2測定體系及ca125測定數(shù)據(jù)的受試者動(dòng)態(tài)特征(roc)曲線解析的結(jié)果示于圖16；將auc(areaunderthecurve、roc曲線下面積)及差異顯著性檢驗(yàn)中的p值示于表6。卵巢透明細(xì)胞腺癌組及其它卵巢腫瘤組間的2種tfpi2測定值的差異顯著性均顯示為p＜0.0002，確認(rèn)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，因此表明2種tfpi2測定試劑與ca125相比在卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢測中有用。此外表明：包括地測定完整tfpi2及nt-tfpi2的nt+i-tfpi2測定體系的p值以及auc均超過僅測定完整tfpi2的i-tfpi2測定體系。

[表6]

表6

然后，將tfpi2基準(zhǔn)值(cutoff值)設(shè)為由上述roc解析所得到的值、且將ca125的基準(zhǔn)值設(shè)為一般基準(zhǔn)值附近的36u/ml，將這種情況下的卵巢透明細(xì)胞腺癌組及其它卵巢腫瘤組間的靈敏度(sensitivity)及特異度(specificity)示于表7。雖然對于ca125為不利條件，但至少在以透明細(xì)胞腺癌的特異性診斷為目的的情況下，tfpi2的有用性是明確的。此外表明：a)nt+i-tfpi2測定試劑的特異度高于b)i-tfpi2測定試劑。

[表7]

表7

將tfpi2設(shè)為上述基準(zhǔn)值且將ca125設(shè)為作為一般基準(zhǔn)值的35u/ml，將這種情況下的實(shí)施例17記載的全部臨床檢體的陽性率示于表8。a)nt+i-tfpi2測定試劑在該板中假陽性極低，且能夠以高的概率判斷透明細(xì)胞腺癌陽性，表明具有作為透明細(xì)胞腺癌診斷標(biāo)志物的性能。

[表8]

表8

＜實(shí)施例19＞通過質(zhì)譜法進(jìn)行的nt-tfpi2多肽的c末端序列解析

通過使用了重氧水的質(zhì)譜法，對nt-tfpi2多肽的c末端序列進(jìn)行解析。

使用實(shí)施例9所制備的ovmana作為卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用ts-tf01抗體柱，按照下述方式制備質(zhì)譜用樣品。

(1)使用hitrapnhs柱(gehealthcare公司制)和ts-tf01抗體，按照常規(guī)方法制作ts-tf01抗體結(jié)合柱。

(2)用注射器使ovmana培養(yǎng)上清10ml通入抗體柱3次，用tbs進(jìn)行3次洗滌。

(3)使0.1m甘氨酸(ph2.0)溶液1ml通入抗體柱3次，回收抗體柱結(jié)合級分溶液。

(4)將抗體柱結(jié)合級分溶液用三氯乙酸濃縮后，用sds-page展開，通過sypro-ruby染色(invitrogen公司制)進(jìn)行染色。

(5)將確認(rèn)了染色的總計(jì)3種(圖17a：sypro-ruby染色的#1～#3中記載的片段)的凝膠片段切出，用乙腈脫水后，用v8蛋白酶(sigma公司制)進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。此時(shí)，為了由質(zhì)量信息區(qū)分所得到的c末端序列是通過凝膠內(nèi)消化產(chǎn)生的、還是通過細(xì)胞的加工作用產(chǎn)生的，在將通常的超純水(h2o¹⁶)和重氧水(h2o¹⁸)以1：1的比例混合而成的10mm碳酸氫銨水溶液中進(jìn)行凝膠內(nèi)消化反應(yīng)。

(6)將肽消化物用與c18反相納米lc系統(tǒng)相連的三重tof5600質(zhì)譜儀(absciex公司制)進(jìn)行分析。測定數(shù)據(jù)使用proteinpilot軟件(absciex公司制)相對于swiss-prot數(shù)據(jù)庫上的氨基酸序列進(jìn)行檢索，從而鑒定氨基酸序列。

將抗體柱結(jié)合級分的sypro-ruby染色像示于圖17a，將由條帶#1～#3鑒定的序列信息定位于tfpi2氨基酸序列上的結(jié)果示于圖17b，將由條帶#3檢測的代表性的來自tfpi2的肽的前體離子的質(zhì)譜示于圖17c，將對應(yīng)的離子鑒定信息示于表9。表明抗體柱結(jié)合級分的在sypro-ruby染色像中顯示強(qiáng)信號(hào)的28kda(#1)、24kda(#2)、及17.5kda(#3)的條帶均為tfpi2肽。關(guān)于置信值99以上、且n末端的最前方具有谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)殘基的肽(不包括緊接著分泌信號(hào)序列的23daaqeptgnnae34(序列號(hào)13))中，僅從#3檢出了124kffsggch131(序列號(hào)15)、及124kffsggc130(序列號(hào)16)。

[表9]

表9

在目的在于鑒定c末端序列的本實(shí)施例中，在利用v8蛋白酶進(jìn)行的凝膠內(nèi)消化的實(shí)驗(yàn)體系中，使用將超純水(h2o¹⁶)和重氧水(h2o¹⁸)以1：1混合的水溶液。在凝膠內(nèi)進(jìn)行了蛋白酶消化的肽的c末端以同等程度被o¹⁶和o¹⁸標(biāo)記，而細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)通過加工作用產(chǎn)生的c末端則未被o¹⁸標(biāo)記。

根據(jù)本實(shí)施例中檢出的肽的前體離子的質(zhì)譜的代表例(圖17c)、及對應(yīng)的離子鑒定信息(表9)而設(shè)想為內(nèi)部肽的23daaqeptgnnae34(序列號(hào)13)、81acddacwrie90(序列號(hào)14)中，同時(shí)檢測、鑒定了c末端被o¹⁸標(biāo)記的生成肽和通常的由o¹⁶生成的肽。例如圖17c所示，關(guān)于23daaqeptgnnae34(序列號(hào)13)，分別檢測了被o¹⁶及o¹⁸標(biāo)記的m/z608.76及m/z609.76的2價(jià)離子的單同位素離子，以它們所對應(yīng)的同位體混在的形式檢出了前體離子。81acddacwrie90(序列號(hào)14)時(shí)也同樣，該數(shù)據(jù)表明這些肽并非為c末端，證明了主旨在于鑒定c末端序列的本解析體系的妥當(dāng)性。

另一方面，作為用o¹⁶標(biāo)記而生成的肽，檢測、鑒定了124kffsggch131(序列號(hào)15)、124kffsggc130(序列號(hào)16)、及203dckracakalk212(序列號(hào)17)，但未檢測用o¹⁸標(biāo)記而生成的肽。因此，強(qiáng)烈暗示nt-tfpi2多肽的c末端序列為his131或cys130。

由本說明書的實(shí)施例綜合考察，通過蛋白質(zhì)印跡而檢測的全長tfpi2相當(dāng)于條帶#1和條帶#2，n末端為asp23、c末端為lys212，lys212之后的序列由于某些理由而被切斷。條帶#1和條帶#2在sds-page上的移動(dòng)度不同這一點(diǎn)，可能起因于tfpi2的糖鏈結(jié)構(gòu)的差異。另一方面明確了：通過wb檢測的17.5kda的nt-tfpi2多肽相當(dāng)于條帶#3，n末端與全長tfpi2相同為asp23，c末端為his131或cys130。

此外，由條帶#3還檢測了位于全長tfpi2的c末端側(cè)的203dckracakalk212(序列號(hào)17)，因此表明：條帶#3中，nt-tfpi2和具有從arg132起的c末端序列的多肽、即所謂的ct-tfpi2是混在的。但是，nt-tfpi2多肽的c末端序列是由利用重氧水法的質(zhì)量信息定義的，并不否定該結(jié)論的妥當(dāng)性。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

根據(jù)本發(fā)明，提供一種卵巢透明細(xì)胞腺癌的新的檢測標(biāo)志物，此外，提供一種在具有多樣的組織型的良性卵巢腫瘤及惡性卵巢腫瘤中，以高靈敏度和特異度僅檢測卵巢透明細(xì)胞腺癌的方法。這些適合用于卵巢透明細(xì)胞腺癌的篩選及術(shù)后后續(xù)觀察、或子宮內(nèi)膜異位癥的后續(xù)觀察等用途，在產(chǎn)業(yè)上非常有用。

序列表

<110>公立大學(xué)法人橫濱市立大學(xué)(publicuniversitycorporationyokohamacityuniversity)

東曹株式會(huì)社(tosohcorporation)

<120>卵巢透明細(xì)胞腺癌的檢查方法及檢查藥

<130>15450

<150>jp2014-239433

<151>2014-11-27

<160>17

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>235

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>1

metaspproalaargproleuglyleuserileleuleuleupheleu

151015

thrglualaalaleuglyaspalaalaglngluprothrglyasnasn

202530

alagluilecysleuleuproleuasptyrglyprocysargalaleu

354045

leuleuargtyrtyrtyraspargtyrthrglnsercysargglnphe

505560

leutyrglyglycysgluglyasnalaasnasnphetyrthrtrpglu

65707580

alacysaspaspalacystrpargileglulysvalprolysvalcys

859095

argleuglnvalservalaspaspglncysgluglyserthrglulys

100105110

tyrphepheasnleusersermetthrcysglulysphephesergly

115120125

glycyshisargasnargilegluasnargpheproaspglualathr

130135140

cysmetglyphecysalaprolyslysileproserphecystyrser

145150155160

prolysaspgluglyleucysseralaasnvalthrargtyrtyrphe

165170175

asnproargtyrargthrcysaspalaphethrtyrthrglycysgly

180185190

glyasnaspasnasnphevalserarggluaspcyslysargalacys

195200205

alalysalaleulyslyslyslyslysmetprolysleuargpheala

210215220

serargilearglysilearglyslysglnphe

225230235

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2正向引物

<400>2

cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca31

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2反向引物

<400>3

catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg31

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>分泌tfpi2正向引物

<400>4

cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca31

<210>5

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>分泌tfpi2正向引物

<400>5

agcatcagtggtgaattctcattagtggcgacgcagaactttgcaaaattgcttcttccg60

<210>6

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2-kd1正向引物

<400>6

cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca31

<210>7

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2-kd1反向引物

<400>7

catcagtggtgaattctttttctatcctcca31

<210>8

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2-kd2正向引物

<400>8

cgatgacgacaagcttgttcccaaagtttgc31

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2-kd2反向引物

<400>9

catcagtggtgaattctttctttggtgcgca31

<210>10

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2-kd3正向引物

<400>10

cgatgacgacaagcttattccatcattttgc31

<210>11

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gpi錨定型tfpi2-kd3反向引物

<400>11

catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg31

<210>12

<211>7

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>12

phepheserglyglycyshis

15

<210>13

<211>12

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>13

aspalaalaglngluprothrglyasnasnalaglu

1510

<210>14

<211>10

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>14

alacysaspaspalacystrpargileglu

1510

<210>15

<211>8

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>15

lysphepheserglyglycyshis

15

<210>16

<211>7

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>16

lysphepheserglyglycys

15

<210>17

<211>11

<212>prt

<213>人類(homosapiens)

<400>17

aspcyslysargalacysalalysalaleulys

1510