本發(fā)明涉及與l1結(jié)合的結(jié)合分子、編碼所述結(jié)合分子的核酸、其用途以及包含所述結(jié)合分子的藥物組合物，所述結(jié)合分子能夠結(jié)合至被單克隆抗體l1-ov52.24識(shí)別的相同的l1表位，和/或所述結(jié)合分子與單克隆抗體l1-ov52.24競(jìng)爭(zhēng)性地與l1結(jié)合，其中l(wèi)1-ov52.24的輕鏈可變部分包含如seqidno:1所示的序列或其中輕鏈由seqidno:3編碼，以及其中l(wèi)1-ov52.24的重鏈可變部分包含如seqidno:2所示的序列或其中重鏈由seqidno:4編碼。

單克隆抗體(mab)已成為癌癥治療的新的重要支柱[1]。在過(guò)去二十年中，分子生物學(xué)提供了制備用于治療主要惡性疾病的嵌合、人源化或全人抗體的方法[2]。迄今為止，多種抗體和抗體綴合物已批準(zhǔn)作為癌癥療法在歐洲和美國(guó)上市銷售[3,4]。其包括未經(jīng)修飾的抗體、抗體藥物綴合物、以及放射性核素的綴合物和雙特異性抗體[5]。然而，眾所周知針對(duì)給定癌癥抗原的mab在其靶向癌細(xì)胞的能力方面可能有所不同。

在最近的工作中，我們發(fā)現(xiàn)了l1cam(也稱為l1)可能是人類癌癥的優(yōu)異靶分子。l1cam在多種人類癌癥中過(guò)表達(dá)，帶來(lái)癌癥預(yù)后不良，以及增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。來(lái)自異種移植[6]和人l1cam轉(zhuǎn)基因小鼠[7]模型的結(jié)果表明，l1cammabl1-9.3(也稱為mab9.3)可能會(huì)成為一種有前景的癌癥治療工具。這種mab與l1cam分子的1.ig-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且具有良好的adcc功能[6]。最近的結(jié)果表明這種mab的igg2a型非常適于激活免疫系統(tǒng)，并募集免疫效應(yīng)細(xì)胞，導(dǎo)致癌細(xì)胞的消除[6,7]。因此，有充分的證據(jù)表明，這種mab特別適于adcc依賴性效應(yīng)機(jī)制，其代表mab依賴性腫瘤療法的一種重要手段。

wo2008/151819[12]公開(kāi)了與l1的第一ig結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位結(jié)合的抗-l1抗體9.3。

抗體-藥物綴合物方面的最新進(jìn)展需要具有迅速內(nèi)化特征的mab。眾所周知，l1cam特異性抗體的結(jié)合將導(dǎo)致l1cam內(nèi)化，隨后導(dǎo)致靶分子的再循環(huán)或降解[8]。l1cam分子的內(nèi)化特征與多種其他細(xì)胞表面分子具有共同之處。事實(shí)上，已知l1cam的內(nèi)化是l1cam介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控所需的[9-11]。

已在多個(gè)出版物中報(bào)道了抗體誘導(dǎo)的l1cam內(nèi)化(大多使用多克隆抗體)，但是還沒(méi)有人使用mab進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)研究。因此，目前尚不知曉，l1cam分子上不同表位的參與是否將導(dǎo)致不同的內(nèi)化速率。我們現(xiàn)已生成了一種與fniii-4-5結(jié)合的l1cam特異性mab，并將其稱為mabl1-ov52.24(或ov52.24)。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)這種mab與此前表征的mabl1-9.3相比，具有更好的內(nèi)化速率。我們進(jìn)一步驚奇地發(fā)現(xiàn)，mabl1-ov52.24分別與抗-l1cam單克隆抗體5g3和uj127.11相比，具有更好的內(nèi)化速率。l1-ov52.24這些獨(dú)特的性質(zhì)將使藥物向癌細(xì)胞的遞送得以改善和加速。

盡管本發(fā)明抗體l1-ov52.24的一些特征已經(jīng)部分地有所描述(參見(jiàn)[6])，但是本發(fā)明抗體的抗體本身或互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)的序列從未公開(kāi)或向公眾開(kāi)放。

許多治療活性劑僅在細(xì)胞內(nèi)有效。這樣如果此類治療活性劑不能以非修飾形式進(jìn)入細(xì)胞，就會(huì)帶來(lái)問(wèn)題。因此，需要例如單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段這樣的結(jié)合劑，其可有效內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并可因此將與結(jié)合劑連接的藥劑靶向至腫瘤細(xì)胞。

如實(shí)施例中所示，通過(guò)對(duì)分別與l1-ov52.24孵育40、60、70或90分鐘的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡分析和成像流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體l1-ov52.24令人驚奇地顯示出迅速有效地內(nèi)化進(jìn)入攜帶l1的此類細(xì)胞。

因此，此類單克隆抗體或其他結(jié)合分子(如與l1結(jié)合的，以及與l1上l1-ov52.24所識(shí)別的同一表位結(jié)合的抗體)在生物技術(shù)研究、診斷或治療領(lǐng)域具有令人驚奇的優(yōu)勢(shì)。特別地，可以將活性劑連接至本發(fā)明的結(jié)合分子，其通過(guò)內(nèi)化攝取進(jìn)入細(xì)胞。然后，此類活性劑可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮所需的作用，如細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖抑制作用。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種與l1結(jié)合的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子能夠結(jié)合至l1上單克隆抗體l1-ov52.24所識(shí)別的同一表位，其中l(wèi)1-ov52.24的輕鏈可變部分包含優(yōu)選地具有如seqidno:1所示的序列，或其中輕鏈由seqidno:3編碼，以及其中l(wèi)1-ov52.24的重鏈可變部分包含優(yōu)選地具有如seqidno:2所示的序列，或其中重鏈由seqidno:4編碼。

seqidno:1涉及vj結(jié)構(gòu)域，即l1-ov52.24輕鏈的可變部分。輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域公知的并且其鼠源性cdna序列如下所示。

seqidno:2涉及vdj結(jié)構(gòu)域，即l1-ov52.24重鏈的可變部分。重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域公知的并且其鼠源性cdna序列如下所示。

l1(也稱為l1cam)是一種跨膜蛋白；其是一種200-220kda的神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子(l1蛋白家族成員)，并且參與軸突導(dǎo)向(axonguidance)和細(xì)胞遷移，這在對(duì)治療產(chǎn)生抗性的癌癥中意義重大。本發(fā)明所述的l1優(yōu)選地理解為哺乳動(dòng)物l1蛋白，更有選地理解為人或小鼠l1蛋白。人l1蛋白的genbank條目為np_000416，小鼠的l1蛋白的genbank條目為np_032504。l1cam也被稱為cd171。

表位是被抗體或相關(guān)結(jié)合分子識(shí)別的抗原的一部分。例如，表位是與抗體結(jié)合的抗原的特異性片段。表位可以是構(gòu)象表位或線形表位。構(gòu)象表位由抗原氨基酸序列的不連續(xù)部分組成。這些表位基于抗原的3-d表面特征和形狀或三級(jí)結(jié)構(gòu)與互補(bǔ)位相互作用。構(gòu)象表位的比例是未知的。

在實(shí)施例中顯示了l1-ov52.24結(jié)合至并識(shí)別l1的纖連蛋白iii4-5結(jié)構(gòu)域中的表位。在現(xiàn)有技術(shù)(wolterink等，cancerres.(2010),70:2504-2515)中和實(shí)施例中描述了確定被結(jié)合分子結(jié)合和識(shí)別的表位的方法。如在實(shí)施例中所示，優(yōu)選地通過(guò)構(gòu)建一系列攜帶不同ig結(jié)構(gòu)域的l1-fc蛋白確定被識(shí)別的表位。為了根據(jù)該實(shí)施例進(jìn)行精細(xì)定位，可以使用重組的v5標(biāo)記的l1片段，如gouveia等(proteinexpr.purif.(2007)52:182-193)中所述的范例?？梢栽谟糜诒砦欢ㄎ坏膃lisa或western印跡分析中使用重組蛋白。mabsl1-ov52.24與l1的4-5fniii結(jié)構(gòu)域反應(yīng)。在通常情況下，用于確定給定抗體的表位的方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括制備目標(biāo)給定區(qū)的合成線性肽，以及隨后測(cè)試抗體是否與所述肽結(jié)合(參見(jiàn)epitopemapping,apracticalapproach,oxforduniversitypress2001，編輯：olwynwestwood和frankhay)?；蛘?，可以制備覆蓋目標(biāo)區(qū)的不同的重組蛋白并測(cè)試其與抗體的結(jié)合(oleszewski,m.,gutwein,p.,vonderlieth,w.,rauch,u.,altevogt,p.characterizationofthel1-neurocanbindingsite.implicationsforl1-l1homophilicbinding.j.biol.chem.275:34478-34485(2000))。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種結(jié)合分子，所述結(jié)合分子與單克隆抗體l1-ov52.24競(jìng)爭(zhēng)性地與l1的結(jié)合，其中l(wèi)1-ov52.24的輕鏈可變部分優(yōu)選地包含具有如seqidno:1所示的序列，或其中輕鏈由seqidno:3編碼，以及其中l(wèi)1-ov52.24的重鏈優(yōu)選地包含具有seqidno:2所示的序列，或其中重鏈由seqidno:4編碼。

可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的實(shí)驗(yàn)確定競(jìng)爭(zhēng)，如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

l1-ov52.24的輕鏈(vj結(jié)構(gòu)域，無(wú)恒定結(jié)構(gòu)域；即可變部分)蛋白序列如下所示：

根據(jù)kabat確定的l1-ov52.24的輕鏈(vj結(jié)構(gòu)域)cdr序列如下所示：

cdr-l1(或lcdr1)：kasqnvgtnva(seqidno:5)

cdr-l2(或lcdr2)：stsyrys(seqidno:6)

cdr-l3(或lcdr3)：qqyntypyt(seqidno:7)

l1-ov52.24的重鏈(vdj結(jié)構(gòu)域，無(wú)恒定結(jié)構(gòu)域；即可變部分)蛋白序列如下所示：

根據(jù)kabat確定的cdr序列以下劃線顯示。

根據(jù)kabat確定的l1-ov52.24的重鏈(vdj結(jié)構(gòu)域)cdr序列如下所示：

cdr-h1(或hcdr1)：fnikdyymq(seqidno:8)

cdr-h2(或hcdr2)：widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)

cdr-h3(或hcdr3)：wnplaf(seqidno:10)

l1-ov52.24單克隆抗體的免疫球蛋白基因的cdna序列如下所示：

編碼：5’utr(部分，即只有已測(cè)序部分)，前導(dǎo)序列，igkv/igkj或ighv/ighd/ighj，igkc或ighc

重鏈

ctgcctcatgaatatgcaaacatgagtctgtgattataaatacagagatatccataccaaacaacttatgagcactgttttctctacagtcactgaatctcaaggtccttacaatgcaatgcagctgggtcatcttcttcctgatggcagtggttacaggggtcaattcagaggttcagctgcagcagtctggggctgagcttgtgaggccaggggccttagtcaagttgtcctgcaaagcttctggcttcaacattaaagactactatatgcagtgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggagtggattggatggattgatcctgagaatggtaaaacagtttttgacccgaagttccggggcaaggccagtatatcagcggacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtgctagatggaacccccttgccttctggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctggagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagccctcggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatgaacacgaatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga(seqidno:4)

輕鏈

tttgatgactgctttgcatagatccctagaggccagcccagctgcccatgatttataaaccaggtctttgcagtgagatctgaaatacatcagatcagcatgggcatcaagatggagtcacagactcaggtctttgtatacatgttgctgtggttgtctggtgttgatggagacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtggcctggtatcaacagaaaccaggtcactctcctaaagcactgatttactcgacatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatccgcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtacttctgtcagcaatataacacctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag(seqidno:3)

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

將結(jié)合分子理解為多肽，所述多肽顯示出與指定靶點(diǎn)特異性結(jié)合。本發(fā)明中的靶點(diǎn)是蛋白l1。因此本發(fā)明的結(jié)合分子與l1特異性結(jié)合。優(yōu)選地，結(jié)合分子是包含免疫球蛋白的分子，即包含至少一個(gè)ig結(jié)構(gòu)域或抗-l1抗體。

將“特異性結(jié)合”理解為通過(guò)例如western印跡分析或elisa檢測(cè)，結(jié)合分子與l1的結(jié)合比與對(duì)照蛋白如白蛋白的結(jié)合強(qiáng)至少50倍，優(yōu)選地至少100倍。

如在本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗-l1抗體”指與天然存在的抗體具有結(jié)構(gòu)相似性并且能夠與l1結(jié)合的任意多肽，其中結(jié)合特異性由多肽的cdr決定。因此，“抗-l1抗體”旨在指與l1結(jié)合的來(lái)源于免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)。將抗原結(jié)合片段理解為包含全長(zhǎng)抗體中的至少一個(gè)抗原結(jié)合片段的多肽。抗原結(jié)合片段至少由重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域組成，以兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在一起能夠與特定抗原結(jié)合的方式排布。

單克隆抗體是相同的單特異性抗體，因?yàn)槠溆删鶠閱我挥H代細(xì)胞克隆的一種類型的免疫細(xì)胞產(chǎn)生?！皢慰寺】贵w”和單克隆抗體的生產(chǎn)屬于現(xiàn)有技術(shù)。在通常情況下，單克隆抗體能夠例如根據(jù)winter&milstein(winter,g.&milstein,c.(1991)nature,349,293-299)的公知方法制備?？梢酝ㄟ^(guò)用目標(biāo)多肽篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如抗體噬菌體展示文庫(kù))鑒定和分離針對(duì)本發(fā)明多肽的單克隆抗體，代替制備分泌單克隆抗體的雜交瘤。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒是市售的(例如pharmaciarecombinantphageantibodysystem，目錄號(hào)27-9400-01；以及stratagenesurfzapphagedisplaykit，目錄號(hào)240612)。此外，特別適于在產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)中使用的方法和試劑的實(shí)例可以參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,223,409；wo92/18619；wo91/17271；wo92/20791；wo92/15679；wo93/01288；wo92/01047；wo92/09690；wo90/02809；fuchs等，1991,bio/technology9:1370-1372；hay等，1992,hum.antibod.hybridomas3:81-85；huse等，1989,science246:1275-1281；griffiths等，1993,emboj.12:725-734。

“全長(zhǎng)”或“完全”抗體指包含通過(guò)二硫鍵彼此連接的兩條重鏈(h)和兩條輕鏈(l)的蛋白，其包含(1)就重鏈而言，可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)，所述重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3；以及(2)就輕鏈而言，輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，所述輕鏈恒定區(qū)包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域cl。關(guān)于術(shù)語(yǔ)“完整抗體”，是指具有天然存在抗體的典型總體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(即包含具有3個(gè)或4個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈和具有1個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的輕鏈以及相應(yīng)的可變結(jié)構(gòu)域)的任何抗體，即使每個(gè)結(jié)構(gòu)域可以包含進(jìn)一步的修飾，如突變、缺失或插入，其不改變總體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。例如，mabl1-ov52.24是全長(zhǎng)抗體。

單克隆抗體的“抗原結(jié)合片段”是單克隆抗體的片段，其顯示出與作為該片段來(lái)源的完整單克隆抗體基本相同的功能和特異性。使用木瓜蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解消化將ig原型切割為3個(gè)片段。分別含有一條完整的l鏈和約半條h鏈的兩個(gè)相同的氨基末端片段是抗原結(jié)合片段(fab)。第三個(gè)片段在尺寸上相似，但含有具有鏈間二硫鍵的兩條重鏈羧基末端的半段，為可結(jié)晶片段(fc)。fc含有碳水化合物、補(bǔ)體結(jié)合和fcr結(jié)合位點(diǎn)。限制性胃蛋白酶消化產(chǎn)生含有兩個(gè)fab片段的單一f(ab')2片段以及包括h-h鏈間二硫鍵的鉸鏈區(qū)?？梢郧懈頵(ab')2的二硫鍵以獲得fab'。而且，可以將重鏈和輕鏈可變區(qū)融合在一起形成單鏈可變片段(scfv)。

由于第一代全尺寸抗體存在一些問(wèn)題，因而很多第二代抗體僅包含抗體的片段。可變結(jié)構(gòu)域(fv)是具有由一個(gè)vl和一個(gè)vh組成的完整抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小片段。僅具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的此類片段能夠由酶促方法或者例如在細(xì)菌和真核細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)基因片段來(lái)產(chǎn)生?？梢允褂貌煌椒?，例如僅用fv片段，或用'fab'-片段，所述'fab'-片段包含包括fv和第一恒定結(jié)構(gòu)域的“y”的上臂之一。通常通過(guò)在兩條鏈之間引入導(dǎo)致產(chǎn)生單鏈fv(scfv)的多肽連接來(lái)穩(wěn)定這些片段?；蛘呖梢允褂枚蜴I連接的fv(dsfv)片段。片段的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與任意恒定結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生全長(zhǎng)抗體或者可以與其他蛋白或多肽融合。

重組抗體片段是單鏈fv(scfv)片段。在通常情況下，其針對(duì)其抗原具有較高親和性并且能夠在多種宿主中表達(dá)。這些和其他性質(zhì)使得scfv片段不僅適用于醫(yī)藥，而且還具有在生物技術(shù)方面應(yīng)用的潛力。如上文所詳細(xì)描述的，在scfv片段中vh和vl結(jié)構(gòu)域通過(guò)親水性和柔性肽接頭連接在一起，由此提高了表達(dá)和折疊效率。通常使用約15個(gè)氨基酸的接頭，其中最經(jīng)常使用(gly4ser)3接頭。取決于所用的接頭，scfv分子可能易于被蛋白水解降解。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，事實(shí)上這些局限性能夠通過(guò)專注于對(duì)功能和穩(wěn)定性的改進(jìn)的研究來(lái)克服。一個(gè)實(shí)例是產(chǎn)生二硫鍵穩(wěn)定的(或二硫鍵連接的)fv片段，其中vh-vl二聚體通過(guò)鏈間二硫鍵穩(wěn)定。在vl與vh結(jié)構(gòu)域之間的界面引入半胱氨酸形成二硫鍵，其將兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起。

scfv的解離導(dǎo)致產(chǎn)生單體scfv，可以將其復(fù)合成二聚體(二體)、三聚體(三體)或更大的聚集物如tandab(串聯(lián)雙特異性抗體)和柔性體(flexibody)。

可以通過(guò)用簡(jiǎn)單的多肽連接將兩個(gè)scfv(scfv)2結(jié)合或通過(guò)將兩個(gè)單體二聚化(二體)，形成具有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體。最簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)是具有兩個(gè)功能性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二體，所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以是相同的、相似的(二價(jià)二體)或具有針對(duì)不同抗原的特異性(雙特異性二體)。

另外，已研發(fā)出了具有4個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和4個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體形式。該抗體形式的實(shí)例包括四價(jià)雙特異性抗體(tandab和柔性體，affimedtherapeuticsag,德國(guó)海德堡)。與雙特異性二體相反的是，雙特異性tandab是僅由一種多肽組成的同型二聚體。由于具有兩個(gè)不同的鏈，因而二體能夠形成三種不同的二聚體，其中僅一種是有功能的。因此，生產(chǎn)和純化這種均質(zhì)產(chǎn)品更加簡(jiǎn)單廉價(jià)。而且，在體內(nèi)tandab通常顯示出更好的結(jié)合性質(zhì)(具有兩倍數(shù)量的結(jié)合位點(diǎn))和更高的穩(wěn)定性。柔性體是scfv與二體多聚體基序的組合，結(jié)果產(chǎn)生具有高度柔性的多價(jià)分子，用于將在細(xì)胞表面上彼此之間距離十分遠(yuǎn)的兩個(gè)分子連接在一起。如果存在兩個(gè)以上有功能的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且如果其對(duì)不同抗原具有特異性，則抗體是多特異性的。

綜上所述，特異性免疫球蛋白(特定的公開(kāi)序列可插入其中或者形成其主要部分)包括但不限于以下結(jié)合分子，其形成了本發(fā)明的特定實(shí)施方式：fab(具有可變輕鏈(vl)、可變重鏈(vh)、恒定輕鏈(cl)和恒定重鏈1(ch1)結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段)、f(ab')2(包含兩個(gè)由二硫鍵橋連接的或在鉸鏈區(qū)連接的fab片段的二價(jià)片段)、fv(vl和vh結(jié)構(gòu)域)、scfv(單鏈fv，其中vl和vh通過(guò)接頭連接，例如肽接頭)、雙特異性抗體分子(與第二功能性部分連接的抗體分子，所述第二功能性部分具有與抗體不同的結(jié)合特異性，其包括但不限于另一種肽或蛋白，如抗體或受體配體，所述抗體分子包含本申請(qǐng)所公開(kāi)的多肽)、雙特異性單鏈fv二聚體、二體、三體、四體、微抗體(與ch3連接的scfv)。

某些結(jié)合分子或單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，包括但不限于fv、scfv、二體分子或結(jié)構(gòu)域抗體(domantis)，可以通過(guò)引入二硫鍵橋以排列vh和vl結(jié)構(gòu)域來(lái)提高穩(wěn)定性?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)(其具體方法包括化學(xué)生產(chǎn)或由雜交的雜交瘤生產(chǎn))以及其他技術(shù)生產(chǎn)雙特異性抗體，其他技術(shù)包括但不限于bite^tm技術(shù)(具有不同特異性的抗原結(jié)合區(qū)以及肽接頭的分子)和knobs-into-holes工程。

因此，單克隆抗體的抗原結(jié)合片段或結(jié)合分子可以是fab、fab'、f(ab')2、fv、二硫鍵連接的fv、scfv、(scfv)2、二價(jià)抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、二體、三體、四體或微抗體。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子是人抗體、嵌合抗體或人源化的抗體。在嵌合抗體中，一個(gè)物種免疫球蛋白的至少一個(gè)區(qū)域通過(guò)基因工程與另一個(gè)物種免疫球蛋白的另一個(gè)區(qū)域融合，以降低其免疫源性。例如，可以將鼠vl和vh區(qū)與人免疫球蛋白的剩余部分融合。嵌合抗體的一個(gè)特定類型是人源化抗體。人源化抗體通過(guò)將編碼非人抗體cdr的dna與產(chǎn)生人抗體的dna合并而產(chǎn)生。然后可以使用所得到的dna構(gòu)建體表達(dá)和產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體通常不會(huì)具有像非人母體抗體或嵌合抗體一樣強(qiáng)的免疫源性，因?yàn)閮Hcdr是非人的。而且，抗體可以是人的。

在人體的應(yīng)用中，優(yōu)先地使用人或至少為人源化的抗體，例如用于在體內(nèi)的預(yù)防、治療或診斷。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，結(jié)合分子(特別是單克隆抗體)包含選自下組的重鏈免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域：人igm恒定結(jié)構(gòu)域、人igg1恒定結(jié)構(gòu)域、人igg2恒定結(jié)構(gòu)域、人igg3恒定結(jié)構(gòu)域、人igg4恒定結(jié)構(gòu)域、人ige恒定結(jié)構(gòu)域和人iga恒定結(jié)構(gòu)域。

如上文中關(guān)于本發(fā)明的結(jié)合分子(優(yōu)選地為單克隆抗體)所詳細(xì)描述的，天然形成的抗體的每條重鏈都有兩個(gè)區(qū)：恒定區(qū)和可變區(qū)。有五種類型的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈：γ、δ、α、μ和ε，其分別定義免疫球蛋白igm、igd、igg、iga和ige的類型。

人有四個(gè)igg亞類(igg1、2、3、4)，依次按照其在血清中的豐度命名(igg1是豐度最高的)。盡管igg亞類的各fc區(qū)彼此之間約有95％的相似性，但是鉸鏈區(qū)的結(jié)構(gòu)相對(duì)不同。這一區(qū)域位于兩條重鏈的fab臂(抗原結(jié)合片段)和兩個(gè)羧基末端結(jié)構(gòu)域ch2和ch3之間，決定分子的柔性。上鉸鏈(朝向氨基末端)區(qū)段允許fab臂之間的角度改變(fab-fab柔性)以及每個(gè)單獨(dú)fab的旋轉(zhuǎn)柔性。下鉸鏈區(qū)(朝向羧基末端)的柔性直接決定fab臂相對(duì)于fc區(qū)的位置(fab-fc柔性)。鉸鏈依賴性的fab-fab和fab-fc柔性在觸發(fā)進(jìn)一步的效應(yīng)物功能(如補(bǔ)體活化和fc受體結(jié)合)方面，可能很重要。因此，鉸鏈區(qū)域的結(jié)構(gòu)使四個(gè)igg類型中的每一個(gè)都具有其獨(dú)特的生物學(xué)特性。

鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度和柔性在igg亞類之間各不相同。igg1的鉸鏈區(qū)包含氨基酸216-231，并且由于其是自由柔性的，因此fab片段能夠圍繞其對(duì)稱軸旋轉(zhuǎn)并且在以兩個(gè)重鏈間二硫鍵中的第一個(gè)為球心的球體內(nèi)移動(dòng)。igg2的鉸鏈短于igg1，其具有12個(gè)氨基酸殘基和4個(gè)二硫鍵。igg2鉸鏈區(qū)缺乏甘氨酸殘基，相對(duì)較短并且含有通過(guò)額外的重鏈間二硫鍵穩(wěn)定的剛性聚脯氨酸雙螺旋。這些性質(zhì)限制了igg2分子的柔性。igg3與其他亞類不同，其具有獨(dú)特的延伸的鉸鏈區(qū)(長(zhǎng)度約為igg1鉸鏈的4倍)，其中含有62個(gè)氨基酸(包括21個(gè)脯氨酸和11個(gè)半胱氨酸)，形成非柔性的聚脯氨酸雙螺旋。在igg3中，fab片段相對(duì)遠(yuǎn)離fc片段，使分子具有更高的柔性。在igg3中延長(zhǎng)的鉸鏈也使其與其他亞類相比具有更高的分子量。igg4的鉸鏈區(qū)短于igg1并且其柔性介于igg1和igg2之間。

因此，在又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子選自下組：?jiǎn)捂溈贵w，優(yōu)選選自scfv和scfv的多聚體，如二體、三體或四體；抗體片段，優(yōu)選為fab、tandab(串聯(lián)雙特異性抗體)、柔性體(flexibody)和雙特異性抗體。

在又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或者其抗原結(jié)合片段。

從實(shí)施例可以看出，抗體l1-ov52.24的表位在l1的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域iii4-5中。因此，本發(fā)明結(jié)合分子(特別是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段)的表位也優(yōu)選在l1的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域iii4-5中。

因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，表位在l1的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域iii4-5(fniii4-5)中。

l1-ov52.24具有下述cdr序列：kasqnvgtnva(lcdr1；seqidno:5)、stsyrys(lcdr2；seqidno:6)、qqyntypyt(lcdr3；seqidno:7)、fnikdyymq(hcdr1；seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(hcdr2；seqidno:9)和wnplaf(hcdr3；seqidno:10)。

上述序列顯示了根據(jù)kabat法確定的單克隆抗體l1-ov52.24的cdr，該方法通常是本領(lǐng)域公知的。

因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)中，至少有一個(gè)：

a)具有選自下述序列中的一個(gè)序列：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)或者

b)具有與a)中提及的序列相比至少有一個(gè)保守性氨基酸替換的序列。

此類本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體結(jié)合片段可以例如通過(guò)cdr移植或重組產(chǎn)生抗體來(lái)產(chǎn)生。此類方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如queen，美國(guó)專利號(hào)5,585,089和winter，u.s:5,225,539，cabillyu.s.4,816,567)。

也可以改變cdr的序列，優(yōu)選通過(guò)導(dǎo)致保守性氨基酸替換的替換。

在通常情況下，可通過(guò)操縱導(dǎo)致在fr以及cdr區(qū)中的改變，并且包括殘基的替換、缺失和插入。所述改變可以通過(guò)隨機(jī)或定向誘變誘導(dǎo)。如前所述的抗體噬菌體展示系統(tǒng)可以用于選擇具有所需的和/或改進(jìn)的性質(zhì)的突變。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子的特征為結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，并且其包含互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)qqyntypyt(seqidno:7)和wnplaf(seqidno:10)，其中任選地存在一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換。

seqidno:7表示l1-ov52.24的lcdr3序列和seqidno:10表示l1-ov52.24的hcdr3序列。lcdr3和hcdr3已知對(duì)于抗體的結(jié)合性質(zhì)很重要。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子的特征為結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，并且其中抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)，其中任選地存在一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，不存在保守性氨基酸替換。

在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子的特征為結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，并且其中所述抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段包含互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)：kasqnvgtnva(lcdr1；seqidno:5)、stsyrys(lcdr2；seqidno:6)、qqyntypyt(lcdr3；seqidno:7)、fnikdyymq(hcdr1；seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(hcdr2；seqidno:9)和wnplaf(hcdr3；seqidno:10)，其中任選地存在一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，不存在保守性氨基酸替換。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段是igg1抗體或其抗原結(jié)合片段。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含：

a)選自下述的序列中的至少一個(gè)序列：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)，或

b)包含與a)中提及的序列相比具有至少一個(gè)保守性氨基酸替換的序列。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含序列qqyntypyt(seqidno:7)和wnplaf(seqidno:10)，其中任選地存在一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換。

在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含序列kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)，其中任選地存在一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替換。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，不存在保守性氨基酸替換。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗-l1單克隆抗體包含互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗-l1單克隆抗體包含互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)：kasqnvgtnva(lcdr1；seqidno:5)、stsyrys(lcdr2；seqidno:6)、qqyntypyt(lcdr3；seqidno:7)、fnikdyymq(hcdr1；seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(hcdr2；seqidno:9)和wnplaf(hcdr3；seqidno:10)。

優(yōu)選地本發(fā)明的結(jié)合分子顯示出與l1具有較強(qiáng)的親和性。發(fā)現(xiàn)l1-ov52.24顯示出針對(duì)l1的親和性kd(m)＝2,41*10^-9。

與l1的親和性可以采用本領(lǐng)域公知的方法確定，例如通過(guò)表面等離子體共振。使用配有cm5傳感器芯片的biacore3000對(duì)l1-ov52.24進(jìn)行結(jié)合分析。簡(jiǎn)言之，使用edc/nhs活化biacorecm5芯片并將不同水平的l1-fc捕獲于活化的表面上。使用乙醇胺/hcl封閉剩余的活性位點(diǎn)。將l1-ov52.24結(jié)合至l1-fc表面并且允許其隨著時(shí)間的推移解離。對(duì)在每個(gè)密度表面上的每次注射的結(jié)合和解離相進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。

因此，在又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子(優(yōu)選單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段)以至少10^-9(優(yōu)選地至少10^-10或10^-11)的親和性(kd)與l1結(jié)合。

令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，如實(shí)施例和圖中所示，l1-ov52.24在孵育40、60、70或90分鐘后有效地內(nèi)化進(jìn)入skov3ip細(xì)胞，而相比較的抗-l1單克隆抗體9.3僅在很小程度上被內(nèi)化。可以使用與適宜診斷化合物(如熒光化合物)連接的結(jié)合分子確定內(nèi)化情況。在實(shí)施例中，使用alexa488作為熒光染料。如在實(shí)施例中所述，可以通過(guò)顯微鏡分析和計(jì)數(shù)或者通過(guò)成像流式細(xì)胞術(shù)對(duì)內(nèi)化情況進(jìn)行定量。在這兩種方法中都發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)l1-ov52.24的內(nèi)化效率是9.3抗體的至少4倍。而且，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)60’和90’l1-ov52.24的內(nèi)化比市售抗-l1cam單克隆抗體5g3和uj127.11更有效(圖6)。在實(shí)施例中確定的l1-ov52.24令人驚奇的優(yōu)異內(nèi)化性質(zhì)匯總于圖7中。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，在90’時(shí)l1-ov52.24的內(nèi)化顯著高于現(xiàn)有技術(shù)中抗-l1cam單克隆抗體9.3、5g3和uj127.11中的任意一種的內(nèi)化，其p-值均≤0.01。因此，l1-ov52.24或其抗原結(jié)合片段，或與l1-ov52.24識(shí)別相同表位的結(jié)合分子，特別適于遞送治療活性劑(藥物遞送)或遞送診斷化合物(例如用于成像目的)。

在又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子被表達(dá)l1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化，優(yōu)選地，其中所述細(xì)胞是表達(dá)l1的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選地是skov3ip細(xì)胞。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)顯微鏡分析和定量或通過(guò)成像流式細(xì)胞術(shù)確定被表達(dá)l1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)化，優(yōu)選地其中所述細(xì)胞是skov3ip細(xì)胞。該方法優(yōu)選地根據(jù)實(shí)施例中的描述進(jìn)行。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，孵育40、60、70或90分鐘后，內(nèi)化是wo2008/151819中所述的單克隆抗體9.3內(nèi)化的至少2倍、優(yōu)選地至少4倍、更優(yōu)選地至少7倍、最優(yōu)選地至少10倍。在又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，孵育60或90分鐘后，內(nèi)化是單克隆抗體5g3內(nèi)化的至少2倍、優(yōu)選地至少4倍。在又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，孵育60或90分鐘后，內(nèi)化是單克隆抗體uj127.11內(nèi)化的至少2倍、優(yōu)選地至少4倍。

在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子是單克隆抗體l1-ov52.24或其抗原結(jié)合片段，其中l(wèi)1-ov52.24的輕鏈可變部分包含優(yōu)選地具有如seqidno:1所示的序列，或其中輕鏈由seqidno:3編碼，且其中l(wèi)1-ov52.24的重鏈可變部分包含優(yōu)選地具有如seqidno:2所示的序列或其中重鏈由seqidno:3編碼。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，l1-ov52.24的輕鏈可變部分包含優(yōu)選地具有如seqidno:1所示的序列，且l1-ov52.24的重鏈可變部分包含優(yōu)選地具有如seqidno:2所示的序列。

序列seqidno:1和2涉及vj結(jié)構(gòu)域；即分別為如上所述的l1-ov52.24的輕鏈可變部分和vdj結(jié)構(gòu)域；l1-ov52.24的重鏈可變部分。

因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及單克隆抗體l1-ov52.24或其抗原結(jié)合片段。單克隆抗體l1-ov52.24通過(guò)其重鏈和輕鏈各可變部分的序列(分別為seqidno:2和seqidno:1)和/或編碼重鏈和輕鏈的cdna(分別為seqidno:3和seqidno:4)在此公開(kāi)。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子與治療活性物質(zhì)連接，使治療活性物質(zhì)內(nèi)化。

本發(fā)明所述的治療活性物質(zhì)應(yīng)理解為在動(dòng)物(優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人)中具有治療或預(yù)防作用的化合物。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述治療活性物質(zhì)在動(dòng)物中具有治療或預(yù)防作用，，可用于治療或預(yù)防腫瘤疾病和/或與l1表達(dá)相關(guān)的疾病。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述治療活性物質(zhì)是可用于化療的化合物，即化療化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述治療活性物質(zhì)是細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖抑制化合物。

因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與治療活性劑連接的本發(fā)明的結(jié)合分子，所述治療活性劑優(yōu)選

化療化合物，優(yōu)選地選自烷化劑、抗腫瘤抗生素、抗代謝藥和天然來(lái)源的衍生物，

細(xì)胞毒性化合物，

細(xì)胞增殖抑制化合物，

細(xì)胞因子，納米顆粒，或

放射性核素。

適宜的細(xì)胞因子為例如tnfα、il-2和il-12。

適宜的化療化合物是本領(lǐng)域公知的。這些化合物分為幾個(gè)不同的類別，包括例如烷化劑、抗腫瘤抗生素、抗代謝藥和天然來(lái)源的衍生物。

可用于本發(fā)明的烷化劑的實(shí)例包括白消安、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺(即細(xì)胞毒素)、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、甲基芐肼、鏈脲菌素和噻替派。

抗腫瘤抗生素的實(shí)例包括博萊霉素、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素(例如絲裂霉素c)、米托蒽醌、噴司他丁和普卡霉素。

抗代謝藥的實(shí)例包括氟脫氧尿苷、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶(5fu))、吉西他濱、羥基脲、巰嘌呤、甲氨蝶呤和硫鳥(niǎo)嘌呤。

天然來(lái)源的衍生物的實(shí)例包括多西他賽、依托泊苷、伊立替康、紫杉烷(例如紫杉醇)、替尼泊苷、托泊替康、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、潑尼松和他莫昔芬。

可用于本發(fā)明的化療劑的其他實(shí)例包括天冬酰胺酶和米托坦。

而且，還可以使用c2神經(jīng)酰胺。

本發(fā)明所述的“連接”理解為包括共價(jià)和非共價(jià)連接，優(yōu)選共價(jià)連接。在共價(jià)連接的實(shí)施方式中，本發(fā)明的結(jié)合分子可以直接或通過(guò)適宜的接頭分子連接至治療活性劑或診斷化合物。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子通過(guò)接頭連接至治療活性劑或診斷化合物。適宜的接頭是本領(lǐng)域公知的。

因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合分子是可通過(guò)接頭連接至治療活性物質(zhì)和/或診斷化合物。

適宜的放射性核素包括^67/64cu、¹³¹i、¹²⁴i或⁹⁰y。此類放射性核素可以通過(guò)形成配合物的部分連接，或者在該放射性核素為碘的情況下，直接共價(jià)連接至本發(fā)明的結(jié)合分子。形成配合物的部分優(yōu)選地(可通過(guò)接頭)共價(jià)連接至結(jié)合分子。

此類抗體綴合物是本領(lǐng)域公知的(wuam,senterpd.armingantibodies:prospectsandchallengesforimmunoconjugates.naturebiotechnol.23:1137-1146,2005，pastani,hassanr,fitzgeralddj,kreitmanrj.immunotoxintreatmentofcancer.annu.rev.med.58:221-237,2007，wo90/12592、wo2007/030642、wo2004/067038、wo2004/003183、us2005/0074426、wo94/04189)。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療活性物質(zhì)是選自下述化療化合物或細(xì)胞毒性化合物或細(xì)胞增殖抑制化合物：dna損傷劑，特別是放線菌素d、絲裂霉素c、順鉑、多柔比星、依托泊苷、維拉帕米、鬼臼毒素、5-fu、天然來(lái)源的衍生物和紫杉烷，優(yōu)選紫杉醇和卡鉑。

而且，將本發(fā)明的結(jié)合分子連接至診斷化合物可能是有利的。

診斷化合物是能夠通過(guò)直接或間接檢測(cè)產(chǎn)生信號(hào)的化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，化合物適于向動(dòng)物施用，如哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地如人。在這個(gè)實(shí)施方式中，所連接的結(jié)合分子可適于體外和體內(nèi)使用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，化合物不適于向動(dòng)物施用，如哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地如人。在這個(gè)實(shí)施方式中，所連接的結(jié)合分子可能適于體外使用。因此，可以直接或間接檢測(cè)診斷化合物。對(duì)于直接檢測(cè)而言，適于在本發(fā)明中使用的診斷化合物可以選自任意公知的可檢測(cè)標(biāo)記物基團(tuán)，如發(fā)色團(tuán)、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(例如吖啶酯或二氧雜環(huán)丁烷)、電化學(xué)發(fā)光化合物、催化劑、酶、酶底物、染料、熒光染料(例如熒光素、香豆素、羅丹明、惡嗪、試鹵靈、花青及其衍生物)、膠態(tài)金屬和非金屬顆粒以及有機(jī)聚合物膠乳顆粒。診斷化合物的其他實(shí)例是發(fā)光金屬配合物，如釕或銪的配合物和放射性同位素。

間接檢測(cè)系統(tǒng)包括例如生物親和(bioaffine)結(jié)合對(duì)的配偶體。適宜的結(jié)合對(duì)的實(shí)例是半抗原或抗原/抗體、生物素或生物素類似物如氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素/抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素、糖/凝集素、核酸或核酸類似物/互補(bǔ)的核酸以及受體/配體，例如類固醇激素受體/類固醇激素。

因此，在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及連接至診斷化合物的本發(fā)明的結(jié)合分子，所述診斷化合物優(yōu)選地選自放射性核素、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、染料或酶。

如在實(shí)施例中所示，l1-ov52.24單克隆抗體成功連接至熒光化合物或熒光染料，即alexa染料(alexa488)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的抗-l1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種核酸，所述核酸

(i)編碼本發(fā)明所述的結(jié)合分子，和/或

(ii)編碼本發(fā)明所述的結(jié)合分子的至少一條鏈，和/或

(iii)包含seqidno:3所示的和/或seqidno:4所示的序列，和/或

(iv)包含編碼下述序列中的至少一個(gè)的序列：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfr(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸是載體的一部分。此類載體是優(yōu)選地用于在細(xì)菌(如大腸桿菌)、在酵母細(xì)胞、在昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸由載體中適宜的調(diào)控序列(如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)控制，從而實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。載體優(yōu)選地包含能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列。

優(yōu)選地，連接至診斷化合物的結(jié)合分子可以在體外用于診斷目的并且從而涉及用于生物技術(shù)研究的重要工具。例如，在通常情況下可以使用本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)患者的組織活檢或身體樣品進(jìn)行分析。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子作為體外診斷試劑，或作為體外生物技術(shù)試劑的用途。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及連接至診斷化合物的本發(fā)明的結(jié)合分子作為體外診斷試劑或作為體外生物技術(shù)試劑的用途。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及連接至治療活性物質(zhì)的本發(fā)明的結(jié)合分子作為體外生物技術(shù)試劑的用途。

在又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子用作藥物或診斷試劑的用途。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，用作藥物的結(jié)合分子是連接至如上文所述的治療活性物質(zhì)的結(jié)合分子。結(jié)合分子遞送治療活性物質(zhì)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中與治療活性物質(zhì)連接的結(jié)合分子能夠發(fā)揮其治療作用。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療活性物質(zhì)以治療有效量施用。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于診斷的結(jié)合分子是連接至診斷化合物的結(jié)合分子。因此，可以對(duì)患者進(jìn)行成像，從而能夠使用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行診斷(如預(yù)后或監(jiān)測(cè)治療)。因此，連接至診斷化合物的本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選地是伴隨診斷劑，用于本發(fā)明中連接至治療活性物質(zhì)的結(jié)合分子。

本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選地包括在藥物組合物中。

化合物可能既為診斷化合物又為治療活性物質(zhì)。一個(gè)實(shí)例是某些放射性核素，例如¹³¹i，其可能既適用于體內(nèi)成像，也適用于腫瘤治療。

在通常情況下，本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子，以及任選地一種或多種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或在美國(guó)藥典或其他普遍認(rèn)可的藥典中列為用于動(dòng)物，特別是人的。術(shù)語(yǔ)“運(yùn)載體”指用來(lái)施用治療劑的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。此類藥物運(yùn)載體可以是無(wú)菌液體，如水和油，包括源于石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的，包括但不限于花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等?？诜┯盟幬锝M合物時(shí)，水是優(yōu)選的運(yùn)載體。靜脈內(nèi)施用藥物組合物時(shí)，鹽水和葡萄糖水溶液是優(yōu)選的運(yùn)載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液優(yōu)選地用作可注射溶液的液體運(yùn)載體。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，所述組合物還可以含有少量潤(rùn)濕劑或乳化劑，或者ph緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、混懸液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續(xù)釋放制劑等形式?？梢允褂脗鹘y(tǒng)粘合劑和運(yùn)載體如甘油三酯將組合物制成栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)運(yùn)載體如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在e.w.martin的“remington'spharmaceuticalsciences”中描述了適宜藥物運(yùn)載體的實(shí)例。此類組合物將含有治療有效量的治療劑(優(yōu)選為純化形式)以及適量的運(yùn)載體以提供向患者施用的適宜形式。制劑應(yīng)適于施用方式。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)常規(guī)程序?qū)⒔M合物制成適于向人類靜脈內(nèi)施用的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是溶于無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時(shí)，組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑(如利多卡因)，以緩解注射部位的疼痛。在通常情況下，各成分單獨(dú)提供，或在單位劑型中混合在一起提供，例如以在密封容器如顯示活性劑的量的安瓿或小袋中以凍干粉末或無(wú)水濃縮物形式提供。通過(guò)輸注施用組合物時(shí)，可以將其分配于含有藥用級(jí)無(wú)菌水或鹽水的輸液瓶中。通過(guò)注射施用組合物時(shí)，可以提供用于注射的裝有無(wú)菌水或鹽水的安瓿，使各成分可在施用前混合。

可以將本發(fā)明的治療劑制成中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括由游離羧基形成的鹽，如來(lái)源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，由游離氨基形成的鹽，如來(lái)源于異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽，以及來(lái)源于鈉、鉀、銨、鈣和氫氧化鐵等的鹽。

本發(fā)明的治療劑對(duì)特定病癥或癥狀的有效治療量，將取決于該病癥或癥狀的性質(zhì)，并且可以由標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。此外，可選用體外測(cè)定以輔助鑒定最佳劑量范圍。制劑中采用的精確劑量還將取決于施用途徑、疾病或病癥的嚴(yán)重程度，并且應(yīng)根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷和每個(gè)患者的情況決定。然而，靜脈內(nèi)施用的適宜劑量范圍通常為約20-500毫克活性化合物每千克體重。鼻內(nèi)施用的適宜劑量范圍通常為約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重?？梢詮膩?lái)源于體外或動(dòng)物模型檢測(cè)系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線，外推有效劑量。在通常情況下，栓劑可以含有0.5％至10％重量的活性成分；口服劑型優(yōu)選地含有10％至95％的活性成分。

多種公知的遞送系統(tǒng)可以用于施用本發(fā)明的治療劑，例如在脂質(zhì)體、微粒和微囊中包封；使用能夠表達(dá)治療劑的重組細(xì)胞，使用受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(例如wu和wu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)；構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體一部分的治療性核酸等。引入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。可以通過(guò)任何方便的途徑施用化合物，例如通過(guò)輸注、通過(guò)快速推注、通過(guò)上皮或皮膚粘膜襯里(例如口、直腸和腸粘膜)吸收，以及可以與其他生物活性試劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可能理想的是，通過(guò)任意適宜的途徑將本發(fā)明的藥物組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；可以通過(guò)例如與儲(chǔ)庫(kù)(如ommaya儲(chǔ)庫(kù))連接的腦室內(nèi)導(dǎo)管，來(lái)輔助腦室內(nèi)注射。還可以使用肺部施用，例如通過(guò)使用吸入器或噴霧器，以及具有霧化劑的制劑。

在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，向需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的藥物組合物可能是理想的。這可以通過(guò)例如但不限于在手術(shù)期間局部輸注、局部應(yīng)用(例如與手術(shù)后的傷口敷料結(jié)合)、通過(guò)注射、借助于導(dǎo)管、借助于栓劑或借助于植入物實(shí)現(xiàn)，所述植入物材料為多孔的、無(wú)孔的或凝膠狀的，包括膜，如硅橡膠膜或纖維。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以在惡性腫瘤或腫瘤或癌前組織位點(diǎn)(或原位點(diǎn))直接注射施用。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，治療劑的遞送可以在囊泡，特別是脂質(zhì)體(langer,1990,science249:1527-1533)，更特別地是陽(yáng)離子脂質(zhì)體(wo98/40052)中。

在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過(guò)控釋系統(tǒng)遞送治療劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用泵(langer，見(jiàn)前文)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以將控釋系統(tǒng)置于治療靶點(diǎn)附近，因而僅需要全身劑量的一部分。

在本發(fā)明這個(gè)方面的背景下，本發(fā)明還包括治療或預(yù)防患者的腫瘤疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子，優(yōu)選單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

在整個(gè)發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“有效量”意為，給定的分子或化合物以足以獲得所需的治療效果的量施用。在整個(gè)發(fā)明中，如果兩種化合物以治療有效量施用，這包括一種或每種化合物以亞治療量施用的情況，即每種化合物的量不足以獨(dú)立提供治療效果，但是兩種化合物聯(lián)合產(chǎn)生所需的治療效果。但是，本發(fā)明中也包括每種化合物都各自以治療有效量施用。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“治療腫瘤疾病”既包括在患有腫瘤疾病的患者中殺死腫瘤細(xì)胞、減少腫瘤細(xì)胞的增殖(例如減少至少30％、至少50％或至少90％)也包括完全抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，該術(shù)語(yǔ)包括預(yù)防致瘤性疾病，例如通過(guò)殺死可能或傾向于在將來(lái)成為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，以及預(yù)防轉(zhuǎn)移的形成。

根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，擬應(yīng)用的各療法將取決于例如患者的身體狀況或疾病的嚴(yán)重程度，并且因此必須根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或結(jié)合分子的藥物組合物。關(guān)于所述藥物組合物，上述的所有實(shí)施方案也都適用。

在又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子(優(yōu)選單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段)在治療或預(yù)防腫瘤疾病中的用途，優(yōu)選地其中腫瘤疾病是上皮腫瘤疾病和/或選自下組：星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)纖維瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、頭頸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、鱗狀細(xì)胞癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肝癌、結(jié)腸癌、間皮瘤和表皮樣癌。

在又一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如上文所述的本發(fā)明的結(jié)合分子和任選地一種或多種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與l1結(jié)合的結(jié)合分子，其中結(jié)合分子是抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于抗-l1單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)中的至少一個(gè)

a)具有選自下組序列中的一個(gè)：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)或者

b)具有與a)中提及的序列相比具有至少一個(gè)保守性氨基酸替換的序列。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與l1結(jié)合的結(jié)合分子，其特征在于結(jié)合分子包含

a)選自下組序列中的一個(gè)：kasqnvgtnva(seqidno:5)、stsyrys(seqidno:6)、qqyntypyt(seqidno:7)、fnikdyymq(seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(seqidno:9)和wnplaf(seqidno:10)或者

b)包含與a)中提及的序列相比具有至少一個(gè)保守性氨基酸替換的序列。

本發(fā)明的此類單克隆抗體或其抗體結(jié)合片段或結(jié)合分子可以例如通過(guò)cdr移植或抗體的重組產(chǎn)生。此類方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如queen，美國(guó)專利號(hào)5,585,089和winter,u.s:5,225,539,cabillyu.s.4,816,567)。

本申請(qǐng)描述的發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式適用于本發(fā)明的所有結(jié)合分子和單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。

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12.wo2008/151819

附圖

圖1：在skov3ip細(xì)胞上檢測(cè)mabl1cammab9.3的細(xì)胞攝取。

將skov3ip細(xì)胞與alexa488綴合的l1cammabl1-9.3孵育不同長(zhǎng)度的時(shí)間。隨后固定樣品并使用與alexa647偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。將0’時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞在冰上孵育以避免抗體內(nèi)化。在amnisisx成像流式細(xì)胞儀上檢測(cè)樣品，收集3000個(gè)細(xì)胞并使用amnisideas軟件分析。顯示了在時(shí)間點(diǎn)0分鐘(a)、60分鐘(b)和90分鐘(c)獲取的細(xì)胞的典型圖像。下面一列曲線圖顯示了對(duì)應(yīng)樣品的定量。對(duì)時(shí)間點(diǎn)0’(d)、60’(e)和90’(f)進(jìn)行了描述。y軸給出了歸一化的頻率，x軸顯示了alexa488綴合的l1cammab9.3相對(duì)于細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度的各細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。曲線圖下面的表格顯示了分析中包括的細(xì)胞數(shù)(計(jì)數(shù))和曲線圖的平均值(均值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，顯示典型結(jié)果。

圖2：在skov3ip細(xì)胞上檢測(cè)抗體l1cammabov52.24的細(xì)胞攝取。

將skov3ip細(xì)胞與alexa488綴合的l1mabov52.24孵育不同長(zhǎng)度的時(shí)間。隨后固定樣品并使用與alexa647偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。將0’時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞在冰上孵育以避免抗體內(nèi)化。在amnisisx成像流式細(xì)胞儀上檢測(cè)樣品，收集3000個(gè)細(xì)胞并使用amnisideas軟件分析。顯示了在時(shí)間點(diǎn)0分鐘(a)、60分鐘(b)和90分鐘(c)獲取的細(xì)胞的典型圖像。下面的一列曲線圖顯示了對(duì)應(yīng)的樣品的定量。對(duì)時(shí)間點(diǎn)0’(d)、60’(e)和90’(f)進(jìn)行了描述。y軸給出了歸一化的頻率，x軸顯示了alexa488綴合的l1mabov52.24相對(duì)于細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度的各細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。曲線圖下面的表格顯示了分析中包括的細(xì)胞數(shù)(計(jì)數(shù))和曲線圖的平均值(均值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，顯示典型結(jié)果。

圖3：在skov3ip細(xì)胞上檢測(cè)l1cammabs9.3和ov52.24的細(xì)胞攝取。

該圖給出了對(duì)圖1和圖2中結(jié)果的概述。上方圖表和下方圖表分別顯示了在不同時(shí)間點(diǎn)0’、60’和90’分鐘針對(duì)l1cammab9.3和l1cammabov52.24的曲線圖。

圖4：使用共聚焦激光掃描顯微鏡在skov3ip細(xì)胞上檢測(cè)l1cammabs9.3和ov52.24的細(xì)胞攝取。

使用與alexa488綴合的l1cammabs9.3或ov52.24孵育skov3ip細(xì)胞70分鐘。隨后固定樣品并使用與alexa647偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。樣品隨后在leicasp5ii共聚焦激光掃描顯微鏡上成像。在相似的z-位置獲得z-切片。針對(duì)每種抗體采集n＝30個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行定量(a)。使用fiji(imagej)對(duì)圖像進(jìn)行分析，并繪制顯示與alexa488綴合的l1mab9.3和l1-ov52.24相對(duì)于細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的柱狀圖(b)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，顯示典型結(jié)果。對(duì)應(yīng)的左側(cè)條柱顯示了mab9.3分別在40min和90min的結(jié)果。對(duì)應(yīng)的右側(cè)條柱顯示了mabov52.24分別在40min和90min的結(jié)果。

圖5：使用共聚焦激光掃描顯微鏡確認(rèn)skov3ip細(xì)胞上對(duì)l1cammabs5g3和uj127.11的細(xì)胞攝取。

使用與alexa488綴合的l1cammabs5g3和uj127.11孵育skov3ip細(xì)胞70分鐘。隨后固定樣品并使用與alexa647偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。樣品隨后在leicasp5ii共聚焦激光掃描顯微鏡上成像。在相似的z-位置獲得z-切片。針對(duì)每種抗體采集n＝30個(gè)細(xì)胞。顯示典型結(jié)果。

圖6：在skov3ip細(xì)胞上檢測(cè)和比較抗體l1cammabs9.3、ov52.24、5g3和uj127.11的細(xì)胞攝取。

將skov3ip細(xì)胞與alexa488綴合的l1mab孵育不同長(zhǎng)度的時(shí)間。隨后固定樣品并使用與alexa647偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。將0’時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞在冰上孵育以避免抗體內(nèi)化。在amnisisx成像流式細(xì)胞儀上檢測(cè)樣品，收集5000個(gè)細(xì)胞并使用amnisideas軟件分析。左列、中間和右列的曲線圖分別顯示了時(shí)間點(diǎn)0分鐘、60分鐘和90分鐘。y軸給出了歸一化的頻率，x軸顯示了alexa488綴合的l1mab相對(duì)于細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度的各細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。曲線圖中給出了各條件下相對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，顯示典型結(jié)果。

圖7：在skov3ip細(xì)胞上比較l1cammabs9.3、ov52.24、5g3和uj127.11的細(xì)胞攝取。

該圖給出了對(duì)圖6中典型分析的總結(jié)。根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)中各l1cammab的平均相對(duì)細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)度，對(duì)三次不同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)制圖。柱狀圖的值以平均值±s.d表示。為了確定不同l1cammab的內(nèi)化增加或減少的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性概率，使用雙尾、非配對(duì)的studentt檢驗(yàn)對(duì)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。星號(hào)分配如下：*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001。

實(shí)施例

實(shí)施例1

材料和方法

細(xì)胞系

人卵巢癌細(xì)胞skov3ip從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(弗吉尼亞馬納薩斯)獲得。該細(xì)胞系經(jīng)德國(guó)生物材料資源中心(德國(guó)布倫瑞克)驗(yàn)證，并且研究者對(duì)整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中的典型形態(tài)進(jìn)行了評(píng)估。每周進(jìn)行檢測(cè)以確保培養(yǎng)物為支原體陰性。在補(bǔ)充了10％熱滅活胎牛血清(fcs)(biochrom,德國(guó)柏林)、2mml-谷氨酰胺(invitrogen,德國(guó)卡爾斯魯厄)和1mm丙酮酸鈉(invitrogen)的dmem培養(yǎng)基(sigma-aldrich,德國(guó)deisenhoffen)中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將所有細(xì)胞維持在37℃和5％co2下的濕潤(rùn)環(huán)境中。

單克隆抗體

此前已對(duì)針對(duì)人l1cam的mabl1-9.3進(jìn)行了描述[6,12]。

l1-ov52.24是使用包含l1胞外域的人l1-fc蛋白，或使用skov3ip細(xì)胞免疫接種小鼠產(chǎn)生。

確定了l1-ov52.24單克隆抗體免疫球蛋白基因的cdna序列并且示于上文(輕鏈：seqidno:3，重鏈：seqidno:4)。

另外，分別確定了l1-ov52.24重鏈和輕鏈(vdj或vj結(jié)構(gòu)域，無(wú)恒定結(jié)構(gòu)域)的蛋白序列(seqidno:2和seqidno:1)，并且根據(jù)kabat命名法確定了l1-ov52.24的cdr序列。l1-ov52.24的cdr序列為：kasqnvgtnva(lcdr1；seqidno:5)、stsyrys(lcdr2；seqidno:6)、qqyntypyt(lcdr3；seqidno:7)、fnikdyymq(hcdr1；seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(hcdr2；seqidno:9)和wnplaf(hcdr3；seqidno:10)。

這兩種mab均是igg1同種型。

同種型對(duì)照mab由bioxcell(新罕布什爾，西黎巴嫩)獲得。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書(shū)使用標(biāo)記試劑盒(invitrogen)將l1cammab與alexa488綴合。簡(jiǎn)言之，將100μg抗體與1瓶標(biāo)記試劑混合，孵育1小時(shí)并且隨后在柱子上純化。確定標(biāo)記程度以確保相似的標(biāo)記效能。

結(jié)合常數(shù)

表面等離子體共振(spr)平衡分析

使用配有cm5傳感器芯片的biacore3000進(jìn)行結(jié)合分析。簡(jiǎn)言之，使用edc/nhs活化biacorecm5芯片并將不同水平的l1-fc捕獲在活化的表面上。使用乙醇胺/hcl封閉剩余的活性位點(diǎn)。將l1-mab結(jié)合至l1-fc表面并允許其隨著時(shí)間的推移解離。對(duì)在每個(gè)密度表面上的每次注射的結(jié)合和解離相進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。

識(shí)別的表位

為了確定表位特異性，我們構(gòu)建了一系列攜帶不同ig結(jié)構(gòu)域的l1-fc蛋白(如[6]中所述)。為了精細(xì)定位，使用了最近描述的重組v5-標(biāo)記的l1片段(gouveiarm,moraisva,peixotoc等，productionandpurificationoffunctionaltruncatedsolubleformsofhumanrecombinantl1celladhesionglycoproteinfromspodopterafrugiperdasf9cells.proteinexprpurif2007；52:182–93)。在elisa或在western印跡分析中使用重組蛋白用于表位定位?？贵w攝取測(cè)定

對(duì)于成像流式細(xì)胞術(shù)(imagestream)

使用胰酶/edta分離skov3ip細(xì)胞，在培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并分成相等細(xì)胞數(shù)的等分樣品(200000個(gè)細(xì)胞)。在持續(xù)存在標(biāo)記抗體(10μg/ml)的條件下，將細(xì)胞在37℃下孵育不同時(shí)間點(diǎn)，或?qū)⒓?xì)胞在冰上孵育時(shí)間點(diǎn)0分鐘。在各時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞以800xg沉淀，使用冰冷的pbs洗滌1次并使用4％pfa(thermofischer)在冰上固定15min。固定的細(xì)胞用pbs洗滌兩次，并使用25μg/ml山羊抗小鼠alexa-647二抗(invitrogen,德國(guó)卡爾斯魯厄)孵育20分鐘并且隨后使用pbs洗滌兩次。

對(duì)于共聚焦激光掃描顯微鏡法

在8孔μ-載玻片(ibidi,德國(guó)慕尼黑)上接種25000個(gè)細(xì)胞并生長(zhǎng)24h。在持續(xù)存在標(biāo)記抗體(10μg/ml)的條件下，將細(xì)胞在37℃下在不同時(shí)間點(diǎn)孵育。在各時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞用冰冷的pbs洗滌，并用4％pfa(thermofischer)在冰上固定15min。固定的細(xì)胞用pbs洗滌兩次，并使用25μg/ml山羊抗小鼠alexa-647二抗(invitrogen,德國(guó)卡爾斯魯厄)孵育20分鐘并且隨后使用pbs洗滌兩次。

成像流式細(xì)胞術(shù)和分析

在amnisimagestreamx(isx)(amnis公司，美國(guó)西雅圖)上檢測(cè)樣品，488nm激光設(shè)為100％，561nm激光設(shè)為80％，使用60x物鏡并將擴(kuò)展景深(edf)選項(xiàng)激活。記錄通道2和5以及通道1中的亮場(chǎng)圖像，每個(gè)樣品收集4000個(gè)細(xì)胞。在固定之后、用抗小鼠alexa647抗體復(fù)染之前，取等分細(xì)胞樣品作為各抗體針對(duì)alexa488偶聯(lián)l1cammab的補(bǔ)償對(duì)照。使用與綴合的抗體相同濃度的相應(yīng)的未綴合l1mab，在冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并且用相同的抗小鼠alexa647二抗進(jìn)行復(fù)染，作為用抗小鼠alexa647抗體復(fù)染的補(bǔ)償對(duì)照。在isx上用相應(yīng)的補(bǔ)償設(shè)置獲取補(bǔ)償對(duì)照。

使用ideas軟件(amnis公司，美國(guó)西雅圖)對(duì)isx數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。打開(kāi)原始圖像文件并使用相應(yīng)的補(bǔ)償文件生成補(bǔ)償矩陣。將所采集的細(xì)胞進(jìn)行門控以獲得在焦點(diǎn)的細(xì)胞，并且隨后使用亮場(chǎng)圖像控制的門控以獲得單個(gè)細(xì)胞。使用通道5的圖像產(chǎn)生“細(xì)胞表面掩膜”，強(qiáng)度下限限制為200，上限保持4095不變以消除背景并優(yōu)化信號(hào)。對(duì)于通道2，強(qiáng)度下限設(shè)定為150，上限保持4095不變并將其稱為“通道2”。這兩個(gè)設(shè)置均來(lái)源于l1cammab同種型對(duì)照或僅二抗的對(duì)照染色。此外，將“細(xì)胞表面掩膜”擴(kuò)大一個(gè)像素，以包括通道2上的相鄰像素。生成稱為“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)”的另一掩膜，將其定義為“通道2非細(xì)胞表面掩膜”。最后，生成稱為“相對(duì)細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)度”的組合特征，其定義如下：“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)/(強(qiáng)度_mc_ch02*100)”。繪制相應(yīng)的直方圖并確定平均值。對(duì)所有檢測(cè)的樣品應(yīng)用相同程序。

共聚焦激光掃描顯微鏡法和分析

在配有hyd檢測(cè)器的leicasp5ii(leica微系統(tǒng)，德國(guó)韋茨拉爾)共聚焦激光掃描顯微鏡上檢測(cè)樣品。使用波長(zhǎng)為488nm的氬激光激發(fā)與alexa-488綴合的l1mab，使用波長(zhǎng)為633nm的hene激光線激發(fā)alexa-647。在相似的z-位置獲得z-切片。針對(duì)每種抗體采集n＝30個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行定量。使用fiji(imagej,nih,美國(guó)bethesda,)對(duì)圖像進(jìn)行分析，其中使用抗小鼠alexa-647復(fù)染細(xì)胞表面的信號(hào)來(lái)分割和鑒定單細(xì)胞邊界，然后確定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度和總細(xì)胞強(qiáng)度。使用excel(微軟，美國(guó)redmond)將結(jié)果繪制成條形圖，其顯示與alexa488綴合的mabl1-9.3和l1-ov52.24相對(duì)于細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

結(jié)果

mabsl1-9.3和l1-ov52-54與l1cam細(xì)胞表面分子的不同細(xì)胞表面表位結(jié)合。mab9.3明顯與由第一ig結(jié)構(gòu)域(1.ig-l1-fc；[12])組成的融合蛋白反應(yīng)。通過(guò)western印跡分析，確證了mabl1-ov52.24識(shí)別l1的4-5fniii結(jié)構(gòu)域。mabl1-9.3與第一ig結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而l1-ov52.24與4-5.fniii結(jié)構(gòu)域中的表位結(jié)合。mab9.3與l1的親和性為kd(m)＝8,5*10^-11(見(jiàn)[6])，而mabl1-ov52.24與l1的親和性為kd(m)＝2,41*10^-9。發(fā)現(xiàn)l1-ov52.24在western印跡分析和facs分析實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異，并發(fā)現(xiàn)其在免疫組化(ihc)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好。

我們使用上述材料和方法部分概述的與alex-488綴合的mab，在skov3ip細(xì)胞中進(jìn)行內(nèi)化測(cè)定。通過(guò)結(jié)合了facs和熒光分析，且能夠?qū)?shù)千個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量的imagestream^x分析，對(duì)內(nèi)化進(jìn)行測(cè)定。使用ideas軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)l1-9.3的分析表明其在時(shí)間點(diǎn)0min、60min和90min緩慢內(nèi)化(圖1a-f)，在最終時(shí)間點(diǎn)的平均值為7.8％。相比之下，mabl1-ov52.24的內(nèi)化迅速得多，并且在最終時(shí)間點(diǎn)的平均值達(dá)到40％(圖2a-f)。在圖3中直接對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

為了驗(yàn)證這些結(jié)果，使用所附著的細(xì)胞進(jìn)行了類似的分析。在蓋玻片上培養(yǎng)skov3ip細(xì)胞，并使其與alexa綴合的抗體內(nèi)化。通過(guò)激光掃描顯微鏡以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行目測(cè)計(jì)數(shù)，來(lái)完成定量。染色實(shí)例如圖4中所示并且結(jié)果匯總于圖4b。這些結(jié)果確證了通過(guò)imagestream分析獲得的數(shù)據(jù)，并且顯示mabl1-ov52.24導(dǎo)致內(nèi)化速率提高接近10倍。該結(jié)果是預(yù)料不到的并且表明mab-l1-ov52.24適于遞送抗體藥物綴合物。

實(shí)施例2

材料和方法

細(xì)胞系

人卵巢癌細(xì)胞skov3ip從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(弗吉尼亞馬納薩)獲得。該細(xì)胞系經(jīng)德國(guó)生物材料資源中心(德國(guó)布倫瑞克)驗(yàn)證，并且研究者對(duì)整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中的典型形態(tài)進(jìn)行了評(píng)估。每周進(jìn)行檢測(cè)以確保培養(yǎng)物為支原體陰性。在補(bǔ)充了10％熱滅活胎牛血清(fcs)(biochrom,德國(guó)柏林)、2mml-谷氨酰胺(invitrogen,德國(guó)卡爾斯魯厄)和1mm丙酮酸鈉(invitrogen)的dmem培養(yǎng)基(sigma-aldrich,德國(guó)deisenhoffen)中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將所有細(xì)胞保持在37℃和5％co2下的濕潤(rùn)環(huán)境中。

單克隆抗體

此前已對(duì)針對(duì)人l1cam的mabl1-9.3、5g3和uj127.11進(jìn)行了描述[6]。

l1-ov52.24是使用包含l1胞外域的人l1-fc蛋白，或使用skov3ip細(xì)胞免疫接種小鼠產(chǎn)生。

確定了l1-ov52.24單克隆抗體免疫球蛋白基因的cdna序列并且示于上文(輕鏈：seqidno:3和重鏈：seqidno:4)。

另外，分別確定了l1-ov52.24重鏈和輕鏈(vdj或vj結(jié)構(gòu)域，無(wú)恒定結(jié)構(gòu)域)的蛋白序列(seqidno:2和seqidno:1)，并且根據(jù)kabat命名法確定了l1-ov52.24的cdr序列。l1-ov52.24的cdr序列為：kasqnvgtnva(lcdr1；seqidno:5)、stsyrys(lcdr2；seqidno:6)、qqyntypyt(lcdr3；seqidno:7)、fnikdyymq(hcdr1；seqidno:8)、widpengktvfdpkfrg(hcdr2；seqidno:9)和wnplaf(hcdr3；seqidno:10)。

mabl1-9.3、l1-ov52.24和uj127.11是igg1同種型。mab5g3是igg2a同種型。相應(yīng)的同種型對(duì)照mab由bioxcell(新罕布什爾，西黎巴嫩)獲得。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書(shū)使用標(biāo)記試劑盒(invitrogen)將l1cammab與alexa488綴合。簡(jiǎn)言之，將100μg抗體與1瓶標(biāo)記試劑混合，孵育1小時(shí)并且隨后在柱子上純化。確定標(biāo)記程度以確保相似的標(biāo)記效能。與alexa488綴合的mab5g3購(gòu)自novusbiologicals(美國(guó)利特爾頓)。

抗體攝取測(cè)定

對(duì)于成像流式細(xì)胞術(shù)(imagestream)

使用胰酶/edta分離skov3ip細(xì)胞，在培養(yǎng)基中重懸，計(jì)數(shù)并分成相等細(xì)胞數(shù)的等分樣品(200000個(gè)細(xì)胞)。在持續(xù)存在標(biāo)記抗體(10μg/ml)的條件下，將細(xì)胞在37℃下孵育不同時(shí)間點(diǎn)，或?qū)⒓?xì)胞在冰上孵育時(shí)間點(diǎn)0分鐘。在各時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞以800xg沉淀，使用冰冷的pbs洗滌1次并使用4％pfa(thermofischer)在冰上固定15min。固定的細(xì)胞用pbs洗滌兩次，并使用25μg/ml山羊抗小鼠alexa-647二抗(invitrogen,德國(guó)卡爾斯魯厄)孵育20分鐘并且隨后使用pbs洗滌兩次。

對(duì)于共聚焦激光掃描顯微鏡法

在8-孔μ-載玻片(ibidi，德國(guó)慕尼黑)上接種25000個(gè)細(xì)胞并生長(zhǎng)24h。在持續(xù)存在標(biāo)記抗體(10μg/ml)的條件下，將細(xì)胞在37℃下在不同時(shí)間點(diǎn)孵育。在各時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞用冰冷的pbs洗滌，并用4％pfa(thermofischer)在冰上固定15min。固定的細(xì)胞用pbs洗滌兩次，并使用25μg/ml山羊抗小鼠alexa-647二抗(invitrogen,德國(guó)卡爾斯魯厄)孵育20分鐘并且隨后使用pbs洗滌兩次。

成像流式細(xì)胞術(shù)和分析

在amnisimagestreamx(isx)(amnis公司，美國(guó)西雅圖)上檢測(cè)樣品，488nm的激光設(shè)為100％，561nm的激光設(shè)為80％，使用60x物鏡并將擴(kuò)展景深(edf)選項(xiàng)激活。記錄通道2和5以及通道1中的亮場(chǎng)圖像，每個(gè)樣品收集10.000個(gè)細(xì)胞。在固定之后、用抗小鼠alexa647抗體復(fù)染之前，取等分細(xì)胞樣品作為各抗體針對(duì)alexa488偶聯(lián)l1mab的補(bǔ)償對(duì)照。在冰上使用濃度與綴合的抗體相同的各未綴合l1mab分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并且用相同的抗小鼠alexa647二抗進(jìn)行復(fù)染，作為用抗小鼠alexa647抗體復(fù)染的補(bǔ)償對(duì)照。在isx上用相當(dāng)?shù)难a(bǔ)償設(shè)置獲取補(bǔ)償對(duì)照。使用ideas軟件(amnis公司，美國(guó)西雅圖)對(duì)isx數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。打開(kāi)原始圖像文件并使用相應(yīng)的補(bǔ)償文件生成補(bǔ)償矩陣。對(duì)所采集的細(xì)胞進(jìn)行門控以獲得在焦點(diǎn)的細(xì)胞，并且隨后使用亮場(chǎng)圖像控制的門控以獲得單個(gè)細(xì)胞。使用通道5的圖像產(chǎn)生“細(xì)胞表面掩膜”，將強(qiáng)度下限限制為200，上限保持4095不變以消除背景并優(yōu)化信號(hào)。對(duì)于通道2，將強(qiáng)度下限設(shè)定為150，上限保持4095不變并將其稱為“通道2”。這兩個(gè)設(shè)置均來(lái)源于l1mab同種型對(duì)照或僅二抗的對(duì)照染色。此外，將“細(xì)胞表面掩膜”擴(kuò)大一個(gè)像素，以包括通道2上的相鄰像素。生成稱為“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)”的另一掩膜，將其定義為“通道2非細(xì)胞表面掩膜”。最后，生成稱為“相對(duì)細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)度”的組合特征，其定義如下：“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)/(強(qiáng)度_mc_ch02*100)”。繪制相應(yīng)的直方圖并確定平均值。對(duì)所有檢測(cè)的樣品應(yīng)用相同程序。

共聚焦激光掃描顯微鏡法

在配有hyd檢測(cè)器的leicasp5ii(leica微系統(tǒng)，德國(guó)韋茨拉爾)共聚焦激光掃描顯微鏡上檢測(cè)樣品。使用波長(zhǎng)為488nm的氬激光激發(fā)與alexa-488綴合的l1mab，使用波長(zhǎng)為633nm的hene激光線激發(fā)alexa-647。在相似的z-位置獲得z-切片。針對(duì)每種抗體采集n＝30個(gè)細(xì)胞。顯示典型圖像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)

使用studentt-檢驗(yàn)確定至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的條件之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的增加或減少的概率。進(jìn)行雙尾、非配對(duì)的t-檢驗(yàn)。以平均值±s.d.表示條形圖中的值。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。以星號(hào)表示圖中的顯著性。星號(hào)分配如下：*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001。

結(jié)果

實(shí)施例2的結(jié)果如圖5至7中所示。我們使用上述材料和方法部分概述的與alex-488綴合的mab，在skov3ip細(xì)胞中進(jìn)行內(nèi)化測(cè)定。通過(guò)結(jié)合了facs和熒光分析，且能夠?qū)?shù)千個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量的imagestream^x分析，對(duì)內(nèi)化進(jìn)行測(cè)定。使用ideas軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析表明，現(xiàn)有技術(shù)的單克隆抗體l1-9.3、5g3和uj127.11在時(shí)間點(diǎn)0min、60min和90min緩慢內(nèi)化(圖6)。而相反的是，本發(fā)明的mabl1-ov52.24內(nèi)化非常迅速并且在最終時(shí)間點(diǎn)的平均值達(dá)到41,7％(圖6)。數(shù)據(jù)匯總于圖7。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，l1-ov52.24在90’時(shí)的內(nèi)化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于現(xiàn)有技術(shù)中抗-l1單克隆抗體9.3、5g3和uj127.11中任意一種的內(nèi)化，其p-值均≤0.01。

為了驗(yàn)證這些結(jié)果，使用所附著的細(xì)胞進(jìn)行了類似的分析。在蓋玻片上培養(yǎng)skov3ip細(xì)胞，并使其與alexa綴合的抗體內(nèi)化。通過(guò)激光掃描顯微鏡以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行目測(cè)計(jì)數(shù)，來(lái)完成定量。染色實(shí)例如圖5中所示。這些結(jié)果確證了通過(guò)imagestream分析獲得的數(shù)據(jù)，并且顯示與現(xiàn)有技術(shù)中直接針對(duì)l1cam的抗體相比，mabl1-ov52.24導(dǎo)致驚人的高內(nèi)化速率。該結(jié)果是預(yù)料不到的并且表明mab-l1-ov52.24適于遞送抗體藥物綴合物。