本發(fā)明涉及源自粉塵螨的新型蛋白質(zhì)以及該蛋白質(zhì)的利用。
背景技術(shù)：
：作為過敏性疾病的代表性疾病，可以列舉花粉癥等的過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、特應(yīng)性支氣管哮喘、特應(yīng)性皮膚炎等，但近年來，日本的這些過敏性疾病的患病率日趨增加。已知特應(yīng)性支氣管哮喘、特應(yīng)性皮膚炎的發(fā)病原因的大部分是由包括螨蟲的蟲體、螨蟲的排泄物、霉、寵物等動(dòng)物的毛等在內(nèi)的室內(nèi)灰塵造成的，但是已知特別是在源自室內(nèi)生存的塵螨的過敏原發(fā)揮了重要的作用。(非專利文獻(xiàn)1)。在室內(nèi)生存的代表性的塵螨絕大多數(shù)由粉塵螨(dermatophagoidesfarinae，以下簡(jiǎn)稱為“derf”))和屋塵螨(dermatophagoidespteronyssinus，以下簡(jiǎn)稱為“derp”))構(gòu)成。已知這些塵螨在溫暖且濕潤(rùn)的條件下繁殖得最好，而在高氣密化、高隔熱化的建筑物增加的現(xiàn)代，一年中室內(nèi)被保持在適于塵螨的條件的機(jī)會(huì)增大，其生存數(shù)量也增大。可以認(rèn)為這是過敏性疾病的增加的原因的一個(gè)因素。在這些過敏性疾病的治療中，使用抗組胺藥、類固醇系抗炎癥藥、抗白三烯藥、脫顆粒抑制藥、th2細(xì)胞因子抑制藥等，但所有都限于對(duì)癥療法。然而，近年來，以皮下過敏原免疫療法(scit)、舌下過敏原免疫療法(slit)為代表的過敏原免疫療法相繼開發(fā)。過敏原免疫療法是通過在體內(nèi)逐次少量投與過敏原來控制對(duì)于過敏原的免疫應(yīng)答的治療法，被認(rèn)為這是目前能夠根治過敏性疾病的唯一的方法。在過敏原免疫療法的開發(fā)中，關(guān)于作為原因的過敏原的研究和理解是必不可少的。例如，在日本被認(rèn)為生存數(shù)量多的粉塵螨蟲體和排泄物中被報(bào)告有被稱為derf1、derf2、derf3的抗原性高的過敏原，而且已經(jīng)被克隆(非專利文獻(xiàn)2、3)。另外，根據(jù)過去的報(bào)告，已知螨蟲過敏的患者80％以上具有對(duì)這些抗原任意1種以上特異性的ige(非專利文獻(xiàn)4)。此外，也積極進(jìn)行著粉塵螨過敏原的探索研究，對(duì)于以螨蟲為原因的過敏性疾病的預(yù)防和治療要求更加有用的新型過敏原蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)5)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：korsgaardj,etal.,allergy,53：77-83,1998非專利文獻(xiàn)2：dilworthrj,etal.,clinicalandexperimentalallergy,21：25-32,1991非專利文獻(xiàn)3：yuukit.etal.,jpn.j.allegol.,39(6)：557-561,1990非專利文獻(xiàn)4：heymannpw,etal.,j.allergyclin.immunol.,83：1055-1067,1989非專利文獻(xiàn)5：thomaswr,etal.,int.arch.allergyimmunol.,129：1-18,2002技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明涉及提供新型的粉塵螨蛋白質(zhì)、以及使用其的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷藥、預(yù)防藥和治療藥等。用于解決課題的方法本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行研究的結(jié)果，從粉塵螨排泄物中，成功獲得了與源自以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者的血清中的ige顯示高的反應(yīng)性、分子量110kda附近的新的蛋白質(zhì)，而且發(fā)現(xiàn)其作為以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷藥、預(yù)防藥、治療藥有用。即，本發(fā)明涉及以下的1)～14)。1)選自以下的(a)～(c)中的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽。(a)由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。(b)由在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、且具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)。(c)由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)。2)編碼選自以下的(a)～(c)中的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽的聚核苷酸。(a)由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。(b)由在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、且具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)。(c)由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)。3)選自以下的(d)～(f)中的聚核苷酸。(d)由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸。(e)與由與序列號(hào)1所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、編碼具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)的聚核苷酸。(f)由與序列號(hào)1所示的堿基序列具有90％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成、且編碼具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)的聚核苷酸。4)以上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽為有效成分的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑。5)以上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽為有效成分的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷藥。6)與上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽結(jié)合的結(jié)合蛋白質(zhì)。7)如上述6)所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其為抗體分子。8)如上述6)所述的結(jié)合蛋白質(zhì)，其為單克隆抗體。9)上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽用于制造以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑的使用。10)上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽用于制造以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷藥的使用。11)如上述1)所述的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段，其用于以肽粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療。12)如上述1)所述的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段，其用于以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷。13)一種以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療方法，其中，對(duì)患者投與上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽。14)一種以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷方法，其中，對(duì)被測(cè)試者投與上述1)的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽。發(fā)明的效果本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)由于與源自以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者的血清中的ige顯示高的反應(yīng)性，所以能夠在以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷、預(yù)防和治療中利用。該粉塵螨蛋白質(zhì)是與公知的粉塵螨過敏原、特別是derf1(分子量約27kda)、derf2(分子量約15kda)、derf3(分子量約29kda)不同的蛋白質(zhì)，因此通過將它們組合，能夠成為更有用的過敏原免疫療法。附圖說明圖1是用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)解析粉塵螨粗提取液和粗純化物(用利用fplc的陰離子交換色譜分級(jí))得到的圖。圖2是表示使用以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者(rastscore≥2)5名的血清的純化過敏原特異性的ige抗體效價(jià)的分析結(jié)果的圖。圖3是表示使用以粉塵螨為原因的過敏患者疾病(2名)的末梢血的過敏原活性評(píng)價(jià)(嗜堿性粒細(xì)胞上的cd203c表達(dá)增強(qiáng))的結(jié)果的圖。圖中百分?jǐn)?shù)表示解析對(duì)象細(xì)胞中的p4門(gate)內(nèi)分布(population)。具體實(shí)施方式粉塵螨蛋白質(zhì)本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)是選自以下的(a)～(c)中的蛋白質(zhì)、或其片段肽。(a)由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。(b)由在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、且具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)。(c)由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)。(a)的由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)為由粉塵螨，通過利用fplc的陰離子交換色譜分級(jí)(fraction)后，通過超濾法除去100kda以下的蛋白而進(jìn)行分離、純化的蛋白質(zhì)，具有以下的性質(zhì)。i)與以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者的血清中ige顯示結(jié)合反應(yīng)。ii)將以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者的嗜堿性粒細(xì)胞活化。iii)由sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)測(cè)定的分子量為約110kda。因此，該蛋白質(zhì)是與以derf1(分子量約27kda)、derf2(分子量約15kda)、derf3(分子量約29kda)為代表的公知的粉塵螨過敏原不同的(非專利文獻(xiàn)5)、新型的粉塵螨蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)中，只要具有粉塵螨過敏原活性，則包括由在該序列號(hào)2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(上述(b))。作為包含這樣的氨基酸序列的粉塵螨蛋白質(zhì)，可以列舉例如具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列的粉塵螨蛋白質(zhì)的同種型等。其中，被缺失、取代或添加的多個(gè)氨基酸是指例如1～10個(gè)、更優(yōu)選1～5個(gè)氨基酸。另外，上述的添加包括在兩末端的1～數(shù)個(gè)氨基酸的添加。本說明書中，“過敏原”是指引起過敏性疾病的原因物質(zhì)。另外，所謂“粉塵螨過敏原活性”不僅包括與肥大細(xì)胞上的ige結(jié)合、對(duì)特應(yīng)性的人引起速發(fā)型過敏反應(yīng)的活性(deweck,al.etal.,int.arch.allergyimmunol.,146:177-189,2008)，還包括僅與血清中的ige結(jié)合的活性(參照實(shí)施例2(i))。另外，本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)中，只要具有粉塵螨過敏原活性，則還包括將相當(dāng)于序列號(hào)2所示的氨基酸序列的序列適當(dāng)比對(duì)時(shí)，由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)((上述(c))。其中，與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的同一性優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為98％以上。該氨基酸序列的同一性例如能夠適用使用blast(國(guó)家生物信息中心基本局部比對(duì)搜索工具，basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiologicalinformation)，以可選參數(shù)為初期設(shè)定值進(jìn)行計(jì)算的方法。另外，本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)可以為融合蛋白質(zhì)質(zhì)這樣的較大蛋白質(zhì)的一部分。其中，作為融合蛋白質(zhì)中所添加的序列，可以列舉例如多重組氨酸殘基那樣有助于純化的序列、確保重組生產(chǎn)時(shí)的穩(wěn)定性的添加序列等。本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)可以僅是過敏原活性所必須的區(qū)域的片段肽。例如，優(yōu)選列舉包含特別是由以粉塵螨為原因的過敏患者疾病的t細(xì)胞所特異性識(shí)別的表位(t細(xì)胞表位)的部分片段。與hlaii類分子結(jié)合并抗原提呈的肽的長(zhǎng)度，從肽解析的結(jié)果(chicz,r.m.etal.,j.exp.med.,178:27-47,1993)來看，可以認(rèn)為由約10～34的氨基酸殘基構(gòu)成，因此至少包含1個(gè)t細(xì)胞表位的片段也包括這樣長(zhǎng)度的肽。t細(xì)胞表位能夠通過利用10mer～20mer左右的重疊肽的研究、例如jahn-schmidb.j.etal.,allergyclinimmunol.126(5):1068-71,2010、sone,t,etal.,j.immunol.,161:448-457,1998等中記載的方法來鑒定。編碼粉塵螨蛋白質(zhì)的聚核苷酸本發(fā)明的聚核苷酸編碼上述粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽，優(yōu)選列舉(d)由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸、(e)與由與序列號(hào)1所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)的聚核苷酸、(f)由與序列號(hào)1所示的堿基序列具有90％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成、且編碼具有粉塵螨過敏原活性的蛋白質(zhì)的聚核苷酸。(e)和(f)的聚核苷酸包括(d)的聚核苷酸的變異體。該變異體包括天然的等位基因變異體、使用該領(lǐng)域中公知的變異誘發(fā)技術(shù)能夠生成的天然不存在的變異體。本發(fā)明的聚核苷酸不僅包括雙鏈dna，還包括構(gòu)成其的正義鏈和反義鏈等各種單鏈dna、rna。反義鏈能夠作為探針等利用。dna包括例如由克隆、化學(xué)合成技術(shù)或它們的組合所得到的cdna、基因組dna等。此外，本發(fā)明的聚核苷酸中，除了本發(fā)明的編碼多肽的堿基序列以外，還可以包括非翻譯區(qū)(utr)的序列、載體序列(包含表達(dá)載體序列)等的堿基序列。這里，所謂嚴(yán)格條件，可以列舉例如molecularcloning:alaboratorymanual(secondedition,j.sambrooket.al,1989)中記載的條件等。即，可以列舉在含有6×ssc(1×ssc的組成：0.15m氯化鈉、0.015m檸檬酸鈉、ph7.0)、0.5％sds、5×denhardt和100mg/ml鯡魚精子dna的溶液中，與探針一起，在65℃恒溫8～16小時(shí)，使其雜交的條件等。另外，與序列號(hào)1所示的堿基序列的同一性優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為98％以上。該堿基序列的同一性能夠適用例如使用blast、將可選參數(shù)作為初期設(shè)定值進(jìn)行計(jì)算的方法。編碼粉塵螨蛋白質(zhì)的聚核苷酸的取得編碼本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)的聚核苷酸能夠由粉塵螨克隆，作為克隆方法，可以列舉已知的方法，例如使用鳥槍法、pcr法進(jìn)行的方法。例如，制備與本發(fā)明的聚核苷酸的堿基序列的一部分特異性雜交的探針，使用該探針對(duì)于基因組dna文庫(kù)或cdna文庫(kù)進(jìn)行篩選即可。作為這樣的探針，只要為與本發(fā)明的聚核苷酸或其互補(bǔ)鏈的至少一部分特異性雜交的探針，則可以使用任何序列和長(zhǎng)度的探針。另外，本發(fā)明的聚核苷酸也能夠通過用適當(dāng)?shù)脑砣〉门c包含本發(fā)明的聚核苷酸的一部分或全部的聚核苷酸雜交的序列來獲得。例如，可以列舉使用包含上述的本發(fā)明的聚核苷酸的一部分的聚核苷酸作為引物進(jìn)行的pcr法、使用包含上述的本發(fā)明的聚核苷酸的一部分的聚核苷酸作為探針的方法。例如，使用pcr等擴(kuò)增手段的方法，能夠通過從本發(fā)明的聚核苷酸的5'側(cè)和3'側(cè)的序列(或其互補(bǔ)序列)中分別制備引物，使用這些引物以基因組dna(或cdna)等為模板進(jìn)行pcr等擴(kuò)增反應(yīng)，將兩引物之間所夾的dna區(qū)域擴(kuò)增，由此大量取得包含該聚核苷酸的dna片段。另外，本發(fā)明中提供的聚核苷酸例如也能夠通過利用定向或隨機(jī)的變異導(dǎo)入法等方法，改變由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸來制作。這里，在定向地導(dǎo)入變異時(shí)的變異計(jì)劃例如能夠通過參考聚核苷酸序列上的特征性序列來進(jìn)行。另外，作為隨機(jī)地導(dǎo)入變異的方法，可以列舉例如pcr法、利用突變?cè)幚淼姆椒?。作為定向地?dǎo)入變異的方法，可以列舉部位特異性的突變誘導(dǎo)法，更具體而言，能夠使用例如site-directedmutagenesissystemmutan-superexpresskm試劑盒(takarabio)等進(jìn)行。另外，也能夠使用重組pcr法(pcrprotocols,academicpress,newyork,1990)。粉塵螨蛋白質(zhì)的制造本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)能夠從粉塵螨分離純化而得到。分離純化方法沒有特別限定，例如將粉塵螨提取液使用凝膠過濾、離子交換色譜法、親和色譜等現(xiàn)有公知的方法分離、純化即可。另外，也能夠?qū)⑼ㄟ^在適當(dāng)?shù)妮d體中插入本發(fā)明的聚核苷酸所制作的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使粉塵螨蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)，來采取。用于插入本發(fā)明的聚核苷酸的載體只要能夠在大腸桿菌、枯草桿菌等細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞等宿主中復(fù)制，就沒有特別限定，可以列舉例如質(zhì)粒dna、噬菌體dna等。表達(dá)載體的構(gòu)建所使用的載體dna可以使用廣泛普及的容易獲得的載體。例如可以列舉puc19(takarabio)、ptv118n(takarabio)、pmamneo(clontech)、pgex(gehealthcare)、pet160(invitrogen)、pdest(invitrogen)等。在使用該重組載體轉(zhuǎn)化宿主時(shí)，能夠使用原生質(zhì)體法、感受態(tài)細(xì)胞法、電穿孔法等進(jìn)行。作為宿主，沒有特別限制，能夠使用所有宿主，例如能夠使用動(dòng)物、源自動(dòng)物的細(xì)胞、植物、源自植物的細(xì)胞、微生物等。所得到的轉(zhuǎn)化體使用包含能夠利用的碳源、氮源、金屬鹽、維生素等的培養(yǎng)基在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)即可。能夠從這樣得到的培養(yǎng)液中，通過一般的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的收集、純化，得到本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)。以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽與源自以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者的血清中ige顯示高的反應(yīng)性，因此能夠作為以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑，能夠向患者給藥，并用于以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療。這里，以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療，具體是指對(duì)粉塵螨的特異性抗原為原因的所有過敏性疾病的預(yù)防或治療，作為該過敏性疾病，可以列舉例如特應(yīng)性支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、特應(yīng)性皮膚炎等。該以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療可以列舉例如對(duì)以粉塵螨為原因的過敏性疾病的過敏原免疫療法。另外，本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)為與以現(xiàn)有公知的derf1、derf2為代表的過敏原不同的蛋白質(zhì)，因此通過與它們組合，能夠成為更加有用的過敏原免疫療法。使用本發(fā)明的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑作為過敏原免疫療法劑的情況下，優(yōu)選將粉塵螨蛋白質(zhì)、或其片段肽直接或者干燥后制成粉末狀，或者根據(jù)需要通過常規(guī)方法添加一般使用的各種添加劑、例如穩(wěn)定劑、賦形劑、助溶劑、乳濁劑、緩沖劑、止痛劑、保存劑、著色劑等，調(diào)制成復(fù)方制劑。例如，能夠?qū)⒎勰畹谋患兓姆蹓m螨蛋白質(zhì)溶解到添加了苯酚的生理鹽水中，用作過敏原免疫療法用抗原的原液。在使用本發(fā)明的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑作為過敏原免疫療法劑的情況下，在投與時(shí)，能夠包含具有免疫賦活作用的佐劑。作為佐劑，能夠列舉例如完全弗氏佐劑(completefreund'sadjuvant(cfa))、不完全弗氏佐劑(incompletefreund'sadjuvant(ifa))、明礬、脂質(zhì)a、單磷酰脂質(zhì)a、卡介苗bcg(bacillus-calmette-guerrin)等的細(xì)菌制劑、cpg-dna、dsrna等的核酸、結(jié)核菌素等的細(xì)菌成分制劑、鑰孔血藍(lán)蛋白或酵母甘露聚糖等的天然高分子物質(zhì)、胞壁酰三肽和胞壁酰二肽或它們的衍生物、明礬(alum)、非離子性嵌段共聚物、白細(xì)胞介素2(il-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor)(gm-csf)、干擾素－α(ifn-α)、干擾素－β(ifn-β)等的細(xì)胞因子等，能夠使用它們中的1種或組合2種以上使用。佐劑也可以與本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)、或其片段肽以混合狀態(tài)、或作為乳液同時(shí)投與使用。本發(fā)明的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑能夠通過通常的給藥途徑例如經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)口、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、滴鼻等的給藥方法進(jìn)行。配合給藥形態(tài)，可以制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、含片、舌下片、糖漿劑、注射劑、栓劑、吸入劑、經(jīng)皮吸收劑、滴眼劑、滴鼻劑、鼻腔內(nèi)噴霧劑、濕布劑、濕敷劑、軟膏、乳劑、霜?jiǎng)┑鹊母鞣N劑型的制劑。本發(fā)明的以粉塵螨為原因的過敏性疾病的預(yù)防或治療劑的給藥量和給藥次數(shù)根據(jù)給藥途徑、癥狀等的不同而不同，例如能夠以每1次給藥量為約0.1μg～100mg的范圍的方式適當(dāng)選擇，以每周1次到數(shù)次左右給藥。以粉塵螨為原因的過敏性疾病的診斷本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽能夠成為以粉塵螨為原因的過敏性疾病診斷藥、具體而言對(duì)于以粉塵螨為原因的過敏性疾病的皮內(nèi)反應(yīng)診斷藥，通過將其少量注射到被測(cè)試者的皮內(nèi)，能夠掌握生物體對(duì)于粉塵螨的過敏狀態(tài)、免疫狀態(tài)，用于抗原的確定、疾病的診斷。在作為皮內(nèi)反應(yīng)診斷試劑使用的情況下，將通過上述方法取得的本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽例如進(jìn)行干燥后制成粉末狀，將其溶解于含有苯酚的生理鹽水中，稀釋使用。與粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽結(jié)合的結(jié)合蛋白質(zhì)與本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽結(jié)合的結(jié)合蛋白質(zhì)是能夠與本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)或其片段肽特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。作為結(jié)合蛋白質(zhì)，可以列舉例如免疫球蛋白(iga、igd、igg、igm、igy等)、fab段、f(ab')2段、單鏈抗體段(scfv)、單域抗體等(carter,pj.,nat.rev.immunol.,6：343-357,2006)的抗體分子、affibody、darpins、avimer等的抗體樣分子，作為抗體分子，可以列舉多克隆抗體、單克隆抗體(小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等)，但不限定于這些。上述結(jié)合蛋白質(zhì)能夠使用各種公知的方法制作，制作方法沒有特別限定。上述結(jié)合蛋白質(zhì)能夠在表達(dá)本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)的生物體或其組織或者細(xì)胞的鑒定等中利用。例如，能夠用于測(cè)定大氣中或室內(nèi)的空間或人的粘膜中的粉塵螨蛋白質(zhì)的有無(wú)等。該測(cè)定能夠通過公知的免疫學(xué)方法進(jìn)行，例如能夠通過elisa法進(jìn)行。另外，也能夠用于以粉塵螨為原因的過敏性疾病的治療。以下，利用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例限定。實(shí)施例實(shí)施例1源自粉塵螨的蛋白質(zhì)的純化將長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng)螨蟲后的培養(yǎng)基加濕干燥，通過180μm的篩后，分散在phosphatebufferedsaline(磷酸鹽緩沖溶液，pbs)中，立即通過53μm的篩，去除不溶物。將分散有排泄物的pbs在37℃靜置2小時(shí)，提取可溶性成分。在4℃以5,000rpm離心30分鐘，將上清分離，用分級(jí)分子量12,000-14,000的透析膜透析2天，去除低分子成分。將其使用離心濃縮器(vivaspin20、mwco10kda)濃縮，得到粗提取物。在粗提取物中加入10倍量的20mmtris-hcl(ph9.0)后，上樣于陽(yáng)離子柱(vivapuresmaxim)，離心(500g、5分)后，回收洗脫組分。將洗脫組分上樣于陰離子色譜柱(unoq1ml、bio-rad)，以0～1m的nacl梯度使其洗脫?；厥蘸心繕?biāo)蛋白質(zhì)的組分，使用離心濃縮器(vivaspin6、mwco100kda)去除低分子組分，得到純化蛋白質(zhì)。將純化蛋白質(zhì)用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)解析的結(jié)果表示在圖1中。實(shí)施例2純化抗原的過敏原活性確認(rèn)(i)與以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者血清ige的反應(yīng)性的確認(rèn)制備本發(fā)明蛋白質(zhì)以及已知的螨蟲抗原(derf1)20μg/ml溶液，以成為1μg/50μl/孔的方式添加在maxisorp96孔板(nunc)中后，在4℃靜置一晩，由此使抗原固相化。第二天將板清洗后，添加含有1％牛血清白蛋白的pbs，在室溫靜置1小時(shí)，由此實(shí)施封閉。在板清洗后，添加5倍稀釋的患者血清，在室溫靜置2小時(shí)。作為陰性對(duì)照，使用市售的人ab型血清(cellect(r)humanabserum；mpbiomedicals)。板清洗后，添加以含有1％牛血清白蛋白的pbs稀釋7000倍的2次抗體(hrp標(biāo)記山羊抗人ige抗體、novus)，室溫靜置40分鐘。清洗板后，用tmbsubstratereagentset(tmb底物試劑盒)(bdbiosciences)通過室溫靜置以遮光狀態(tài)實(shí)施20分鐘tmb顯色。結(jié)束后，通過添加1n硫酸，使顯色停止，微孔板檢測(cè)器測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光度。將其結(jié)果表示在圖2中。(ii)以粉塵螨為原因的過敏性疾病患者嗜堿性粒細(xì)胞的活化已知在被過敏原刺激的嗜堿性粒細(xì)胞中，cd203c的表達(dá)增強(qiáng)(deweck,al.etal.,int.arch.allergyimmunol.,146:177-189,2008)。根據(jù)該原理，使用allergenicity試劑盒(beckmancoulter)，分析患者血液中的嗜堿性粒細(xì)胞活化。在肝素采血的全血100μl中加入本發(fā)明蛋白質(zhì)過敏原溶液(最終濃度1～100ng/ml)20μl和包含cd3-pc7、crth2-fitc和cd203c-pe的抗體混合物20μl，在37℃孵育15分鐘。加入反應(yīng)停止液100μl和溶血固定液2ml，在室溫反應(yīng)10分鐘。離心(200xg、5分鐘)之后，去除上清，加入磷酸緩沖液(pbs)3ml，再離心。去除上清后，將細(xì)胞懸浮于加有0.1％甲醛的pbs，利用流式細(xì)胞儀(facscanto、bdbiosciences)測(cè)定。對(duì)于所得到的數(shù)據(jù)，以cd3-pc7陰性且crth2-fitc陽(yáng)性為指標(biāo)，選擇血球中的嗜堿性粒細(xì)胞，分析cd203c的表達(dá)強(qiáng)度。將其結(jié)果表示于圖3。與僅添加pbs時(shí)相比，確認(rèn)到添加過敏原時(shí)的cd203c的表達(dá)增強(qiáng)。實(shí)施例3堿基序列和氨基酸序列的確定＜部分內(nèi)部氨基酸序列的確定＞為了明確本發(fā)明蛋白質(zhì)內(nèi)部的部分氨基酸序列，對(duì)利用蛋白酶有限酶解得到的片段進(jìn)行解析。將純化蛋白50μg進(jìn)行sds-page后，將分子量110kda條帶附近的凝膠切碎，在1ml的純化水中進(jìn)行攪拌、清洗(20分鐘×2次)。添加300μl的7mol/l胍/0.5mol/ltris-hcl/0.01mol/ledta(ph8.5)和10μl的2-巰基乙醇，進(jìn)行氮置換和超聲波處理后，通過在室溫靜置2小時(shí)進(jìn)行還原。接著，添加10μl的4-乙烯基吡啶，在進(jìn)行氮置換和超聲波處理(1分鐘)之后，在室溫靜置30分鐘，由此進(jìn)行烷基化。將反應(yīng)液廢棄后，新加入1ml的0.1vol％三氟乙酸，確認(rèn)為酸性后，攪拌1小時(shí)。將溶液廢棄，在1ml的0.025mol/l碳酸氫銨/50vol％乙腈中攪拌(20分鐘×2次)。將溶液廢棄，在1ml的乙腈中攪拌5分鐘后，將溶液廢棄，用離心蒸發(fā)器將凝膠減壓干燥固化。將溶解于0.025mol/l碳酸氫銨的賴氨酰內(nèi)肽酶以酶/底物比1/20添加，在冰上靜置，使凝膠膨潤(rùn)1小時(shí)。追加0.025mol/l碳酸氫銨，使溶液完全浸透凝膠，之后再在37℃反應(yīng)17小時(shí)，回收反應(yīng)液([1]液)。為了提取肽，在剩余的凝膠中添加100μl的0.1vol％三氟乙酸/50vol％乙腈，攪拌20分鐘后，回收提取液([2]液)。進(jìn)而在100μl的乙腈中攪拌20分鐘后，回收提取液([3]液)。將[1]～[3]液混合并減壓濃縮后，加入反相高效液相層析(xbridgec18)，以乙腈0～80重量％的梯度進(jìn)行洗脫、分級(jí)。收集主要的2個(gè)肽，利用蛋白測(cè)序(procise492clc；appliedbiosystems)進(jìn)行n末端氨基酸序列解析的結(jié)果，得到了thr-asp-asp-phe-phe-pro-tyr-ala-ser-asp-glu-his-ala-tyr-trp-thr-gly-tyr-phe-thr〔部分氨基酸序列1(序列號(hào)3)〕和gln-gly-asp-tyr-val-glu-phe-asp-phe-val-val-gly-pro-ile-x-val〔部分氨基酸序列2(序列號(hào)4)〕。＜粉塵螨rna的提?。緩脑谝后w氮中凍結(jié)的粉塵螨中，使用rneasyminikit(qiagen)按照以下的操作提取rna。對(duì)粉塵螨10mg，加入600μlbufferrlt，通過18g注射針進(jìn)行破碎。將粉塵螨懸濁液加入到qiashredder旋轉(zhuǎn)柱(qiagen)進(jìn)行離心(15000rpm2分鐘)，回收穿柱液。在回收的rna溶液中添加70％乙醇水溶液600μl后，添加于rneasymini柱中，進(jìn)行離心(10000rpm15秒)。進(jìn)而將柱用bufferrw1350μl清洗后，用rnase-freednaseset(qiagen)進(jìn)行dnase處理。將柱用bufferrw1350μl清洗后，按照rneasyminikit的操作說明進(jìn)行rna的純化。純化后，添加rnasefreeh2o30μl，回收總rna(totalrna)。＜粉塵螨cdna的制作＞從所得到的總rna中，使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr(invitrogen)合成cdna。將總rna3μg懸浮于8μl的純化水中，加入oligo(dt)201μl、10mmdntp1μl后，在65℃孵育5分鐘。在冰上冷卻2分鐘后，加入10xrtbuffer2μl、25mmmgcl21μl、0.1mdtt2μl、rnaseout(40u/μl)1μl、superscriptiiireversetranscriptase1μl并混合。在50℃孵育50分鐘后，在85℃進(jìn)行5分鐘處理，停止反應(yīng)。＜cdna序列的確定＞由所得到的部分氨基酸序列3、4設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。作為相當(dāng)于部分氨基酸序列3的正義引物，設(shè)計(jì)primer1及其下游的primer2。同樣作為相當(dāng)于部分氨基酸序列4的反義引物，設(shè)計(jì)primer3及其上游的primer4。使用這些引物，以螨蟲cdna為模板，進(jìn)行利用kodfxneo(toyobo)的巢式pcr。將pcr產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠(nacalaitesque)上電泳后，將包含擴(kuò)增的條帶的凝膠片段用wizardsvgelandpcrclean-upsystem(promega)純化。純化的pcr產(chǎn)物使用primer2、primer4的引物進(jìn)行利用kodfxneo的pcr，將pcr產(chǎn)物用wizardsvgelandpcrclean-upsystem(promega)純化。純化后，使用bigdyexterminatorkit(appliedbiosystems)和dna測(cè)序儀(3130xl；appliedbiosystems)分析堿基序列，取得中間序列。接著，為了分析3'側(cè)序列，使用5'/3'racekit2ndgeneration(roche)，制作在3'末端添加了錨序列的粉塵螨cdna。使用根據(jù)由中間序列得到的序列設(shè)計(jì)的primer5、primer6的2階段的引物，進(jìn)行利用kodfxneo的巢式pcr。分析所得到的pcr產(chǎn)物的堿基序列，取得3'末端序列。通過中間序列和3'末端序列的解析，取得1850bp的部分序列。對(duì)與該部分序列具有相同性的蛋白質(zhì)利用ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)果得知，與capitellateleta(海蠕蟲)的假定蛋白captedraft_151096(genbank:elt89240.1)的相同性為37％，與lottiagigantean(霸王蓮花青螺)的假定蛋白lotgidraft_207233(genbank:eso84761.1)的相同性為40％，與amphimedonqueenslandica(大堡礁海綿)的predicted:lysosomalalpha-mannosidase-like(溶酶體α-甘露糖苷酶樣)(ncbireferencesequence:xp_003383866.1)的相同性為47％。因此，分析elt89240.1、eso84761.1、xp_003383866.1之間的相同序列，設(shè)計(jì)對(duì)于在n末端附近氨基酸序列一致的區(qū)域的簡(jiǎn)并引物primer7、primer8。利用由中間序列設(shè)計(jì)的primer9、primer10和primer7、primer8，從粉塵螨cdna使用kodfxneo實(shí)施巢式pcr。分析所得到的pcr產(chǎn)物的堿基序列，取得5'側(cè)的部分序列。進(jìn)而為了分析5'側(cè)序列，使用smarterracecdna擴(kuò)增試劑盒(clontech公司)實(shí)施5'race法。將粉塵螨總rna使用nucleotrapmrnamini(macherey-nagel)純化粉塵螨polyamrna。使用純化的polyamrna用smarterracecdna擴(kuò)增試劑盒取得在5'末端包含接頭序列的cdna。對(duì)該cdna用由5′側(cè)部分序列設(shè)計(jì)的primer11用primestarhsdna聚合酶(takarabio)進(jìn)行降落pcr。關(guān)于反應(yīng)條件，按照smarterracecdna擴(kuò)增試劑盒的操作說明。分析所得到的pcr產(chǎn)物的堿基序列，由此取得直到5′側(cè)末端的序列。[表1]使用引物primer15’-cngaygayttyttyccntayg-3’序列號(hào)5primer25’-gaygarcaygcntaytgga-3′序列號(hào)6primer35’-aartcraaytcnacrtartcnc-3’序列號(hào)7primer45’-raaytcnacrtartcnccytg-3’序列號(hào)8primer55’-gttggtcataaaggacaacg-3’序列號(hào)9primer65’-tcggtatcgttcaagaagta-3’序列號(hào)10primer75’-gtnccncayacncaygayg-3’序列號(hào)11primer85’-ncaygaygaygtnggntgg-3’序列號(hào)12primer95’-ttgtggccacacttttacgtccag-3′序列號(hào)13primer105’-ccattgcttcacgtaatctt-3’序列號(hào)14primer115’-agccatttcccgggaatgaccaaatg-3’序列號(hào)15表中r＝a+g、y＝c+t、n＝a+t+g+c的混合堿基編碼本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)的cdna由3006bp的orf構(gòu)成。由堿基序列推定的氨基酸數(shù)為1002aa。根據(jù)信號(hào)序列預(yù)測(cè)軟件(signalp4.1、http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)的解析，最初的27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。因此，作為天然物的本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)為975aa，由該氨基酸序列預(yù)測(cè)的本發(fā)明的粉塵螨蛋白質(zhì)的分子量為113.5kda。該預(yù)測(cè)分子量與sds-page的分子量約110kda一致。使用ncbi的blast檢索進(jìn)行由所確定的堿基序列推定的氨基酸序列的相同性檢索，結(jié)果顯示與以derf1、derf2為代表的已知的derf由來過敏原沒有相同性，為新型的蛋白質(zhì)。序列表<110>大鵬藥品工業(yè)株式會(huì)社<120>新型粉塵螨蛋白質(zhì)<130>th0094<150>jp2014-244038<151>2014-12-02<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>3006<212>dna<213>粉塵螨<220><221>cds<222>(1)..(3006)<220><221>sig_peptide<222>(1)..(81)<220><221>mat_peptide<222>(82)..(3006)<400>1atggattatcataatctatcattattggtggtggctctattgtctgtg48metasptyrhisasnleuserleuleuvalvalalaleuleuserval-25-20-15accatattcacaacaattcaacaatctgaatcggttgttattaaagtg96thrilephethrthrileglnglnsergluservalvalilelysval-10-5-115gaaaatctgccagaacgttgtgattattcacaatgtccaaaatgggat144gluasnleuprogluargcysasptyrserglncysprolystrpasp101520cctaatgatattaatgtacatttggtggcccatacacatgatgatgtt192proasnaspileasnvalhisleuvalalahisthrhisaspaspval253035ggttggttaaaaacggtggaacaatattattatggcctaaaaaatgat240glytrpleulysthrvalgluglntyrtyrtyrglyleulysasnasp404550attcaacgtgccggagtgcaatatattttggatacagtaattgaagaa288ileglnargalaglyvalglntyrileleuaspthrvalilegluglu556065ttaatacgtaataaacaacgacgttttatttatgttgagattgcattc336leuileargasnlysglnargargpheiletyrvalgluilealaphe70758085ttttggaaatggtggcaagaacaagatgaagatcaacgtatgatcgta384phetrplystrptrpglngluglnaspgluaspglnargmetileval9095100cgagaattagtacgtactggacaattggaatttattaatggtggctgg432arggluleuvalargthrglyglnleuglupheileasnglyglytrp105110115tcaatgccagatgaagcagcaacacattataattcacttattgatcaa480sermetproaspglualaalathrhistyrasnserleuileaspgln120125130tctacatggggtctaagacaattgaatgatacattcggtaaatgtggt528serthrtrpglyleuargglnleuasnaspthrpheglylyscysgly135140145catccaaaagtaacatggcaaattgatccatttggtcattcccgggaa576hisprolysvalthrtrpglnileasppropheglyhisserargglu150155160165atggctaatctttatgcacagatgggttatgatgcattattttttgca624metalaasnleutyralaglnmetglytyraspalaleuphepheala170175180cgtcaagattatcaagatcgtgaaaatcgtatgacaaatcgtaaattg672argglnasptyrglnasparggluasnargmetthrasnarglysleu185190195gaacatgtatggcaaggatcagatgatcttggtactgctggtgatata720gluhisvaltrpglnglyseraspaspleuglythralaglyaspile200205210ttcactggtatgatgtttagtggttatggacctattgaattcaattgg768phethrglymetmetpheserglytyrglyproileglupheasntrp215220225gatataacaaatggccccgaagatgctgttgttgataatcctgagtca816aspilethrasnglyprogluaspalavalvalaspasnprogluser230235240245gaagaatataatgttccggataaaatacgacgttttgtggaaaaagca864gluglutyrasnvalproasplysileargargphevalglulysala250255260aaatattttgcacagtattatgcaacaaatcattttatgtttccaatg912lystyrphealaglntyrtyralathrasnhisphemetphepromet265270275ggtacggattttcaatatggtgatgcacatacatggtttaaaaatctg960glythrasppheglntyrglyaspalahisthrtrpphelysasnleu280285290gataaattgatcaaagctgtaaataatgctggaaaaggtgttcgggca1008asplysleuilelysalavalasnasnalaglylysglyvalargala295300305ttctattcaacaccatcatgctatgcacgtgcattatatgaaacgaat1056phetyrserthrprosercystyralaargalaleutyrgluthrasn310315320325cgtacatggaccacgaaaacagatgatttttttccctatgcatcagat1104argthrtrpthrthrlysthraspaspphepheprotyralaserasp330335340gaacatgcatattggactggatatttcaccagtagaccggctttaaaa1152gluhisalatyrtrpthrglytyrphethrserargproalaleulys345350355cgtatggaacgtatgggcaataatctattacaagcatgtaaacaattg1200argmetgluargmetglyasnasnleuleuglnalacyslysglnleu360365370gatattttggccggaaatgatggacgttttgaaatgaatataacaaga1248aspileleualaglyasnaspglyargpheglumetasnilethrarg375380385ttacgtgaagcaatgggtgtcatgcaacatcatgatgctgtaaccgga1296leuargglualametglyvalmetglnhishisaspalavalthrgly390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