發(fā)明領域本發(fā)明涉及可用于治療真菌病的化合物，包含其的組合物及其在治療中的用途。發(fā)明背景真菌感染的發(fā)病率在過去二十年中大幅增加，侵入性形式是發(fā)病率和死亡率的主要原因，特別是在免疫功能低下或免疫抑制患者中。傳播性念珠菌病、肺曲霉菌病和新出現的機會性真菌是產生這些嚴重真菌病的最常見的因素。真菌的一種特殊特征是它們能夠產生將其結合在一起的細胞外基質(ecm)，并使得它們能夠粘附于它們在體外或體內的底物上。這些生物膜用于保護其對抗宿主免疫系統(tǒng)的敵對環(huán)境并抵抗被抗菌劑殺死(kaur和singh,2013)。肺曲霉病可以分為那些患有非侵入性疾病的患者與患有侵入性疾病的患者。使用另外的亞分類來表征與未出現此類情況的患者相比的出現曲霉病的過敏癥狀(稱為abpa；過敏性支氣管肺曲霉病)的患者。引發(fā)肺曲霉病的因素可能是急性的，例如接觸高劑量的免疫抑制藥物或重癥監(jiān)護室插管?；蛘撸淇梢允锹缘?，例如以前感染結核病(denning等人,2011a)。慢性肺部感染曲霉菌可使患者產生廣泛而持續(xù)的肺損傷，需要用口服唑類藥物終身治療(limper等人,2011)。越來越多的研究表明，曲霉菌感染可能在臨床哮喘中發(fā)揮重要作用(chishimba等人,2012；pasqualotto等人,2009)。此外，最近出版的著作將曲霉菌感染與copd患者中較差的臨床結果相關聯(bafadhel等人,2013)。類似地，交叉部分研究已顯示了在痰液中曲霉菌屬物種(aspergillusspp.)和假絲酵母屬物種(candidaspp.)的存在與肺功能惡化之間的關聯(chotirmall等人,2010；agbetile等人,2012)。侵入性曲霉病(ia)在免疫受損患者，例如接受同種異體干細胞移植或實體器官移植(如肺移植)的患者中表現出高死亡率。在免疫受損患者中報告的ia的第一例發(fā)生在1953年。這一事件與將皮質類固醇和細胞毒性化學療法引入治療方案同時發(fā)生(rankin，1953)。鑒于其高發(fā)病率和相關死亡率，侵入性曲霉病是在治療白血病和其它血液惡性腫瘤中的主要顧慮。盡管口服三唑類藥物(salmeron等人，2012)有可用性，但同種異體造血干細胞移植受者中的死亡率通常也超過了50％(lin等人，2001)，長期死亡率可達90％。在進行實體器官移植(特別是肺)的患者中，使用高劑量的類固醇使患者易于感染(thompson和patterson，2008)，這是一個嚴重的問題。這些疾病也出現在不太嚴重的免疫功能受損的患者群體中。這些患者包括患有copd或硬化的患者、接受高劑量類固醇的患者和配有中央靜脈導管或通過機械通氣支持的個體(dimopoulos等人，2012)?，F有的抗真菌藥物以口服或全身性給藥為主。由于在感染部位達到的藥物濃度傾向于低于在器官的濃度，所以這些通常使用的遞送途徑不足以治療肺氣道感染。對于肝臟而言尤其如此，這是一個毒性部位：高達15％的用伏立康唑治療的患者出現轉氨酶水平升高(levin等人，2007；lat和thompson，2011)。肝臟接觸也導致由肝p450酶的抑制所引起的顯著的藥物相互作用(jeong，等人，2009；wexler等人，2004)。此外，在診所和農業(yè)中廣泛使用三唑類導致了一些地方出現耐藥性真菌病的增長和問題發(fā)生(denning等人，2011b；bowyer和denning，2014)。顯而易見地是，對于提供具有改善的功效和更好的系統(tǒng)耐受性特征的新型抗真菌藥物仍有急迫的醫(yī)療需求。發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了化合物(i)其是：4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)-n-(4-氟苯基)苯甲酰胺，及其可藥用鹽(下文有時稱作“本發(fā)明化合物”)。下文公開的生物學數據揭示了本發(fā)明化合物(化合物(i))在體外試驗中是煙曲霉生長的有效抑制劑。在免疫抑制的小鼠中，化合物(i)表現出對煙曲霉感染的強烈抑制作用。本文描述了化合物(i)的其它所需特性。附圖簡述圖1顯示了用化合物(i)進行的預防性和治療性治療對煙曲霉感染的免疫受損的嗜中性粒細胞減少癥小鼠的肺中的cfu的效果。圖2和圖3分別顯示了在煙曲霉感染的免疫受損的嗜中性粒細胞減少癥小鼠中用化合物(i)進行的預防性和治療性治療對balf和血清中半乳甘露聚糖濃度的效果。在圖1-3中，符號***是指顯著性，p<0.001。發(fā)明詳述流程1：經途徑1-3制備化合物(i)。已經開發(fā)了用于從市售的起始原料生成化合物(i)的三種可選的匯聚式合成途徑，如上所述(流程1)。這些合成方法在制備式(iv)的高級苯甲酸酯中間體的方式上不同。途徑1在通常用于這種反應的條件下，適當保護的哌嗪衍生物(xii)與4-溴-2-甲基苯酚(xiva)的buchwald偶聯提供單n-芳基化哌嗪(xi)。用于這種轉化的合適的氮保護基團是使用boc基團(p＝co2tbu)作為氨基甲酸酯。本領域技術人員應當理解，可以使用許多種條件來影響這種轉換。具體而言，鈀催化劑和膦配體如ruphosg3和ruphos通常在堿的存在下使用，例如碳酸銫或六甲基二硅烷基氨基鋰。在堿性條件下，使用甲苯磺酸酯(ix)將所得的酚(xi)進行烷基化產生醚(vii)。甲苯磺酸酯(ix)是一種結構穩(wěn)定的非揮發(fā)性(固體)試劑，可從商業(yè)來源廣泛獲得，具有高對映體純度；盡管其它親電子衍生物如相應的甲磺酸酯以及鹵代甲基(例如氯甲基和溴甲基)衍生物可被預期用作該轉化的合適的替代物。除去氮保護基釋放出單取代的哌嗪(v)。在boc衍生物(rb＝co2tbu)的情況下，胺脫保護步驟通常通過將氨基甲酸酯暴露于強無機酸或強有機酸如tfa，在無溶劑條件下或在溶劑例如dcm的存在下進行。胺(v)與4-溴苯甲酸烷基酯(vi)的第二次buchwald偶聯在堿性條件下和催化劑的作用下，產生了n,n′-二芳基化產物(iv)，其中ra表示低級烷基，例如c1-5烷基，例如甲基或乙基或叔丁基。途徑2苯甲酸酯中間體(iv)可以在僅需要單一鈀介導的偶聯的替代方法中獲得。在標準buchwald偶聯條件下，溴酚(xiva)與單n-芳基化哌嗪衍生物[(x)，ra＝低級烷基，例如c1-5烷基，例如甲基或乙基或叔丁基]的反應生成1,4-二芳基哌嗪(viii)。如上所述，該酚類產物與甲苯磺酸酯(ix)的o-烷基化提供了直接從市售的起始原料經兩個步驟得到醚產物(iv)。途徑3從上述制備路徑(流程1)可以看出，在某些情況下，有利的是以不同的順序進行相同或相似的合成轉化，從而提高該方法的總體效率和/或從其所獲的物質的質量。例如，通過以相反的順序進行上述兩個步驟，溴酚(xiva)可以轉化成式(iv)化合物。以這種方式，用甲苯磺酸酯(ix)處理所述苯酚獲得式(xiii)的醚衍生物。該芳基溴化物底物可以與式(x)的n-芳基哌嗪在如上所述的buchwald偶聯條件下反應，得到式(iv)中間體，從中間體(iv)制備化合物(i)在某些情況下，例如其中ra是甲基或乙基的那些，通過在水存在下用堿處理酯(iv)可以方便地生成游離苯甲酸(ii)。通常的條件包括用堿金屬氫氧化物如氫氧化鋰在水和合適的水溶性溶劑的混合物中進行處理。在其它情況下，如在叔丁酯的情況下，在酸性條件下進行水解步驟可能是有利的。用于這種相互轉化的常用試劑包括在水溶性有機溶劑如ipa的存在下的強無機酸，例如鹽酸。在本領域廣泛使用的標準酰胺偶聯條件下用4-氟苯胺處理苯甲酸產物(ii)，提供了本發(fā)明的化合物，即化合物(i)。例如，反應可以通過在非親核有機堿(通常為dipea等)存在下，在極性非質子溶劑如dmf中將酸(ii)和4-氟苯胺與偶聯試劑hobt和edci混合來進行。流程2：通過途徑4制備化合物(i)途徑4本發(fā)明的化合物還可以使用本文所述制備技術的另一種變通方案(流程2)來配制。在該替代方法(途徑4)中，酰胺鍵形成作為第一步進行，并且醚連接的生成構成最后的合成轉化。用4-氟苯胺(iii)與4-溴苯甲酰氯(xx)的?；玫奖郊柞０菲?xix)。如已經提到的，這樣的酰胺產物可以直接使用多種活化劑(包括肽偶聯試劑)由相應的胺和苯甲酸制備，其在本領域內具有廣泛的選擇。將芳基溴化物產物用合適的單保護哌嗪(xii)經buchwald偶聯條件在催化劑的作用下以上述方式進行反應，產生式(xviii)的中間體。在boc保護基團[p＝co2tbu]的情況下，通過短時間暴露于強酸可容易地獲得所需的n-芳基哌嗪(xvii)，例如通過用tfa處理，隨后經減壓蒸發(fā)將其從反應介質中方便地除去。然后分兩步從與溴-苯甲醚(xivb)的第二次buchwald偶聯得到甲基醚中間體[(xvi)rc＝me]，隨后用三溴化硼進行o-脫烷基化，得到化合物(i)的酚類前體[(xv)；rc＝h]。然后將苯酚(xv)通過前述方式用甲苯磺酸酯試劑(ix)重新烷基化而轉化為化合物(i)。保護基團及其去除方式如“protectivegroupsinorganicsynthesis”，theodoraw.greene和peterg.m.wuts,由johnwiley&sonsinc出版；第4版，2006,isbn-10:0471697540中所述。關于制備酰胺的方法綜述包含于：“amidebondformationandpeptidecoupling”montalbetti,c.a.g.n.和falque,v.tetrahedron,2005,61,10827-10852。因此，本發(fā)明還提供了制備化合物(i)或其可藥用鹽的方法，其包括將式(ii)化合物：其中ra代表氫；或其活化衍生物(例如酰鹵如酰氯或酸酐)；或其鹽；與式(iii)化合物反應：或其鹽。本發(fā)明還提供了制備化合物(i)或其可藥用鹽的方法，其包括將式(xv)化合物：或其鹽；與式(ix)化合物反應:其中：z代表離去基團，例如對甲苯基so2o；或其鹽。式(i)化合物的可藥用鹽特別包括所述化合物的可藥用酸加成鹽。式(i)化合物的可藥用酸加成鹽意圖包括式(i)化合物能夠形成的治療活性無毒的酸加成鹽。這些可藥用酸加成鹽可以方便地通過在合適的溶劑或溶劑混合物中用合適的酸處理游離堿形式來獲得。合適的酸包括例如無機酸，例如氫鹵酸，如鹽酸或氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有機酸，例如乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)拉酸、水楊酸、對氨基水楊酸、雙羥萘酸等。相反，所述鹽形式可以通過用合適的堿處理轉化為游離堿形式。式(i)化合物的定義意圖包括所述化合物的所有互變異構體。式(i)化合物的定義意圖包括所述化合物的所有溶劑合物(包括所述化合物的鹽的溶劑合物)，除非上下文另有具體說明。溶劑合物的實例包括水合物。本公開物的化合物包括其中指定的一個或多個原子是天然存在或非天然存在的同位素的實施方案。在一個實施方案中，同位素是穩(wěn)定的同位素。因此，本公開物的化合物包括例如含氘化合物等。本公開物還延伸到本文定義的化合物的所有多晶型物。如本文所述式(ii)、(iv)、(v)、(vii)、(viii)、(xiii)和(xv)的新中間體及其鹽，形成本發(fā)明另一方面。鹽包括可藥用鹽(例如上述那些)和非可藥用鹽。酸(例如羧酸)的鹽包括第一和第二族金屬鹽，包括鈉、鉀、鎂和鈣鹽。在一個實施方案中，提供了包含任選與一種或多種可藥用稀釋劑或載體組合的本發(fā)明化合物的藥物組合物。適當地，本發(fā)明的化合物經肺或鼻局部施用，特別是經肺局部施用。因此，在一個實施方案中，提供了包含任選與一種或多種局部可接受的稀釋劑或載體組合的本發(fā)明化合物的藥物組合物。用于肺或鼻內施用的合適的組合物包括粉末、液體溶液、液體懸浮液、包含溶液或懸浮液或加壓或非加壓氣溶膠的滴鼻劑。該組合物可以方便地以單位劑型施用，并且可以通過制藥領域眾所周知的任何方法制備，例如如remington'spharmaceuticalsciences,第17版,mackpublishingcompany,easton,pa.,(1985)中所述。該組合物還可以方便地以多個單位劑型施用?？梢酝ㄟ^使用非加壓制劑如水溶液或懸浮液來實現對鼻子或肺的局部給藥。這樣的制劑可以通過噴霧器例如可以手持和便攜式或家庭或醫(yī)院使用(即不便攜式)。一種示例裝置是respimat吸入器。該制劑可以包含賦形劑如水、緩沖劑、張力調節(jié)劑、ph調節(jié)劑、粘度調節(jié)劑、表面活性劑和共溶劑(如乙醇)。混懸液和氣溶膠制劑(無論是加壓還是未加壓)通常以精細粉碎形式包含本發(fā)明的化合物，例如用0.5-10μm的d50，例如約1-5μm。可以使用d10、d50和d90值來表示粒度分布。顆粒尺寸分布的d50中值被定義為將分布分成兩半的微米粒度。從激光衍射得到的檢測結果更準確地描述為體積分布，并因此使用該方法獲得的d50值更有意義地稱為dv50值(體積分布的中值)。如本文所用，dv值是指使用激光衍射檢測的粒度分布。類似地，在激光衍射背景下使用的d10和d90值被認為是指dv10和dv90值，并且分別是指分布的10％低于d10值的粒徑，并且90％的分布低于d90值。根據本發(fā)明的一個具體方面，提供了包含懸浮在水性介質中的顆粒形式的本發(fā)明化合物的藥物組合物。水性介質通常包含水和一種或多種選自緩沖劑、張力調節(jié)劑、ph調節(jié)劑、粘度調節(jié)劑和表面活性劑的賦形劑。也可以通過使用氣溶膠制劑來實現對鼻子或肺的局部給藥。氣溶膠制劑通常包含懸浮或溶解在合適的氣溶膠推進劑如氯氟烴(cfc)或氫氟烴(hfc)中的活性成分。合適的cfc推進劑包括三氯一氟甲烷(推進劑11)、二氯四氟甲烷(推進劑114)和二氯二氟甲烷(推進劑12)。合適的hfc推進劑包括四氟乙烷(hfc-134a)和七氟丙烷(hfc-227)。推進劑通常包含40％-99.5％例如40％-90％總吸入組合物重量。該制劑可以包含賦形劑，包括共溶劑(例如乙醇)和表面活性劑(例如卵磷脂、脫水山梨糖醇三油酸酯等)。其它可能的賦形劑包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。氣溶膠制劑包裝在罐中，并且通過計量閥(例如由bespak、valois或3m提供，或者由aptar、coster或vari提供)提供合適的劑量。也可以通過使用干粉制劑來實現對肺的局部施用。干粉制劑將以細碎形式包含本公開物的化合物，通常具有1-10μm的mmd或0.5-10μm的d50，例如約1-5μm。細碎形式的本發(fā)明化合物的粉末可以通過微粉化方法或類似的尺寸減小方法制備。微粉化可以使用諸如由hosokawaalpine制造的噴射磨機進行。可以使用激光衍射(例如使用malvernmastersizer2000s儀器)檢測所得的粒度分布。該制劑通常含有局部可接受的稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖或甘露醇(優(yōu)選乳糖)，通常具有比較大的粒度，例如50μm或以上的mmd，例如100μm或以上或者d50為40-150μm。如本文所用，術語“乳糖”是指含乳糖的組分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、無水α-乳糖、無水β-乳糖和無定形乳糖。可以通過微粉化，篩分，研磨，壓縮，附聚或噴霧干燥來處理乳糖成分。還包括各種形式的市售形式的乳糖，例如(吸入級乳糖；dfepharma)、70(干粉吸入器的篩分乳糖；meggle)、(dfepharma)和(篩選吸入級乳糖；dfepharma)產品。在一個實施方案中，乳糖組分選自α-乳糖一水合物、無水α-乳糖和無定形乳糖。優(yōu)選地，乳糖是α-乳糖一水合物。干粉制劑還可以含有其它賦形劑，例如硬脂酸鈉、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂。干粉制劑通常使用干粉吸入器(dpi)裝置遞送。干粉遞送系統(tǒng)的實例包括spinhaler、diskhaler、turbohaler、diskus、skyehaler、accuhaler和clickhaler。干粉遞送系統(tǒng)的其它實例包括eclipse、next、rotahaler、handihaler、aeroliser、cyclohaler、breezhaler/neohaler、monodose、flowcaps、twincaps、x-caps、turbospin、elpenhaler、miathaler、twisthaler、novolizer、pressair、ellipta、oriel干粉吸入器、microdose、pulvinal、easyhaler、ultrahaler、taifun、pulmojet、omnihaler、gyrohaler、taper、conix、xcelovair和prohaler。本發(fā)明的化合物也可以局部施用于另一種內部或外部表面(例如粘膜表面或皮膚)或口服施用。本發(fā)明的化合物可以常規(guī)配制用于這種給藥途徑。本發(fā)明的化合物可用于治療真菌病和預防或治療與真菌病相關的疾病。在本發(fā)明的一個方面，提供了本發(fā)明化合物在制備用于治療真菌病和用于預防或治療與真菌病相關的疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的另一方面，提供了治療患有真菌病的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量的本發(fā)明化合物。在本發(fā)明的另一方面，提供了預防或治療個體中與真菌病相關的疾病的方法，其包括向所述個體施用有效量的本發(fā)明化合物。具體而言，真菌病可以由曲霉屬物種(aspergillusspp.)引起，例如煙曲霉(aspergillusfumigatus)或出芽曲霉(aspergilluspullulans)，尤其是煙曲霉(aspergillusfumigatus)。真菌病還可由假絲酵母屬物種(candidaspp.)，例如白色假絲酵母(candidaalbicans)或光滑假絲酵母(candidaglabrata)，根霉屬物種(rhizopusspp.)，例如米根霉(rhizopusoryzae)，隱球菌屬物種(cryptococcusspp.)，如新生隱球菌(cryptococcusneoformans)，毛殼菌屬物種(chaetomiumspp.)，如球毛殼菌(chaetomiumglobosum)，青霉屬物種(penicilliumspp.)，如產黃青霉(penicilliumchrysogenum)，以及毛癬菌屬物種(trichophytonspp.)，如紅色毛癬菌(trichophytonrubrum)引起。與真菌病有關的疾病是例如肺曲霉病。本發(fā)明的化合物可以在預防性治療中通過在發(fā)生真菌病之前施用所述化合物來使用。個體包括人類和動物個體，特別是人類個體。本發(fā)明的化合物特別可用于治療真菌病如煙曲霉菌感染，并且用于預防或治療與危險個體中例如煙曲霉感染等真菌病相關的疾病。危險個體包括早產兒、肺或心臟先天性缺陷的兒童、免疫受損的個體(例如患有hiv感染的個體)、哮喘患者、囊性纖維化個體、老年個體和患有影響心臟或肺的慢性健康病癥的個體(例如充血性心力衰竭或慢性阻塞性肺病)。本發(fā)明的化合物還可用于治療對唑類有抗性的真菌病，例如唑類抗性的煙曲霉感染，特別是與泊沙康唑組合。本發(fā)明的化合物可以與第二種或其它活性成分組合施用。第二種或其它活性成分可以例如選自其它抗真菌劑(如伏立康唑或泊沙康唑)、兩性霉素b、棘球白素(例如卡泊芬凈)和3-羥基-3-甲基-戊二酰基-coa還原酶抑制劑(如洛伐他汀、普伐他汀或氟伐他汀)。第二種或其它活性成分包括適用于治療或預防真菌病例如煙曲霉感染、或與真菌病例如煙曲霉菌感染相關的疾病、或與真菌病如煙曲霉菌感染并發(fā)的病癥的活性成分。本發(fā)明的化合物可以與第二種或其它活性成分共同配制，或者第二種或其它活性成分可以配制成通過相同或不同的途徑分開施用。例如，本發(fā)明的化合物可以向已經用抗真菌劑如伏立康唑或泊沙康唑進行全身治療的患者施用。例如，本發(fā)明的化合物可以與選自兩性霉素b、棘球白素(如卡泊芬凈)和3-羥基-3-甲基-戊二酰coa還原酶抑制劑(如洛伐他汀、普伐他汀或氟伐他汀)的一種或多種藥物共同施用，例如共同配制。本發(fā)明的化合物可以替代地(或另外)與一種或多種選自以下的藥物共同施用，例如共同配制：克念菌素、非律平、哈霉素、納他霉素、制霉菌素、龜裂霉素、聯苯芐唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、酮康唑、魯利康唑、咪康唑、奧莫康唑、奧昔康唑。舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑(albaconazole)、艾氟康唑(efinaconazole)、環(huán)氧菌唑(epoxiconazole)、氟康唑、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑、丙環(huán)唑、雷夫康唑、特康唑、阿巴芬凈(abafungin)、阿莫羅芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬凈、米卡芬凈、苯甲酸、環(huán)吡酮、氟胞嘧啶(5-氟胞嘧啶)、灰黃霉素、托萘酯和十一烯酸。優(yōu)選的組合伙伴包括伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬凈和泊沙康唑。根據本發(fā)明的一個方面，提供了藥盒，包括：(a)包含本發(fā)明化合物和任選的一種或多種稀釋劑或載體的藥物組合物；(b)包含第二活性成分和任選的一種或多種稀釋劑或載體的藥物組合物；(c)任選的一種或多種其它藥物組合物，其各自包含第三種或其它活性成分和任選的一種或多種稀釋劑或載體；以及(d)將所述藥物組合物向有需要的個體施用的說明書。所述有需要的個體可能患有或易感真菌病，如煙曲霉菌感染。本發(fā)明的化合物可以以合適的間隔施用，例如每天一次、每天兩次、每天三次或每天四次。預期平均體重(50-70kg)的人的合適劑量為約50μg至10mg/天，例如500μg至5mg/天，但所施用的精確劑量可由技術人員確定。預期本發(fā)明的化合物具有以下的一個或多個有利屬性：·有效的抗真菌活性，特別是針對曲霉菌例如煙曲霉的活性，或針對以下真菌的活性：假絲酵母屬物種，例如白色假絲酵母或光滑假絲酵母，根霉菌屬物種，例如米根霉，隱球菌屬物種，例如新型隱球菌，毛殼菌屬物種，例如球毛殼菌，青霉屬物種，例如產黃青霉，或毛癬菌屬物種，例如紅色毛癬菌，特別是在向肺或鼻局部給藥后；·長時間的肺部作用，優(yōu)選按照每日一次給藥；·肺或鼻局部施用后的全身接觸量低；且·可接受的安全性，特別是向肺或鼻局部給藥后。試驗部分本文使用的縮寫定義如下(表1)。任何未定義的縮寫旨在表達其普遍接受的含義。表1：縮寫通用方法所有的原料和溶劑都是從商業(yè)來源獲得或根據文獻引用制備。除非另有說明，否則所有反應都被攪拌。有機溶液按照常規(guī)用無水硫酸鎂干燥。分析方法反相hplc方法：watersxselectcshc18xp柱,2.5μm(4.6x30mm)，40℃；流速2.5-4.5mlmin-1，用h2o-mecn(包含0.1％v/v甲酸(方法a)或10mmnh4hco3的水溶液(方法b))梯度洗脫，歷經4min，用uv在254nm檢測。梯度信息：0-3.00min,從95％h2o-5％mecn向5％h2o-95％mecn傾斜；3.00-3.01min,保持在5％h2o-95％mecn,流速升至4.5mlmin-1；3.013.50min,保持在5％h2o-95％mecn；3.50-3.60min,恢復至95％h2o-5％mecn,流速減至3.50mlmin-1；3.60-3.90min,保持在95％h2o-5％mecn；3.90-4.00min,保持在95％h2o-5％mecn,流速減至2.5mlmin-1。1hnmr光譜法：1hnmr譜圖獲自brukeradvanceiii光譜儀，在400mhz用殘余未氘化溶劑作為參考，除非另有說明，在dmso-d6中進行。制備化合物(i)的合成方法4-(4-羥基-3-甲基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯將裝有哌嗪-1-甲酸叔丁酯(xiia)(7.44g,40.0mmol)、4-溴-2-甲基苯酚(6.23g,33.3mmol)、ruphos(311mg,0.67mmol)和ruphosg3(557mg,0.67mmol)的燒瓶抽真空，并回充氮氣三次。加入lihmds溶液(1m的thf溶液,100ml,100mmol)，并將反應混合物在70℃加熱3小時。冷卻至室溫后，將該混合物通過加入1m的鹽酸(100ml)猝滅，并隨后用1m的nahco3水溶液(100ml)中和。將水層用etoac萃取(3x100ml)，并將合并的有機萃取物干燥。真空除去揮發(fā)物，得到粗產物，將其經快速柱色譜(sio2,120g,0-100％etoac在異己烷中的溶液，梯度洗脫)，得到標題化合物，中間體(xia)，為淺褐色固體(7.80g,78％)；rt2.07min(方法b)；m/z293(m+h)+(es+)；1hnmrδ:1.41(9h,s),2.07(3h,s),2.86-2.88(4h,m),3.41-3.43(4h,m),6.58-6.65(2h,m),6.71(1h,d)和8.72(1h,s)。1-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪向中間體(xia)(7.80g,25.1mmol)在dmso(60ml)的溶液中加入氫氧化鈉水溶液(3.0ml,12.5m,37.6mmol)。將該混合物在rt下攪拌10分鐘，并隨后用((3s,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲基4-甲基苯磺酸酯(ix)(exapichem,目錄號：ac-8330,12.4g,27.6mmol)分批進行處理。將反應混合物在30℃攪拌18小時，冷卻至rt，并加入水(200ml)。將所得混合物用etoac萃取(3x200ml)，并將合并的有機萃取物用鹽水洗滌(2x200ml)，然后干燥，并真空蒸發(fā)，得到褐色油狀物。將粗的boc-保護的產物(viia)經1hnmr分析顯示其包含～10％的烯烴：(r)-1-((2-(2,4-二氟苯基)-4-亞甲基四氫呋喃-2-基)甲基)-1h-1,2,4-三唑，其作為消除反應副產物形成。將粗的烏拉坦(viia)溶于dcm(150ml)中，并用tfa(39.0ml,502mmol)處理。rt下2小時后，將反應混合物真空濃縮以除去大部分揮發(fā)物，并隨后用etoac(200ml)稀釋，并用naoh水溶液(2m,200ml)洗滌。分離水相，并用etoac萃取(2x200ml)。將合并的有機萃取物用鹽水洗滌(2x200ml)，然后干燥并真空蒸發(fā)，得到淺褐色油狀物。將該粗產物經快速柱色譜純化(sio2,80g,0-10％0.7mnh3/meoh在dcm中的溶液，梯度洗脫)，得到標題化合物，中間體(v)，為粘稠狀淺褐色油狀物(9.46g,80％)；rt1.91min(方法b)；m/z470(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.07(3h,s),2.15(1h,dd),2.36-2.42(1h,m),2.52-2.56(1h,m),2.79-2.81(4h,m),2.87-2.90(4h,m),3.66(1h,dd),3.73-3.77(2h,m),4.04(1h,t),4.57(2h,dd),6.64(1h,dd),6.70-6.75(2h,m),6.99(1h,td),7.25-7.34(2h,m),7.76(1h,s)和8.34(1h,s)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯將裝有中間體(v)(9.00g,19.2mmol)、4-溴苯甲酸甲酯(via)(4.95g,23.0mmol)、ruphos(0.18g,0.38mmol,2mol％)、ruphosg3(0.32g,0.38mmol,2mol％)和碳酸銫(9.99g,30.7mmol)的燒瓶抽真空和回充氮氣三次，然后加入dmf(150ml)。將該混合物在80℃加熱22小時，然后，雖然還很熱，將其倒入水(150ml)中，以形成褐色膠質。加入更多的水(300ml)，并將水相用dcm萃取(2x200ml)。將有機萃取物合并，并真空濃縮，得到褐色油狀物，將其倒入水(100ml)中。經過濾收集所得沉淀，并隨后再次懸浮于thf(100ml)中。將該混合物在回流下加熱1小時，期間形成乳狀混懸液。將該混合物冷卻至rt，并將所得沉淀經過濾收集，用thf洗滌(2x50ml)，并隨后真空干燥，得到標題化合物，中間體(iva)，為淺黃色固體(9.48g,79％)；rt2.79min(方法b)；m/z604(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.09(3h,s),2.16(1h,dd),2.37-2.43(1h,m),2.52-2.58(1h,m),3.11-3.14(4h,m),3.43-3.46(4h,m),3.68(1h,dd),3.74-3.79(5h,s與m重疊),4.05(1h,dd),4.58(2h,dd),6.75(2h,brs),6.85(1h,brd),7.00(1h,td),7.04(2h,d),7.25-7.34(2h,m),7.76(1h,s),7.81(2h,d)和8.34(1h,s)。4-(4-(4-羥基-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯將裝有4-(哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(xa)(20.0g,85.0mmol)和4-溴-2-甲基苯酚(19.2g,102mmol)在dmf(213ml)中的溶液的燒瓶抽真空，并回充氮氣三次。加入ruphosg3(1.43g,1.71mmol)，并將該燒瓶抽真空，并回充氮氣。將反應混合物冷卻至0℃，并加入lihmds(17.1g,102mmol)。將反應物在rt攪拌10分鐘，然后在水浴中冷卻，并以5分鐘間隔以等量部分(7x2.85g)加入lihmds(20.0g,120mmol)。將所得溶液在rt下攪拌30分鐘，并隨后冷卻至0℃，用2m鹽酸(200ml)處理，得到ph6-7。將該混合物在rt攪拌15分鐘，然后用etoac(220ml)萃取。分離水層，并用etoac萃取(4x50ml)，并將合并的有機物用鹽水洗滌(6x50ml)，然后干燥并真空蒸發(fā)，得到乳狀固體。加入異己烷和ipa混合物(1:1,150ml)，并將該混懸液在rt攪拌30分鐘。經過濾收集固體，并在rt攪拌30分鐘。經過濾收集固體，將濾餅用異己烷和ipa混合物(1:1,2x10ml)洗滌，然后用異己烷洗滌(4x10ml)，并在40℃真空干燥18小時，得到標題化合物，中間體(viiia)，為乳狀固體(15.3g,50％)；rt2.29min(方法b)；m/z341(m+h)+(es+)；1hnmrδ:1.29(3h,t),2.09(3h,s),3.06-3.09(4h,m),3.42-3.44(4h,m),4.24(2h,dd),6.66(2h,brs),6.76(1h,brs),7.03(2h,d),7.80(2h,d),8.72(1h,s)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯向冷卻至0℃的中間體(viiia)(15.3g,44.9mmol)在dmf(110ml)的溶液中加入乙醇鈉(3.13g,46.1mmol)，并將該混合物在0℃攪拌10分鐘，然后用甲苯磺酸酯(ix)(20.2g,44.9mmol)處理。將反應混合物加溫至rt，加熱至50℃持續(xù)1小時，然后冷卻至rt。加入鹽酸(1m,60ml)和水(200ml)，并將該混合物在rt攪拌30分鐘，然后用dcm(150ml)萃取。分離水層，并用dcm萃取(2x50ml)，將合并的有機物用鹽水洗滌(4x30ml)，隨后干燥并真空蒸發(fā)，得到乳狀固體。將該固體懸浮于等量的異己烷和ipa混合物(80ml)中，并在rt下攪拌1小時。將該固體經過濾收集，用異己烷和ipa1:1混合物(3x20ml)洗滌，然后在40℃真空干燥18小時，得到標題化合物，中間體(ivb)，為白色固體(16.4g,56％)；rt2.92min(方法b)；m/z618(m+h)+(es+)；1hnmrδ:1.29(3h,t),2.10(3h,s),2.16(1h,dd),2.37-2.42(1h,m),2.52-2.58(1h,m),3.12-3.14(4h,m),3.43-3.46(4h,m),3.68(1h,dd),3.74-3.79(2h,m),4.05(1h,dd),4.24(2h,dd),4.58(2h,dd),6.76(2h,brs),6.86(1h,brs),6.98-7.05(3h,m),7.26-7.34(2h,m),7.77(1h,s),7.81(2h,d),8.34(1h,s)。1-(((2r,4r)-4-((4-溴-2-甲基苯氧基)甲基)-2-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-2-基)甲基)-1h-1,2,4-三唑向4-溴-2-甲基苯酚(920mg,4.89mmol)在dmso(10ml)的溶液中加入氫氧化鈉水溶液(0.39ml,12.5m,4.89mmol)，并將該混合物在rt下攪拌10分鐘，并隨后用甲苯磺酸酯(ix)(2.00g,4.45mmol)處理。將反應混合物在60℃攪拌72小時，然后冷卻至rt，并在水(25ml)和etoac(20ml)之間分配。分離并保存有機相，將水層用etoac萃取(3x25ml)。將合并的有機萃取物用鹽水洗滌(3x15ml)，然后干燥并真空蒸發(fā)。將粗產物經快速柱色譜純化(sio2,12g,0-30％etoac在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到標題化合物，中間體(xiii),為無色油狀物(1.84g,86％)；rt2.78min(方法a)；m/z464(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.09(3h,s),2.17(1h,dd),2.37-2.43(1h,m),2.52-2.60(1h,m),3.72-3.78(2h,m),3.82(1h,dd),4.00-4.06(1h,m),4.57(2h,dd),6.82(1h,d),7.00(1h,td),7.25-7.34(4h,m),7.76(1h,s),8.34(1h,s)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯將裝有4-(哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(x)(103mg,0.44mmol)、中間體(xiii)(170mg,0.37mmol)、ruphos(8.5mg,18μmol)、ruphosg3(14.2mg,18μmol)和碳酸銫(191mg,0.59mmol)的瓶抽真空，并回充氮氣三次，然后加入dmf(3.0ml)。將該混合物在80℃加熱18小時，然后在100℃加熱24小時。將反應混合物冷卻至rt，并在水(10ml)和etoac(10ml)之間分配。分離并保存有機相，將水層用etoac萃取(3x10ml)。將合并的有機物用鹽水洗滌(3x10ml)，隨后干燥并真空蒸發(fā)。將粗產物經快速柱色譜純化(sio2,12g,0-100％etoac在異己烷中的溶液，梯度洗脫)，得到標題化合物，中間體(ivb)，為白色固體(100mg,43％)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸甲基酯的水解(iva)向中間體(iva)(9.00g,14.9mmol)在dmso(370ml)的混懸液中加入氫氧化鋰(1.79g,74.5mmol)在水(37.0ml)中的溶液。將該混合物在70℃加熱22小時，并隨后冷卻至rt，用水(1000ml)稀釋，并通過加入1m鹽酸水溶液(80ml)酸化(至～ph2)。將該混合物在冰浴中冷卻2小時，并經過濾收集所得沉淀。將濾餅用水洗滌(3x80ml)，并在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(ii)，為白色固體(4.66g,54％)；rt2.21min(方法1a)；m/z590(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.10(3h,s),2.16(1h,dd),2.37-2.43(1h,m),2.52-2.58(1h,m),3.12-3.14(4h,m),3.42-3.45(4h,m),3.68(1h,dd),3.74-3.79(2h,m),4.05(1h,dd),4.58(2h,dd),6.76(2h,brs),6.86(1h,brd),6.97-7.03(3h,m),7.25-7.34(2h,m),7.77-7.80(3h,m),8.34(1h,s)和12.31(1h,s)。乙基酯的水解(ivb)向中間體(ivb)(16.4g,26.6mmol)在dmso(375ml)的混懸液中加入氫氧化鋰(3.18g,74.5mmol)在水(50ml)的溶液中。將該混合物在70℃加熱22小時，然后冷卻至rt，倒入水(500ml)中，并通過加入2m鹽酸(70ml)酸化(至～ph5-6)。將該混合物在rt下攪拌30分鐘，并經過濾收集所得固體，用水(2x20ml)和乙醚(3x30ml)洗滌，并隨后在40℃真空干燥18小時，得到標題化合物，中間體(ii)，為棕褐色固體(14.2g,84％)；rt2.26min(方法1a)；m/z590(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.09(3h,s),2.16(1h,dd),2.37-2.42(1h,m),2.52-2.58(1h,m),3.12-3.14(4h,m),3.42-3.44(4h,m),3.68(1h,dd),3.74-3.79(2h,m),4.05(1h,dd),4.58(2h,dd),6.75(2h,brs),6.86(1h,brs),6.97-7.03(3h,m),7.26-7.34(2h,m),7.77-7.80(3h,m),8.34(1h,s),12.31(1h,brs)。4-溴-n-(4-氟苯基)苯甲酰胺向4-氟苯胺(iii)(0.85ml,9.00mmol)、三乙胺(1.88ml,13.5mmol)和dmap(0.11g,0.90mmol)在thf(15ml)的溶液中加入4-溴苯甲酰氯(xx)(2.37g,10.8mmol)。將反應混合物在rt下保持1小時，并隨后在etoac(100ml)和1m鹽酸(100ml)之間分配。分離有機相，并依次用1m鹽酸(100ml)、飽和nahco3水溶液(100ml)和鹽水(100ml)洗滌，隨后干燥并真空蒸發(fā)。將粗的殘余物從溫熱的dcm(100ml)中研磨，并將該混合物回流加熱，得到白色混懸液，將其冷卻至rt。經過濾收集所得沉淀，得到標題化合物，中間體(xix)，為白色固體(1.81g,65％)；rt2.23min；m/z294/296(m+h)+(es+)；1hnmrδ:7.20(2h,t),7.74-7.79(4h,m),7.90(2h,d)和10.36(1h,s)。4-(4-((4-氟苯基)氨甲酰基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯將裝有哌嗪-1-甲酸叔丁酯(xii)(4.00g,215mmol)、中間體(xix)(6.63g,22.6mmol)、ruphos(100mg,0.215mmol)和ruphosg3(180mg,0.215mmol)的瓶抽真空，并回充氮氣三次。加入lihmds溶液(1m在thf中的溶液,75.0ml,75.0mmol)，并將反應混合物在70℃加熱5小時。冷卻至rt后，將該混合物在etoac(150ml)和1m鹽酸(150ml)之間分配。分離并保存有機相，將水相用etoac萃取(3x150ml)。將合并的有機物干燥并真空濃縮，得到褐色固體，將其在異己烷和乙醚(1:1,100ml)的混合物中研磨。將所得產物經過濾收集，用異己烷和乙醚(1:1,25ml)的混合物洗滌，并隨后在40℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(xviii)，為棕褐色固體(6.44g,85％)；rt2.40min(方法a)；m/z400(m+h)+；1hnmrδ:1.43(9h,s),3.27-3.30(4h,m),3.45-3.48(4h,m),7.03(2h,d),7.14-7.18(2h,m),7.74-7.79(2h,m),7.88(2h,d),9.99(1h,s)。n-(4-氟苯基)-4-(哌嗪-1-基)苯甲酰胺向中間體(xviii)(6.44g,16.1mmol)在dcm(200ml)的溶液中加入tfa(24.7ml,322mmol)。將反應物在rt攪拌2小時，然后真空蒸發(fā)。加入甲苯(5.0ml)，并將該混合物再次真空蒸發(fā)。將所得油狀物溶于dcm(90ml)和甲醇(10ml)的混合物中，并隨后用水(50ml)和飽和nahco3水溶液(50ml)的混合物萃取。分離并保存有機相，將水層用dcm和甲醇(9:1,3x100ml)的混合物萃取。將合并的有機層干燥并真空濃縮，得到標題化合物，中間體(xvii)，為褐色固體(3.74g,70％)；rt1.02min(方法a)；m/z300(m+h)+；1hnmrδ:2.81-2.83(4h,m),3.18-3.20(4h,m),6.99(2h,d),7.14-7.18(2h,m),7.74-7.80(2h,m),7.85(2h,d),9.99(1h,s)。n-(4-氟苯基)-4-(4-(4-甲氧基-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺將裝有4-溴-1-甲氧基-2-甲基苯(xivb)(406mg,2.02mmol)、中間體(xvii)(550mg,1.84mmol)、ruphos(43mg,0.092mmol)和ruphosg3(77mg,0.092mmol)的瓶抽真空，并用氮氣回充三次。加入lihmds(9.2ml,1m在thf中的溶液,9.2mmol)，并將反應混合物在70℃加熱8小時。冷卻至rt后，將該混合物通過加入1m鹽酸水溶液(9.0ml)猝滅，并隨后在水(15ml)和etoac(15ml)之間分配。分離并保存有機層，將水層用etoac萃取(2x15ml)。將合并的有機物用鹽水(20ml)洗滌，然后干燥并真空蒸發(fā)。將所得粗產物經快速柱色譜純化(sio2,12g,0-100％etoac在異己烷中的溶液，梯度洗脫)，得到黃色固體。將該物質經快速柱色譜再次純化(sio2,4g,0-10％etoac在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到標題化合物，中間體(xvi)，為灰白色固體(83mg,11％)；rt2.27min(方法a)；m/z420(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.13(3h,s),3.13-3.16(4h,m),3.42-3.45(4h,m),3.72(3h,s),6.77-6.88(3h,m),7.08(2h,d),7.17(2h,t),7.75-7.80(2h,m),7.89(2h,d),10.02(1h,s)。n-(4-氟苯基)-4-(4-(4-羥基-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺在0℃下向中間體(xvi)(83mg,0.20mmol)在dcm(5.0ml)的混懸液中加入三溴化硼(0.59ml,1m在dcm中的溶液,0.59mmol)。將反應混合物在0℃攪拌30分鐘，加溫至rt持續(xù)8小時，并隨后在水(15ml)和dcm(10ml)之間分配。分離并保存有機層，并將水層用dcm和meoh(90:10,5x15ml)的混合物萃取。將合并的有機物干燥并真空蒸發(fā)，得到粗產物，將其經快速柱色譜純化(sio2,4.0g,0-3％meoh在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到標題化合物，中間體(xv)，為淺褐色固體(61mg,72％)；rt1.73min(方法a)；m/z406(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.10(3h,s),3.08-3.11(4h,m),3.41-3.43(4h,m),6.67(2h,brs),6.77(1h,brs),7.07(2h,d),7.17(2h,t),7.76-7.80(2h,m),7.89(2h,d),8.73(1h,s),10.01(1h,s)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)-n-(4-氟苯基)苯甲酰胺1.從苯甲酸中間體(ii)制備化合物(i)。向中間體(ii)(2.50g,4.24mmol)、edci(1.63g,8.48mmol)和dmap(30mg,0.21mmol)在吡啶(30ml)的混懸液中加入4-氟苯胺(0.41ml,4.3mmol)，并將反應混合物在60℃加熱2小時，然后冷卻至rt。用水(60ml)稀釋該混合物，并攪拌5分鐘，產生固體，將其經過濾收集，并隨后用水(3x10ml)和乙醚(2x15ml)洗滌，得到棕褐色粉末。將所得粗產物經快速柱色譜純化(sio2,40g,0-3％meoh在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到化合物(i)，為黃色固體(2.47g,85％)；rt2.60min(方法a)；m/z683(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.10(3h,s),2.15(1h,dd),2.37-2.43(1h,m),2.53-2.58(1h,m),3.13-3.16(4h,m),3.42-3.44(4h,m),3.68(1h,dd),3.74-3.79(2h,m),4.05(1h,dd),4.58(2h,dd),6.76(2h,brs),6.86(1h,brs),6.99(1h,td),7.08(2h,d),7.16(2h,t),7.25-7.35(2h,m),7.76-7.80(3h,m),7.89(2h,d),8.34(1h,s)和10.00(1h,s)。2.從苯酚中間體(xv)制備化合物(i)。向中間體(xv)(19mg,0.047mmol)在dmso(1.5ml)的溶液中加入氫氧化鈉水溶液(1m,98μl,0.098mmol)。將該混合物在rt下攪拌10分鐘，并隨后用甲苯磺酸酯(ix)(exapichem,目錄號：ac-8330,23.2mg,0.052mmol)在dmso(0.5ml)中的溶液處理。將反應混合物在60℃攪拌2小時，冷卻至rt，并加入水(10ml)。將所得混合物用etoac萃取(3x10ml)，將合并的有機萃取物干燥并真空蒸發(fā)，得到褐色油狀物。將所得粗產物經快速柱色譜純化(sio2,4g,0-2％meoh在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到淺褐色固體(23mg)。將產物經快速柱色譜再次純化(sio2,4.0g,0-50％etoac在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到化合物(i)，為灰白色固體(14mg,42％)；rt2.60min(方法a)；m/z683(m+h)+(es+)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)-n-(4-氟苯基-2,3,5,6-d4)苯甲酰胺。制備化合物(i)的四氘代衍生物向中間體(ii)(200mg,0.34mmol)、edci(130mg,0.68mmol)和dmap(2.1mg,0.02mmol)在吡啶(1.5ml)的混懸液中加入4-氟苯胺-2,3,5,6-d4(43mg,0.37mmol)在吡啶(0.5ml)中的溶液，并將反應混合物在60℃加熱1小時。將反應混合物冷卻至rt，用水(10ml)稀釋，并攪拌5分鐘，其產生沉淀。經過濾收集固體，用水洗滌(3x2.0ml)，并隨后溶于dcm和meoh的混合物(9:1,5.0ml)中。將該混合物通過相分離器，并將有機溶液真空蒸發(fā)，得到棕褐色固體(200mg)。將所得粗產物經快速柱色譜純化兩次(sio2,12g,0-2％meoh在dcm中的溶液,梯度洗脫；sio2,40g,0-2.5％meoh在dcm中的溶液,梯度洗脫)，得到灰白色粉末。將該固體懸浮于dmso(0.75ml)中，并加熱至60℃持續(xù)5分鐘，直至全部溶解。將所得溶液冷卻至rt，并用水(1.0ml)處理，得到沉淀。將該混懸液在rt下攪拌20分鐘，并經過濾收集固體，用水沖洗(3x0.5ml)，并在50℃下真空干燥三天，得到標題化合物，(i)4[2h]，為白色固體(147mg,62％)；rt2.59min(方法1a)；m/z687(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.10(3h,s),2.16(1h,dd),2.37-2.43(1h,m),2.52-2.60(1h,m),3.13-3.16(4h,m),3.42-3.44(4h,m),3.68(1h,dd),3.74-3.79(2h,m),4.05(1h,dd),4.58(2h,dd),6.76(2h,brs),6.86(1h,brs),7.00(1h,td),7.08(2h,d),7.25-7.35(2h,m),7.77(1h,s),7.89(2h,d),8.34(1h,s)和10.01(1h,s)。通過途徑2對化合物(i)的制備進行放大上文所述途徑2(流程1)的合成方法已經成功開發(fā)，以超過1.0kg的api(流程3)的規(guī)模制備本發(fā)明的化合物。已經開發(fā)了該方法的兩種變通方法，其中4-哌嗪基苯甲酸酯[中間體(viii)]包括乙酯(viiia)或相應的叔丁酯(viiib)。這兩種化合物都可以與甲苯磺酸酯(ix)偶聯，得到苯甲酸(ii)所對應的酯前體。在乙酯的情況下，通過皂化獲得游離酸，而叔丁基衍生物是通過酸解被脫酯化。該合成活動所采用的方法如下所述，并在本文描述。流程3：化合物(i)合成的放大分析和光譜方法本實驗部分的分析和光譜方法如下。lcms分析的反相hplc條件：xbridgebeh苯基4.6x150mm柱；2.5μm(ex.waters#186006720)，40℃；流速1.0ml.min-1，用純h2o-mecn(包含1％甲酸)梯度洗脫25min，在300nm下用uv檢測。注射體積5μl。梯度信息：0-2min,保持在95％h2o-5％mecn；2-15min,從95％h2o-5％mecn傾斜至10％h2o-90％mecn；15-25min,保持在10％h2o-90％mecn。1hnmr光譜：1hnmr譜用joelecx400mhz光譜儀收集。使用殘余未氘代溶劑作為參考，除非另有說明，樣品在dmso-d6中進行。4-(4-(4-羥基-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯4-(1-哌嗪基)苯甲酸乙酯(xa)(500g,2.13mol)和4-溴-2-甲基苯酚(479g,2.56mol)在無水dmf(5.0l)中的溶液，通過將該混合物交替地置于真空和充入氮氣三次進行脫氣。然后將該混合物用ruphosg3(35.7g,0.043mol)和lihmds溶液(1.0m在thf中的溶液,2560ml,2.56mol)處理，但保持內部溫度低于35℃(水浴冷卻)。然后將lihmds(1.0m在thf中的溶液)溶液于20-35℃下在兩分鐘間隔以十四等份(14x213ml,共2.98l,2.98mol)加入。將所得溶液在18-25℃攪拌30分鐘，然后用hplc分析，顯示0.6％的4-(1-哌嗪基)苯甲酸乙酯剩余，認為反應完成。通過加入2m鹽酸(5.50l)將反應混合物調至ph7.6，但保持溫度低于40℃，然后加入etoac(3.00l)，并分離所得相。將水相用etoac萃取(2x3.00l，然后2x2.00l)，并將合并的有機物用飽和鹽水洗滌(8x1.00l)，用mgso4干燥，并隨后真空蒸發(fā)，得到淺褐色油狀固體。將粗產物在ipa(2.50l)中于20-25℃下漿化30分鐘，并將所得固體經過濾收集。將濾餅用ipa洗滌(2x500ml)，抽干，并隨后將該固體在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(viiia)，為淺褐色固體(380.0g,52％,hplc純度97.2％)；rt11.01min；m/z341.3(m+h)+(es+)。為了控制鈀殘留量，將幾批產品合并(1900g,殘留pd108ppm)，溶于thf(19.0l)，并用mp-tmt樹脂(250g)在18-25℃處理。將該混合物在此溫度下攪拌24小時，并隨后將樹脂經過濾除去，并用thf(3.49l)洗滌。將濾液真空蒸發(fā)至干，并將所得固體在ipa(4.75l)中于18-25℃漿化1小時，并經過濾收集。將濾餅用ipa(500ml)洗滌，抽干，并隨后在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(viiia)，為灰白色固體(1789g,94％,殘留pd17ppm)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)-四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯在15-25℃下向中間體(viiia)(1780g,5.23mol)在無水dmf(17.8l)的溶液中加入乙醇鈉(391g,5.75mol)。45分鐘后，一次加入甲苯磺酸酯(ix)(2586g,5.75mol)，并在60-65℃繼續(xù)攪拌5小時。經hplc分析顯示該反應基本上完全(剩余1.67％起始原料)。將該混合物冷卻至18-25℃，將所得混懸液用水(18.0l)處理，但保持溫度低于30℃。冷卻至15-25℃持續(xù)45分鐘后，經過濾收集該固體，并用水洗滌(2x7.14l)。將該潮濕濾餅在乙醇(8.92l)中回流漿化2小時，然后將該混合物冷卻至15-25℃，并攪拌18小時。經過濾收集所得固體，用乙醇洗滌(2x1.78l)，并隨后在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(ivb)，為灰白色固體(2855g,88％,hplc純度95.97％)；rt14.99min；m/z618.5(m+h)+(es+)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)-四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸單鹽酸化物18-25℃下向中間體(ivb)(1467g,2.38mol)在dmso(1.45l)和水(5.90l)的混合物的混懸液中加入50％w/wkoh水溶液(2.93l)。將該混懸液在90-95℃加熱18小時，然后hplc分析顯示反應完全(剩余0.16％起始原料，97.9％產物)。將反應混合物冷卻至40-50℃，并加入ipa(14.9l)和水(4.42l)的混合物。冷卻至15-25℃后，通過加入濃鹽酸(3.12l)將ph調至1-2，但保持內部溫度低于40℃。將所得混懸液冷卻至15-25℃，并經過濾收集固體，抽干，并隨后在水(7.40l)中于90-95℃漿化30分鐘。冷卻至15-25℃后，經過濾收集固體，用水洗滌(2x1.48l)并抽干。在50℃進一步真空干燥，得到標題化合物，中間體(ii)，為白色固體(1329g,89％,hplc純度99.0％；氯含量:6.61w/w％[理論值5.66w/w％]；rt12.92min；m/z590.4(m+h)+(es+)。4-(4-(4-羥基-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸叔丁酯4-(哌嗪-1-基)苯甲酸叔丁酯(xb)(100g,381mmol)(500g,2.13mol)和4-溴-2-甲基苯酚(85.5g,457mmol)在無水dmf(1.00l)中的溶液，通過將該混合物交替地置于真空下和充入氮氣三次進行脫氣。該操作后，在15-25℃加入ruphosg3(6.38g,7.62mmol)，然后歷經5分鐘加入lihmds在thf中的溶液(1.06m,432.ml,457mmol)，但保持溫度在15-30℃內(水浴冷卻)。攪拌5分鐘后，向反應混合物中以2分鐘間隔以十四等份(14x36ml,共504ml,533mmol)加入另外等份的lihmds溶液(1.06m在thf中的溶液)，導致16℃-21℃的放熱。將反應物在15-25℃攪拌過夜(此處hplc顯示形成72.％所需產物)，并通過加入2m鹽酸(～900ml)將該混合物的ph調至7.3。分離水相，并用etoac重復萃取(1.0l,500ml和2x250ml)。將合并的有機物用鹽水洗滌(6x400ml)，用mgso4干燥，并真空濃縮，得到粘性黃色固體。將所得固體懸浮于ipa(500ml)中，并在15-25℃攪拌1小時。過濾該混懸液，將濾餅用ipa(250ml,200ml)洗滌，并抽干。將產物進一步在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(viiib)，為灰白色固體(105.6g,75％,hplc純度97.1％)；rt12.23min；m/z369.3(m+h)+(es+)4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)-四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸叔丁酯在氮氣中向中間體(viiib)(100g,271mmol)在dmf(500ml)的溶液中加入乙醇鈉(22.2g,325mmol)，導致溫和放熱(從20-22.0℃)。在15-25℃攪拌45min，將該反應混合物用甲苯磺酸酯(ix)(146.4g,325mmol)處理，并隨后在60-65℃加熱2小時。將所得混合物經hplc分析顯示反應基本上完全(剩余4.4％苯酚，14.6％甲苯磺酸酯，77.6％產物)，并將該混合物冷卻至40-45℃，并加入ipa(800ml)。然后在40-45℃下逐滴加入水，直至持續(xù)輕微渾濁(需要500ml)，此時加入少量產物樣品(100mg,0.15mmol)作為種子，并將該混合物在40-45℃攪拌10分鐘，以確保開始沉淀。在40-45℃下逐滴加入水(500ml)，并隨后將該混懸液冷卻至15-25℃。將所得固體經過濾收集，用水洗滌(3x200ml)，并最后在50℃下真空干燥，得到粗產物，為灰白色固體(155.9g,89％,hplc純度94.8％)。將部分該物質(85.0g)溶于ipa(510ml)中，在65-75℃下加熱直至溶解完全。然后將該溶液冷卻至15-25℃，并攪拌30分鐘。將所得固體經過濾收集，用ipa洗滌(2x85ml)，并在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(ivc)，為白色固體(83.4g,87％總產率，hplc純度98.2％)；rt15.74min；m/z646.6(m+h)+(es+)4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)-四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)苯甲酸單鹽酸化物向苯甲酸叔丁酯(ivc)(83.4g,129mmol)在水(250ml)和ipa(417ml)的混合物的混懸液中加入濃鹽酸(167ml)在水(167ml)中的溶液，但保持內部溫度低于35℃。然后將所得溶液在35℃保持24小時(2-3小時后觀察到固體形成)，此時hplc分析顯示反應基本完全(剩余0.6％酯，98.1％產物)。將該混合物冷卻至15-25℃，加入ipa(417ml)，并通過在<40℃加入naoh水溶液(10m,200ml)將ph調至～10得到溶液。然后通過在<40℃加入濃鹽酸(25ml)將ph再次調至1-2。將所得混懸液冷卻至15-25℃，并經過濾收集固體。將濾餅再次懸浮于水(834ml)中，加熱至80-85℃，然后攪拌30分鐘。隨后將該混懸液冷卻至15-25℃，并經過濾收集該固體，用水洗滌(2x83ml)，并在50℃真空干燥，得到標題化合物，中間體(ii)(為單鹽酸鹽)，為白色固體(64.6g,80％,hplc純度97.6％)；rt12.92min；m/z590.4(m+h)+(es+)。4-(4-(4-(((3r,5r)-5-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-5-(2,4-二氟苯基)-四氫呋喃-3-基)甲氧基)-3-甲基苯基)哌嗪-1-基)-n-(4-氟苯基)苯甲酰胺在<40℃下向苯甲酸(ii)的單鹽酸鹽(1001g,1.60mol)和hobt.h2o(216.g,1.41mol)在dmf(5020ml)的攪拌過的混懸液中加入dipea(840ml,4.823mol)，然后加入4-氟苯胺(181ml,1.91mol)，并隨后加入edci.hcl(368g,1.92mol)。將該混合物在60-65℃加熱17小時，此時經hplc分析顯示反應完全(未檢測出起始原料或反應中間體,82.63％產物)。將所得溶液冷卻至15-25℃，并用水(15.2l)在<35℃猝滅，然后再次冷卻至15-25℃，并攪拌1小時。將所得固體經過濾收集，用水洗滌(2x2.00l)并抽干。將濾餅在水(5.00l)中于15-25℃再次漿化45分鐘，并經過濾收集固體，用水洗滌(2x2.00l)，真空干燥，得到標題化合物，化合物(i)，為灰白色固體(1101g,～100％,hplc純度95.8％)；rt14.46min；m/z683.5(m+h)+(es+)；1hnmrδ:2.10(3h,s),2.16(1h,dd),2.37-2.43(1h,m),2.50-2.58(1h,m),3.13-3.15(4h,m),3.41-3.44(4h,m),3.67(1h,dd),3.74-3.78(2h,m),4.05(1h,t),4.55(1h,d),4.61(1h,d),6.76(2h,s),6.86(1h,s),7.00(1h,d,t),7.08(2h,d),7.17(2h,t),7.26-7.35(2h,m),7.76-7.80(2h,m),7.77(1h,s),7.89(2h,d),8.35(1h,s),10.02(1h.s)。生物測試：實驗方法浮游真菌生長評估a.刃天青-微量滴定法該測定使用改良的公開方法進行(monteiro等人,2012)。煙曲霉(ncpf2010，publichealthengland，wiltshire)的孢子在sabouraud葡萄糖瓊脂中培養(yǎng)3天。通過用pbs-吐溫(10ml；含有0.05％吐溫-20、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的pbs)洗滌，從sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物制備儲備孢子懸浮液。使用neubauer血細胞計數器評估孢子計數，并使用pbs調節(jié)至106個孢子/ml。在過濾滅菌的mopsrpmi-1640(50ml；含有2mml-谷氨酰胺、2％葡萄糖和0.165mmops的rpmi-1640，用naoh緩沖至ph7)中制備孢子的工作懸浮液(104個孢子/ml)。將刃天青鈉鹽(100μl1％溶液；sigma-aldrich，dorset，uk)加入到孢子懸浮液中并充分混合。將孢子混懸液-刃天青混合物(100μl/孔)加入384孔平板(目錄號353962,bdfalcon,oxford,uk)中。同時，用integraviaflo96(intergra,zizers,瑞士)將試驗化合物(0.5μldmso溶液)一式四份加入100μl的孢子-刃天青混合物中，得到最終的0.5％的dmso溶液。對于無孢子的對照孔，加入mops-rpmi-刃天青溶液(100μl)來代替孢子-刃天青混合物。將該平板用breatheeasier膜(目錄號z763624,sigma-aldrich,dorset,uk)覆蓋，并孵育(35℃,5％co2)直到接種的孔中的熒光是對照孔的兩倍(約24小時)。每個孔的熒光(545nm(激發(fā))/590nm(發(fā)射)，增益800，焦點高度5.5mm)使用多掃描儀(clariostar:bmg,buckinghamshire,uk)檢測。計算每個孔的抑制百分比，并從每個測試化合物產生的濃度-響應曲線計算mic50、mic75和mic90值。b.培養(yǎng)基微量稀釋試驗該測定使用由eucast(rodriguez-tudela等人,2008)公布的改良方法進行。將煙曲霉的孢子(ncpf2010、ncpf7010(甲硫氨酸220突變體)、ncpf7099(甘氨酸g54突變體)，獲自publichealthengland,wiltshire；tr34/l98h突變體獲自stlouishospital,法國巴黎)在sabouraud葡萄糖瓊脂中培養(yǎng)3天。通過用pbs-吐溫(10ml；含有0.05％吐溫-20、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的pbs)洗滌，從sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物制備儲備孢子懸浮液。使用neubauer血細胞計數器評估孢子計數，并使用pbs調節(jié)至106孢子/ml。在過濾滅菌的bsamopsrpmi-1640(50ml；含有2mml-谷氨酰胺、0.5％bsa、2％葡萄糖、0.165mmops的rpmi-1640，用naoh緩沖至ph7)中制備孢子的工作懸浮液(2x105孢子/ml)。對于該測定，首先將bsamopsrpmi-1640(50μl/孔)加入到384孔板中(目錄號353962,bdfalcon,oxford,uk)。然后用integraviaflo96(integra,zizers,瑞士)將試驗化合物(0.5μldmso溶液)一式四份加入，并用平板混合器充分混合。隨后將50μl如上文制備的工作孢子懸浮液加入除不含孢子的對照孔以外的全部孔中。對于不含孢子的對照孔，加入bsamops-rpmi溶液(50μl/孔)代替。將板子用塑料蓋覆蓋，并孵育(35℃，與環(huán)境空氣一起)48小時。使用多掃描儀(clariostar:bmg,buckinghamshire,uk)測定530nm處的每個孔的od。計算每個孔的抑制百分比，并從每個測試化合物產生的濃度-響應曲線計算mic50、mic75和mic90值。真菌組篩選由eurofinspanlabsinc.進行。測試制品的mic和mic50值按照臨床和實驗室標準研究所的指南對酵母(clsim27-a2)(clsi,2002)和絲狀真菌(clsim38-a)(clsi,2008)的培養(yǎng)基微量稀釋方法測定。支氣管上皮細胞的煙曲霉感染將beas2b細胞接種于96-孔板(100μl；30,000細胞/孔；目錄號3596,sigmaaldrich,dorset,uk)上的10％fbsrpmi-1640中，隨后在試驗前孵育(37℃,5％co2)一天。向每孔中加入試驗化合物(0.5μldmso溶液)或溶媒(dmso)，得到5％的dmso最終濃度。將beas2b細胞用試驗化合物孵育1小時(35℃,5％co2)，然后用煙曲霉(20μl；publichealthengland)分生孢子混懸液(0.5x105/ml，在10％fbsrpmi-1640中)感染。將平板孵育24小時(35℃,5％co2)。收集上清(50μl)，并轉移至pcr平板(目錄號l1402-9700,starlab,miltonkeynes,uk)，將其冷凍(-20℃)直至使用。融化后，將上清(5μl)通過加入r7-pbs溶液(95μl；1:4r7：pbs；bio-rad實驗室,redmond,wa,usa)1:20稀釋。這些樣品(50μl)中的gm水平用plateliagm-eia試劑盒(bio-rad實驗室,redmond,wa,usa)檢測。計算每個孔的抑制百分比，并根據每個試驗化合物產生的濃度-響應曲線計算ic50值。煙曲霉感染人肺泡雙層如以前所述(hope等人,2007)，制備由人肺泡上皮細胞和內皮細胞的雙層組成的人肺泡的體外模型。該系統(tǒng)允許將試驗化合物施用于上部(“空氣”空間)和/或下部(“系統(tǒng)”空間)隔室。已經開發(fā)了這種靈活性以通過將化合物(i)給予上室和將泊沙康唑或其他抗真菌劑給予下室來研究組合治療的效果。收集原代人肺動脈內皮細胞(hpaec)，并在egm-2培養(yǎng)基(lonza,basel,瑞士)中稀釋至106細胞/ml。將穿透小室(transwell)倒置，并將細胞懸浮液(100μl/孔)施加到每個穿透小室的底部。將倒置的穿透小室在室溫下在流罩內孵育2小時，然后將其正放。將egm-2培養(yǎng)基加入到下部(700μl/孔)和上部(100μl/孔)的隔室中，并將穿透小室孵育48小時(37℃,5％co2)。然后用新鮮的egm-2培養(yǎng)基更換下室中的egm-2培養(yǎng)基。收集a549細胞，并在10％ebm中稀釋至5x105個細胞/ml，然后加入到所有穿透小室的上室(100μl/孔)中，并將該平板孵育72小時(37℃,5％co2)。煙曲霉分生孢子(伊曲康唑敏感菌株ncpf2010和伊曲康唑抗性菌株tr34-l98h)分別在sabouraud葡萄糖瓊脂中培養(yǎng)3天。通過用pbs-吐溫(10ml；含有0.05％吐溫-20、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的pbs)洗滌，從sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物制備任一菌株的儲備分生孢子懸浮液。使用neubauer血細胞計數器評估分生孢子計數，并用pbs調節(jié)至106個分生孢子/ml。在使用前立即在ebm(濃度為105分生孢子/ml)中制備分生孢子的工作儲備液。將試驗和參考化合物(或作為溶媒的純dmso)加入到24孔板(3μl/孔，含有600μl2％fbsebm)的適當孔中用于下部隔室處理和96孔板(1μl/孔，含有200μl的2％fbsebm)用于處理上部隔室，以提供0.5％的最終dmso濃度。吸入上部隔室中的培養(yǎng)基，加入含有適當試驗和參考化合物或溶媒的培養(yǎng)基(100μl/孔)。然后將穿透小室轉移到含有試驗和參考化合物或dmso溶媒的24孔板中。孵育1小時(3℃c,5％co2)后，將分生孢子懸浮液(10μl/孔)加入到每個穿透小室的上部隔室中。然后將平板孵育24小時(35℃,5％co2)。收集每個隔室的上清液(5μl/室)并儲存(-20℃)。收集上清液后每天更換培養(yǎng)基，如上所述，用試驗和參考化合物或dmso處理所有孔3天。繼續(xù)收集樣品，直到所有穿透小室中的真菌生長肉眼可見。然后通過elisa(biorad,ca,usa)檢測下部隔室的上清液中gm的水平作為煙曲霉侵襲的指標。細胞活力：刃天青試驗在實驗前將beas2b細胞接種于384孔平板(100μl；3000/孔/；bdfalcon,目錄號353962)中的rpmi-lhc8(rpmi-1640和lhc8等比例混合)中一天。對于不含細胞的對照孔，加入rpmi-lhc8(100μl)。用integraviaflo96(integra,zizers,瑞士)加入試驗化合物(0.5μldmso溶液)，得到0.5％的dmso終濃度。將beas2b細胞與各試驗化合物一起孵育1天(37℃/5％co2，在rpmi-lhc8中)。加完刃天青儲備溶液(5μl,0.04％)后，將該平板再孵育4小時(37℃/5％co2)。每個孔的熒光在545nm(激發(fā))和590nm(發(fā)射)下使用多掃描儀(clariostar:bmglabtech)檢測。計算每個孔相對于溶媒(0.5％dmso)處理的細胞存活率的百分比損失。在適當的情況下，根據每個試驗化合物的濃度-響應曲線產生的濃度-響應曲線計算cc50值。體內抗真菌活性將煙曲霉(atcc13073[菌株:nih5233],americantypeculturecollection,manassas,va,usa)在麥芽瓊脂(nissuipharmaceutical,日本東京)平板上在rt(24±1℃)下生長6-7天。將孢子無菌地從瓊脂平板上移出并懸浮于含有0.05％吐溫80和0.1％瓊脂的無菌蒸餾水中。感染當天，通過血細胞計數器評估孢子計數，調整接種物以獲得1.67×108個孢子/ml生理鹽水的濃度。為了誘導免疫抑制和中性粒細胞減少癥，a/j小鼠(雄性，5周齡)在感染前3、2和1天用氫化可的松(sigmah4881；125mg/kg，sc)和在感染前2天用環(huán)磷酰胺(sigmac0768；250mg/kg，ip)給藥。在第0天，用孢子懸浮液(35μl，經鼻內)感染動物。在第0天感染前30分鐘并隨后在第1、2和3天(代表預防性處理)或僅在第1、2和3天(代表治療)，每日一次鼻內給藥(35μl0.08-2.00mg/ml在生理鹽水中的懸浮液)。對于延長的預防性處理，將試驗化合物(35μl，0.0032或0.016mg/ml的在生理鹽水中的懸浮液)每天一次鼻內給藥，持續(xù)七天；然后在第0天感染前30分鐘以及隨后在感染1、2和3天后，或僅在第0天進行給藥。將這些治療范例的效果與局限于接種前一天和接種前30分鐘以及隨后在感染后第1、2和3天治療所得的結果進行比較；或進一步減少至僅與感染前一天和感染前30分鐘進行比較。每天監(jiān)測動物體重，與第0天的體重相比減少≥20％的動物剔除。最后一次給藥6小時后，將動物麻醉，氣管插管并收集balf。如以前所報道(kimura等人,2013)，使用血細胞計數器測定肺泡細胞總數，分別使用抗小鼠moma2-fitc(巨噬細胞)或抗小鼠7/4(嗜中性粒細胞)通過facs分析(altraii,beckmancoulter,inc.,fullerton,ca,usa)確定肺泡巨噬細胞和嗜中性粒細胞數。分別使用小鼠ifn-γ、il-17、il-6或tnf-αelisa試劑盒(r&d系統(tǒng),inc.,minneapolis,mn,usa)來檢測balf中ifn-γ和il-17以及血清中il-6和tnfα中的水平。一種氧化應激標記物mda通過使用tbarsassay試劑盒(mdaquantitation；cellbiolabsinc,sandiego,ca,usa)進行測定。血清中的曲霉菌gm使用plateliagm-eia試劑盒(bio-radlaboratories,redmond,wa,usa)進行檢測。截止(cut-off)指數通過公式計算：截止指數＝樣品中的od/試劑盒中提供的截止對照品的od。對于組織真菌負載測定，無菌地移出100mg肺組織，并在無菌蒸餾水中的0.2ml0.1％瓊脂中勻漿化。將連續(xù)稀釋的肺勻漿接種在麥芽瓊脂平板(50μl/板)上，并在24±1℃下孵育72至96小時。對每個平板上煙曲霉的菌落進行計數，真菌滴度以每克肺組織的cfu表示。將感染前三天每日施用氫化可的松(sigmah4881；125mg/kg，sc)以及在感染前兩天施用環(huán)磷酰胺(sigmac0768；250mg/kg，ip)的嚴重免疫抑制的中性粒細胞減少的a/j小鼠(雄性，5周齡)用于評價鼻內施用化合物(i)和口服施用泊沙康唑的組合治療的效果。在第0天將動物用35μl煙曲霉(atcc13073[菌株:nih5233])的孢子混懸液(1.67x108孢子/ml生理鹽水)鼻內感染。將在等滲鹽水(0.4mg/ml)中制備為混懸液的化合物(i)在感染后第1-6天通過鼻內注射(35μl/小鼠)每日一次進行給藥。感染后1-6天每天一次口服施用泊沙康唑(1mg/kg)。每天監(jiān)測體重和生存情況，直到第7天。篩選結果概述化合物(i)顯示出對唑類敏感的煙曲霉真菌生長(如通過刃天青試驗法所評估)和支氣管上皮細胞真菌感染的有效抑制活性(表2)。在這些試驗系統(tǒng)中，化合物(i)顯示出比伏立康唑和兩性霉素b更高的效力以及與托替卡唑類似的效力。在最多、至少10μm濃度下用化合物(i)孵育對beas2b支氣管上皮細胞的活力沒有影響或影響很小。表2用伏立康唑、泊沙康唑、兩性霉素b和化合物(i)處理對煙曲霉(ncpf2010)浮游真菌生長、對beas2b支氣管上皮細胞的真菌感染和beas2b細胞活力的影響。表格腳注：1.刃天青-微量滴定法；2.支氣管上皮細胞；3.n＝1-5；如培養(yǎng)基微量稀釋試驗所評估，化合物(i)還顯示出對浮游真菌生長有效的抑制活性(表3)。在該試驗中，與泊沙康唑、伏立康唑和兩性霉素b相比，化合物(i)顯示出對泊沙康唑抗性菌株(ncpf7099、ncpf7100和tr34/l98h)和泊沙康唑敏感株(ncpf2010)二者都顯著更高的效能。表3伏立康唑、泊沙康唑、兩性霉素b和化合物(i)對煙曲霉分離株的浮游真菌生長的影響。表格腳注：1.培養(yǎng)基微量稀釋法，n＝1-3使用clsi培養(yǎng)基微量稀釋法評估化合物(i)對較大范圍真菌病原體生長的影響。發(fā)現化合物(i)是米根霉(rhizopusoryzae)、新生隱球菌(cryptococcusneoformans)、球毛殼菌(chaetomiumglobosum)、產黃青霉(penicilliumchrysogenum)和紅色毛癬菌(trichophytonrubrum)以及一些假絲酵母屬物種(candidaspp)的有效的生長抑制劑(表4)。表4化合物(i)對一系列真菌菌種生長的影響。表格腳注：mic50/mic100＝通過目視檢查對真菌生長抑制50％和100％所需的濃度(clsi)使用化合物(i)(0.1μg/ml，在上部隔室)或泊沙康唑(0.01μg/ml，在下室隔室)的單一療法在第1天抑制人肺泡雙層中gm的產生。然而，這些治療的抑制作用在此之后迅速消失(表5)。相反，化合物(i)與泊沙康唑的組合治療顯示出對感染后侵襲的持續(xù)抑制。因此，組合治療的dfb50為5.48天，比使用單一化合物的值長得多。當化合物(i)與伊曲康唑、伏立康唑或卡泊芬凈組合治療時，組合治療的這種協(xié)同作用或疊加效應也得到證實(結果未顯示)。表5：化合物(i)、泊沙康唑和治療組合對煙曲霉(ncpf2010)侵入人肺泡雙層的下部隔室(穿透小室)的影響。表格腳注：1.以0.1μg/ml給藥；2.以0.01μg/ml給藥；dfb50:達到50％的對照的真菌負載的天數此外，這種組合治療已經在感染煙曲霉的唑類抗性菌株tr34-l98h的雙層中進行了測試。(表6)在上部隔室用化合物(i)(1μg/ml)或在下部隔室用泊沙康唑(0.1μg/ml)的單一療法顯示有限的益處。相反，化合物(i)和泊沙康唑的組合對真菌侵入下部隔室顯示出顯著的抑制作用。在感染后第1天觀察到組合治療的有益效果，但在第2天后消失。表6化合物(i)、泊沙康唑和治療組合對煙曲霉(tr34-l98h菌株)侵入人肺泡雙層細胞系統(tǒng)(穿透小室)下部隔室的影響。表格腳注：1.以1μg/ml給藥；2.以0.1μg/ml給藥；dfb50:達到50％的對照的真菌負載的天數接種后第0天和第1-3天向免疫受損的中性粒細胞減少的小鼠鼻內給藥(預防性治療)時，以頭對頭比較，在3天內檢測的減少由煙曲霉感染引起的體重減輕方面，化合物(i)顯示比泊沙康唑更好的作用(表7)。表7:化合物(i)和泊沙康唑治療對由煙曲霉感染引起的免疫受損的中性粒細胞減少的小鼠的體重減輕的影響的比較。表格腳注：1.以0.4mg/ml鼻內給藥；2.與第0天的動物重量相比的體重減輕％。此外，用化合物(i)的預防和治療性處理對于感染后肺部真菌負載以及balf和血清中的gm濃度都顯示優(yōu)于泊沙康唑的效果。用于預防和治療性給藥方案的化合物(i)的數據示于表8和圖1、2和3(id50值列于表9)中。表8:化合物(i)預防和治療性處理對煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少的小鼠肺中cfu以及balf和血清中半乳甘露聚糖濃度的效果。表格腳注：真菌負載數據顯示為平均值±標準誤差(sem；n＝5-6)。表9：泊洛沙唑和化合物(i)的預防性處理對煙曲霉感染的免疫受損的嗜中性粒細胞減少的小鼠肺中真菌負載以及balf和血清中半乳甘露聚糖濃度的id50值?；衔?i)的預防性處理以類似于泊沙康唑的方式抑制balf中的炎癥細胞蓄積(表10)。此外，化合物(i)的預防性處理顯示出比泊沙康唑對于balf中的il-17、ifnγ和mda濃度更好的抑制作用，并且在獨立實驗中化合物(i)和泊沙康唑的對比的id50值如表11中所示。表10：化合物(i)的預防和治療性處理對巨噬細胞和嗜中性粒細胞在煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠的balf中蓄積的影響。表格腳注：細胞數的數據顯示為平均值±標準誤差(sem)，n＝5-6。表11：在煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠中泊沙康唑和化合物(i)的預防性處理對balf中il-17、ifnγ和mda水平的id50值。此外，當預防性或治療性施用時，顯示化合物(i)對balf中的ifnγ、il-17和mda水平的影響的數據如表12中所示，并且對血清、il-6和tnfα的影響如表13中所述。表12：化合物(i)的預防和治療性處理對煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠的balf中的ifnγ、il-17和mda水平的影響。表格腳注：生物標志物濃度的數據顯示為平均值±平均值的標準誤差(sem)，n＝5-6。表13:化合物(i)的預防和治療性處理對煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠的血清中il-6和tnfα水平的影響表格腳注：生物標志物濃度的數據顯示為平均值±平均值的標準誤差(sem),n＝5-6。在煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠中，化合物(i)的治療性處理也被發(fā)現對肺真菌負載、血清半乳甘露聚糖水平和balf細胞因子濃度維持有效的抑制作用。(表7、8、9和10以及圖1、2和3)。還評估了化合物(i)的延長的預防性給藥對煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠中生物標志物的影響。發(fā)現用比以前的生物標志物研究中使用的劑量低25倍的化合物(i)進行的延長預防可抑制肺中的真菌負載以及balf和血清中的gm濃度(表14)。此外，數據表明，在重復給藥情況下肺中抗真菌作用的積累，因為與預防性治療只添加一天相比，7天的預防產生更高的抗真菌作用。發(fā)現從第-7天至第0天的治療在第3天產生了比在第-1天和第0天治療更好的抗真菌作用，表明該化合物在肺中的持續(xù)作用。然而，這種縮短的給藥方案仍然是預防性的。表14：化合物(i)延長的預防給藥在煙曲霉感染的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠中對肺中真菌負載(cfu)和balf和血清中gm濃度的影響。表格腳注：1.所有藥物處理組的n值為6；2.溶媒處理組的n值為5；3.真菌負載和gm水平的數據顯示為平均值±標準誤差和相對于溶媒的抑制百分比。評估了在嚴重免疫受損的中性粒細胞減少小鼠中接種煙曲霉后局部施用化合物(i)與口服泊沙康唑的組合治療對存活率的影響。用化合物(i)(0.4mg/ml，鼻內給藥)或用泊沙康唑(1.0mg/kg，口服給藥)的單一治療顯示出非常有限的治療益處。相反，化合物(i)和泊沙康唑的組合顯示在感染后的存活時間顯著增加(表15)。表15：化合物(i)和泊沙康唑作為單一療法或組合療法對感染煙曲霉的嚴重免疫受損的中性粒細胞減少小鼠的存活的影響。表格腳注:每組n＝8。體內藥物動力學對于肺部治療劑來說，常規(guī)使用的方法是向動物(例如小鼠)的肺給藥，并在給藥后的不同時間點收集血漿，以表征所得到的對所施用化合物的全身接觸的情況?？梢栽谶@樣的體內系統(tǒng)中測試本發(fā)明的化合物?；衔?i)的生物學特性概述已發(fā)現化合物(i)是煙曲霉浮游生物生長和支氣管上皮細胞感染的有效抑制劑?；衔?i)還抑制了對泊沙康唑耐藥和伏立康唑耐藥的煙曲霉分離株的生長，顯示出比泊沙康唑、伏立康唑和伊曲康唑對這些菌株更大的效力。化合物(i)還被發(fā)現是米根霉、新生隱球菌、球毛殼菌、產黃青霉和紅色毛癬菌以及一些假絲酵母物種生長的有效抑制劑。在肺泡的體外模型中，化合物(i)無論作為單一療法還是與泊沙康唑組合使用都對曲霉菌侵襲顯示出令人印象深刻的活性。在體內，在感染煙曲霉的免疫受損的中性粒細胞減少小鼠中，化合物(i)對煙曲霉感染以及相關的肺部免疫應答表現出強烈的抑制作用，無論是預防性還是治療性給藥都是如此?；衔?i)在減少感染依賴性的體重減輕方面也是非常有效的。這些抑制作用優(yōu)于泊沙康唑。在預防和治療背景中觀察到化合物(i)的有益的抗真菌作用是顯著的。參考文獻：agbetile，j.，fairs，a.，desai，d.，hargadon，b.，bourne，m.，mutalithas，k.，edwards，r.，morley，j.p.，monteiro，w.r.，kulkarni，n.s.，green，rh，pavord，i.d.，bradding，p.，brightling，c.e.，wardlaw，a.j.andpashley，c.h.isolationoffilamentousfungifromsputuminasthmaisassociatedwithreducedpost-bronchodilatorfev1.clin.exp.allergy，2012，42，782-91.bafadhelm.，mckennas.，aqbetilej.，fairsa.，desaid.，mistryv.，morleyj.p.，pancholim.，pavordi.d.，wardlawa.j.，pashleyc.h.andbrightlingc.e.aspergillusfumigatusduringstablestateandexacerbationsofcopd.eur.respir.j.，2014，43，64-71.bowyerp.anddenningd.w.environmentalfungicidesandtriazoleresistanceinaspergillus.pestmanagementscience，2014，70，173-178.chishimbal.，nivenr.m，fomm.，cooleyj.anddenningd.w.voriconazoleandposaconazoleimproveasthmaseverityinallergicbronchopulmonaryaspergillosisandsevereasthmawithfungalsensitization.pharmacotherapy，2012，49，423-433.chotirmalls.h.，o′donoghuee.，bennettk.，gunaratnamc.，o′neills.j.andmcelvaneyn.g.sputumcandidaalbicanspresagesfev1declineandhospital-treatedexacerbationsincysticfibrosis.chest，2010，138，1186-95.clsim27-a2：referencemethodforbrothdilutionantifungalsusceptibilitytestingofyeasts；approvedstandard，2nded，ncclsdocumentm27-a2，clinicalandlaboratorystandardsinstitute，wayne，pa，2002.clsim38-a2：referencemethodforbrothdilutionantifungalsusceptibilitytestingoffilamentousfungi；approvedstandard，2nded，clsidocumentm38-a2，clinicalandlaboratorystandardsinstitute，wayne，pa，2008.denningd.w.，pleuvrya.andcoled.c.globalburdenofchronicpulmonaryaspergillosisasasequeltopulmonarytuberculosis.bulletinoftheworldhealthorganization，2011a，89，864-872.denningd.w.，parks.，lass-floric.，fraczekm.g.，kirwanm.，gorer.，smithj.，bueida.，moorec.b.，bowyerp.andperlind.s.highfrequencytriazoleresistancefoundinnonculturableaspergillusfumigatusfromlungsofpatientswithchronicfungaldisease.clin.infect.dis.，2011b，52，1123-1129.dimopoulosg.，frantzeskakif.，poulakoug.andarmaganidisa.lnvasiveaspergillosisintheintensivecareunit.ann.nyacad.sci.，2012，1272，31-39.geistm.j.p.，egererg.，burhennej.，riedelk-d.andmikusg.inductionofvoriconazolemetabolismbyrifampininapatientwithacutemyeloidleukemia：importanceofinterdisciplinarycommunicationtopreventtreatmenterrorswithcomplexmedications.antimicrob.agentschemother.，2007，51，3455-3456.hopew.w.，kruhlakm.j.，lymanc.a.，petraitiener.，petraitisv.，francesconia.，kasaim.，mickiened.，seint.，peterj.，kelahera.m.，hughesj.e.，cottonm.p.，cottenc.j.，bacherj.，tripathis.，bermudezl.，maugelt.k.，zerfasp.m.，wingardj.r.，drusanog.l.andwalsht.j.pathogenesisofaspergillusfumigatusandthekineticsofgalactomannaninaninvitromodelofearlyinvasivepulmonaryaspergillosis：implicationsforantifungaltherapy.j.infect.dis.，2007，195(3)，455-466.jeongs.，nguyenp.d.anddestaz.comprehensiveinvitroanalysisofvoriconazoleinhibitionofeightcytochromep450(cyp)enzymes：majoreffectoncyps2b6，2c9，2c19，and3a.antimcrob.agentschemother.，2009，53，541-551.kaurs.andsinghs.biofilmformationbyaspergillusfumigatus.med，mycol.，2014，52，2-9.kimurag.，uedak.，etos.，watanabey.，masukot.，kusamat.，barnesp.j.，itok.andkizaway.toll-likereceptor3stimulationcausescorticosteroid-refractoryairwayneutrophiliaandhyper-responsivenessinmice.chest.2013，144，99-105.lata.andthompsong.r.updateontheoptimaluseofvoriconazoleforinvasivefungalinfections.lnfect.drugresist.，2011，4，43-53.limpera.h.，knoxk.s.，sarosig.a.，ampeln.m.，bennettj.e.，catanzaroa.，daviess.f.，dismukesw.e.，hagec.a.，marrk.a.，modyc.h.，peffectj.r.andstevensd.a.anofficialamericanthoracicsocietystatement：treatmentoffungalinfectionsinadultpulmonaryandcriticalcarepatients.am.j.respir.crit.caremed.，2011，183，96-128.levinm-d，denhollanderj.g.，vanderholtb.，rijndersb.j.，vanvlietm.，sonneveldp.andvanschaikr.h.hepatotoxicityoforalandintravenousvonconazoleinrelationtocytochromep450polymorphisms.j.antimicrob.chemother.，2007，60，1104-1107.lins-j，scranzjandteutschs.m.aspergilluscase-fatalityrate：systematicreviewoftheliterature.clin.infect.dis.，2001，32，358-366.monteirom.c.，delacruzm，cantizanij.，morenoc.，tormoj.r.，melladoe，delucasj.r.，asensiof.，valiantev.，brakhagea.a.，latgéjp，genilloudo.，vicentef.anewapproachtodrugdiscovery：high-throughputscreeningofmicrobialnaturalextractsagainstaspergillusfumigatususingresazurin.j.biomol.screen.2012，17，542-549.pasqualottoa.c.，powellg.，nivenr.anddenningd.w.theeffectsofantifungaltherapyonsevereasthmawithfungalsensitizationandallergicbronchopulmonaryaspergillosis.respirology，2009，14，1121-127.piercec.g.，uppulurip.，tristana.r.，wormleyf.l.jr.，mowate.，ramageg.，lopez-ribotj.l.asimpleandreproducible96-wellplate-basedmethodfortheformationoffungalbiofilmsanditsapplicationtoantifungalsusceptibilitytestiing.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