本發(fā)明涉及新種類的離子交換吸附劑，其適合從含有抗體的溶液中分離宿主細(xì)胞蛋白(hcp)、抗體片段和低分子量物質(zhì)。本發(fā)明特別涉及通過分離目標(biāo)生物分子和雜質(zhì)來純化生物樣品的方法，其包括使樣品與由纖維組成的所述色譜介質(zhì)接觸的步驟，所述纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜和/或疏水性相互作用的官能團。

背景

純化單克隆抗體

因為單克隆抗體(mab)用于藥物應(yīng)用，所以它們需要格外高的純度[a.jungbauer,g.carta,proteinchromatography,processdevelopmentandscale-up(蛋白色譜法，工藝開發(fā)和規(guī)?；?;wiley-vchverlag,weinheim(德國)2010]。

通常，采用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物來制造當(dāng)前銷售的大部分治療單克隆抗體(mab)。這些藥物抗體的生產(chǎn)通常在含有中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞懸浮液的生物反應(yīng)器中開始，中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞分泌抗體到細(xì)胞外流體中。所得抗體隨后經(jīng)受包括澄清、過濾和純化的一系列過程，由此除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片、宿主細(xì)胞蛋白(hcp)、脂質(zhì)、dna、病毒、細(xì)菌、抗體聚集體等。該系列過程常被稱為下游過程(dsp)。

最常用的dsp包括一個或兩個結(jié)合-洗脫色譜純化步驟，接著是一個或兩個流通精制步驟(圖1，標(biāo)準(zhǔn)mab純化方案)。典型的下游純化方法采用填充有基于多孔珠的色譜介質(zhì)的填充柱或基于膜的裝置。這些單元操作串聯(lián)使用，并且以流通精制或結(jié)合/洗脫捕獲模式各自靶向清除特定雜質(zhì)。

精制介質(zhì)的主要目的之一在于將hcp的濃度降低到<10ppm(就mab濃度而言)。各種治療生物分子的工業(yè)規(guī)模純化目前使用基于珠粒的色譜樹脂實現(xiàn)。生物藥物生產(chǎn)商在該流通精制步驟中最常使用簡單的陰離子交換(aex)色譜介質(zhì)。采用aex介質(zhì)以除去酸性hcp、dna、內(nèi)毒素和病毒。然而，其在除去帶正電荷的雜質(zhì)諸如堿性hcp、產(chǎn)物聚集體和片段方面常常不太有效。

單克隆抗體繼續(xù)贏得作為治療和診斷劑的重要性。篩選候選mab的雜交瘤庫的方法既耗時又勞動密集。一旦建立了表達合適mab的雜交瘤細(xì)胞系，則必須開發(fā)純化方法以生產(chǎn)足夠的mab以便進一步表征。

用于純化的傳統(tǒng)方法涉及使用蛋白a或蛋白g親和色譜以及離子交換色譜。將純化的抗體脫鹽并使用透析交換到生物緩沖液中。整個過程通常需要幾天才能完成，且如果需要平行地評估多個mab，可能會特別繁重。

因此，近來已經(jīng)開發(fā)出多種新的精制吸附劑，其顯示出更大的容量和親和力，從而允許其除去更寬范圍的雜質(zhì)。這些吸附劑包括所謂的“混合模式”配體，既為陰離子交換材料(aex)(例如us7,714,112)又為陽離子交換材料(cex)(例如，us7,385,040)。然而，在樹脂上的這些復(fù)雜配體的較高成本阻止了它們單次使用或在一次性使用過程中的使用。

通常，所施用的基于珠粒的吸附劑證明了高孔隙率和大表面積，這為材料提供了足夠的吸附能力以在生產(chǎn)規(guī)模(例如，10,000升)下分批加工生物分子。根據(jù)專利文獻，已知在用于該技術(shù)應(yīng)用的混合床固定相中使用的這種基于珠粒的介質(zhì)的許多實例。

在jp01-10178(asahichem.ind.coltd.，還作為jp2660261b2公開)中，公開了多功能模塊，其包括用于在單一裝置中除去陽離子、陰離子和細(xì)顆粒的目的的aex和cex多孔中空纖維膜的組合。

bio-radlaboratories，inc.已經(jīng)開發(fā)了多介質(zhì)親和柱(us8,053,565b)，其包括在單一柱中在第二種類型的色譜介質(zhì)之上的親和色譜介質(zhì)層，使得在洗脫目標(biāo)親和結(jié)合蛋白質(zhì)的過程中該第二下部的色譜介質(zhì)將捕獲來自上部親和色譜介質(zhì)的任何浸出親和配體。

promegacorp.(us6,270,970a)已經(jīng)開發(fā)了用于從不純的混合物中分離核酸的混合床固相。所包含兩相中的每一相具有在不同溶液條件下結(jié)合和釋放靶核酸的能力。

在由milliporecorp.和ebaracorp.提交的另一專利申請(wo2005/011849a)中，公開了電去離子模塊，其中離子交換裝置由陰離子交換纖維的織物和以面對面關(guān)系放置的陽離子交換纖維的織物的組件構(gòu)成。

混合床色譜在單一裝置中采用組合在一起的兩種或更多種不同的吸附介質(zhì)。其允許施用多種不同的相互作用以用于在單一裝置內(nèi)分析并純化蛋白質(zhì)溶液。rassi和horváth證實，由aex-樹脂和cex樹脂構(gòu)成的混合床柱給出與串聯(lián)的兩個單獨柱類似的蛋白質(zhì)分離(elrassi,z.;harváth,c.;“tandemcolumnsandmixed-bedcolumnsinhigh-performanceliquidchromatographyofproteins(在蛋白的高效液相色譜中的串聯(lián)柱和混合床柱)”;j.chrom.1986,359,255-264)。使用這些系統(tǒng)，他們能夠拆分在僅采用單一樹脂時將同時洗脫的幾種不同蛋白質(zhì)的混合物。

已經(jīng)將混合床色譜施用到包括蛋白組的分析的幾種不同應(yīng)用，蛋白組特別難以分析，因為它們由多種高豐度蛋白和低豐度蛋白構(gòu)成(boschetti,e.;righetti,p.g.;“mixed-bedchromatographyasawaytoresolvepeculiarfractionationsituations”,j.chomatogr.b2011,897,827-835)。

分離材料如色譜樹脂通常呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠在最小流動不均勻性下實現(xiàn)有效柱填充。在珠粒之間的孔隙空間提供了經(jīng)由色譜柱對流傳輸?shù)牧鲃油ǖ?。這使得色譜柱能夠以大床深度以高線速度在最小壓降下運行。這些因素的組合使得色譜樹脂能夠提供生物分子的大規(guī)模純化需要的所需效率、高滲透性和足夠的結(jié)合能力。

在基于珠粒的色譜中，用于吸附的大部分可用表面積在珠粒內(nèi)部。因此，分離過程本質(zhì)上是緩慢的，因為質(zhì)量傳輸速率通常通過孔擴散來控制。為了使該擴散阻力最小化并且同時使動態(tài)結(jié)合能力最大化，可采用小直徑的珠粒。然而，使用該小直徑珠粒是以增加的柱壓下降為代價的。因此，制備型色譜分離的優(yōu)化常涉及在效率/動態(tài)能力(小珠粒有利)和柱壓下降(大珠粒有利)之間的折衷。

色譜介質(zhì)通常價格很高(>$1000/l)且大規(guī)模制備柱需要非常大的量。因此，生物醫(yī)藥生產(chǎn)商使色譜樹脂再循環(huán)數(shù)百次。這些再生循環(huán)中的每次消耗大量的介質(zhì)，且每個步驟產(chǎn)生與每次清潔、殺菌和柱填充操作的有效性關(guān)聯(lián)的額外成本。

如上所指出，數(shù)種技術(shù)描述于專利文獻中且商業(yè)上面市以基于功能化纖維介質(zhì)和/或復(fù)合材料進行生物醫(yī)藥分離。大多數(shù)依賴于將多孔凝膠合并到纖維基質(zhì)中，凝膠提供所需的表面積以獲得合理的結(jié)合能力。然而，在這樣的構(gòu)造中，凝膠位置和質(zhì)量的不良均勻性通常引起不良效率(淺貫穿(shallowbreakthrough)和洗脫前沿(elutionfront))。另外，即使對于短床深度，流動阻力也可能很高，問題常常因在中度壓力負(fù)載下的凝膠壓縮而加劇。

采用的另一方法是將微粒結(jié)合到纖維基質(zhì)內(nèi)，所述微粒常為多孔的并具有天然吸附官能團；實例是活性碳和硅膠。

目的

當(dāng)前的下游過程(dsp)為復(fù)雜且昂貴的。這是為何工業(yè)對于開發(fā)壓縮、簡化且降低這些過程的成本的新技術(shù)感興趣的原因。因此，目的在于開發(fā)通過消除在使用后清潔并儲存管柱所需要的時間和緩沖液而降低生產(chǎn)成本的低廉的一次性吸附介質(zhì)。目的還在于通過靶向更寬種類的雜質(zhì)而提高吸附介質(zhì)的性能。

另外，希望具有可定制的配體化學(xué)組合物，因此可將吸附介質(zhì)特別地精調(diào)到靶向給定進料中存在的雜質(zhì)的特定混合物。這是對基于樹脂和基于膜的吸附介質(zhì)待完成的挑戰(zhàn)。

還希望提供用于生物分子色譜應(yīng)用的高表面積纖維與側(cè)接吸附官能團的組合，而不犧牲床滲透性和可獲得的流速。

除此之外，本發(fā)明的另一目的還在于提供廉價的可制造且化學(xué)上限定的載體材料，該材料可通過常規(guī)方法衍生化，使得其可用作離子交換材料或疏水分離材料兩者。

發(fā)明概述

現(xiàn)有技術(shù)的缺陷已經(jīng)通過本文公開的實施方案解決，實施方案涉及用于色譜、特別是離子交換色譜的吸附介質(zhì)且特別是使用該介質(zhì)純化生物樣品的相應(yīng)方法。

本文公開的通過分離目標(biāo)生物分子和雜質(zhì)的純化生物樣品的方法包括使所述樣品與由纖維組成的色譜介質(zhì)接觸的步驟，所述纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜和/或疏水性相互作用的官能團，且包括洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)或以提取所述目標(biāo)生物分子的步驟。

詳細(xì)地講，根據(jù)本發(fā)明的純化包含目標(biāo)生物分子和雜質(zhì)的樣品的方法通常包括以下步驟：

a)提供樣品，

b)使所述樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)接觸，所述纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜或疏水性相互作用色譜的官能團，

c)洗滌所述第一纖維介質(zhì)以除去未結(jié)合的物質(zhì)，

d)洗滌所述第一纖維介質(zhì)以提取所述目標(biāo)生物分子，

e)使所述目標(biāo)生物分子與包含纖維的第二色譜介質(zhì)接觸，所述纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜或疏水性相互作用色譜的官能團，

f)洗滌所述第二纖維介質(zhì)以除去未結(jié)合的物質(zhì)，和

g)洗滌所述第二纖維介質(zhì)以提取所述目標(biāo)生物分子，但條件是在步驟b)和e)中使用不同官能化的纖維介質(zhì)。

在步驟b)中，使施用的樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)接觸，所述纖維具有賦予的能夠?qū)崿F(xiàn)陰離子交換色譜的官能團，且其中，在步驟e)中，使用包含具有能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維的色譜介質(zhì)。然而，該方法也可以改進的形式進行，其中，在步驟b)中，使所述樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)接觸，所述纖維具有賦予的能夠?qū)崿F(xiàn)陽離子交換色譜的官能團，且其中，在步驟e)中，使用包含具有能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維的色譜介質(zhì)。在該方法的另一實施方案中，在步驟b)中，使用包含具有能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維的色譜介質(zhì)，且在步驟e)中，所述離子交換色譜為陰離子交換色譜或陽離子交換色譜。但是，根據(jù)所施用生物樣品的性質(zhì)，還有可能的是，在步驟b)中，使用包含具有能夠?qū)崿F(xiàn)陰離子交換色譜的官能團的纖維的色譜介質(zhì)且在步驟e)中的所述第二色譜介質(zhì)為陽離子交換色譜或者相反。

在本發(fā)明方法的另一實施方案中，步驟如下：

a)提供樣品，

b)使所述樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)和包含纖維的第二色譜介質(zhì)的混合物接觸，所述第一色譜介質(zhì)包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維，所述第二色譜介質(zhì)包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維，

c)洗滌所述色譜介質(zhì)的混合物以除去未結(jié)合的物質(zhì)，和

d)洗滌所述色譜介質(zhì)的混合物以提取所述目標(biāo)生物分子。

在此，所述第一色譜介質(zhì)為陰離子交換色譜且所述第二色譜介質(zhì)為陽離子交換色譜或者相反。

本發(fā)明的方法的另一變體為

a)提供樣品，

b)使所述樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)和包含纖維的第二色譜介質(zhì)的混合物接觸，所述第一色譜介質(zhì)包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維，所述第二色譜介質(zhì)包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維，

c)洗滌所述色譜介質(zhì)的混合物以除去未結(jié)合的物質(zhì)，和

d)洗滌所述色譜介質(zhì)的混合物以提取所述目標(biāo)生物分子。

包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維的所述第二色譜介質(zhì)可為陽離子交換色譜或陰離子交換色譜。

本發(fā)明還涉及包含纖維的填充床的外殼；所述填充床具有第一層和第二層，所述第一層包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維，且所述第二層包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維。所述離子交換色譜可為陰離子交換色譜或陽離子交換色譜。在根據(jù)本發(fā)明的外殼的一個特別的實施方案中，其包含纖維的填充床；所述填充床具有第一層和第二層，所述第一層包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維，且所述第二層包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維。所述離子交換色譜可為陰離子交換色譜或陽離子交換色譜。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述外殼包含纖維的填充床；所述填充床具有第一色譜介質(zhì)和第二色譜介質(zhì)的混合物，所述第一色譜介質(zhì)包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團的纖維，且所述第二色譜介質(zhì)包含具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團的纖維。所包含的離子交換色譜可為陰離子交換色譜或陽離子交換色譜。

純化包含目標(biāo)生物分子和雜質(zhì)的樣品的本發(fā)明方法還可通過以下來進行：使樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)接觸，所述第一纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團，和使樣品與包含纖維的第二色譜介質(zhì)接觸，所述第二纖維也具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團。優(yōu)選所述第一色譜介質(zhì)為陽離子交換纖維且所述第二色譜介質(zhì)為陰離子交換纖維。在所述方法的另一優(yōu)選的實施方案中，所述第一色譜介質(zhì)為陰離子交換纖維且所述第二色譜介質(zhì)為陽離子交換纖維。選擇該方法中的色譜介質(zhì)使得所述第一官能團能夠?qū)崿F(xiàn)以流通模式純化且所述第二官能團能夠?qū)崿F(xiàn)以流通模式純化。在本發(fā)明方法的另一實施方案中，進行選擇以使得所述第一官能團能夠?qū)崿F(xiàn)以結(jié)合/洗脫模式純化且所述第二官能團能夠?qū)崿F(xiàn)以結(jié)合/洗脫模式純化。然而，如果證明是對于純化有利，則也可對所述方法進行改進，使得所述第一官能團能夠?qū)崿F(xiàn)以流通模式純化且所述第二官能團能夠?qū)崿F(xiàn)以結(jié)合/洗脫模式純化。

此外，用于純化包含目標(biāo)生物分子和雜質(zhì)的樣品的本發(fā)明方法也可通過使樣品與包含纖維的第一色譜介質(zhì)和包含纖維的第二色譜介質(zhì)接觸來進行，所述第一纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)離子交換色譜的官能團，所述第二纖維具有賦予其上的能夠?qū)崿F(xiàn)疏水性相互作用色譜的官能團。在本發(fā)明方法的該實施方案中，優(yōu)選所述第一色譜介質(zhì)為陽離子交換纖維且所述第二色譜介質(zhì)為疏水性相互作用色譜纖維。否則，如果目標(biāo)生物分子需要，則所述第一色譜介質(zhì)為陰離子交換纖維且所述第二色譜介質(zhì)為疏水性相互作用色譜纖維。如果不僅所述第一官能團而且所述第二官能團都能夠?qū)崿F(xiàn)以流通模式純化，則實現(xiàn)良好的純化效果。如果需要且有利，可選擇如下色譜介質(zhì)，其中所述第一官能團能夠以結(jié)合/洗脫模式實現(xiàn)純化，且所述第二官能團能夠以結(jié)合/洗脫模式實現(xiàn)純化。在本發(fā)明方法的另一實施方案中，可選擇色譜介質(zhì)使得所述第一官能團能夠以流通模式實現(xiàn)純化且所述第二官能團能夠以結(jié)合/洗脫模式實現(xiàn)純化。此外，在本發(fā)明方法的一個特別的實施方案中，所述第一色譜介質(zhì)和所述第二色譜介質(zhì)布置成各種官能化纖維的混合物，或所述第一色譜介質(zhì)和所述第二色譜介質(zhì)布置成多層。層狀色譜介質(zhì)的相應(yīng)實施方案在下文中更詳細(xì)地描述。

發(fā)明詳述

所公開的色譜介質(zhì)衍生自具有高表面積的成形或多孔的纖維。在某些實施方案中，所述成形纖維提供原纖化或隆起結(jié)構(gòu)。根據(jù)某些實施方案的高表面積纖維的實例為自allassoindustries,inc.(raleigh,nc)購得的“翼狀”纖維?？蔀橐頎罨蚋呖椎暮线m纖維提供約1-14m²/g的表面積。

還如本文所公開，纖維材料在將提供例如陽離子交換或陰離子交換官能團的表面?zhèn)冉庸倌軋F添加到高表面積纖維的方法中衍生化。該側(cè)接官能團可用于諸如單克隆抗體(mab)的生物分子的離子交換色譜純化。

本文公開的色譜交換劑材料包括具有至少在1-14m²/g范圍內(nèi)的高表面積的非織造聚合物纖維，繼而在其表面上包含官能團，即至少陰離子交換基團、陽離子交換基團或具有疏水性相互作用官能性的基團，且其中所述官能團可以混合或原樣連接到相同纖維的表面且由此不同官能化的纖維可以彼此組合或混合。根據(jù)所執(zhí)行的官能化，本發(fā)明的材料為離子交換材料，其為陰離子交換劑或陽離子交換吸附劑。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述官能化色譜交換劑材料可包含在已經(jīng)通過離子基團官能化的相同纖維的表面上或在單獨纖維的表面上的疏水性相互作用官能團。

這意味著本發(fā)明的色譜交換劑材料可包含具有不同官能團的纖維，或者可包含具有不同官能團的纖維的混合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，將本發(fā)明的材料共混在一起以提供色譜介質(zhì)內(nèi)不同官能團的均勻分布的混合物。色譜介質(zhì)的組成可通過針對具體應(yīng)用改變兩種不同類型的纖維的相對量來控制。例如，針對具體應(yīng)用，可產(chǎn)生由50%陰離子交換劑纖維(aex纖維)和50%陽離子交換劑纖維(cex纖維)構(gòu)成的色譜介質(zhì)。在另一情況下，可產(chǎn)生由25%aex纖維和75%cex纖維構(gòu)成的色譜介質(zhì)以解決不同應(yīng)用的特定分離需要。

在一個供選的實施方案中，本發(fā)明的材料具有層狀結(jié)構(gòu)，其中不同的層可由相同的纖維制成或者其中各層可具有不同的官能團。因此，具有不同的官能團的層可彼此跟隨。這些層可以特殊順序彼此跟隨，任選地進行數(shù)次，或者具有相同官能團的層以直接順序重復(fù)幾次以產(chǎn)生期望的層厚度。

形成色譜交換劑材料的纖維為具有1-14m²/g范圍內(nèi)的高表面積的纖維，其基于具有8-32個深通道的輕質(zhì)翼狀纖維或基于高孔纖維。翼狀纖維可通過共擠出制成，由在均勻的直邊翼之間的8-32個深通道形成核心特征。高孔纖維也可作為色譜交換劑材料使用。通常，對于本發(fā)明的色譜交換劑材料使用具有0.5mm-5cm范圍的長度的纖維。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的色譜交換劑材料由具有0.5mm-2.5cm范圍的長度的纖維構(gòu)成。特別優(yōu)選包括具有0.5mm-2.5cm的長度的纖維的色譜交換劑材料。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有利的是色譜交換劑材料包含由選自以下的聚合物制成的纖維：聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚(環(huán)氧乙烷)、聚酯、聚丙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、聚(丙二醇)單甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正己酯、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)和聚酰胺。

通過本文公開的色譜交換劑材料，可以生產(chǎn)具有在生物流體的分離和純化過程中具有顯著改善的性質(zhì)的新裝置。相應(yīng)裝置因此也是本發(fā)明的主題。通過實驗發(fā)現(xiàn)，包含色譜交換劑材料的裝置特別適合，其中所述纖維由聚酰胺、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)或聚丙烯(pp)制成，特別是用丙烯酸類單體衍生的纖維。所述丙烯酸類單體可選自甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)、丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)。這些丙烯酸類單體可原樣或者以其組合用于衍生化。特別優(yōu)選其中纖維用甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)或用甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)和甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)的組合衍生化的相應(yīng)裝置。根據(jù)本發(fā)明，這些裝置優(yōu)選用這樣的衍生化纖維制成，繼而通過與包含官能團的化合物或與配體反應(yīng)來改性。所述官能團選自氨基、羧基、羥基、環(huán)氧基、磺基丙基、磺酸和巰基。

因為新裝置可使用相當(dāng)廉價的纖維和方法制造，所以它們可制成一次性裝置。

本發(fā)明的目的還在于自生物樣品分離靶標(biāo)試劑的方法，其包括以下步驟：

a)提供含有所述靶標(biāo)試劑的樣品；

b)使所述樣品與本文公開的色譜交換劑材料接觸；和

c)使所述靶標(biāo)試劑結(jié)合到高表面積纖維并由此自所述樣品分離。

在隨后的步驟(d)中，可收集由步驟(c)產(chǎn)生的樣品，或者由步驟(c)產(chǎn)生的樣品在步驟(d)中回收，且在下一步驟(e)中，結(jié)合到非織造纖維材料的靶標(biāo)試劑用洗脫溶液洗脫通過非織造材料來收集，洗脫溶液影響靶標(biāo)試劑與纖維之間的結(jié)合由此從纖維上分離出靶標(biāo)試劑。在該方法的一個特別的實施方案中，非織造材料被壓縮成片材，或者填充并壓縮成柱。

該方法特別適合分離過程，其中靶標(biāo)試劑為蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、dna分子、rna分子、有機分子、無機分子、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、毒素或朊病毒。

如上所述的色譜介質(zhì)可衍生自成形纖維。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些實施方案中，所述成形纖維提供原纖化或隆起的結(jié)構(gòu)。當(dāng)與普通纖維相比較時，這些隆起可大大增加纖維的表面積。因此，無需降低纖維直徑獲得了高表面積，這通常引起床滲透性顯著減小和流速相應(yīng)降低。

根據(jù)某些實施方案的高表面積纖維的一個實例為自allassoindustries,inc.(raleigh,nc;allassowingedfiber^tm)購得的“翼狀”纖維。這些纖維由尼龍制成且重量很輕，并且具有1-14m²/g的相同總表面積。這些纖維包含經(jīng)具體設(shè)計的紡絲組件(spinpack)共擠出的成形芯聚合物和犧牲聚合物。該芯的特征在于在均勻的直邊翼之間的8-32個深通道。在纖維形成期間皮聚合物填充通道且在最終產(chǎn)品的完成期間溶解。

如先前已經(jīng)提到，高孔纖維也適用于本發(fā)明。

現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物分子諸如單克隆抗體(mab)的色譜純化可在簡化的條件下處理，但是當(dāng)利用該纖維材料的混合官能團(其包括離子相互作用和疏水性相互作用)時，具有改善的結(jié)果。

因此，研發(fā)了一種方法，其中加入表面?zhèn)冉庸倌軋F，所述側(cè)接官能團為高表面積纖維提供了陽離子交換、陰離子交換或疏水性相互作用功能性。

為了生產(chǎn)合適的官能化的高表面積纖維，不僅可應(yīng)用由尼龍制成的allasso翼狀纖維，而且可使用表現(xiàn)出至少1-14m²/g的高表面積的其他纖維。例如，還可應(yīng)用高孔纖維。這樣的纖維由s.megelski等人在macromolecules2002,35,8456-8466中公開且由聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚(環(huán)氧乙烷)紡絲。而且，出于該目的可使用聚酯、聚丙烯(pp)、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、聚(丙二醇)單甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正己酯、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)或聚酰胺的相應(yīng)纖維。優(yōu)選類型的纖維由聚酰胺、聚丙烯、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)或聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)制成。

通過使用這些改性的高表面積纖維，可提供純化的備選模式，其利用具有側(cè)接aex和cex配體的基于纖維的色譜介質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，將aex纖維介質(zhì)和cex纖維介質(zhì)兩者共混并包裝在單一裝置中。該模式在其操作簡單性和通過該方法進行工藝模板壓縮的潛力方面是有利的。

在另一實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對用于疏水性相互作用色譜的纖維介質(zhì)的設(shè)計有利的性質(zhì)。這種類型的纖維介質(zhì)可用于所謂的“串聯(lián)色譜(tandemchromatography)”，其中僅提供一個色譜柱，并且在該色譜柱內(nèi)以離散層布置兩種不同類型的纖維色譜介質(zhì)。

該特別的布置適合如下應(yīng)用，其中單克隆抗體進料流使用布置在第一層中的cex纖維介質(zhì)通過結(jié)合/洗脫純化，且隨后洗脫且隨后使用布置在同一色譜柱或其他合適裝置內(nèi)的第二層中的所述hic纖維介質(zhì)通過疏水相互作用色譜純化。

發(fā)現(xiàn)如本文所述類型的基于纖維的離子交換劑的混合床的組合具有不同的預(yù)料不到的優(yōu)勢。特別地講，具有變化的離子交換或疏水性相互作用色譜配體官能團的纖維介質(zhì)可容易地布置成多層結(jié)構(gòu)，而對于基于珠粒的系統(tǒng)，無法容易地實現(xiàn)該模式。

混合床色譜為用于純化衍生自重組細(xì)胞的治療性蛋白的特別有效的方法，因為這些來源含有多種宿主細(xì)胞蛋白(hcp)雜質(zhì)。在僅使用單一類型的色譜介質(zhì)時，在低濃度下這些蛋白雜質(zhì)的去除特別具有挑戰(zhàn)性。一種方法是將幾種不同的吸附介質(zhì)布置在一系列管柱中。然而，這將顯著增加下游過程的死容積和復(fù)雜性。將不同的吸附劑介質(zhì)組合到單一裝置中允許在單一步驟中除去不同的雜質(zhì)。

預(yù)料不到的是，由aex官能化纖維介質(zhì)和cex官能化纖維介質(zhì)構(gòu)成的混合床色譜裝置對于從抗體洗脫中流通除去殘留hcp是非常有效的?；旌侠w維床允許除去帶正電的hcp和帶負(fù)電的hcp兩者。官能化纖維的相對較低的成本使其作為單次、一次性應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明，表面改性的色譜介質(zhì)在外殼、單一色譜柱或其他合適色譜裝置內(nèi)分層為離散的帶導(dǎo)致改善的分離和純化結(jié)果?！胺謱印蓖ㄟ^首先施用介質(zhì)到管柱并將介質(zhì)壓縮到更高密度以形成介質(zhì)的下層來實現(xiàn)。接著可將第二層施用到管柱且將介質(zhì)壓縮到更高密度以形成上層。最后，分層的介質(zhì)可通過將上部流動分配頭安裝在色譜柱或其他合適色譜裝置上而壓縮到第三、最高密度?？梢蕴峁┌▽訝钪膯沃浒瑑煞N類型的具有不同配體的基于纖維的色譜介質(zhì)，所述配體為cex配體(例如，如實施例3中所公開)和疏水性相互作用色譜配體(例如，如實施例6中所公開)，其提供兩種正交分離模式。在圖2中，公開了用于“串聯(lián)色譜”的分層介質(zhì)柱，其提供位于hic纖維介質(zhì)的第二層上面的cex纖維介質(zhì)的第一層。該模式可用于例如通過首先將后-蛋白a洗脫池(mab進料)施用到層狀柱的頂部純化單克隆抗體工藝流中。

在一個實施方案中，mab進料處于低導(dǎo)電率(通常3ms/cm)且在用適當(dāng)緩沖系統(tǒng)調(diào)節(jié)之后ph為5(圖2)。將該mab進料溶液加載到管柱上且首先遇到cex纖維介質(zhì)層，其中mab通過離子交換相互作用結(jié)合到纖維介質(zhì)。所述纖維介質(zhì)用適當(dāng)緩沖液洗滌以清除任何未結(jié)合的hcp、dna或其他雜質(zhì)。在洗滌之后，將高導(dǎo)電率的洗脫緩沖液(30-1000ms/cm，ph5)施用到管柱以從cex層洗脫mab。隨著經(jīng)洗脫的mab行進到由hic纖維介質(zhì)占據(jù)的管柱區(qū)中，mab通過疏水性相互作用結(jié)合到hic介質(zhì)(歸因于用于從cex介質(zhì)層洗脫的緩沖液體的高離子強度)。將纖維介質(zhì)再次用適當(dāng)?shù)母唠x子強度的緩沖液洗滌以從管柱的hic纖維介質(zhì)部分清除任何未結(jié)合的hcp或其他雜質(zhì)。最后，將低離子強度的洗脫緩沖液(3ms/cm，ph5)施用到管柱以從hic層洗脫mab。在該步驟之后的分離的mab產(chǎn)物具有低導(dǎo)電率且僅需要稍微的ph調(diào)節(jié)用于隨后的基于aex的精制操作。

圖2示出了上述分離方法的示意性流程圖，其為通過串聯(lián)色譜(cex介質(zhì)和hic)進行mab純化的實例，其包括以下步驟：

i.后-蛋白質(zhì)mab加載(導(dǎo)電率3ms，ph5)；

ii.高鹽mab洗脫(導(dǎo)電率：30-1000ms，ph5)，其中產(chǎn)物mab從上部cex介質(zhì)層洗脫而結(jié)合到下部hic介質(zhì)層；

iii.低鹽mab洗脫(導(dǎo)電率3ms，ph5)，其中產(chǎn)物mab通過用低離子強度洗脫劑從下部hic介質(zhì)層洗脫。

現(xiàn)在，準(zhǔn)備好洗脫的mab用于隨后的aex精制操作，而不需要稀釋以降低溶液導(dǎo)電率。

如上所提，本文所述的溶液提供用于mab的廉價分離方法，其包括一次性模式且可在低材料成本下進行。除此之外，將必須在不同的管柱和過濾裝置中在反復(fù)減小的液體量并調(diào)節(jié)ph值和導(dǎo)電率的條件下進行的不同工藝步驟壓縮成在單個管柱中進行的程序，其中發(fā)生基材向結(jié)合位點的對流傳輸。

高表面積纖維的表面官能化也可通過兩步法實現(xiàn)。合適的官能化方法為如在wo2012/015908a中所述的接枝聚合。該官能化從側(cè)接烯丙基連接到纖維表面(例如由聚酰胺nylon6制成的翼狀纖維的表面)開始。在此，將纖維在氫氧化鈉水溶液存在下在50度下用烯丙基縮水甘油醚處理12小時。纖維表面官能化的該第一步驟可如在上述專利申請中所公開或在改變的條件下通過不同的合適單體如環(huán)氧氯丙烷或(甲基)丙烯酸縮水甘油酯進行..[0058]。側(cè)接烯丙基隨后充當(dāng)纖維表面上的錨接位點，作為側(cè)接丙烯酰胺聚合物官能團的連接點。提供用于丙烯酰胺單體的溶液聚合的條件，且在纖維表面上的側(cè)接烯丙基連接到溶液中生長中的聚合物鏈。因此，烯丙基官能化的纖維可接著在約80℃下用2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、n,n-二甲基丙烯酰亞胺和過硫酸銨的水溶液處理約4小時。在加熱到該溫度時，過硫酸鹽分解引發(fā)丙烯酸類單體的自由基聚合。在該反應(yīng)中，接收包含磺酸基的陽離子交換劑。在這些條件下，在纖維表面上的側(cè)接烯丙基可充當(dāng)側(cè)接丙烯酸類聚合物官能團的連接點且所述丙烯酸類聚合物共價連接到纖維表面。

還可采用鈰離子氧化還原接枝聚合以便高表面積纖維的表面改性。在這些條件下，所述酸可為hno3且ce(vi)離子由如硝酸鈰(iv)銨的鹽提供。在這種情況下，反應(yīng)時間大大縮短且溫度較低。

一般而言，鈰離子氧化還原接枝反應(yīng)根據(jù)mino和kaizerman[mino,g.,kaizerman,s.j.polymerscience31,242-243(1958)和j.polymerscience38,393-401(1959)]處理，其在硝酸水溶液中進行。該反應(yīng)可用溶解于水溶液中的單體進行。如果不使用水溶性單體，溶解性則可通過諸如二噁烷或四氫呋喃的合適增溶劑改善。

在隨后的反應(yīng)步驟中，例如用聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)改性的表面官能化的纖維可通過將所述官能化纖維與50重量%三甲胺(aq.)在甲醇中的溶液簡單混合而轉(zhuǎn)化成陰離子交換劑。

通過適當(dāng)?shù)夭捎媒又Ψ磻?yīng)或通過使用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)物，可以將未交聯(lián)而帶有多種官能團的聚合物鏈共價地結(jié)合到所施用纖維的表面上。

術(shù)語“官能團”為歸納性術(shù)語，諸如活性、可水解、可水合的、氫鍵形成-引起離子化(可電離)電荷-帶有(陽離子或陰離子)基團。這樣的基團的實例為-oh和/或-co-和/或-nh2和/或-so3^-和/或-so4^-和/或-po4^-和/或-so2cl和/或-nh4⁺和/或-conh和/或-cho和/或-cooh和/或-coo^-和/或-sh。

因此，陰離子交換色譜的合適官能團例如為季銨基團，如季型羥基丙基二乙基氨基乙基-、季型三甲基氨基乙基-、或二乙基氨基乙基。根據(jù)官能團的離子離解程度，陰離子交換劑可分類為強、中或弱堿性陰離子交換劑。

在本發(fā)明的另一實施方案中，所施用的纖維用酸基官能化為陽離子交換劑。陽離子交換色譜的合適官能團例如為磺基甲基-、磺基丙基-或羧甲基。

適于疏水性相互作用色譜的基團例如為烷基和芳基配體，如醚和甲基配體，其提供與蛋白的弱相互作用；或丁基或辛基配體、苯基或其他芳基配體，其顯示更強的相互作用。

用官能團取代至少一個氫原子可經(jīng)由亞甲基、亞乙基、亞丙基或亞丁基橋或相應(yīng)烷氧基或芳基間接地進行。

如上所提，官能團可通過合適的接枝聚合物結(jié)合到所施用纖維的表面。一般而言，接枝-聚合根據(jù)已知方法在合適引發(fā)劑存在下進行，所述引發(fā)劑可為氧化還原引發(fā)劑，諸如鈰(iv)離子(硝酸鈰銨：(nh4)2ce(no3)6、硫酸鈰(iv)、硫酸鈰銨、鐵(ii)-過氧化氫(fe²⁺-h2o2：芬頓試劑)、乙酰丙酮酸鈷(iii)絡(luò)合鹽、co(ii)-單過硫酸鉀、亞硫酸鈉-過硫酸銨或自由基產(chǎn)生劑諸如偶氮二異丁腈(c8h12n4：aibn)、過硫酸鉀(k2s2o8：kps)、過硫酸銨((nh4)2s2o8:aps)和過氧化苯甲酰(c14h10o4:bpo)。

例如，接枝聚合可使用酸性單體如丙烯酸和甲基丙烯酸的合適鈰(iv)鹽處理。即使在相對較低比率下如果組合這樣的單體酸與諸如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯和丙烯腈的中性單體，在纖維上的接枝非常容易地發(fā)生。所得接枝共聚物為弱酸性高容量陽離子交換劑。

根據(jù)所采用的纖維和用于衍生化的單體的化學(xué)性質(zhì)，可發(fā)生不同的反應(yīng)和機制，且用于適當(dāng)表面改性的可能方法為：

-原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atrp)

-uv引發(fā)的自由基聚合

-熱引發(fā)的自由基聚合

-陰離子聚合

-陽離子聚合

-γ-引發(fā)的自由基聚合

-過渡金屬催化聚合

-可逆加成斷裂轉(zhuǎn)移聚合(raft)。

存在用于進行接枝聚合的各種合適單體。根據(jù)所生產(chǎn)材料的期望性質(zhì)，可采用不同的單體。

為了將正電荷引入接枝觸手中，可選擇來自以下組的單體：

氯化2-(丙烯酰氨基乙基)三甲基銨、

氯化3-(丙烯酰氨基丙基)三甲基銨、

2-(二乙基氨基乙基)丙烯酰胺、

2-(二乙基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、

2-(二甲基氨基乙基)丙烯酰胺、

2-(二甲基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、

3-(二乙基氨基丙基)-丙烯酰胺、

3-(二乙基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、

3-(二乙基氨基-丙基)丙烯酰胺、

3-(二乙基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、

氯化2-(甲基丙烯酰氨基乙基)三甲基銨、

氯化3-(丙烯酰氨基-丙基)三甲基銨、

n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽、

[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]二甲基(3-磺基丙基)氫氧化銨內(nèi)鹽、

甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯、

甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯、

甲基丙烯酸2-氨基乙酯鹽酸鹽、

甲基丙烯酸2-(二異丙基氨基)乙酯和

甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯。

通過使用選自以下組的單體，可以在觸手中產(chǎn)生負(fù)電荷：

2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸、

2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸鈉鹽溶液、

2-丙烯酰氨基乙磺酸、

羧甲基丙烯酰胺、

羧乙基丙烯酰胺、

羧丙基丙烯酰胺、

羧甲基甲基丙烯酰胺、

羧乙基甲基丙烯酰胺、

羧丙基甲基丙烯酰胺、

丙烯酸、

甲基丙烯酸和

甲基丙烯酸3-磺基丙酯鉀鹽。

另一方面，通過使用選自以下組的單體將疏水基團引入所產(chǎn)生的觸手：

n-芐基-2-甲基丙烯酰胺、

n-異丙基甲基丙烯酰胺、

n,n-二甲基甲基丙烯酰胺、

n,n-二乙基甲基丙烯酰胺、

甲基丙烯酸甲酯、

甲基丙烯酸乙酯、

甲基丙烯酸羥乙酯、

甲基丙烯酸丙酯、

甲基丙烯酸正丁酯、

甲基丙烯酸異丁酯、

甲基丙烯酸仲丁酯、

甲基丙烯酸叔丁酯、

甲基丙烯酸己酯、

甲基丙烯酸月桂酯、

甲基丙烯酸異冰片酯、

甲基丙烯酸芐酯、

甲基丙烯酸1-萘酯、

甲基丙烯酸2-萘酯、

甲基丙烯酸2-乙基己酯、

甲基丙烯酸環(huán)己酯、

甲基丙烯酸3,3,5-三甲基環(huán)己酯、

甲基丙烯酸二茂鐵基甲酯和

甲基丙烯酸苯酯。

本領(lǐng)域技術(shù)人員已知除了此處列出的那些化合物以外的更多合適的化合物，這些化合物在本文中可以充當(dāng)單體，并且其適用于相應(yīng)地使生成的聚合物鏈帶正電荷或負(fù)電荷。

用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的分離材料的合適纖維可具有任何長度和直徑且優(yōu)選為切割或短切的纖維或非織造織物。它們不需要作為一體結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起，但可有效地充當(dāng)單個的離散實體。它們可以連續(xù)長度的形式，例如長度不定的細(xì)絲或單絲，或者它們可形成較短的單根纖維，例如通過切斷纖維材料(例如，短切纖維)或作為非織造或織造織物，將連續(xù)長纖維切成單個片段，通過結(jié)晶生長法形成等。優(yōu)選所述纖維由諸如聚丙烯、聚酯、聚乙烯、聚酰胺、熱塑性聚氨酯、聚苯乙烯、共聚酯或液晶聚合物的熱塑性聚合物制成。

優(yōu)選用于在此描述的目的的纖維具有遠(yuǎn)大于纖維截面的最寬尺寸的長度且不形成壓實體。優(yōu)選這些纖維具有幾毫米到數(shù)厘米范圍內(nèi)的長度。對于本發(fā)明的目的，所用纖維具有0.5mm-5cm的長度，更合適的是具有0.5mm-2.5cm的長度的相應(yīng)纖維。特別是非常適合的是具有約0.5mm-2mm的長度的纖維。

在某些實施方案中，所述纖維具有約1μm-約100μm的截面長度和約1μm-約100μm的截面寬度。一種合適的纖維具有約20μm的截面長度和約10μm的截面寬度。優(yōu)選所述纖維具有約10-20μm的截面長度。

在某些實施方案中，所述纖維截面通常為翼形的，具有限定基本縱向軸線的主體區(qū)域和從主體區(qū)域向外徑向延伸的多個突出部分。所述突出部分形成沿纖維的長度延伸的共線通道陣列，每根纖維通常有20-30個這樣的通道。在某些實施方案中，突出部分的長度比主體區(qū)域的長度短。在某些實施方案中，所述纖維截面通常為翼形的，具有包括沿著纖維中心延伸的縱向軸線的中間區(qū)域并且具有從中間區(qū)域延伸的多個突出部分。在某些實施方案中，多個突出部分通常從中間區(qū)域徑向延伸。由于該構(gòu)造，多個通道由突出部分限定。在突出部分之間的合適通道寬度為約200-約1000納米。合適的纖維公開在美國專利公告號2008/0105612中，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中來。

具有至少1m²/g-約14m²/g或甚至更大的表面積的纖維是合適的。此外，優(yōu)選合適的是具有至少20m²/g的表面積的纖維，而且更優(yōu)選具有至少25m²/g的表面積的纖維，并且另外優(yōu)選具有至少30m²/g的表面積的纖維。這適用于翼狀纖維以及高孔纖維。因此，優(yōu)選使用具有在該范圍內(nèi)的表面積的纖維，而且具有高得多的表面積的纖維適用于制備根據(jù)本發(fā)明的分離材料。

合適的纖維包括多孔纖維，諸如在美國臨時申請62/044,630中描述的那些，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中來。

多孔纖維可具有高表面積，但必須使所述孔具有允許其通過接枝聚合官能化的尺寸，然而，其中有效性和可接近性在后續(xù)分離過程中不受限制。此外，重要的是這些多孔纖維在應(yīng)用中具有必需的穩(wěn)定性，使得它們適用于壓縮的色譜柱。

在某些實施方案中，所述纖維可容易地在壓縮下填充到具有適當(dāng)端口和尺寸的裝置或容器中，使得當(dāng)產(chǎn)品到達準(zhǔn)備好服務(wù)時，用戶不需要包裝。纖維還可以預(yù)成形床形式使用，例如通過在非織造布工業(yè)中常見的紡粘(連續(xù)長絲)或濕法成網(wǎng)(短切纖維)方法產(chǎn)生的非織造薄片材料。合適的預(yù)成型纖維形式包括片材、墊子、纖維網(wǎng)、整料等。

成形的纖維介質(zhì)在其形態(tài)性質(zhì)方面提供優(yōu)于多孔色譜珠粒的某些優(yōu)勢。通常，在基于珠粒的色譜中，分離過程中的速率限制步驟是通過擴散控制將被吸附物(溶質(zhì))進入多孔珠粒的深度的滲入；對于諸如蛋白的大分子，這種擴散傳輸可能相對較慢。對于本文公開的高表面積纖維，結(jié)合位點主要暴露在纖維的外部，且因此易于通過流動流中的被吸附物分子進入。由該方法提供的快速傳輸允許短停留時間(高流動速度)，由此能夠通過諸如模擬移動床系統(tǒng)的方式實現(xiàn)快速介質(zhì)循環(huán)。因為處理的速度為生物學(xué)生產(chǎn)中的關(guān)鍵參數(shù)，所以如本文所述基于纖維的色譜介質(zhì)具有優(yōu)于常規(guī)基于珠粒的介質(zhì)的特別的處理優(yōu)勢。

在1-5cm的床高下約0.1-0.4g/ml、優(yōu)選約0.32g/ml的合適的柱填充密度將為色譜評價中的可接受性能提供足夠的流動均勻性。本文公開的實施方案的表面官能化纖維介質(zhì)顯示填充床形式的高滲透性。

在此描述的該新型表面官能化纖維介質(zhì)的一個特別的優(yōu)勢是其通用性。根據(jù)所用的纖維及其衍生化，多種靶分子的分離和純化是可能的，例如蛋白質(zhì)(特別是蛋白a)、肽、脂質(zhì)、dna分子、rna分子、有機分子、無機分子、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、毒素或朊病毒。特別地講，在施用到生物流體的分離方法中，已經(jīng)證明本文所述的材料的性質(zhì)是特別有利且有效的。

縮寫：

aex陰離子交換色譜介質(zhì)

aq.含水的/水溶液

aris-arir兩組分系統(tǒng)，其為在金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)中表達的致病基因的調(diào)節(jié)劑

cex陽離子交換色譜介質(zhì)

cho中國倉鼠卵巢

cv柱體積

di去離子水

dna脫氧核糖核酸

dsp下游過程

fab抗原結(jié)合片段(fab片段)為抗體上與抗原結(jié)合的區(qū)域

fc區(qū)域(可結(jié)晶片段)區(qū)域，根據(jù)抗體的分類由提供兩個或三個恒定域的兩個重鏈構(gòu)成

gma甲基丙烯酸縮水甘油酯

hcp宿主細(xì)胞蛋白

hic疏水性相互作用色譜

igg免疫球蛋白g(igg)，或丙種球蛋白，g類抗體(免疫球蛋白)

lrv“對數(shù)去除值”，該術(shù)語是指在純化步驟的加載中雜質(zhì)的質(zhì)量與在產(chǎn)物池中雜質(zhì)的質(zhì)量的比率的log(log10)。

mab單克隆抗體

q-官能化用季銨(q)表面官能化

圖：

圖1：示出標(biāo)準(zhǔn)mab純化方案，其采用包括結(jié)合-洗脫色譜純化步驟以及隨后的流通精制步驟的dsp；

圖2：示出通過串聯(lián)色譜(cex介質(zhì)和hic)進行的mab純化的分離方法的示意流程圖，其包括以下步驟：

i.后-蛋白amab加載(導(dǎo)電率3ms，ph5)；

ii.高鹽mab洗脫(導(dǎo)電率：30-100ms，ph5)，其中產(chǎn)物mab從上部cex介質(zhì)層洗脫而結(jié)合到下部hic介質(zhì)層；和

iii.低鹽mab洗脫(導(dǎo)電率3ms，ph5)，其中產(chǎn)物mab通過用低離子強度洗脫劑洗脫從下部hic介質(zhì)層洗脫；

圖3：以條棒圖形式示出在流通純化之后mab04蛋白a進料的hcp清除率，其中使用來自實施例5的所述介質(zhì)(aex纖維、cex纖維、以及aex介質(zhì)和cex介質(zhì)兩者的共混物)；

圖4：在0.4m硝酸鈰(iv)銨存在下用選擇的反應(yīng)性甲基丙烯酸類單體(甲基丙烯酸羥乙酯、聚(丙二醇)-單乙基丙酸酯)、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正己酯)進行的翼狀尼龍纖維介質(zhì)表面的改性。

表：

表1：用aex纖維、cex纖維、或aex纖維和cex纖維兩者的共混物填充的管柱關(guān)于床深和柱體積、壓力和流速、滲透率和速度的表征。

表2：使用aex纖維介質(zhì)、cex纖維介質(zhì)和共混的aex/cex纖維介質(zhì)管柱關(guān)于特性(流通、mab在纖維上的加載量、mab的回收、hcp濃度和hcp的lrv)而言的mab04流通純化數(shù)據(jù)。

本發(fā)明的描述使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠全面地應(yīng)用本發(fā)明。因此假定本領(lǐng)域技術(shù)人員即使在沒有進一步評述的情況下也能夠在最廣泛的范圍內(nèi)利用上述描述。

如果有什么不清楚的話，不言而喻應(yīng)該查閱引用的出版物和專利文獻。因此，認(rèn)為這些文獻是本發(fā)明描述的公開內(nèi)容的一部分。

為了更好地理解且為了說明本發(fā)明，下文給出在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)的實施例。這些實施例還用以說明可能的變體。然而，由于所描述的發(fā)明原理的通用有效性，這些實施例不適合于將本申請的保護范圍僅僅減少到這些。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不言而喻，在給出的實施例以及說明書的其余部分中，組合物中存在的組分的量基于組合物整體計算只能總計為100重量%或100摩爾%，并且即使從所給出的百分比范圍可能產(chǎn)生更高的值，也不能超過該值。除非另有說明，否則數(shù)據(jù)%為重量%或摩爾%，在體積數(shù)據(jù)中示出的比率除外，諸如洗脫劑，對于其制備，溶劑以一定的體積比以混合物形式使用。

在實施例和說明書以及權(quán)利要求中給出的溫度始終以℃計。

實施例

實施例1

未改性的尼龍纖維的接枝聚合

將10gallasso尼龍纖維和水(466ml)加到500ml瓶子中。將14ml1mhno3(14.4mmol)加到反應(yīng)混合物中，接著加入1.2ml的在1mhno3(0.480mmol)中的0.4m硝酸鈰(iv)銨溶液。將反應(yīng)混合物攪拌15分鐘。加入3.39g甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma，24mmol)?，F(xiàn)在將攪拌的反應(yīng)混合物加熱到35℃歷時1小時。在冷卻到室溫之后，將固體用去離子水(3x300ml)洗滌且在下一步驟中立即使用該潮濕物質(zhì)。

實施例2

環(huán)氧官能化纖維(aex纖維介質(zhì))的q-官能化

將來自實施例1的潮濕gma官能化纖維與水(500ml)和50重量%三甲胺(aq.)在甲醇(500ml)中的溶液一起加到2l瓶子中。將混合物在室溫下攪拌18小時。隨后，將纖維固體接著用0.2m抗壞血酸在0.5m硫酸中的溶液(3x400ml)、去離子水(3x400ml)、1m氫氧化鈉溶液(3x400ml)、去離子水(3x400ml)和乙醇(1x400ml)洗滌。接著，將物質(zhì)置于烘箱中以在40℃下干燥48小時。得到：11.74g白色纖維固體。

實施例3

未改性的尼龍纖維(cex纖維介質(zhì))的接枝聚合

將10gallasso尼龍纖維和水(460ml)加到1000ml瓶子中。將29.8ml1mhno3溶液(30mmol)加到反應(yīng)混合物中，接著加入7.46ml0.4m硝酸鈰(iv)銨溶液在1mhno3(3.00mmol)中的溶液。將反應(yīng)混合物攪拌15分鐘。隨后，加入61.5g甲基丙烯酸3-磺基丙基酯鉀鹽(3-spma，250mmol)且將所得的攪拌的反應(yīng)混合物加熱到35℃歷時18小時。在冷卻到室溫之后，將來自各瓶的纖維固體用去離子水(3x300ml)、在0.5m硫酸中的0.2m抗壞血酸(3x300ml)、去離子水(3x300ml)、1m氫氧化鈉溶液(3x300ml)、去離子水(3x300ml)和乙醇(1x300ml)洗滌。隨后將制備的物質(zhì)置于烘箱中以在40℃下干燥。得到：11.38g白色纖維固體。

實施例4

共混的離子交換介質(zhì)柱填充

將0.35g的所述纖維介質(zhì)(見表1)在25mmtrisph8中的漿液加到6.6mmidomnifit管柱中。將纖維介質(zhì)壓縮到3.0cm的床深(1.03ml柱體積，0.35g/ml纖維填充密度)。纖維床滲透率通過使25mmtrisph8緩沖液以2.0ml/min的流速流過管柱并通過電壓力傳感器測量柱壓降來評定。纖維床滲透率值也提供在表1中。

表1：

用aex纖維、cex纖維、或aex纖維和cex纖維兩者的共混物填充的管柱的特征

實施例5

在用aex纖維、cex纖維、和aex介質(zhì)和cex介質(zhì)兩者的共混物的情況下自mab04蛋白a洗脫去除hcp的比較

使mab04的細(xì)胞培養(yǎng)物澄清且隨后使用蛋白a柱色譜法以7.2mg/ml的濃度捕獲。隨后將mab04蛋白a洗脫液的ph用tris堿調(diào)整到ph5以便儲存，且隨后使其過濾通過stericup-gp0.22μmmilliporeexpressplus膜(1l，目錄號：scgpu02re，milliporecorp.billerica,ma,01821,usa)。在臨使用前溶液的ph用tris堿調(diào)節(jié)到ph7.0。隨后將所得溶液過濾通過stericup-gp0.22mmmilliporeexpressplus膜(1l，目錄號scgpu02re,milliporecorp.billerica,ma,01821,usa)。

如在實施例4中所述制備含有官能化纖維的三個管柱。第一個1ml管柱由來自實施例2的用季銨配體官能化的aex纖維(批號ja7654-163b)組成。第二個1ml管柱由來自實施例3的用磺酸酯配體官能化的cex纖維組成(批次ja7654-131)。第三個1ml管柱由相等量的來自實施例2的用季銨配體官能化的aex纖維(ja7654-163b)和來自實施例3的用磺酸酯配體官能化的cex纖維(ja7654-131)的共混物組成，參見實施例4。這三個管柱用緩沖溶液(25mmtris，ph7)平衡。

使120ml蛋白a洗脫池以0.33ml/min的流速穿過各管柱，在各纖維填充柱中提供3分鐘的駐留時間。自各管柱收集三個40ml級分。給出代表80ml和120ml之后穿過管柱的洗脫池組合物的匯集樣品以便分析。分析溶液的宿主細(xì)胞蛋白(hcp)和igg濃度。hcp分析使用自cygnustechnologies,southport,nc,usa購得的elisa試劑盒(目錄號f550)，按照試劑盒生產(chǎn)商的方案執(zhí)行。igg濃度使用裝備有poros^?a蛋白a分析柱的agilenthplc系統(tǒng)測量。結(jié)果匯總于表3和圖3中。

實驗結(jié)果示出組合含有aex纖維和cex纖維的混合床柱給出更高的hcp去除，對數(shù)去除值(lrv)為約1.6lrv。這大大超過對于僅含有aex纖維的管柱觀察到的約0.9lrv的hcp和對于僅含有cex纖維的管柱觀察到的約0.6lrv的hcp。通過具有兩種纖維的共混物的管柱可以除去更大量的hcp，因為其具有能夠吸附hcp的具有不同特性的兩種不同配體。aex官能化纖維能夠結(jié)合到在其表面上具有帶負(fù)電的區(qū)域的雜質(zhì)，這對于具有較低等電點的蛋白質(zhì)是典型的。cex官能化纖維能夠結(jié)合在其表面上具有帶正電的區(qū)域的雜質(zhì)，這對于具有較高等電點的蛋白質(zhì)是典型的。

表2：使用aex纖維介質(zhì)、cex纖維介質(zhì)和共混的aex/cex纖維介質(zhì)柱的mab04的流通純化

圖3：示出在使用來自實施例5的所述介質(zhì)流通純化之后mab04蛋白a進料的hcp清除率。

實施例6

具有疏水性相互作用色譜配體的纖維介質(zhì)

在上文中描述的疏水性相互作用色譜介質(zhì)可通過使用在實施例1和3中描述的纖維表面改性方法和甲基丙烯酸酯單體或選自以下物質(zhì)的其他可聚合官能團制備：

甲基丙烯酸甲酯、

甲基丙烯酸羥乙酯、

聚(丙二醇)單甲基丙烯酸酯、

甲基丙烯酸苯酯、

甲基丙烯酸正丁酯、

甲基丙烯酸正己酯。

在實施例1和3中描述的鈰離子氧化還原聚合方法可用于用在該實施例中公開的反應(yīng)性甲基丙烯酸類單體使allasso尼龍纖維介質(zhì)的表面直接改性。(參見圖4)。在接枝聚合和合適的洗滌方法(還在實施例1和3中描述)之后，纖維介質(zhì)現(xiàn)在表現(xiàn)出用于疏水性相互作用色譜(hic)的適當(dāng)疏水配體官能性。介質(zhì)現(xiàn)在準(zhǔn)備加載到色譜柱或其他裝置以用于在上文描述的串聯(lián)色譜應(yīng)用。

圖4：適合本發(fā)明的纖維介質(zhì)的hic配體的選擇和連接到allasso尼龍纖維介質(zhì)的表面的方法

i：使用選自以下各物的甲基丙烯酸酯單體對allasso纖維介質(zhì)表面進行改性：

甲基丙烯酸羥乙酯、聚(丙二醇)單乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正己酯，allasso尼龍纖維，0.4m硝酸鈰(iv)銨，硝酸，水，35℃，18小時，根據(jù)在實施例1和3中采用的表面改性方法。

實施例7

纖維介質(zhì)用聚(甲基丙烯酸羥乙酯)配體改性以便用于疏水性相互作用色譜

將甲基丙烯酸羥乙酯(hema，1,69g，13mmol)和水(232,5ml)加到500ml瓶子中。隨后，將5.00gallasso尼龍纖維(wingedfiber^tm)加到該溶液中。將1mhno3溶液(7.21ml，7.2mmol)加到該反應(yīng)混合物中，接著加入硝酸鈰(iv)銨在1mhno3中的0.4m溶液(0.601ml，0.240mmol)。將反應(yīng)混合物加熱到35℃歷時1小時。在冷卻到室溫之后，將固體用0.2m抗壞血酸在0.5m硫酸中的溶液(3x100ml)、去離子水(3x100ml)、1m氫氧化鈉溶液(3x100ml)、去離子水(3x100ml)和乙醇(1x100ml)洗滌。將物質(zhì)置于烘箱中以在40℃下干燥12小時。得到：5.58g，作為白色纖維固體。