本發(fā)明涉及允許增加的測(cè)序速錄和增加的測(cè)序數(shù)據(jù)密度的測(cè)序方法。系統(tǒng)可以基于如合成測(cè)序(sequencingbysynthesis)(sbs)的下一代測(cè)序方法，但使用多個(gè)在相同核苷酸鏈的不同位置處結(jié)合的多個(gè)引物。破譯dna序列對(duì)于生物研究的幾乎所有分支都至關(guān)重要。隨著sanger測(cè)序的出現(xiàn)，科學(xué)家獲得了從任何給定的生物系統(tǒng)中闡明遺傳信息的能力。該技術(shù)已經(jīng)在世界各地的實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用，但一直受到通量、可擴(kuò)展性、速度和分辨率的固有限制的阻礙，這些限制通常阻礙了科學(xué)家獲得所需的基本信息。為了克服這些障礙，開發(fā)了下一代測(cè)序(ngs)，其引發(fā)了許多突破性的發(fā)現(xiàn)并引發(fā)了基因組學(xué)科學(xué)中革命的根本不同的測(cè)序方法。下一代測(cè)序數(shù)據(jù)輸出最初以超過摩爾定律的速度增長，自其發(fā)明以來每年的增長都超過一倍。2007年，單次測(cè)序運(yùn)行最多可產(chǎn)生大約一千兆堿基(gb)數(shù)據(jù)。到2011年，這一速率在單次測(cè)序運(yùn)行中幾乎達(dá)到了terabase(tb)數(shù)據(jù)，幾乎在4年中增加了1000倍。憑借快速生成大量測(cè)序數(shù)據(jù)的能力，下一代測(cè)序使研究人員可以在幾小時(shí)或幾天內(nèi)從想法快速移動(dòng)到完整的數(shù)據(jù)集。研究人員現(xiàn)在可以在單次運(yùn)行中測(cè)序16個(gè)人類基因組，大概3日內(nèi)生成數(shù)據(jù)，而每個(gè)基因組的試劑成本仍在下降。相比之下，第一個(gè)人類基因組使用ce技術(shù)進(jìn)行測(cè)序需要大約10年并用額外的3年來完成分析。完成的項(xiàng)目于2003年發(fā)布，僅在發(fā)明下一代測(cè)序的前幾年，并且?guī)淼膬r(jià)格標(biāo)簽接近30億美元。雖然最新的高通量測(cè)序儀器能夠進(jìn)行大量數(shù)據(jù)輸出，下一代測(cè)序技術(shù)是高度可擴(kuò)展的。同樣的基礎(chǔ)化學(xué)可用于較低產(chǎn)率的目標(biāo)研究或較小的基因組。這種可擴(kuò)展性給出了研究人員設(shè)計(jì)最適合其特定研究需求的研究的彈性。為了測(cè)序小細(xì)菌/病毒基因組或目標(biāo)區(qū)域(如外顯子)，研究人員可以選擇使用較低輸出的儀器，并且每次運(yùn)行處理較少數(shù)量的樣品，或者可以選擇通過在高通量?jī)x器上進(jìn)行多路復(fù)用(multiplexing)來處理大量樣品。多路復(fù)用可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)期間同時(shí)測(cè)序大樣本數(shù)。雖然下一代測(cè)序顯著提高了產(chǎn)率，當(dāng)例如處理大型基因組時(shí)，提高測(cè)序數(shù)據(jù)速率和密度仍是有利的。本發(fā)明旨在進(jìn)一步改善數(shù)據(jù)速率和數(shù)據(jù)密度/產(chǎn)率，特別是當(dāng)適用于下一代測(cè)序/合成測(cè)試(sbs)方法時(shí)。優(yōu)選地，術(shù)語“堿基調(diào)用(basecall)”指將堿基(核堿基)分配至測(cè)序期間獲得的信息的過程，例如通過將核苷酸分配至色譜峰。如本文所用，并且除非另有說明，以下每個(gè)術(shù)語的定義應(yīng)當(dāng)如下。●a--腺嘌呤；●c-胞嘧啶；●dna--脫氧核糖核酸；●g--鳥嘌呤；●rna--核糖核酸；●t--胸腺嘧啶；和●u--尿嘧啶。“核酸”將意指任何核酸分子，包括但不限于dna、rna和其雜合體。形成核酸分子的核酸堿基可以是堿基a、c、g、t和u，以及它們的衍生物。這些堿基的衍生物是本領(lǐng)域熟知的，并且示例于pcr系統(tǒng)，試劑和消耗品中(perkinelmercatalogue1996-1997,rochemolecularsystems,inc.,branchburg,n.j.,usa)。核苷酸的“類型”指a、g、c、t或u。“質(zhì)量標(biāo)簽”將意指預(yù)定大小的分子實(shí)體，其能夠通過可切割鍵連接到另一實(shí)體?！肮腆w基底”將意指存在于固相的介質(zhì)，其中抗體或試劑可以附接(affix)至所述固相。在提供一系列數(shù)值的情況下，可以理解，除非上下文另有明確規(guī)定，每個(gè)干預(yù)值，到下限單位的十分之一，在該范圍的上限和下限之間，以及在該范圍內(nèi)的任何其他規(guī)定或干預(yù)值，包含在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在較小的范圍內(nèi)，并且也包括在本發(fā)明中，在規(guī)定的范圍內(nèi)受到任何明確排除的限制。如果所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)限制，本發(fā)明也包括排除了那些包括的限制中的一個(gè)或全部的范圍。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種測(cè)定核酸序列的方法，其包括提供與支持物結(jié)合的至少一個(gè)核酸；將至少兩個(gè)引物與核酸的相同鏈雜交；在所述至少兩個(gè)引物中的每個(gè)處在所述核酸的相同鏈上進(jìn)行引物延伸；獲得對(duì)應(yīng)于每次引物延伸時(shí)摻入的至少一個(gè)核苷酸堿基的信號(hào)數(shù)據(jù)；從所述信號(hào)數(shù)據(jù)測(cè)定所述核酸堿基的身份并將所述堿基分配至延伸讀段。優(yōu)選地，所述方法包括在允許雜交的條件下在存在下列各項(xiàng)的情況下將所述核酸與酶接觸以給出多個(gè)延伸讀段，每個(gè)延伸讀段從所述至少兩個(gè)引物之一延伸：(i)能夠在不同位置處與所述核酸的相同鏈雜交的至少兩個(gè)引物，和(ii)四個(gè)標(biāo)記部分(labelledmoieties)，其包含至少一個(gè)選自dgtp、dctp、dttp、dutp、和datp的核苷酸類似物，所述四個(gè)標(biāo)記部分的每個(gè)具有不同于其他三個(gè)標(biāo)記部分的獨(dú)特標(biāo)記物的獨(dú)特標(biāo)記物。所述方法可以包括除去未結(jié)合的標(biāo)記部分的步驟。優(yōu)選地，多個(gè)延伸讀段包含基本同時(shí)的延伸讀段。在某些實(shí)施方案中，四個(gè)標(biāo)記部分各包含選自dgtp、dctp、dttp、dutp、和datp的單一可逆終止核苷酸類似物或可逆終止劑類似物或者包含至少一個(gè)選自dgtp、dctp、dttp、dutp、和datp的核苷酸類似物的寡核苷酸探針。有利地，可以基本上同時(shí)獲得對(duì)應(yīng)于所述至少兩個(gè)引物延伸中每個(gè)的所述信號(hào)數(shù)據(jù)。這提供了優(yōu)勢(shì)，即信號(hào)數(shù)據(jù)包含對(duì)應(yīng)于來自相同核酸鏈的多個(gè)信號(hào)的數(shù)據(jù)。任選地，信號(hào)數(shù)據(jù)包含一個(gè)或多個(gè)圖像。任選地，信號(hào)數(shù)據(jù)以對(duì)應(yīng)于所述引物延伸上摻入的多個(gè)核苷酸類似物的顏色信號(hào)檢測(cè)，并且其中每個(gè)顏色信號(hào)對(duì)應(yīng)于不同核苷酸類似物或核苷酸類似物的組合。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于測(cè)定核酸序列的方法，其包括進(jìn)行以下步驟：(a)提供至少一個(gè)與支持物結(jié)合的核酸；(b)在允許雜交的條件下在存在下列各項(xiàng)的情況下將所述核酸與酶接觸以給出多個(gè)延伸讀段，每個(gè)延伸讀段從所述至少兩個(gè)引物之一延伸：(i)能夠在不同位置處與所述核酸的相同鏈雜交的至少兩個(gè)引物，和(ii)四個(gè)標(biāo)記部分，其包含至少一個(gè)選自dgtp、dctp、dttp、dutp、和datp的核苷酸類似物，所述四個(gè)標(biāo)記部分的每個(gè)具有不同于其他三個(gè)標(biāo)記部分的獨(dú)特標(biāo)記物的獨(dú)特標(biāo)記物。(c)除去未結(jié)合的探針；(d)通過測(cè)定對(duì)應(yīng)獨(dú)特標(biāo)記物的身份來測(cè)定摻入步驟(b)中的核酸類似物的身份，以及(e)將核苷酸堿基分配至延伸讀段。優(yōu)選地，所述多個(gè)延伸讀段包含同時(shí)延伸讀段。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括合成測(cè)序和酶包含聚合酶。四個(gè)探針的每個(gè)可以包含選自dgtp、dctp、dttp、dutp、和datp的單個(gè)可逆終止核苷酸衍生物或可逆終止劑類似物。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括通過連接測(cè)序并且所述酶包含連接酶。所述四個(gè)探針可以包含寡核苷酸。所述寡核苷酸可以是用于通過連接技術(shù)測(cè)序的類型。所述方法可以包括合成測(cè)序、通過連接測(cè)序、焦磷酸測(cè)序或納米孔測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)獨(dú)特標(biāo)記物可檢測(cè)為不同的顏色。有利地，因?yàn)閮蓚€(gè)或更多個(gè)引物與核酸的相同鏈在不同位置處雜交，這允許鏈的測(cè)序開始于兩個(gè)不同的位點(diǎn)，以給出多個(gè)延伸讀段，潛在地倍增了數(shù)據(jù)的密度和其獲得的速率。當(dāng)系統(tǒng)使用結(jié)合固體支持物的核酸時(shí)(例如在下一代測(cè)序技術(shù)中)，這允許在每個(gè)特定位置處制造出多個(gè)堿基調(diào)用。將每個(gè)堿基調(diào)用分配至正確延伸讀段，這允許測(cè)定核酸序列。在某些實(shí)施方案中，該方法提供的優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)時(shí)同時(shí)鑒定在相同鏈上的不同位置處摻入核酸的單個(gè)模板鏈的多個(gè)核苷酸堿基。優(yōu)選地，核酸是脫氧核糖核酸(dna)。優(yōu)選地，核酸結(jié)合至固體基底。更優(yōu)選地，固體基底是合成測(cè)序或通過連接方法測(cè)序中使用的類型。優(yōu)選地，固體基底是芯片。優(yōu)選地，固體基底是珠。任選地，獨(dú)特標(biāo)記物經(jīng)由可切割連接子結(jié)合至堿基。任選地，獨(dú)特標(biāo)記物經(jīng)由化學(xué)可切割或光可切割連接子結(jié)合至堿基。任選地，獨(dú)特標(biāo)記物是染料、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、組合熒光能量轉(zhuǎn)移標(biāo)簽、質(zhì)量標(biāo)簽，或電泳團(tuán)(electrophore)。優(yōu)選地，在(a)提供至少一個(gè)結(jié)合支持物的核酸后；擴(kuò)增了核酸。更優(yōu)選地，通過橋式擴(kuò)增(bridgeamplification)來擴(kuò)增核酸。任選地，至少兩個(gè)能夠在不同位置處與核酸的相同鏈雜交的兩個(gè)引物具有重疊序列。任選地，第二引物與末端具有額外的一個(gè)堿基的第一引物相同。也可以使用每一個(gè)添加額外堿基的另外的引物。任選地，封閉的和未封閉的引物用于在化學(xué)上區(qū)分延伸讀段。這確保將正確的堿基調(diào)用分配至正確的延伸讀段。這可以通過使用不同水平的用于至少兩個(gè)使用的引物的每個(gè)的封閉和未封閉引物來實(shí)現(xiàn)。任選地，使用生物信息學(xué)信息將所述堿基分配至延伸讀段。在某些實(shí)施方案中，確定核苷酸類似物身份的步驟包括檢測(cè)對(duì)應(yīng)于多個(gè)擴(kuò)展讀段的信號(hào)數(shù)據(jù)。可以同時(shí)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于多個(gè)擴(kuò)展讀段中的每個(gè)的信號(hào)數(shù)據(jù)。確定核苷酸類似物身份的步驟可以包括分析對(duì)應(yīng)于在每個(gè)擴(kuò)展讀段處檢測(cè)到的獨(dú)特標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度概況。這可以包括同時(shí)測(cè)量對(duì)應(yīng)于每個(gè)擴(kuò)展讀段的信號(hào)數(shù)據(jù)中的信號(hào)強(qiáng)度。任選地，該方法包括通過產(chǎn)生強(qiáng)度數(shù)據(jù)的直方圖來確定信號(hào)數(shù)據(jù)中的強(qiáng)度測(cè)量的分布。信號(hào)數(shù)據(jù)可以被檢測(cè)為對(duì)應(yīng)于步驟(b)中摻入的多個(gè)核苷酸類似物的顏色信號(hào)，其中每個(gè)顏色信號(hào)對(duì)應(yīng)于不同的核苷酸類似物或核苷酸類似物的組合。該方法可以包括信號(hào)處理步驟，其包括信號(hào)去卷積，信號(hào)改良和信號(hào)選擇中的一個(gè)或多個(gè)。該方法可以包括在每個(gè)擴(kuò)展讀段選擇最高強(qiáng)度的顏色信號(hào)以提供堿基調(diào)用。可以在每個(gè)雜交循環(huán)進(jìn)行多個(gè)堿基調(diào)用。任選地，將堿基分配給擴(kuò)展讀段的步驟包括確定核苷酸類似物的位置。任選地，將堿基分配給擴(kuò)展讀段的步驟包括為每個(gè)擴(kuò)展讀段提供初步堿基調(diào)用和最終堿基調(diào)用。任選地，最終堿基調(diào)用是通過將初步堿基調(diào)用數(shù)據(jù)與參考基因組相比較來提供的。任選地，最終堿基調(diào)用是通過將初步堿基調(diào)用數(shù)據(jù)與參考基因組相比較來提供的。在某些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)引物可以是重疊的引物。在某些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)引物可以因單個(gè)堿基添加而不同。有利地，在某些實(shí)施方案中，該方法提供檢測(cè)包含信號(hào)數(shù)據(jù)的信號(hào)，所述信號(hào)數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于相同核酸鏈或分子上不同位點(diǎn)處的多個(gè)基本上同時(shí)的引物延伸。有利地，在該方法中需要不多于對(duì)應(yīng)于dgtp、dctp、dttp、dutp和datp的單核苷酸單體類似物或者對(duì)應(yīng)于包含dgtp、dctp、dttp、dutp和datp的類似物的寡核苷酸探針的四個(gè)獨(dú)特標(biāo)記物。在用于每個(gè)擴(kuò)展讀段的方法中優(yōu)選使用相同的四個(gè)探針組。根據(jù)本發(fā)明，在此提供了用于測(cè)定核酸序列的方法，其包括對(duì)要測(cè)序核酸的每個(gè)殘基進(jìn)行以下步驟：(a)提供至少一個(gè)結(jié)合至支持物的核酸；(b)在允許聚合酶催化核酸合成條件下在存在下列各項(xiàng)的情況下將所述核酸與核酸聚合酶接觸以給出多個(gè)延伸讀段，每個(gè)擴(kuò)展讀段從引物延伸：(i)能夠在不同位置處與所述核酸的相同鏈雜交的至少兩個(gè)引物，和(ii)四個(gè)可逆終止核酸類似物或可逆終止劑，其選自dgtp、dctp、dttp、dutp、和datp的核苷酸類似物，所述四個(gè)類似物的每個(gè)具有不同于其他三個(gè)類似物的獨(dú)特標(biāo)記物的獨(dú)特標(biāo)記物。(c)除去未結(jié)合的核酸類似物；(d)通過測(cè)定對(duì)應(yīng)獨(dú)特標(biāo)記物的身份來測(cè)定摻入步驟(b)中的核酸類似物的身份，以及(e)將所述堿基分配至擴(kuò)展讀段。而本發(fā)明的另一方面提供了用于測(cè)定核酸序列的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含具有用于固定至少一個(gè)核酸的固體支持物的測(cè)序儀器，以及通過將核酸與酶在下列各項(xiàng)存在下相接觸來用于測(cè)定其序列的裝置：(i)能夠在不同位置處與所述核酸的相同鏈雜交的至少兩個(gè)引物和(ii)包含至少一個(gè)選自dgtp、dctp、dttp、dutp和datp核苷酸類似物的四個(gè)探針，四個(gè)探針中的每一個(gè)都具有與其他三個(gè)探針的獨(dú)特標(biāo)記物不同的獨(dú)特標(biāo)記物，在允許雜交的條件下，以給出多個(gè)延伸讀段，每個(gè)擴(kuò)展讀段從至少兩個(gè)引物中的一個(gè)延伸；除去未結(jié)合的探針；通過測(cè)定對(duì)應(yīng)獨(dú)特標(biāo)記物的身份來測(cè)定摻入的核酸類似物的身份，以及將核苷酸堿基分配至擴(kuò)展讀段。本發(fā)明的另一方面提供了一種測(cè)序方法，包括：提供至少一個(gè)與支持物雜交的核酸；將至少兩個(gè)引物雜交到核酸的相同鏈以提供兩個(gè)擴(kuò)展讀段；用可逆終止劑堿基進(jìn)行每個(gè)引物的延伸；獲得針對(duì)每個(gè)堿基添加的結(jié)合的可逆終止劑堿基的圖像。從所述圖像測(cè)定存在于支持物上位置處的多個(gè)堿基，并將所述堿基分配至擴(kuò)展讀段。而本發(fā)明的另一方面提供了用于測(cè)定核酸序列的系統(tǒng)，其包含具有用于固定至少一個(gè)核酸的固體支持物的測(cè)序裝置和用于以下的裝置：提供至少一個(gè)結(jié)合到支持物的核酸；將至少兩個(gè)引物與核酸的相同鏈雜交；在所述至少兩個(gè)引物的每個(gè)在所述核酸的相同鏈上進(jìn)行至少兩個(gè)引物延伸；獲得對(duì)應(yīng)于至少兩個(gè)引物延伸中每個(gè)摻入時(shí)的至少一個(gè)核苷酸堿基的信號(hào)數(shù)據(jù)；從所述信號(hào)數(shù)據(jù)測(cè)定所述核酸堿基的身份并將所述堿基分配至延伸讀段。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)包含用于處理所述信號(hào)數(shù)據(jù)的信號(hào)處理器。而本發(fā)明的另一方面提供了用于測(cè)定核酸序列的試劑盒，其包含用于進(jìn)行所述方法的測(cè)序試劑和說明書。為了舉例說明本發(fā)明，使用具有v2phix簇的流通池。圖1和以下示出了標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建體，其包含p5、sbs3，然后是一個(gè)t殘基之后是基因組插入物，sbs8’然后是a殘基和p7。圖1sbs3/sbs8stdpe構(gòu)建體粗體＝p5,下劃線＝sbs3,斜體＝sbs8,斜體和粗體＝p7aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctaccacgacgctcttccgatct‐‐‐insert‐‐‐ttactatgccgctggtggctctagatgtgagaaagggatggtgctgcgagaaggctaga‐‐‐insert‐‐‐agatcggaagagcggttcagcaggaatgccgagaccgatctcgtatgccgtcttctgcttgtctagccttctcgccaagtcgtccttacggctctggctagagcatacggcagaagacgaac如下表所示，將sbs3，sbs3+t和sbs8'引物單獨(dú)和組合雜交。表1道(lane)引物雜交期望的1st循環(huán)1sbs3t2sbs3+tall4(作為基因組)3sbs8’a4sbs3/sbs8’t+a5sbs3+t/sbs8’all4(作為基因組)+a進(jìn)行第一個(gè)測(cè)序循環(huán)并且獲得了流動(dòng)池的第一圖像。圖2顯示了針對(duì)觀察的三個(gè)通道的灰階(grayscale)(綠色，橙色和紅色)中的1st循環(huán)個(gè)別掃描。道1和3在3個(gè)通道中的不同2個(gè)中具有最強(qiáng)的信號(hào)，而由于在該道中的sbs3和sbs8'上摻入了t和a堿基的混合物，因此道4具有所有3個(gè)通道中最強(qiáng)的信號(hào)。在sbs3上的t摻入顯示出與綠色和橙色通道一樣強(qiáng)的信號(hào)，在紅色通道中非常弱。在sbs8’上的a摻入顯示出與橙色和紅色通道一樣強(qiáng)的信號(hào)，在綠色通道中弱和強(qiáng)信號(hào)的混合。由于在使用的2引物上摻入了t和a，sbs3/sbs8’顯示出在綠色、橙色和紅色通道中的強(qiáng)信號(hào)。從圖3可以看出，強(qiáng)度直方圖顯示了組合的信號(hào)導(dǎo)致獲得不同的強(qiáng)度信息，然后可以將該信息分配給堿基信息以允許有效的堿基調(diào)用。上方的直方圖來自單獨(dú)的sbs3，說明了t堿基調(diào)用，下方的直方圖來自單獨(dú)的sbs8’，說明了a堿基調(diào)用，而中心的直方圖顯示了組合的sbs3/sbs8’直方圖，其中制造了a堿基調(diào)用和t堿基調(diào)用兩者，一個(gè)來自每個(gè)擴(kuò)展讀段。類似地，圖4再一次地顯示了強(qiáng)度直方圖，這一次上方的直方圖來自單獨(dú)的sbs3+t，其中堿基調(diào)用可以是與基因組dna相關(guān)的4個(gè)堿基中的任何一個(gè)，下方的直方圖來自單獨(dú)的sbs8’，說明了a堿基調(diào)用，而中心的直方圖顯示了組合的sbs3+t/sbs8’直方圖，其中堿基調(diào)用可以是與來自一個(gè)擴(kuò)展讀段加上給出來自a/a簇雙強(qiáng)度峰的來自其他擴(kuò)展讀段的a堿基調(diào)用的基因組dna相關(guān)的任何4個(gè)堿基。一旦已經(jīng)獲得強(qiáng)度讀段和圖像，可以為每個(gè)帶有在用于測(cè)序的每個(gè)循環(huán)的每個(gè)位置被制造的多個(gè)調(diào)用的位置制造堿基調(diào)用。然后，需要將在每個(gè)位置上的每個(gè)調(diào)用分配至正確的擴(kuò)展讀段。這可以通過化學(xué)方法完成，例如通過通過使用封閉和未封閉引物的混合物使其中一個(gè)讀段比另一個(gè)讀段更亮來完成。另一個(gè)選擇是使用生物信息學(xué)信息以確定例如如果我們使用人類插入物或大腸桿菌插入物等則哪個(gè)是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上更“正確”堿基調(diào)用。在特定的實(shí)施方案中，多個(gè)引物可以是重疊引物。例如可以在多個(gè)循環(huán)將sbs3和sbs3+t用于序列2保守堿基以通過詢問每個(gè)堿基多次來給出更好的精確性，在這種情況下其中使用由單堿基添加而不同的兩個(gè)引物每個(gè)堿基詢問兩次。在一些情況下，使用封閉和未封閉引物來通過化學(xué)方法區(qū)分?jǐn)U展讀段。例如，其中一個(gè)引物將在開始時(shí)是完全未封閉的，而另一個(gè)引物將是封閉/未封閉的混合物。因此例如引物1將是100％未封閉的并且在測(cè)序上給出100％信號(hào)。然后“引物2”將是例如25％未封閉和75％封閉的混合物，這意味著在測(cè)序上你將從該引物位點(diǎn)得到25％的信號(hào)。因此，你將最終得到在2個(gè)不同水平(100％和25％)上的2個(gè)讀段給出數(shù)據(jù)，這會(huì)使區(qū)分哪個(gè)堿基屬于哪個(gè)讀段變得更為容易。當(dāng)使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)將所述堿基分配給擴(kuò)展讀段時(shí)，有可能可以從所讀取的堿基的混合物中生物信息地搜索最可能的讀段，例如如果你的讀數(shù)是：a/g,a/g,t/t,c/g,c/c,a/t則，可以針對(duì)可能匹配在進(jìn)行測(cè)序的基因組中搜索，并且可能將2個(gè)讀段區(qū)分為：r1，人類，agtcctr2，大腸桿菌，gatgca這與從上述堿的混合物的任何其他可能的讀段相反(例如，在任一基因組中都沒有發(fā)現(xiàn)aatcca)。更長的讀段對(duì)于每個(gè)基因組將更有可能是獨(dú)一無二的。測(cè)序方法本文描述的方法可以與各種核酸測(cè)序技術(shù)結(jié)合使用。特別適用的技術(shù)是其中將核酸附接在陣列中的固定位置，使得它們的相對(duì)位置不改變，并且其中陣列被重復(fù)成像的那些。在不同顏色通道中獲得圖像的實(shí)施方案，例如，與用于區(qū)分一種核苷酸堿基類型與另一種核苷酸堿基類型的不同標(biāo)記相符是特別適用的。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定靶核酸核苷酸序列的過程可以是自動(dòng)化過程。優(yōu)選的實(shí)施方案包括合成測(cè)序("sbs")技術(shù)。sbs技術(shù)通常涉及通過重復(fù)添加針對(duì)模板鏈的核苷酸來酶促延伸新生核酸鏈。在sbs的傳統(tǒng)方法中，可以在每個(gè)遞送中，在聚合酶存在下，向目標(biāo)核苷酸提供單個(gè)核苷酸單體。然而，在本文所述的方法中，在遞送中，在聚合酶存在下，可以將多于一種類型的核苷酸單體提供給目標(biāo)核酸。sbs可以利用具有終止劑部分或那些缺少任何終止劑部分的核苷酸單體。使用缺乏終止劑的核苷酸單體的方法例如包括，使用γ-磷酸/磷酸鹽標(biāo)記的核苷酸的焦磷酸測(cè)序和測(cè)序，如下面進(jìn)一步詳細(xì)闡述的。在使用缺乏終止劑的核苷酸單體的方法中，每個(gè)循環(huán)中加入的核苷酸數(shù)目通常是可變的，并取決于模板序列和核苷酸遞送模式。對(duì)于利用具有終止劑部分的核苷酸單體的sbs技術(shù)，終止劑可以在測(cè)序條件下是有效不可逆轉(zhuǎn)的，如傳統(tǒng)的利用雙脫氧核苷酸的sanger測(cè)序的情況，或者終止劑可以是可逆的，如solexa(現(xiàn)在是illumina,inc.)開發(fā)的測(cè)序方法的情況。sbs技術(shù)可以利用具有標(biāo)記部分或缺乏標(biāo)記部分的核苷酸單體。因此，可以基于標(biāo)簽的特征來檢測(cè)摻入事件，如熒光標(biāo)記；核苷酸單體的特征如分子量或電荷；核苷酸摻入的副產(chǎn)物，如磷酸/鹽釋放等。在實(shí)施方案中，其中測(cè)序試劑中存在兩個(gè)或更多個(gè)不同的核苷酸，可以彼此區(qū)分不同的核苷酸，或者替代地，在使用的檢測(cè)技術(shù)下，兩個(gè)或更多個(gè)不同的標(biāo)簽可以是不可區(qū)分的。例如，測(cè)序試劑中存在的不同核苷酸可以具有不同的標(biāo)記并且可以使用solexa(現(xiàn)在是illumina,inc.)開發(fā)的測(cè)序方法示例的適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)來區(qū)分它們。實(shí)施方案包括焦磷酸測(cè)序技術(shù)。焦磷酸測(cè)序檢測(cè)由于將特定的核苷酸摻入到新生鏈中而導(dǎo)致的無機(jī)焦磷酸鹽(ppi)的釋放(ronaghi,m.,karamohamed,s.,pettersson,b.,uhlen,m.andnyren,p.(1996)“real-timednasequencingusingdetectionofpyrophosphaterelease.”analyticalbiochemistry242(1),84-9；ronaghi,m.(2001)“pyrosequencingshedslightondnasequencing.”genomeres.11(1),3-11；ronaghi,m.,uhlen,m.andnyren,p.(1998)“asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate.”science281(5375),363；美國專利號(hào)6,210,891；美國專利號(hào)6,258,568和美國專利號(hào)6,274,320,前述公開通過引用以它們的整體并入本文)。在焦磷酸測(cè)序中，釋放的ppi可以通過atp硫酸化酶立即轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷(atp)來檢測(cè)，并且通過螢光素酶產(chǎn)生的光子檢測(cè)產(chǎn)生的atp水平?？梢詫⒁判虻暮怂岣浇拥疥嚵兄械奶卣?，并且可以成像以捕捉由于在陣列的特征處摻入核苷酸而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在用特定核苷酸類型處理陣列后可以獲得圖像(例如a,t,c或g)。在添加每種核苷酸類型后獲得的圖像將不同于檢測(cè)陣列中的哪些特征。圖像中的這些差異反映了陣列上特征的不同序列內(nèi)容。然而，每個(gè)特征的相對(duì)位置在圖像中將保持不變?？梢允褂帽疚乃龅姆椒▉泶鎯?chǔ)，處理和分析圖像。例如，以用各種不同核苷酸類型的陣列處理后獲得的圖像可以以與本文例舉的用于基于可逆終止劑的測(cè)序方法的不同檢測(cè)通道獲得的圖像相同的方式來處理。在sbs的另一個(gè)示例性類型中，循環(huán)測(cè)序通過逐步添加可逆終止劑核苷酸來完成，所述可逆終止劑核苷酸例如包括以下所述的可切割或者熒光可切割標(biāo)簽：wo04/018497和美國專利號(hào)7,057,026，所述公開以其整體通過引用并入本文。這種方法正在被solexa(現(xiàn)在是illumina,inc.)商業(yè)化，并且還描述于wo91/06678和wo07/123,744中，每個(gè)以其整體通過引用并入本文。熒光標(biāo)記的終止劑(可以顛倒這兩個(gè)終止劑)和切割的熒光標(biāo)簽的可用性促進(jìn)有效的循環(huán)可逆終止(crt)測(cè)序。也可以共同設(shè)計(jì)聚合酶以有效地?fù)饺氩倪@些修飾的核苷酸延伸出來。優(yōu)選地，在基于可逆終端的測(cè)序?qū)嵤┓桨钢?，在sbs反應(yīng)條件下，標(biāo)記物基本上不能抑制延伸。然而，檢測(cè)標(biāo)記物可以是可移除的，例如通過裂解或降解。在將標(biāo)記物并入陣列的核酸特征之后，可以捕獲圖像。在具體實(shí)施方案中，每個(gè)循環(huán)涉及將四種不同核苷酸類型同時(shí)遞送至陣列，并且每種核苷酸類型具有光譜上不同的標(biāo)記物。然后可以獲得四個(gè)圖像，每個(gè)圖像使用對(duì)四個(gè)不同標(biāo)簽之一選擇的檢測(cè)通道。或者，可以順序添加不同的核苷酸類型，并且可以在每個(gè)添加步驟之間獲得陣列的圖像。在此類實(shí)施方案中，每個(gè)圖像將顯示已經(jīng)摻入特定類型的核苷酸的核酸特征。由于每個(gè)特征的不同序列內(nèi)容，不同的圖像將存在或不存在不同的特征。然而，圖像中的特征的相對(duì)位置將保持不變?？梢匀绫疚乃鰧?duì)從此類可逆終止劑-sbs方法獲得的圖像進(jìn)行儲(chǔ)存，處理和分析。在圖像捕獲步驟之后，可以去除標(biāo)記物，并且可以除去可逆終止劑部分以用于隨后的核苷酸添加和檢測(cè)循環(huán)。標(biāo)簽在特定循環(huán)內(nèi)和之后的循環(huán)中被檢測(cè)到后，可以提供降低背景信號(hào)和循環(huán)之間串?dāng)_的優(yōu)點(diǎn)。有用的標(biāo)簽和去除方法的實(shí)例如下所述。在具體實(shí)施方案中，一些或全部核苷酸單體可以包括可逆終止劑。在此類實(shí)施方案中，可逆終止劑/可裂解熒光劑可以包括經(jīng)由3'酯鍵連接至核糖部分的熒光劑(metzker,genomeres.15:1767-1776(2005),其通過引用以其整體并入本文)。其他方法將終止劑化學(xué)與熒光標(biāo)記的切割分離(rupareletal.,procnatlacadsciusa102:5932-7(2005),其通過引用以其整體并入本文)。ruparel等人描述了開發(fā)的使用小的3'烯丙基封閉延伸的可逆終止劑，但是其可以通過用鈀催化劑的短暫處理容易地解封。熒光團(tuán)經(jīng)由光可裂解接頭附接在堿基上，所述接頭可以通過暴露于長波長uv光30秒而容易地被切割。因此，可以使用二硫鍵還原或光切割作為可切割的連接子?？赡娼K止的另一種方法是使用在dntp上放置大體積染料之后發(fā)生的自然終止。dntp上帶電荷的大體積染料的存在可以通過空間和/或靜電阻礙作為有效的終止劑。除非染料被去除，一個(gè)摻入事件的存在防止進(jìn)一步摻入。染料的切割可去除熒光，并有效地反轉(zhuǎn)終止。修飾的核苷酸的實(shí)例也描述在美國專利號(hào)7,427,673和美國專利號(hào)7,057,026中，其通過引用以它們的整體并入本文?？梢耘c本文描述的方法和系統(tǒng)一起使用的附加的示例性sbs系統(tǒng)和方法描述于以下中：美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0166705,美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0188901,美國專利號(hào)7,057,026,美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0240439,美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0281109,pct公開號(hào)wo05/065814,美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2005/0100900,pct公開號(hào)wo06/064199,pct公開號(hào)wo07/010,251,美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0270305以及美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0260372，每個(gè)公開的內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。一些實(shí)施方案可以利用四種不同的標(biāo)記物來檢測(cè)四種不同的核苷酸。例如，可以使用描述于美國專利公開號(hào)2013/0079232中的方法和系統(tǒng)來執(zhí)行sbs，該專利以其整體通過引用并入本文。作為第一個(gè)實(shí)例，可以以相同的波長檢測(cè)一對(duì)核苷酸類型，但是基于一對(duì)成員與另一成員的強(qiáng)度差異，或基于一對(duì)成員的改變(例如，經(jīng)由化學(xué)修飾，光化學(xué)改性或物理改性)，所述改變導(dǎo)致相較于該對(duì)的其他成員檢測(cè)到的信號(hào)所出現(xiàn)或消失的明顯信號(hào)。作為第二個(gè)實(shí)例，在特定條件下可以檢測(cè)四種不同核苷酸類型中的三種，而第四核苷酸類型缺少在這些條件下可檢測(cè)的標(biāo)記物，或在這些條件下被最小檢測(cè)(例如，由背景熒光引起的最小檢測(cè)等)。可以基于它們各自存在的信號(hào)來測(cè)定前三種核苷酸類型摻入至核酸，并且可以基于任何信號(hào)的不存在或最小檢測(cè)來確定第四種核苷酸類型摻入到核酸中。作為第三個(gè)實(shí)例，一種核苷酸類型可以包括在兩個(gè)不同通道中檢測(cè)到的標(biāo)記物，而在不超過一個(gè)通道中檢測(cè)到其他核苷酸類型。上述三個(gè)示例性配置不被認(rèn)為是相互排斥的，并且可以以各種組合使用。組合了所有三個(gè)實(shí)例的示例性實(shí)施例為基于熒光的sbs法，其使用在第一通道中檢測(cè)到的第一種核苷酸類型(例如，當(dāng)被第一激發(fā)波長激發(fā)時(shí)具有在第一通道中檢測(cè)到的標(biāo)簽的datp)，在第二通道中檢測(cè)到的第二種核苷酸類型(例如，當(dāng)被第二激發(fā)波長激發(fā)時(shí)具有在第二通道中檢測(cè)到的標(biāo)簽的dctp)，在第一和第二通道中檢測(cè)到的第三種核苷酸類型(例如，當(dāng)被第一和/或第二激發(fā)波長激發(fā)時(shí)具有至少一個(gè)在兩個(gè)通道中檢測(cè)到的標(biāo)記物的dttp)以及在任一通道中未被檢出或被最小檢出的缺少標(biāo)簽的第四種核苷酸類型(例如，沒有標(biāo)記的dgtp)。此外，如并入美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0079232的材料中所描述的，可以使用單個(gè)通道獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。在所謂的單染料測(cè)序方法中，第一種核苷酸類型是標(biāo)記的，但該標(biāo)記物在第一種圖像生成后被去除，并且僅在產(chǎn)生第一圖像之后標(biāo)記第二種核苷酸類型。第三種核苷酸類型在第一和第二圖像中保留其標(biāo)簽，并且第四種核苷酸類型在兩個(gè)圖像中保持未標(biāo)記。一些實(shí)施方案可以利用連接技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。此類技術(shù)利用dna連接酶摻入寡核苷酸并鑒定此類寡核苷酸的摻入。寡核苷酸通常具有與寡核苷酸雜交的序列中特定核苷酸的同一性相關(guān)的不同標(biāo)記。與其他sbs方法一樣，在用標(biāo)記的測(cè)序試劑處理核酸特征陣列之后可以獲得圖像。每個(gè)圖像將顯示已經(jīng)摻入特定類型的標(biāo)簽的核酸特征。由于每個(gè)特征的不同序列內(nèi)容，不同的圖像將存在或不存在不同的特征，但是圖像中的特征的相對(duì)位置將保持不變。從基于連接的測(cè)序方法獲得的圖像可以如本文所述進(jìn)行存儲(chǔ)，處理和分析。可以與本文描述的方法和系統(tǒng)一起使用的示例性sbs系統(tǒng)和方法描述于美國專利號(hào)6,969,488，美國專利號(hào)6,172,218和美國專利號(hào)6,306,597中，所述專利通過引用以其整體并入本文。通過連接測(cè)序是用于測(cè)序的眾所周知的方法，其需要用光重復(fù)或長時(shí)間照射二堿基探針。使用合成測(cè)序的示例性系統(tǒng)包括appliedbiosystems的solidtm系統(tǒng)(lifetechnologies,carlsbad,ca)。簡(jiǎn)言之，通過連接測(cè)序的方法包括將測(cè)序引物與固定在模板珠上的銜接子序列雜交。一組四個(gè)熒光標(biāo)記的二堿基探針競(jìng)爭(zhēng)連接至測(cè)序引物。二堿基探針的特異性通過在每個(gè)連接反應(yīng)中詢問每一個(gè)和第二個(gè)堿基來實(shí)現(xiàn)。在一系列連接循環(huán)后，除去延伸產(chǎn)物，并用與n-1位置處互補(bǔ)的測(cè)序引物復(fù)位模板，用于第二輪連接循環(huán)。用測(cè)定最終讀數(shù)長度的周期數(shù)來進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的連接，檢測(cè)和切割。此外，本文描述的方法和技術(shù)方案可以特別適用于從核酸陣列測(cè)序，其中由于每個(gè)位置處的每個(gè)核苷酸可以基于其可識(shí)別的標(biāo)記來鑒定，可以從陣列上的多個(gè)位置處同時(shí)讀取多個(gè)序列。示例性的方法描述于us2009/0088327；us2010/0028885；和us2009/0325172。一些實(shí)施方案可以通過利用納米孔測(cè)序(deamer,d.w.&akeson,m.“nanoporesandnucleicacids:prospectsforultrarapidsequencing.”trendsbiotechnol.18,147-151(2000)；deamer,d.andd.branton,“characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis”.acc.chem.res.35:817-825(2002)；li,j.,m.gershow,d.stein,e.brandin,andj.a.golovchenko,“dnamoleculesandconfigurationsinasolid-statenanoporemicroscope”nat.mater.2:611-615(2003),上述公開通過引用以其整體并入本文)。在此類實(shí)施方案中，目標(biāo)核酸穿過納米孔。納米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，如α-溶血素。當(dāng)目標(biāo)核酸通過納米孔時(shí)，可以通過測(cè)量孔隙電導(dǎo)的波動(dòng)來鑒定每個(gè)堿基對(duì)(u.s.patent7,001,792；soni,g.v.&meller,“a.progresstowardultrafastdnasequencingusingsolid-statenanopores.”clin.chem.53,1996-2001(2007)；healy,k.“nanopore-basedsingle-moleculednaanalysis.”nanomed.2,459-481(2007)；cockroft,s.l.,chu,j.,amorin,m.&ghadiri,m.r.“asingle-moleculenanoporedevicedetectsdnapolymeraseactivitywithsingle-nucleotideresolution.”j.am.chem.soc.130,818-820(2008),上述公開通過引用以其整體并入本文)。從納米孔測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)可以如本文所述進(jìn)行存儲(chǔ)，處理和分析。特別地，可以根據(jù)本文所列的光學(xué)圖像和其他圖像的示例性處理將數(shù)據(jù)作為圖像進(jìn)行處理。在某些實(shí)施方案中，單個(gè)孔可用于保持與兩個(gè)或兩個(gè)以上引物雜交的dna鏈。然后可以執(zhí)行基于光的合成測(cè)序。一些實(shí)施方案可以利用涉及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)dna聚合酶活性的方法?？梢酝ㄟ^含熒光團(tuán)聚合酶和γ-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)相互作用來檢測(cè)核酸摻入，其例如描述于美國專利號(hào)7,329,492和美國專利號(hào)7,211,414中(上述公開通過引用以其整體并入本文)，或者可以用零模式波導(dǎo)和使用熒光核苷酸類似物和工程化聚合酶來檢測(cè)核苷酸摻入。所述零模式波導(dǎo)例如描述于美國專利號(hào)7,315,019中(該公開通過引用以其整體并入本文)，所述熒光核苷酸類似物和工程化聚合酶例如描述于美國專利號(hào)7,405,281和美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2008/0108082中(上述公開通過引用以其整體并入本文)?？梢詫⒐庠?illumination)限制在圍繞表面系留聚合酶的zeptoliter-尺度體積使得可以低背景觀察熒光標(biāo)記核苷酸的摻入(levene,m.j.etal.“zero-modewaveguidesforsingle-moleculeanalysisathighconcentrations.”science299,682-686(2003)；lundquist,p.m.etal.“parallelconfocaldetectionofsinglemoleculesinrealtime.”opt.lett.33,1026-1028(2008)；korlach,j.etal.“selectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsinglednapolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures.”proc.natl.acad.sci.usa105,1176-1181(2008),上述公開通過引用以其整體并入本文)。從這些方法獲得的圖像可以如本文所述進(jìn)行存儲(chǔ)，處理和分析。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)聚合酶可以存在于每個(gè)孔的底部，每個(gè)生成來自附接于相同模板分子的不同引物的測(cè)序數(shù)據(jù)。一些sbs實(shí)施方案包括在將核苷酸摻入延伸產(chǎn)物中時(shí)釋放的質(zhì)子的檢測(cè)。例如基于檢測(cè)釋放的質(zhì)子的測(cè)序可以使用可從iontorrent(guilford,ct,alifetechnologiessubsidiary)購得的電檢測(cè)器以及相關(guān)的技術(shù)或者描述于以下專利中的測(cè)序方法和系統(tǒng)：us2009/0026082a1；us2009/0127589a1；us2010/0137143a1；orus2010/0282617a1,每個(gè)通過引用并入本文。更具體地，本文所列的方法可用于生產(chǎn)用于檢測(cè)質(zhì)子的擴(kuò)增子的克隆群。在使用焦磷酸測(cè)序法的實(shí)施方案中，核酸的每條鏈?zhǔn)褂脙蓚€(gè)或多個(gè)引物可能意味著每單位時(shí)間更多的信號(hào)要去卷積。在焦磷酸測(cè)序法中，被沖洗出的兩倍于正常的ph值下降可能意味著引物中的1個(gè)具有tt摻入，或者每個(gè)引物具有單個(gè)t摻入。上述方法可以有利地以多重形式進(jìn)行使得多個(gè)不同的靶核酸被同時(shí)操作。在具體實(shí)施方案中，不同的靶核酸可以在常見的反應(yīng)容器中或在特定的基底的表面上進(jìn)行處理。這允許以多種方式來方便地遞送測(cè)序試劑，去除未反應(yīng)的試劑和檢測(cè)摻入事件。在使用表面結(jié)合靶核酸的實(shí)施方案中，靶核酸可以是陣列形式。在陣列形式中，目標(biāo)核酸通?？梢砸钥臻g上可區(qū)分的方式結(jié)合到表面。目標(biāo)核酸可以通過直接共價(jià)附接，附接到珠子或其他顆粒或結(jié)合至聚合酶或附接于表面的其它分子結(jié)合。該陣列可以包括在每個(gè)位點(diǎn)(也稱為特征)的目標(biāo)核酸的單拷貝，或者具有相同序列的多個(gè)拷貝可以存在于每個(gè)位點(diǎn)或特征?？梢酝ㄟ^如下文進(jìn)一步詳述的橋式擴(kuò)增或乳液pcr的擴(kuò)增方法生產(chǎn)多個(gè)拷貝。本文所述的方法可以使用具有各種密度的特征的陣列，包括例如，至少約10特征/cm2、100特征/cm2、500特征/cm2、1,000特征/cm2、5,000特征/cm2、10,000特征/cm2、50,000特征/cm2、100,000特征/cm2、1,000,000特征/cm2、5,000,000特征/cm2，或更高。本文所列方法的優(yōu)點(diǎn)在于它們以并行的方式為多個(gè)目標(biāo)核酸提供的快速和有效的檢測(cè)。因此，本公開提供了能夠使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備和檢測(cè)核酸的綜合系統(tǒng)，例如上面列舉的那些。因此，本公開的集成系統(tǒng)可以包括能夠遞送擴(kuò)增試劑的流體組分和/或針對(duì)一個(gè)或多個(gè)固定化的dna片段的測(cè)序試劑，所述系統(tǒng)包含如泵，閥，儲(chǔ)存器，流體管線等部件。流動(dòng)池可以在用于檢測(cè)靶核酸的集成系統(tǒng)中配置和/或使用。示例性的流動(dòng)池例如描述于us2010/0111768a1和美國系列號(hào)13/273,666中，每篇專利通過引用以其整體并入本文。如流動(dòng)池所示例，集成系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)流體組分可用于擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。以核酸測(cè)序?qū)嵤┓桨笧槔?，集成系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)流體組分可以用于本文所述的擴(kuò)增方法和用于在諸如上述例舉的測(cè)序方法中遞送測(cè)序試劑。或者，集成系統(tǒng)可以包括單獨(dú)的流體系統(tǒng)以執(zhí)行擴(kuò)增方法和執(zhí)行檢測(cè)方法。能夠創(chuàng)建擴(kuò)增核酸并還能夠測(cè)定核酸序列的集成測(cè)序系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于miseqtm平臺(tái)(illumina,inc.,加利福尼亞州圣地亞哥)和描述于美國系列號(hào)13/273,666中的設(shè)備，其以其整體通過引用并入本文。核酸擴(kuò)增在一些實(shí)施方案中，使用如美國專利號(hào)7,985,565和7,115,400的公開內(nèi)容的簇?cái)U(kuò)增方法來擴(kuò)增固定化的dna片段，每篇專利的內(nèi)容以其整體通過引用并入本文。美國專利號(hào)7,985,565和7,115,400中并入的材料描述了固相核酸擴(kuò)增方法，其允許擴(kuò)增產(chǎn)物被固定在固體支持物上，以形成包含固定化的核酸分子的簇或“群落”。每個(gè)在此類陣列上的簇或群落由多個(gè)相同的固定化的多核苷酸鏈和多個(gè)相同的固定化的互補(bǔ)多核苷酸鏈形成。本文中如此形成的陣列大體上稱為“簇陣列”。美國專利號(hào)7,985,565和7,115,400中描述的固相擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物是所謂的“橋接”結(jié)構(gòu)，其通過退火固定的多核苷酸鏈和未固定的互補(bǔ)鏈的對(duì)來形成，所述兩個(gè)鏈優(yōu)選地經(jīng)由共價(jià)附接，在5’末端固定化在固體支持物上。簇?cái)U(kuò)增方法是方法的例子，其中固定化的核酸模板用于生產(chǎn)固定化的擴(kuò)增子。也可以使用其它合適的方法從根據(jù)本文提供的方法制備的固定化的dna片段來產(chǎn)生固定化的擴(kuò)增子。例如，可以通過固相pcr來形成一個(gè)或多個(gè)簇或群落，其中每個(gè)擴(kuò)增引物對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)引物是固定化的。在其他實(shí)施方案中，在溶液中擴(kuò)增固定化的dna片段。例如，在一些實(shí)施方案中，固定化的dna片段被切割或以其他方式從固體支持物釋放出來，并且然后將擴(kuò)增引物在溶液中與釋放的分子雜交。在其他實(shí)施方案中，擴(kuò)增引物在一個(gè)或多個(gè)起始擴(kuò)增步驟中與固定化的dna片段雜交，然后在溶液中進(jìn)行隨后的擴(kuò)增步驟。因此，在一些實(shí)施方案中，固定化的核酸模板可用于生產(chǎn)固相擴(kuò)增子。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述或本領(lǐng)域通常已知的任何擴(kuò)增方法可用于通用或靶特異性引物以擴(kuò)增固定化的dna片段。用于擴(kuò)增的合適方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，鏈置換擴(kuò)增(sda)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(tma)和基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)，如描述于美國專利號(hào)8,003,354中，通過引用該專利以其整體并入本文?？梢允褂蒙鲜鰯U(kuò)增方法來擴(kuò)增一種或多種感興趣的核酸。例如，包括多重pcr、sda、tma、nasba等的pcr可用于擴(kuò)增固定化的dna片段。在一些實(shí)施方案中，特異性針對(duì)感興趣的核酸的引物包括在擴(kuò)增反應(yīng)中。用于擴(kuò)增核酸的其它合適的方法可以包括寡核苷酸延伸和連接、滾環(huán)擴(kuò)增(rca)(lizardietal.,nat.genet.19:225-232(1998),其通過引用并入本文)以及寡核苷酸連接測(cè)定(ola)(一般參見美國專利號(hào)7,582,420,5,185,243,5,679,524和5,573,907；ep0320308b1；ep0336731b1；ep0439182b1；wo90/01069；wo89/12696；以及wo89/09835,所有專利通過引用并入本文)技術(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，可以設(shè)計(jì)這些擴(kuò)增方法以擴(kuò)增固定化的dna片段。例如，在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增方法可以包括含有專門針對(duì)感興趣的核酸的引物的連接探針擴(kuò)增或寡核苷酸連接測(cè)定(ola)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增方法可以包括含有專門針對(duì)感興趣的核酸的引物的引物延伸連接反應(yīng)。作為可以專門設(shè)計(jì)以擴(kuò)增感興趣的核酸的引物延伸和連接引物的非限制性實(shí)例，擴(kuò)增可以包括用于goldengate測(cè)定的引物(illumina,inc.,加利福尼亞州圣地亞哥)如美國專利號(hào)7,582,420和7,611,869所示，每篇專利通過引用以其整體并入本文?？捎糜诒竟_的方法的示例性等溫?cái)U(kuò)增方法包括但不限于，多重置換擴(kuò)增(mda)如例如deanetal.,proc.natl.acad.sci.usa99:5261-66(2002)所示，或等溫鏈置換核酸擴(kuò)增如例如美國專利號(hào)6,214,587所示，每篇專利通過引用以其整體并入本文?？捎糜诒竟_的其它非基于pcr的方法例如包括，例如描述于walkeretal.,molecularmethodsforvirusdetection,academicpress,inc.,1995；美國專利號(hào)5,455,166,和5,130,238,以及walkeretal.,nucl.acidsres.20:1691-96(1992)中的鏈置換擴(kuò)增(sda)，或者例如描述于lageetal.,genomeresearch13:294-307(2003)中的超分支鏈置換擴(kuò)增，前述每個(gè)通過引用以其整體并入本文。等位擴(kuò)增方法可以用于鏈置換phi29聚合酶或bstdna聚合酶大片段，5'->3'體外用于基因組dna的隨機(jī)引物擴(kuò)增。這些聚合酶的使用利用其高的持續(xù)性和鏈置換活性。高持續(xù)性允許聚合酶產(chǎn)生長度為10-20kb的片段。如上所述，可以在等溫條件下使用具有低持續(xù)性和鏈置換活性的聚合酶(如klenow聚合酶)來產(chǎn)生較小的片段。美國專利號(hào)7,670,810的公開中詳細(xì)描述了擴(kuò)增反應(yīng)，條件和組分的其他描述，該專利通過引用以其整體并入本文。在本公開中有用的另一種核酸擴(kuò)增方法是使用具有恒定5'區(qū)域接著隨機(jī)3'區(qū)域的雙域引物群體的標(biāo)記pcr(taggedpcr)，其例如描述于grothuesetal.nucleicacidsres.21(5):1321-2(1993)中，通過引用以其整體并入本文。進(jìn)行第一輪擴(kuò)增以允許在基于來自隨機(jī)合成的3'區(qū)域的單獨(dú)雜交的熱變性的dna上多次起始。由于3'區(qū)域的性質(zhì)，起始位點(diǎn)被認(rèn)為在整個(gè)基因組中是隨機(jī)的。因此，可以除去未結(jié)合的引物并且可以使用與恒定5’區(qū)域互補(bǔ)的引物發(fā)生進(jìn)一步的復(fù)制。序列表<110>伊盧米納劍橋有限公司<120>從多個(gè)引物測(cè)序以增加數(shù)據(jù)率和密度<130>p166912.wo.01<160>2<170>bissap1.3<210>1<211>120<212>dna<213>智人<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctaccacgacgctcttccgatcta60gatcggaagagcggttcagcaggaatgccgagaccgatctcgtatgccgtcttctgcttg120<210>2<211>120<212>dna<213>智人<400>2ttactatgccgctggtggctctagatgtgagaaagggatggtgctgcgagaaggctagat60ctagccttctcgccaagtcgtccttacggctctggctagagcatacggcagaagacgaac120當(dāng)前第1頁12