本發(fā)明(實(shí)施方式)涉及醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物技術(shù)、分子生物學(xué)、遺傳工程領(lǐng)域，并且可以被用于鎮(zhèn)痛。

重要的是認(rèn)識(shí)到疼痛不僅僅是隱晦的疾病或損傷過(guò)程的指示，其是獨(dú)立的問(wèn)題，對(duì)個(gè)體和整個(gè)社會(huì)造成重大危害。為了提高生活質(zhì)量，疼痛緩解因此應(yīng)當(dāng)是治療目標(biāo)。治療疼痛的有希望的途徑——其在當(dāng)前繼續(xù)執(zhí)行，是識(shí)別靶向的(針對(duì)特定分子)藥理學(xué)療法的機(jī)制和實(shí)施[who疼痛管理規(guī)范指南(normativeguidelinesonpainmanagement)，日內(nèi)瓦，2007年6月]。

肽酰胺類[us4459225(a)]、苯腙衍生物已知被用作抗炎劑或鎮(zhèn)痛劑[ep0952159(b1)]，合成肽酰胺類——用于預(yù)防和治療疼痛[ru2500685c2]。已知使用肽類家族，其具備鎮(zhèn)痛活性，通式為a-b-tyr-pro(dpro、dhpro、ddhpro、dldhpro、hyp)-c-x[wo2008020778(a1)]，已知使用衍生的肽，其被皮下或口服施用，具備鎮(zhèn)痛或抗傷害活性[us2008009448(a1)]。

化學(xué)合成的肽類和其衍生物的缺點(diǎn)是獲得期望的化合物與對(duì)映體的混合物的能力，其可能導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的結(jié)果。對(duì)映體的概念在藥物學(xué)中起到重要的作用，這是因?yàn)樗幬镂镔|(zhì)的不同對(duì)映體通常具有不同的生物學(xué)活性。使用用于獲得肽分子的現(xiàn)有系統(tǒng)允許獲得天然結(jié)構(gòu)的分子——均質(zhì)混合物。

已知包含同源調(diào)節(jié)子或異源dna的重組質(zhì)粒用于細(xì)菌表達(dá)，最少可以編碼具有鎮(zhèn)痛作用的多肽[sk278170(b6)]。已知在大腸桿菌(escherichiacoli)細(xì)胞中合成的包含深的大基因組(macrogenomic)基因簇的吲哚與新結(jié)構(gòu)的單偶聯(lián)[cn102477436(a)]。已知來(lái)自?？宵c(diǎn)海葵(heteractiscrispa)——的多肽，其具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[ru2368621c1、ru2404245c1]；和其制備方法[ru2415866c1]。已知具有大量的橋接結(jié)(bridgingtie)，分離自納米比亞馬杜拉放線菌屬(actinomaduranamibiensis)的肽類，其用于治療由炎癥引起的神經(jīng)性疼痛[ru2498995c2]。但是，由于這些分子源自與人遠(yuǎn)緣的生物體的事實(shí)，在將它們?cè)谌酥惺褂弥埃渥饔帽仨毐环浅Ｗ屑?xì)地研究。

基于食魚螺毒素(蝸牛毒(snailpoison))的雜合蛋白mvóa(chǎn)和trx是已知的，其可以被用于制備疼痛藥物，用于晚期的癌癥和aids、手術(shù)后疼痛、燒傷等[cn1487085(a)]。使用桿狀病毒和昆蟲細(xì)胞或昆蟲獲得食魚螺毒素的方法是已知的[cn102876683(a)]。已知具有ω-芋螺肽(conopeptide)的鎮(zhèn)痛和改善的阿片劑鎮(zhèn)痛引入——tvia(snx-185)或mviia(snx-111)引入——的方法[ep0625162(b1)]，使用α食魚螺毒素[wo2014023129(a1)、cn102286079(b)、cn103374066(a)]、lt7b食魚螺毒素[cn102628048(a)]的鎮(zhèn)痛方法。已知使用ω-芋螺肽用于生產(chǎn)抑制神經(jīng)性疼痛的進(jìn)展的藥物[ep1336409(b1)]。已知蝎屬多肽具有鎮(zhèn)痛和抗腫瘤活性[us7592309(b2)、cn101591668(a)]，和其應(yīng)用方法[us7592309(b2)和cn101591668(a)]，蜈蚣屬少棘蜈蚣(scolopendrasubspinipesmutilans)，一種-mu-slptx-ssm6a-，具有鎮(zhèn)痛作用[cn102977201(a)]。已知具有鎮(zhèn)痛作用的蜘蛛智利塔蘭圖蛛(grammostolaspatulata)的毒液的肽類[us5776896(a)]、中國(guó)狼蛛的肽hwap-i[us6670329(b2)]。來(lái)自蛇毒液的肽分子和其衍生物、同系物、類似物和模擬物已知單獨(dú)或與其它鎮(zhèn)痛分子組合能夠誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛或減輕疼痛[us6613745(b1)、us7902152(b2)]，并且也已知海蛇平頦海蛇(lapemishardwickii)的縮短的(shortened)神經(jīng)毒素用于鎮(zhèn)痛[us7294697(b2)]。

那組發(fā)明的缺點(diǎn)是使用毒素，其即使是藥學(xué)上純的，仍然存在風(fēng)險(xiǎn)——如果超劑量最高會(huì)導(dǎo)致死亡。

已知使用新的多肽用于鎮(zhèn)痛——人g蛋白的亞基9.01[cn1345751(a)]、亞基12.65[wo0212310(a1)]、亞基9.46[wo0204504(a1)]、亞基11.44[cn1352195(a)]。已知基于g蛋白受體的多肽類，hfiao41[us2001016336(a1)]、hlyaz61[ep0837128(a2)]、huvct36[us5912335(a)]、h7tba62[us5955309(a)]、org10[us2003162945(a1)]、org11[wo0200725(a2)]，并且其也屬于igs4家族[au779993(b2)、us6998255(b1)]。已知由愛(ài)潑斯坦-巴爾ebi3誘導(dǎo)的剪接的g蛋白受體的變體[us5874252(a)]。

通過(guò)施用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(抗體)的拮抗劑治療由骨癌、骨關(guān)節(jié)炎、手術(shù)后疼痛引起的疼痛的方法是已知的[ru2389509c2、ru2429013、ru2338555c2]，與該分子特異性結(jié)合的配偶體是已知的[ru2406728c2]。已知能夠抑制trka受體和ngf之間的結(jié)合的分子可以用作具有延長(zhǎng)作用的鎮(zhèn)痛劑[ru2427387c2]。針對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的抗體已知具有增加的體內(nèi)穩(wěn)定性[ru2011149263a]、對(duì)ngf的高親和力[ru2473564c2]，并且針對(duì)神經(jīng)組織的生長(zhǎng)因子的人源化抗體的劑型是已知的[ru2427387c2]。

治療如下的已知方法：

-疼痛和炎癥-使用肽[ru2011105280a]，通過(guò)分離crmp-2和cav2.2之間的相互作用，導(dǎo)致不存在n型鈣通道(cav2.2)的活化[wo2012009075(a1)]，并且通過(guò)分離li-cam、錨蛋白和電壓依賴性鈣通道的相互作用，治療軸突的損傷，抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和疼痛傳遞，并且阻斷神經(jīng)元中的鈣泵[us7737250(b2)]，用于鎮(zhèn)痛的nav1.7鈉通道的肽毒素的類似物是已知的[us2013296247(a1)]。

-神經(jīng)元組織中的疼痛和炎癥，使用il-31的拮抗劑，單克隆人源化抗體或嵌合抗體[ru2440130c2]，前列腺酸性磷酸酶(“pap”)或其活性變體、片段或衍生物[wo2009064497(a1)]，

-神經(jīng)性疼痛，使用針對(duì)ccr2的抗體[ru2011110169a]，神經(jīng)性疼痛借助于衍生自鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的肽類[ru2007119313a]，包含氨基酸序列thr-r1-lue-ile-asp-asn-asn-ala-thr-glu-glu-ile-leu-tyr的肽，其中r1是d-丙氨酸，影響神經(jīng)變性紊亂或髓鞘形成的寬度[ru2266129c2]，具有與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其可以活化或抑制與神經(jīng)性疼痛相關(guān)聯(lián)的靶基因的表達(dá)(vr1、nav1.8和trka)[us8466267(b2)]。

-神經(jīng)性或中樞性敏化疼痛，使用分離的基因的序列，響應(yīng)于神經(jīng)性或中樞性敏化疼痛的機(jī)械地不同的第一和第二模型，其在哺乳動(dòng)物的脊髓中被調(diào)控[us2003108906(a1)、us2003134301(a1)、us2003138803(a1)、us2004058326(a1)]，

-慢性疼痛，借助于torc多肽[ru98118091a]，histogran和其化學(xué)穩(wěn)定的類似物[ca2219437(a1)]，線性的、環(huán)狀的histogranic肽類和基于它們的假肽類[us6566327(b1)]，包含il-10和il-4的雜合蛋白[wo2013070076(a1)]，基于il-10的多肽類[us7261882(b2)]，

-急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)，使用il-13結(jié)合蛋白[ru2472807c2]、il-12/p40結(jié)合蛋白[ru2012124438a]、il-12/p41結(jié)合蛋白[ru2008103312a]、il-17結(jié)合蛋白[ru2011140335a]、前列腺素e2結(jié)合蛋白[ru2011104228a]、具有雙可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白[ru2515108c2]、具有針對(duì)前列腺素e2的雙可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白[ru2011104348a]、借助于ee3家族蛋白與慢性或急性疼痛斗爭(zhēng)[ru2004114989a]，

-內(nèi)臟疼痛，使用增加受體的鳥苷酸環(huán)化酶活性的多肽[ru2433133(c2)]，

-神經(jīng)性疼痛、骨關(guān)節(jié)炎疼痛、炎性疼痛，使用il-1結(jié)合蛋白[ru2012154210a]；關(guān)節(jié)炎和其它tnf-a介導(dǎo)的紊亂或病理生理學(xué)機(jī)制的炎性過(guò)程，具體而言各種形式的疼痛，借助于穩(wěn)定的和可溶的抗體-tnf-a的抑制劑[ru2415151c2]；關(guān)節(jié)炎疼痛，借助于人源化抗體-cgrp的拮抗劑[ru2467765c2]；由至少一種抗癌劑誘導(dǎo)的疼痛，借助于至少一種肉毒桿菌毒素或基于它的肽[ru2483747c2]，包括連同阿片樣物質(zhì)衍生物[ru2434637c2]；疼痛，借助于與myc蛋白相關(guān)聯(lián)的pam[ru2345785c2]，借助于甘丙肽受體樣gpcr多肽[us2004053244(a1)、us2003073115(a1)、wo0168843(a1)]、kontulakin-g和其去糖基化形式[us6696408(b1)、us6525021(b1)]，借助于蛋白激酶c的肽抑制劑[us7939493(b2)]；內(nèi)臟疼痛，通過(guò)施用針對(duì)與降鈣素基因相關(guān)聯(lián)的肽的抗體-拮抗劑[ru2012106468a]，

-腹部疼痛，借助于肽，優(yōu)選地來(lái)自鼠李糖乳酸桿菌(lactobacillusrhamnosus)[ru2011136454a]。

已知使用trpa1拮抗的抗體，優(yōu)選地單克隆抗體，減輕生理學(xué)和病理生理學(xué)狀況(例如，在異常性疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏中)中的疼痛敏感性，尤其是與經(jīng)由trpa1的機(jī)械敏感性相關(guān)聯(lián)或由其介導(dǎo)的疼痛感的方法[ru2430750c2]。鎮(zhèn)痛劑/抗炎劑已知選自下列種類：受體拮抗劑、受體激動(dòng)劑和酶抑制劑，每個(gè)種類通過(guò)作用于疼痛和炎癥抑制的不同分子機(jī)制起作用：(4)舒緩激肽(bradikinin)受體拮抗劑(肽類)、降鈣素基因介導(dǎo)肽(cgrp)受體的拮抗劑(α-cgrp-(8-37))，(8)白介素受體的拮抗劑(lys-d-pro-thr)[ru2180852c2]、β-動(dòng)物纖維素(btc)蛋白的拮抗劑[jp2000198744(a)]。已知如此方法：使用促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(crf2r)受體的拮抗劑降低crf2r調(diào)制的紊亂的疼痛[ru2385878c2]；借助于下列治療疼痛：具有苯胺(amilin)性質(zhì)的肽[ru2385878c2]，nop肽激動(dòng)劑[ru2012106820a]，包含血管活性腸肽(vip)——其在cns中遞送——的片段11-28的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的肽類[wo9104041(a1)]，基于降鈣素的衍生的肽[us5446026a]，人多肽cgrp-rcf[us5710024(a)、wo9803534(a1)]，多肽類——人源化cgrp受體，包括用于治療頭痛、慢性緊張性頭痛、周期性復(fù)發(fā)的嚴(yán)重的陣發(fā)性頭痛，預(yù)防偏頭痛[us7193070(b2)]，肽類——人11cb的新剪接的選項(xiàng)(option)[us6033872(a)]，后面蛋白的激動(dòng)劑和拮抗劑[wo9928492(a1)]，具有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的受體[us5824504(a)、us6277960(b1)、us6277977(b1)、us5955308(a)、us6221627(b1)、us2002106766(a1)、us5994098(a)、us6174994(b1)、us6037146(a)、us5874243(a)]，具有磷酸二酯酶活性的肽[wo0166716(a1)]，多肽類——人蛋白激酶hyak3和hoacf72[分別地，ep0870825(b1)和us5972606(a)]。

基于腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的雜合蛋白已知使用原核的可溶蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生[cn1978466(b)、wo9942480(a1)]?；?型神經(jīng)降壓素的受體的多肽類已知用于治療疼痛[us6008050(a)]。神經(jīng)降壓素或其類似物與治療肽的綴合物是已知的，其可以被用于引起降溫或鎮(zhèn)痛[wo2010063122(a1)]。α-促黑激素的構(gòu)象優(yōu)化的類似物是已知的，其對(duì)cns具有特異性作用[us4649191(a)]。與snare類似的用于調(diào)制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的合成肽是已知的[kr20090041066(a)]。

肽類已知具有多種功能，包括鎮(zhèn)痛，比如具有許多橋接的肽類——其提取自納米比亞馬杜拉放線菌屬[ru2010144778a]，結(jié)構(gòu)dgsvvvnkvselpaghglnvntlsygdlaad的肽[ru2508296c2]，嘌呤能受體pt1的肽調(diào)制劑[ru2422459c1]，作為血管肽酶抑制劑的在n末端氨基酸殘基上含有2-硫代?；亩念怺ru2298559c2]，胸腺-特異性蛋白[ru2398776c2]，改善鈣代謝的多肽[jph03178993(a)]以及基于肽類和與肽相關(guān)的化合物的具有高度滲透性的前體藥物組合物[ru2011149796a]。

在脊椎動(dòng)物包括人的治療性處理中，已知使用神經(jīng)元去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的選擇性抑制劑和鎮(zhèn)痛劑的協(xié)同組合用于鎮(zhèn)痛或用于預(yù)防或緩解疼痛的鎮(zhèn)痛的組合途徑[us8188048b2]。已知強(qiáng)啡肽的肽類-類似物當(dāng)與麻醉劑或鎮(zhèn)痛劑共同施用時(shí)，加強(qiáng)后者，其包括腦啡肽和β-內(nèi)啡肽類似物[ep0096592b1]。

利用口服和腸胃外施用組合物，借助于與載體基團(tuán)結(jié)合的肽tyr-gly-gly-phe-met，從而形成在治療或緩解疼痛中使用的藥物的前體來(lái)增加物質(zhì)的藥理學(xué)活性的方法是已知的[au2002228260(b2)]。

使用一種高效的藥劑用于鎮(zhèn)痛，其生產(chǎn)簡(jiǎn)單且廉價(jià)，是更加成本有效的選擇。

防御素肽hnp-1的用途是已知的，其單獨(dú)地或與神經(jīng)肽m組合，作為用于預(yù)防和/或治療包括周圍血管疾病的治療劑，所述周圍血管疾病包括麻醉、擴(kuò)散性疼痛、灼痛(燒痛)[wo2009/043461a1]。

包括抗體在內(nèi)的不被認(rèn)為是免疫應(yīng)答誘導(dǎo)物的蛋白質(zhì)分子性質(zhì)的用途可以通過(guò)這些作用復(fù)雜化，其可能導(dǎo)致副作用，例如與自體抗體的形成相關(guān)聯(lián)。

小干擾rna和短發(fā)夾rna的用途是已知的，用于n-甲基-d-天冬氨酸皮下受體的nr1亞基的基因敲落以降低炎性疼痛或無(wú)法忍受的慢性疼痛，尤其是慢性臨床疼痛和由燒傷引起的疼痛[us8372817(b2)、us8575330(b2)、us8361985(b2)]。rna干擾劑已知用于治療慢性疼痛[wo2013126963(a1)]。但是，rna的制品在身體外被快速破壞，需要特殊的儲(chǔ)存條件，其使得基于rna的藥物的工業(yè)適用性成為問(wèn)題。

長(zhǎng)期鎮(zhèn)痛的方法是已知的，其中患者注射有肌源細(xì)胞，在所述肌源細(xì)胞中從相應(yīng)dna合成肽，其活化阿片樣物質(zhì)受體或介導(dǎo)物質(zhì)p與受體的結(jié)合[us7166279(b2)]。但是，該方法的實(shí)施是相當(dāng)復(fù)雜的并且與許多風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。

已知治療抑郁和疼痛的方法，藥劑可以是蛋白質(zhì)、rna或dna[wo2013177484(a1)]。已知用于治療疼痛的慢病毒載體——其包含狂犬病病毒的g蛋白[ep1425403(b1)]、編碼il-24的腺病毒[cn101518655(a)]，包括用于癌癥時(shí)的疼痛緩解。已知制癌蛋白m或其同系物，其合成自用于轉(zhuǎn)移基因的載體：慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、仙臺(tái)病毒、腺病毒和腺伴隨病毒，包括用于治療疼痛[jp4803789(b2)]。已知使用kometin——多肽——治療異常性疼痛、痛覺(jué)增敏、自發(fā)性疼痛和幻痛，其可以作為多肽遞送，或通過(guò)引入用于表達(dá)kometin的表達(dá)載體、細(xì)胞系——其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有蛋白質(zhì)和包含細(xì)胞的被膜[wo2013034157(a1)]。病毒載體具有缺點(diǎn)，包括如下事實(shí)：它們是昂貴的并且可能引起妨礙載體重復(fù)施用的炎性反應(yīng)。病毒載體可以復(fù)制，其降低對(duì)靶蛋白表達(dá)的控制程度，其又不總是期望的和可適用的，特別是關(guān)于鎮(zhèn)痛。

已知基于pvax1載體的重組dna疫苗——其靶向腫瘤，包括用于治療腫瘤學(xué)中的疼痛，其包含編碼環(huán)氧合酶-2(cox-2)的基因、鼠泛素mubi以及dna的iss免疫刺激序列(pvax1-mubi-iss-cox-2-iss)[cn101648011(a)]。但是，該設(shè)計(jì)的目的是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因?yàn)橐雽?dǎo)致和增加免疫原性的元件，是細(xì)胞毒性的。已知如此藥物組合物，其包含載體——包括質(zhì)粒dna，和藥學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑，以減輕、預(yù)防或治療疼痛，該載體包含含有調(diào)制vr1受體表達(dá)的至少一個(gè)區(qū)域的核苷酸序列[us2006154886(a1)]。在該情況下，鎮(zhèn)痛是經(jīng)由阻斷與離子通道相關(guān)聯(lián)的受體——一種非特異性陽(yáng)離子導(dǎo)體。攜帶基因——在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中防御素由該基因合成——的質(zhì)粒dna作為誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的手段的用途也將有助于使身體中病原體發(fā)展的可能性最小化：通常當(dāng)任何病因?qū)W的疼痛時(shí)，健康狀態(tài)惡化，并且身體抵抗感染的能力減弱，并且結(jié)果，在例如外科手術(shù)之后，可以開抗生素的處方，并且天然抗菌肽的使用將使得結(jié)合鎮(zhèn)痛和保護(hù)性作用，結(jié)果，可能拒絕服用抗生素。

本發(fā)明的緊密類似物是在專利cn101648011(a)和發(fā)明申請(qǐng)us2006154886(a1)中描述的發(fā)明，其公開了質(zhì)粒dna形式的鎮(zhèn)痛劑。

示出了當(dāng)肌肉內(nèi)注射dna時(shí)，表達(dá)載體由肌肉細(xì)胞吸收，并且進(jìn)行在輸入載體中的編碼基因的表達(dá)[j.a.wolffetal.,science247,1465(1990)；g.ascadietal.,nature352,815(1991)]。示出了質(zhì)粒被維持為游離基因并且不復(fù)制。也已經(jīng)證明在肌肉內(nèi)注射之后，在大鼠、魚和靈長(zhǎng)類的骨骼肌中和大鼠的心肌中的恒定表達(dá)[h.linetal,circulation82,2217(1990)；r.n.kitsisetal,proc.natlacad.sci.(usa)88,4138(1991)；e.hansenet.al,febslett.290,73(1991)；s.jiaoetal.,hum.genetherapy3,21(1992)；j.a.wolffetal,humanmol.genet.1,363(1992)]。將質(zhì)粒dna遞送入各種組織的細(xì)胞的其它技術(shù)的使用是已知的，例如，無(wú)針注射器，其使得能夠遞送入活體動(dòng)物的各種組織的細(xì)胞[furthetal.,analyticalbiochemistry,205,365-368,(1992)]。

示出了正常肌纖維不表達(dá)mhc抗原，但是在伴隨感染的炎癥期間，或者在干擾素γ存在的情況下，肌纖維能夠產(chǎn)生與第一類mhc或甚至第二類復(fù)合的抗原[meckert,p.c,hontebeyrie-joskowicz,m.,chambo,j.,levin,m.,andlaguens,r.p.(1991).trypanosomacruzi:aberrantexpressionofclassiimajorhistocompatibilitycomplexmoleculesinskeletalandheartmusclecellsofchronicallyinfectedmice.exp.parasitol.72,8-14；hohlfeldandengel,a.g.(1984)theimmunobiologyofmuscle.immunol.today15,269-274.；mantegazza,r.&bernasconi,p.(1994).cellularaspectsofmyositis.curr.opin.rheumatol.6,568-574,hartikkaj,sawdeym,cornefert-jensenf,margalithm,barnhartk,nolascom,vahlsinghl,meekj,marquetm,hobartp,normanj,manthorpem.animprovedplasmiddnaexpressionvectorfordirectinjectionintoskeletalmuscle.humgenether.1996jun20；7(10):1205-17]，在這一點(diǎn)上，引入質(zhì)粒dna——其中對(duì)肌肉的傷害最小化——是優(yōu)選的。

示出了即使在對(duì)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的試驗(yàn)中是免疫原性的，但是在人中，基于質(zhì)粒dna的制劑不是免疫原性的[saadef,petrovskyn.technologiesforenhancedefficacyofdnavaccines.expertrevvaccines.2012feb；11(2):189-209.doi:10.1586/erv.11.188]。研究者也沒(méi)能發(fā)現(xiàn)在小鼠或兔中重復(fù)注射dna之后病理學(xué)改變的證據(jù)[parkerse,borellinif,wenkml,etal.plasmiddnamalariavaccine:tissuedistributionandsafetystudiesinmiceandrabbits.hum.genether.1999；10(5):741-758.]。在2007年，dna疫苗的美國(guó)fda指南中得出結(jié)論：臨床前研究院不需要評(píng)估對(duì)自身免疫疾病的作用。

質(zhì)粒dna應(yīng)當(dāng)包含對(duì)于其維持和使用生物體必需的元件，連同適合的調(diào)控序列。調(diào)控序列是如此核苷酸序列：其可以影響轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的水平下的基因表達(dá)，以及確保質(zhì)粒dna功能的存在和維持的機(jī)制。

對(duì)于原核系統(tǒng)，復(fù)制起點(diǎn)和報(bào)告基因是必需的。質(zhì)粒dna的細(xì)菌元件沒(méi)有消極地影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，并且引起由于使用質(zhì)粒dna引起的副作用。在文獻(xiàn)中，存在如下證據(jù)：使用對(duì)氨芐青霉素具有抗性的基因作為報(bào)告基因可能是不期望的，這與患者中對(duì)氨芐青霉素的反應(yīng)的發(fā)展有關(guān)，但是作者考慮這種作用與質(zhì)粒dna的低品質(zhì)的純化相關(guān)聯(lián)，而不是由于元件自身。

用于哺乳動(dòng)物的質(zhì)粒的必需元件是啟動(dòng)子、mrna前導(dǎo)序列、終止序列。

啟動(dòng)子是質(zhì)粒的重要組分，其觸發(fā)感興趣的基因的表達(dá)。質(zhì)粒dna——藥物的組分——的經(jīng)典啟動(dòng)子是人cmv/即刻早期或cmv-雞-β肌動(dòng)蛋白(cagg)啟動(dòng)子。cmv啟動(dòng)子被用于大多數(shù)dna疫苗，因?yàn)樗鼈冊(cè)趶V泛范圍的哺乳動(dòng)物組織中介導(dǎo)高水平的組成型表達(dá)[manthorpem,cornefert-jensenf,hartikkaj,etal.genetherapybyintramuscularinjectionofplasmiddna:studiesonfireflyluciferasegeneexpressioninmice.hum.genether.1993；4(4):419-431]并且不抑制下游閱讀。當(dāng)改變cmv啟動(dòng)子時(shí)——例如通過(guò)在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的下游包含htlv-1r-u5或使用嵌合sv40-cmv啟動(dòng)子，觀察到表達(dá)水平的增加[williamsja,carnesae,hodgsoncp.plasmiddnavaccinevectordesign:impactonefficacy,safetyandupstreamproduction.biotechnol.adv.2009；27(4):353-370]。組織特異性宿主啟動(dòng)子充當(dāng)cmv啟動(dòng)子的替代物，它們使得避免抗原在不適當(dāng)?shù)慕M織中的組成型表達(dá)——其通常導(dǎo)致較低的免疫原性[cazeauxn,bennassery,vidalpl,liz,paulind,bahraouie.comparativestudyofimmuneresponsesinducedafterimmunizationwithplasmidsencodingthehiv-1nefproteinunderthecontrolofthecmv-ieorthemuscle-specificdesminpromoter.vaccine.2002；20(27-28):3322-3331]。

前導(dǎo)mrna序列也起很大的作用。直接地在起始密碼子atg之前的kozak序列使得表達(dá)增加[kozakm.recognitionofaugandalternativeinitiatorcodonsisaugmentedbyginposition+4butisnotgenerallyaffectedbythenucleotidesinpositions+5and+6.emboj.1997；16(9):2482-2492]。在啟動(dòng)子的下游，在質(zhì)粒中存在內(nèi)含子可以增加mrna的穩(wěn)定性并且增強(qiáng)基因表達(dá)。

使用物種特異性密碼子使得增加基因的表達(dá)[frelinl,ahleng,alheimm,etal.codonoptimizationandmrnaamplificationeffectivelyenhancestheimmunogenicityofthehepatitiscvirusnonstructural3/4agene.genether.2004；11(6):522-533]。

通過(guò)改變終止序列可以影響基因表達(dá)，其需要保留mrna的穩(wěn)定性，用于合適的轉(zhuǎn)錄終止和從細(xì)胞核輸出mrna，包括其縮短。許多現(xiàn)今的dna疫苗使用牛生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)錄終止子的序列[montgomerydl,shiverjw,leanderkr,etal.heterologousandhomologousprotectionagainstinfluenzaabydnavaccination:optimizationofdnavectors.dnacellbiol.1993；12(9):777-783]。為了轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定，需要聚腺苷酸化(polya)。改變polya序列可以導(dǎo)致基因表達(dá)水平的增加[normanja,hobartp,manthorpem,felgnerp,wheelerc.developmentofimprovedvectorsfordna-basedimmunizationandothergenetherapyapplications.vaccine.1997；15(8):801-803]。在pvax1(invitrogen,carlsbad,ca)中，牛生長(zhǎng)激素的終止區(qū)包含同型嘌呤片段，其對(duì)核酸酶是敏感的。示出了可選的polya序列可以顯著地提高質(zhì)粒對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性[azzoniar,ribeirosc,monteiroga,prazeresdmf.theimpactofpolyadenylationsignalsonplasmidnucleases-resistanceandtransgeneexpression.jgenemed.2007；9:392-402]。兩種終止密碼子的引入使得增加轉(zhuǎn)錄終止子的效率。

用于實(shí)施功能的最佳質(zhì)粒設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)組合“細(xì)菌”和“真核”元件與適合的調(diào)控序列以確保在生產(chǎn)過(guò)程期間高數(shù)目的拷貝/細(xì)胞和哺乳動(dòng)物中高水平的表達(dá)[saadef,petrovskyn.technologiesforenhancedefficacyofdnavaccines.expertrevvaccines.2012feb；11(2):189-209.doi:10.1586/erv.11.188]。

為了制造根據(jù)本發(fā)明的鎮(zhèn)痛劑，可能使用質(zhì)粒dna，最低限度地，標(biāo)準(zhǔn)地用于哺乳動(dòng)物包括人中的基因遞送和表達(dá)，并且還對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，包括在williams等，2009中詳細(xì)描述的那些[williamsja,carnesae,hodgsoncp.plasmiddnavaccinevectordesign:impactonefficacy,safetyandupstreamproduction.biotechnol.adv.2009；27(4):353-370]。在fda指南(2007)中，陳述了對(duì)于通過(guò)將新基因克隆入質(zhì)粒載體產(chǎn)生的dna疫苗，可以擱置(waive)在將物質(zhì)引入體內(nèi)之后該物質(zhì)的生物分布的研究，這是由于可接受的生物分布和整合概況先前被記錄了。在who指南(2007)中，陳述了如果不存在利用幾乎相同的或類似的產(chǎn)品的相當(dāng)多的工作經(jīng)驗(yàn)，則需要對(duì)生物學(xué)分布和保存的研究。在emea指南(2006)中，陳述了利用載體系統(tǒng)的工作經(jīng)驗(yàn)將使得對(duì)臨床前研究進(jìn)行優(yōu)化和集中在臨床前研究。借助于具有不同克隆基因的dna載體的安全性研究示出了類似的生物分布[sheetsrl,steinj,manetzts,duffyc,nasonm,andrewsc,kongwp,nabelgjgomezpl.biodistributionofdnaplasmidvaccinesagainsthiv-1,ebola,severeacuterespiratorysyndrome,orwestnilevirusissimilar,withoutintegration,despitedifferingplasmidbackbonesorgeneinserts.sheetsrl,steinj,manetzts,duffyc,nasonm,andrewsc,kongwp,nabelgjgomezpl.toxicolsci.2006jun；91(2):610-9.epub2006mar28.]和毒理學(xué)[sheetsrl,steinj,manetzts,andrewsc,bailerr,rathmannj,gomezpl.toxicologicalsafetyevaluationofdnaplasmidvaccinesagainsthiv-1,ebola,severeacuterespiratorysyndrome,orwestnilevirusissimilardespitedifferingplasmidbackbonesorgene-inserts.toxicolsci.2006jun；91(2):620-30.epub2006mar28]。對(duì)于用于除了人之外的哺乳動(dòng)物中的質(zhì)粒dna，要求是較不嚴(yán)格的，因此可能使用更廣泛范圍的質(zhì)粒。

對(duì)于預(yù)期用于人用途的dna，可能有用的是在藥學(xué)上可接受的載體或緩沖溶液中具有最終dna產(chǎn)物。藥學(xué)上可接受的載體或緩沖溶液在本領(lǐng)域中是已知的并且包括在多個(gè)文本比如remington'spharmaceuticalsciences中描述的那些。

本發(fā)明的實(shí)施方式的原型是在公布為wo2009/043461a1:applicationofdefensinhnp-1forthetreatmentincludingpain的專利申請(qǐng)中公開的發(fā)明。

防御素組成了低分子量(3-5-kda)的通過(guò)數(shù)個(gè)(通常三個(gè))二硫鍵穩(wěn)定的富含半胱氨酸的陽(yáng)離子肽類的大家族[ganz,t.2002.immunology:versatiledefensins.science298:977-979,lehrer,r.i.andganz,t.2002.defensinsofvertebrateanimals.curr.opin.immunol.14:96-102.]，其能夠殺死廣譜的病原體，包括多種細(xì)菌、真菌和有包膜病毒。在人中，該家族由防御素的α-亞家族(hnp)和β-亞家族(hbd)代表。α-防御素主要地在中性粒細(xì)胞和帕內(nèi)特細(xì)胞中表現(xiàn)。hnp-1和hnp-3包含總共30個(gè)氨基酸殘基，除了在位置1中用丙氨酸置換天冬酰胺之外，這些肽是彼此相同的。hnp-2是hnp-1和hnp-3的蛋白水解產(chǎn)物，包含29個(gè)氨基酸殘基(失去自n末端的第一氨基酸)。二硫鍵的存在確保挽救防御素分子對(duì)眾多白細(xì)胞和微生物蛋白酶的穩(wěn)定性，并且挽救炎癥和組織破壞中心的抗菌性[o.levyantimicrobialproteinsandpeptides:anti-infectivemoleculesofmammalianleukocytes.j.ofleukocytebiology.2004；76:909-926]。以正確的空間結(jié)構(gòu)獲得這些分子是十分挑戰(zhàn)性的。

編碼防御素的基因在8號(hào)染色體上的基因座p22-23處形成簇。hnp1-3由兩種基因hdefa1和hdefa3編碼。每種防御素基因包含編碼前肽原(prepropeptide)的數(shù)種外顯子。

首先，防御素以前體的形式合成，作為前肽原，其長(zhǎng)度是94個(gè)氨基酸殘基。前肽原包含信號(hào)片段(平均19個(gè)氨基酸殘基)、陰離子片段(平均45個(gè)氨基酸殘基)和“成熟”肽。在來(lái)自前肽原的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白酶切割的結(jié)果中，進(jìn)行信號(hào)片段的去除和前防御素(prodefensin)形成(平均75個(gè)氨基酸殘基)。在成熟中性粒細(xì)胞顆粒體中發(fā)生隨后的成熟(45個(gè)氨基酸殘基的切割)。α-防御素也在nk細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、γδt淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[a.s.budikhina,b.v.pinegin.defensins-multifunctionalcationicpeptidesoftheperson.immunopathology,allergology,infectology.2008,no.2:31-40]。本發(fā)明的作者首先證明了引入攜帶編碼hnp-1/hnp-2/hnp-3的基因的質(zhì)粒dna導(dǎo)致鎮(zhèn)痛，而且，在這種情況下，觀察到β-內(nèi)啡肽在血清中的水平增加。

類似物和原型的缺點(diǎn)就在它們的描述之后示出。要求保護(hù)的發(fā)明(實(shí)施方式)不含有這些缺點(diǎn)。

來(lái)自使用本發(fā)明的實(shí)施方式的技術(shù)結(jié)果首先表現(xiàn)在擴(kuò)展鎮(zhèn)痛劑的譜系。當(dāng)類似物具有差的耐受性或不耐受時(shí)，代表性的提議的鎮(zhèn)痛劑的形式(version)將允許鎮(zhèn)痛，由于此，患者將具有采取他不能或不想在沒(méi)有鎮(zhèn)痛的情況下進(jìn)行的行動(dòng)的機(jī)會(huì)，例如，以敢于需要的程序，以及改善生活質(zhì)量，例如，與不使用鎮(zhèn)痛劑相比將獲得較少的不適，或者將能夠緩解急性或慢性疼痛。該技術(shù)結(jié)果通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明(實(shí)施方式)的鎮(zhèn)痛劑實(shí)現(xiàn)。

此外，技術(shù)結(jié)果是增加鎮(zhèn)痛的持續(xù)時(shí)間并且通過(guò)下述實(shí)現(xiàn)：質(zhì)粒dna使用，在引入體內(nèi)之后，從該質(zhì)粒dna合成α人防御素hnp-1/hnp-2/hnp-3；并且通過(guò)事實(shí)：編碼人防御素的核苷酸序列包含導(dǎo)致mrna穩(wěn)定性的元件，并且因此增加mrna的半衰期，結(jié)果，從mrna的一個(gè)分子的蛋白質(zhì)合成被進(jìn)行更多次，并且還結(jié)果，合成的蛋白質(zhì)的量增加；并且也通過(guò)事實(shí)：人α防御素的核苷酸序列被密碼子優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，結(jié)果，蛋白質(zhì)合成是更加強(qiáng)的。在付諸實(shí)踐期間，這將使得顯著地降低引入的質(zhì)粒dna的量(10-50倍)——與在基因療法中在本土(blighty)和世界實(shí)踐中當(dāng)前使用的劑量相比。

此外，技術(shù)結(jié)果是增加鎮(zhèn)痛的安全性。該技術(shù)結(jié)果通過(guò)如下事實(shí)實(shí)現(xiàn)：活性成分不是可以形成抗體的蛋白質(zhì)——當(dāng)使用原始生物體的分子時(shí)，其可以引起嚴(yán)重的副作用，而是質(zhì)粒dna，其作為游離基因存在并且不整合入基因組——人蛋白從基因組合成并且然后被分泌，并且結(jié)果，無(wú)免疫原性的、安全的使用人防御素用于鎮(zhèn)痛被進(jìn)行。該技術(shù)結(jié)果也通過(guò)如下事實(shí)實(shí)現(xiàn)：在生物體中由質(zhì)粒dna合成的蛋白質(zhì)經(jīng)歷自然的翻譯后加工，并且由于細(xì)胞分子伴侶，蛋白質(zhì)的正確折疊也被確保。這些修飾在蛋白質(zhì)的生產(chǎn)期間是難以實(shí)現(xiàn)的，其可以顯著地影響許多其功能。該技術(shù)結(jié)果也由于如下事實(shí)實(shí)現(xiàn)：活性物質(zhì)的新陳代謝和分解代謝的天然機(jī)制被使用，而不形成有毒產(chǎn)物，這是由于質(zhì)粒構(gòu)建體和編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，以及形成的蛋白質(zhì)與內(nèi)源性類似物的同一性。該技術(shù)結(jié)果也通過(guò)如下事實(shí)實(shí)現(xiàn)：質(zhì)粒dna在引入哺乳動(dòng)物生物體之后不復(fù)制，其使得控制合成的蛋白質(zhì)的量，并且因此控制鎮(zhèn)痛。該技術(shù)結(jié)果也通過(guò)在質(zhì)粒dna中存在調(diào)控序列如沉默基因和/或絕緣子而實(shí)現(xiàn)，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，其也允許控制合成的蛋白質(zhì)的量，并且基本上，控制蛋白質(zhì)的合成，并且因此分別地控制鎮(zhèn)痛：如果必要，在短時(shí)期中存在停止或降低基因表達(dá)的機(jī)會(huì)。在后者變體中，也可能在必要時(shí)進(jìn)行組織特異性表達(dá)。

技術(shù)結(jié)果也是通過(guò)避免生產(chǎn)的復(fù)雜性和體外蛋白制品純化的過(guò)程來(lái)簡(jiǎn)化和降低生產(chǎn)鎮(zhèn)痛劑的成本，這是由于蛋白合成在體內(nèi)發(fā)生的事實(shí)。dna制品的生產(chǎn)、純化和儲(chǔ)存與蛋白質(zhì)制品相比是更加經(jīng)濟(jì)上有益的，這是因?yàn)榍罢呤歉€(wěn)定的，它們可以以大數(shù)量和以較低的成本生產(chǎn)。

示出了血漿中β-內(nèi)啡肽的濃度的改變直接地依賴于疼痛綜合征的類型、其強(qiáng)度和鎮(zhèn)痛功效，其可以充當(dāng)用于評(píng)估鎮(zhèn)痛效力的標(biāo)準(zhǔn)[beta-endorphin-ananalgesiceffectivenessmarkerforacutepainandchronicpainsyndromeincancerpatients/zvpavlova[andothers]//problemsofclinicalmedicine.-2007.-n1.-p.36-40.-issn1817-8359]。當(dāng)本發(fā)明的鎮(zhèn)痛劑被施用時(shí)，觀察到血清β-內(nèi)啡肽水平的增加(圖3)。

根據(jù)時(shí)間特征，兩種類型的疼痛可以被區(qū)分：

-急性疼痛-與已經(jīng)引起疼痛的損傷緊密地結(jié)合的新的、最近的疼痛，并且通常來(lái)說(shuō)，是疾病的癥狀，當(dāng)損傷消除時(shí)其消失[eddyn.b.,leimbachd.j.//pharmacolexpther.-mar；107(3):385-93.-1953](包括手術(shù)前和手術(shù)后的、受傷后的、燒傷、分娩期間的急性疼痛、由脊髓創(chuàng)傷引起的疼痛、急性頭痛、hiv/aids中的疼痛、鐮狀細(xì)胞危象、三叉神經(jīng)痛、胰腺炎和消化道中的其它疼痛、以及心肌梗死和其它主要的心臟事件、介入性疼痛(在診斷和治療程序期間)、慢性疼痛中急性[whonormativeguidelinesonpainmanagement,genevajune2007]，其持續(xù)多達(dá)2-3個(gè)月，并且可以照射(irradiate)，和

-慢性疼痛-甚至在誘因已經(jīng)消除之后，持續(xù)長(zhǎng)的時(shí)間段(超過(guò)2-3個(gè)月)，常常獲得獨(dú)立疾病的狀態(tài)，例如，炎性過(guò)程[eddyn.b.,leimbachd.j.//pharmacolexpther.-mar；107(3):385-93.-1953]，其中觀察到鎮(zhèn)痛劑的效力降低。慢性疼痛可以是惡性疾病中的慢性疼痛(包括如下中的疼痛：癌癥患者、hiv/aids、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)、多發(fā)性硬化、器官衰竭的末期、擴(kuò)展性慢性阻塞性肺疾患、增強(qiáng)的充血性心力衰竭、帕金森癥)和與惡性疾病沒(méi)有關(guān)聯(lián)的慢性疼痛(慢性肌肉骨骼痛，比如背痛或下背痛、慢性退行性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌筋膜和風(fēng)濕性疼痛、慢性頭痛、偏頭痛、骨疼痛；神經(jīng)性疼痛(包括神經(jīng)壓迫中的疼痛、傷痛、神經(jīng)損傷和截肢后的疼痛)、糖尿病性神經(jīng)病、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征(i型和ii型)和骨骼肌的痙攣、皰疹后神經(jīng)痛，外科手術(shù)介入后的慢性疼痛；內(nèi)臟疼痛(如果牽張中空臟器和絞痛)；和鐮狀細(xì)胞貧血中的慢性疼痛[whonormativeguidelinesonpainmanagement,genevajune2007]。

借助于該鎮(zhèn)痛劑，兩種描述類型的疼痛都可以被減輕并且消除。如從現(xiàn)有技術(shù)可見的，質(zhì)粒鎮(zhèn)痛劑是未知的，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，人α防御素由質(zhì)粒鎮(zhèn)痛劑合成。質(zhì)粒dna元件的多樣性和性質(zhì)要求凈化特性。本發(fā)明的描述，在“

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
”部分中，在“發(fā)明的詳細(xì)描述”部分中，解釋了“本發(fā)明的配方”并且包括質(zhì)粒dna的必要元件的詳細(xì)描述，其允許利用所有其實(shí)施方式實(shí)施本發(fā)明，從而實(shí)現(xiàn)描述的技術(shù)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

質(zhì)粒dna被提出用于在哺乳動(dòng)物中瞬時(shí)表達(dá)，其由包含如下的框架(skeleton)代表：原核元件、復(fù)制起點(diǎn)和報(bào)告基因、和真核元件、強(qiáng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)mrna序列和這些元件的調(diào)控序列、克隆感興趣的基因的至少一個(gè)位點(diǎn)和用于至少一個(gè)引物退火以分析質(zhì)粒dna的內(nèi)含物的至少一個(gè)位點(diǎn)、和由分泌序列代表的多核苷酸、編碼人α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的片段、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被優(yōu)化用于表達(dá)的密碼子、和終止序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，前蛋白原由seqidno:1或seqidno:2或seqidno:7或seqidno:8表示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸由seqidno:3或seqidno:4或seqidno:5或seqidno:6或seqidno:9或seqidno:10或seqidno:11或seqidno:12表示。

而且，這樣的質(zhì)粒dna的生產(chǎn)者基于細(xì)菌細(xì)胞(實(shí)施方式)給出并且鎮(zhèn)痛劑基于有效量的這樣的質(zhì)粒dna，還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，用于哺乳動(dòng)物，特別是人(實(shí)施方式)。

發(fā)明的詳細(xì)描述

質(zhì)粒dna在原核細(xì)胞主要是細(xì)菌細(xì)胞中最具經(jīng)濟(jì)有利地產(chǎn)生。就這一點(diǎn)而言，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna包含用于維持和擴(kuò)增的元件，主要是以大數(shù)量在細(xì)菌細(xì)胞中。這樣的必要元件是具有培養(yǎng)基的情況下用于在細(xì)胞中維持的細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)，優(yōu)選地高數(shù)目的拷貝/細(xì)胞，和用于選擇生產(chǎn)者菌株的報(bào)告基因。合格的復(fù)制起點(diǎn)是pm1(der.)、cole1(der.)和f1、f1和puc，但是不限于它們。合格的報(bào)告基因是對(duì)抗生素具有抗性的基因，例如抗生素主要是氨芐青霉素、卡那霉素，但是不限于它們。

根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna包含用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效起作用的元件。

這樣的元件是具有對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的啟動(dòng)子：具有它們的調(diào)控元件的天然啟動(dòng)子(cam激酶ii、cmv、巢蛋白、l7、bdnf、nf、mbp、nse、p-球蛋白、gfap、gap43、酪氨酸羥化酶、紅藻氨酸受體的亞基1和谷氨酸受體的亞基b等)；或具有調(diào)控序列的合成啟動(dòng)子，以在轉(zhuǎn)錄水平下獲得靶基因的期望的表達(dá)模式(長(zhǎng)度的比值和表達(dá)水平)。

相對(duì)于啟動(dòng)子的可能的調(diào)控序列：

-增強(qiáng)子，以經(jīng)由提高rna聚合酶和dna之間的相互作用來(lái)增加表達(dá)水平，

-絕緣子，用于調(diào)制增強(qiáng)子的功能，

-沉默基因或其片段，以降低轉(zhuǎn)錄水平，例如，用于組織特異性表達(dá)，

-啟動(dòng)子上游的5’非編碼區(qū)，其包括內(nèi)含子。

根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna包含上面提及的調(diào)控序列中的至少一種，這取決于質(zhì)粒dna的變體，基于啟動(dòng)子的選擇和期望的靶基因表達(dá)的參數(shù)?；诂F(xiàn)有技術(shù)水平，和這樣的元件的已知的和顯而易見的變體及它們的用途，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna可以包含滿足上面提及的條件的任何組合，其中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行從質(zhì)粒dna合成α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3。當(dāng)沉默基因被使用時(shí)，或絕緣子作為設(shè)計(jì)的一部分，可能調(diào)控靶基因——描述的人α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3(實(shí)施方式)的基因——的表達(dá)。

其它調(diào)控序列：

-啟動(dòng)子下游的非編碼區(qū)，其包括內(nèi)含子，以增加mrna的穩(wěn)定性和靶基因的表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna進(jìn)一步包括這樣的調(diào)控元件。

根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna包含這樣的重要元件作為前導(dǎo)mrna序列，其就在起始密碼子atg之前包含kozak序列。

質(zhì)粒dna也包含對(duì)于克隆靶基因、對(duì)于靶基因在質(zhì)粒dna中的正確取向不同的位點(diǎn)(優(yōu)選地多個(gè)位點(diǎn))，以及用于其測(cè)序的引物退火的位點(diǎn)(優(yōu)選地多個(gè)位點(diǎn))。

質(zhì)粒dna也包含終止序列，其順序地包含終止密碼子、具有信號(hào)和聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非編碼區(qū)、終止密碼子，借助于其mrna保持穩(wěn)定，并且進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)終止和mrna從細(xì)胞核的輸出。終止序列是天然序列，即固有于靶基因，或其它更強(qiáng)大的序列，其例如由牛生長(zhǎng)激素(bgh)的終止序列代表，但是不限于此，并且在第二實(shí)施方式中，可以在3’非編碼區(qū)之前包含另外的終止密碼子?；诂F(xiàn)有技術(shù)水平，和這樣的元件的已知的和顯而易見的變體，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna可以包含滿足上面條件的任何終止序列，在其存在下，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中從質(zhì)粒dna進(jìn)行α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的合成。

質(zhì)粒dna也包含天然或異源分泌序列，其被密碼子優(yōu)化用于哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，其包含，例如，tpa(組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子同種型1前蛋白原[智人]，ncbi參考序列：np_000921.1)分泌序列，但不限于此。使用tpa分泌序列的優(yōu)勢(shì)是巨大的先前的臨床經(jīng)驗(yàn)，并且其高性能關(guān)于從多種靶基因表達(dá)分泌蛋白來(lái)證明。

質(zhì)粒dna也包含編碼人α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的片段，其被密碼子優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。

密碼子優(yōu)化被進(jìn)行以通過(guò)增加在核糖體上閱讀來(lái)自mrna的信息的效率來(lái)增加靶基因的表達(dá)。

質(zhì)粒dna可以另外地包括有助于該mrna穩(wěn)定的這些基因元件的cdna的初始，比如終止序列(3’非編碼區(qū)，其包含聚腺苷酸化的信號(hào)和位點(diǎn)，還包括轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)——終止密碼子)。因此，在該情況下，質(zhì)粒dna的框架中的類似元件不存在或者不起作用。

但是，用于遞送引起鎮(zhèn)痛的基因的質(zhì)粒dna例如通過(guò)增加mrna穩(wěn)定性組合dna疫苗的這樣的性質(zhì)——基于質(zhì)粒dna，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)感興趣的基因，和用于基因療法的載體的這樣的性質(zhì)，例如缺乏免疫原性和基因表達(dá)的持續(xù)。這樣的dna不整合入基因組并且不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。

用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的適合的載體由對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的表示并且在文獻(xiàn)中描述[hartikkaj,sawdeym,cornefert-jensenf,margalithm,barnhartk,nolascom,vahlsinghl,meekj,marquetm,hobartp,normanj,manthorpem.animprovedplasmiddnaexpressionvectorfordirectinjectionintoskeletalmuscle.humgenether.1996jun20；7(10):1205-17etc.]，以及質(zhì)粒，其可以由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員使用關(guān)于載體元件的指南進(jìn)行制造[“cloningvectors”,ed.pouwlsetal.,elsevier,amsterdam-newyork-oxford,1985,isbn0444904018,williamsja,carnesae,hodgsoncp.plasmiddnavaccinevectordesign:impactonefficacy,safetyandupstreamproduction.biotechnoladv.2009jul-aug；27(4):353-70.doi:10.1016/j.biotechadv.2009.02.003.epub2009feb20.reviewandothers]。用于人的優(yōu)選的質(zhì)粒dna是對(duì)人測(cè)試的載體，其包含上面描述的元件以及相應(yīng)的調(diào)控序列，其便于被修飾以匹配陳述的標(biāo)準(zhǔn)，其使得降低對(duì)于藥物注冊(cè)所要求的研究的數(shù)目。但是，包含要求的描述的元件的其它質(zhì)粒dna的使用是可能的。

在質(zhì)粒dna中描述的元件的序列對(duì)于該領(lǐng)域中的專家是可理解的。

質(zhì)粒dna的生產(chǎn)者基于細(xì)菌細(xì)胞給出(基于主要為大腸桿菌、鏈霉菌屬、桿菌屬、假單胞菌屬的細(xì)胞，但是不限于此)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，使用根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒dna和細(xì)菌細(xì)胞——例如商業(yè)的，但是不限于此，可能例如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法例如轉(zhuǎn)染、電穿孔或粒子槍制造質(zhì)粒dna的生產(chǎn)者。為了降低由于質(zhì)粒dna的甲基化造成的突變的可能性，優(yōu)選的是使用在基因組中不包含甲基化酶的微生物的菌株。

而且，鎮(zhèn)痛劑基于描述的質(zhì)粒dna以有效量給予，還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，用于哺乳動(dòng)物，特別地用于人。該藥物組合物是為了治療、緩解和/或預(yù)防疼痛，具體而言，急性或慢性疼痛、敏感性的紊亂。

本發(fā)明的作者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，確認(rèn)了實(shí)施描述的發(fā)明的組的可能性。獲得的結(jié)果由實(shí)施例(1-3)和圖1-3闡明。

附圖說(shuō)明

圖1.測(cè)試“加熱板”的結(jié)果。x軸是舔舐(lick)前腿和后腿的等待時(shí)間，縱軸是施用測(cè)試物質(zhì)之后的時(shí)間。圖例：1-陰性對(duì)照(注射鹽水)、2-pvax1seq3、3-pvr1012seq4、4-pvr1012seq5、5-pvax1seq6、6-pvr1012seq9、7-pvax1seq10、8-pvax1seq11、9-pvr1012seq12、10-pcdna3.1+seq11、11-pcdna3.1+(var)seq12、12–安乃近(50mg/kg)、13–鹽酸嗎啡(10mg/kg)、14–pvax1、15-pvr1012、16-pcdna3.1+、17-pcdna3.1+(var)。質(zhì)粒dna以5mg/kg的量注射。

圖2.測(cè)試“加熱板”中不同劑量的質(zhì)粒dnapvax1seq3的研究結(jié)果。x軸是舔舐前腿和后腿的等待時(shí)間，縱軸是施用測(cè)試物質(zhì)之后的時(shí)間。圖例：1-陰性對(duì)照(注射鹽水)、2-pvax1seq31mg/kg、3-pvax1seq35mg/kg、4-pvax1seq310mg/kg、6-安乃近(50mg/kg)、7–鹽酸嗎啡(10mg/kg)。

圖3.小鼠的血清中β-內(nèi)啡肽的濃度改變的研究結(jié)果。x軸是施用測(cè)試物質(zhì)之后的時(shí)間，縱軸是血清中β-內(nèi)啡肽的濃度。圖例：1-陰性對(duì)照(注射鹽水)、2-pvr1012、3-pvr1012seq4。質(zhì)粒dna以5mg/kg的量注射。

實(shí)施例1.獲得編碼α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna

1.1.進(jìn)行dna的化學(xué)合成，所述dna如下表征：seqidno:3-seqidno:6和seqidno:9-seqidno:12，任選地側(cè)接限制位點(diǎn)，加入kozak序列。對(duì)于seqidno:3和seqidno:10限制位點(diǎn)，使用nhei(5’)、bamhi(3’)，對(duì)于seqidno:4和seqidno:9限制位點(diǎn)，使用sali(5’)、kpni(3’)，對(duì)于seqidno:5和seqidno:12限制位點(diǎn)，使用sali(5’)、bamhi(3’)，對(duì)于seqidno:6和seqidno:11限制位點(diǎn)，使用nhei(5’)、apai(3’)。

1.2.進(jìn)行將合成的基因克隆入pvax1質(zhì)粒(invitrogen)和pvr1012(vical)。也在載體pcdna3.1+(invitrogen)中在限制位點(diǎn)nhei(5’)、apai(3’)處進(jìn)行序列seqidno:11的克隆。而且，不能夠表達(dá)新霉素的載體pcdna3.1+被接受，這是由于在sv40啟動(dòng)子(-71bp)的區(qū)域中該載體具有nsii限制酶(restrictase)的限制。seqidno:12在限制位點(diǎn)nhei(5’)、apai(3’)處克隆在得到的載體中。

1.3.對(duì)于連接反應(yīng)，3μl的合成的dna溶液、1μl的制備的載體溶液、5μl的連接緩沖液×2和1μl的t4-連接酶被采用。反應(yīng)在+20℃下進(jìn)行2小時(shí)。

其后，混合物在+95℃下被加熱10min，并且使用具有0.025μm孔徑的硝化纖維素濾器(millipore,usa)通過(guò)透析從鹽中純化。透析針對(duì)包含10％甘油中的0.5mmedta的溶液進(jìn)行，持續(xù)10min。

獲得下列質(zhì)粒dna：pvax1seq3、pvr1012seq4、pvr1012seq5、pvax1seq6、pvr1012seq9、pvax1seq10、pvax1seq11、pvr1012seq12、pcdna3.1+seq11、pcdna3.1+(var)seq12。

1.4.然后，大腸桿菌菌株dh10b/r(f-mcra,δ(mrr-hsdrms-mcrbc)、15,δlacx74,deor,reca1,enda1,arad139,δ(ara,leu)769,galu,galkλ-,rpsl,nupg)的細(xì)胞通過(guò)使用電穿孔器micropulser(biorad)的電穿孔方法轉(zhuǎn)化有獲得的質(zhì)粒dna。該菌株不包含甲基化酶，其有助于最小化在dna——包括在該菌株中維持的克隆入質(zhì)粒的基因——中發(fā)生突變的可能性。1μl的透析的連接酶混合物被加入到12μl的感受態(tài)細(xì)胞并且被放置在poration單元的電極之間，并且用電流脈沖處理。

在轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞放置在1ml的soc培養(yǎng)基(2％細(xì)菌用胰蛋白胨(bacto-tripton)、0.5％酵母提取物、10mmnacl、2.5mmkcl、10mmmgcl2、10mmmgso4、20mm葡萄糖)中并且在+37℃下培育40min。

1.5.在包含lb-瓊脂、50μg/ml的卡那霉素或氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基(對(duì)于基于pcdna3.1+的質(zhì)粒dna)上進(jìn)行包含質(zhì)粒dna的大腸桿菌細(xì)胞的克隆的鑒定。

質(zhì)粒dna從生長(zhǎng)的克隆分離。質(zhì)粒dna的分離使用wizardminiprepsdna純化系統(tǒng)(promega,usa)進(jìn)行。純化的重組質(zhì)粒dna通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。

1.6.通過(guò)sanger的方法使用一組appliedbiosystems終止子(bdt)v3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(appliedbiosystems,usa)根據(jù)所附說(shuō)明書進(jìn)行克隆片段的測(cè)序。為了標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物，使用熒光染料標(biāo)記的ddntp，每種ddntp對(duì)應(yīng)于染料。為了測(cè)序，使用未標(biāo)記的質(zhì)粒特異性引物。進(jìn)行pcr反應(yīng)，然后使用試劑盒bigdyex-終止子純化試劑盒(appliedbiosystems,usa)中的說(shuō)明書從游離的標(biāo)記的ddntp純化反應(yīng)混合物，并且測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物使用毛細(xì)管測(cè)序儀appliedbiosystems3500/3500xl基因分析儀(appliedbiosystems,usa)和試劑3500/3500xl基因分析儀聚合物“pop-6^tm”(appliedbiosystems,usa)進(jìn)行分離。

測(cè)序的反應(yīng)產(chǎn)物的分離結(jié)果通過(guò)利用激光掃描和檢測(cè)包含在所有類型的ddntp中的四種熒光染料來(lái)記錄。

1.7.dna序列的計(jì)算機(jī)分析使用個(gè)人計(jì)算機(jī)利用程序chromas和bioedit進(jìn)行。調(diào)查的dna片段的核苷酸序列與所設(shè)計(jì)的進(jìn)行比對(duì)，合成的片段與計(jì)算的片段的同一性被證明。結(jié)果，選擇大腸桿菌細(xì)胞的克隆，其包含質(zhì)粒中的靶基因的全序列——編碼α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的dna序列。

實(shí)施例2.生產(chǎn)編碼α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna，以對(duì)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物進(jìn)行研究。

將在培養(yǎng)皿中加入卡那霉素(或氨芐青霉素)的lb-瓊脂上生長(zhǎng)的大腸桿菌的集落放置在10ml的選擇培養(yǎng)基中。細(xì)胞在恒定攪拌(250rpm)下在+37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。所得到的細(xì)胞通過(guò)在4000g下離心收集。質(zhì)粒dna的進(jìn)一步分離和純化使用endofree質(zhì)粒大型試劑盒(qiagen)進(jìn)行，其允許獲得無(wú)熱原dna。分離的質(zhì)粒dna利用在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳進(jìn)行分析，其濃度使用熒光測(cè)定法測(cè)量。

作為對(duì)照溶液，使用不加入測(cè)試制品的水。1,950ml的水和0.05ml的測(cè)試溶液(濃度1mg/ml)被加入到小室(cell)，用于測(cè)量混合的2ml體積的光學(xué)密度，并且該光學(xué)密度在260nm的波長(zhǎng)下測(cè)量。dna濃度的測(cè)定根據(jù)下式進(jìn)行：

c(μg/ml)＝40а260к，

其中а260-在260nm的波長(zhǎng)下測(cè)量的制品的光學(xué)密度；k(μg/ml)-對(duì)于dna50μg/ml(在水中的50μg/ml雙鏈dna)；40-測(cè)試制品的稀釋度。

最后，確定利用3.4mg/ml的濃度獲得質(zhì)粒dnapvax1seq3，pvr1012seq4–3.7mg/ml、pvr1012seq5–4mg/ml、pvax1seq6–3,8mg/ml、pvr1012seq9–4,1mg/ml、pvax1seq10–4mg/ml、pvax1seq11–4.3mg/ml、pvr1012seq12–4.5mg/ml、pcdna3.1+seq11–4.4mg/ml、pcdna3.1+(var)seq12-4.3mg/ml。從1l培養(yǎng)基，質(zhì)粒dna的產(chǎn)量范圍為3.4mg到4.5mg。

獲得的質(zhì)粒dna制品的純度通過(guò)在260nm的波長(zhǎng)下測(cè)量的制品的光學(xué)密度與在280nm的波長(zhǎng)下測(cè)量的制品的光學(xué)密度的比值(а260/а280)和在260nm的波長(zhǎng)下測(cè)量的制品的光學(xué)密度與在230nm的波長(zhǎng)下測(cè)量的制品的光學(xué)密度的比值(а260/а230)來(lái)判斷。測(cè)量在水溶液中進(jìn)行，不加入測(cè)試制品的水被用作參比溶液。

對(duì)于dna的純制品，а260/а280＞1.80和а260/а230＞1.80是特征性的。對(duì)于接受的所有質(zhì)粒dna的制品，在實(shí)驗(yàn)中限定的值對(duì)應(yīng)于純制品的關(guān)系а260/а28和а260/а230的值。

蛋白質(zhì)雜質(zhì)的定量測(cè)定使用microbca測(cè)定[smith,p.k.,etall,measurementofproteinusingbicinchoninicacid.analyt.biochem.150,76-85(1985)]在獲得的質(zhì)粒dna制品pvax1seq3、pvr1012seq4、pvr1012seq5、pvax1seq6、pvr1012seq9、pvax1seq10、pvax1seq11、pvr1012seq12、pcdna3.1+seq11、pcdna3.1+(var)seq12中進(jìn)行，測(cè)量具有銅和二喹啉甲酸的所獲得的著色蛋白質(zhì)復(fù)合物在562nm的波長(zhǎng)下的光學(xué)密度。方法microbca測(cè)定的靈敏度為0.5-20μg/ml蛋白質(zhì)。在質(zhì)粒dna的任何研究制品中的總蛋白質(zhì)的濃度不超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)(0.5至12μg/mg的質(zhì)粒dna)。

使用凝膠-血栓版本的lal測(cè)試——其具有>0,25eu/ml的靈敏度(toxinsensor,genscript,usa)，也在質(zhì)粒dna的制品中測(cè)定細(xì)菌脂多糖類的含量。鱟——美洲鱟——阿米巴狀細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物充當(dāng)lal-試劑。lal-試劑特異性地與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)，酶促反應(yīng)的結(jié)果是在反應(yīng)混合物中存在改變，這與內(nèi)毒素的濃度成比例。通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)管，該結(jié)果根據(jù)在管的底部存在或不存在密集血栓來(lái)評(píng)價(jià)。凝膠-血栓在稀釋的樣品的研究期間不形成，對(duì)于質(zhì)粒dna制品pvax1seq3、pvr1012seq4、pvr1012seq5、pcdna3.1+(var)seq12，稀釋10倍，對(duì)于質(zhì)粒dna制品pvax1seq6、pvr1012seq9、pvax1seq10、pvax1seq11、pvr1012seq12、pcdna3.1+seq11，稀釋5倍，即，分別在2.5eu/ml和1.25eu/ml的方法靈敏度下，考慮到樣品中質(zhì)粒dna的濃度，其確認(rèn)了從內(nèi)毒素純化的有效指示。

實(shí)施例3.測(cè)定編碼α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna的鎮(zhèn)痛作用

3.1.測(cè)試“加熱板”

使用測(cè)試“加熱板”(熱板)，進(jìn)行編碼α防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna的鎮(zhèn)痛活性的研究。

進(jìn)行測(cè)試“加熱板”(熱板)以測(cè)量急性疼痛敏感度的閾值和研究的質(zhì)粒dna制品的潛在鎮(zhèn)痛作用[valdmana.v.,ignatov,yu.d.centralmechanismsofpain.—l.:nauka.—1976]。該測(cè)試對(duì)于鎮(zhèn)痛活性的研究是重要的，其被用于鑒定有鎮(zhèn)痛活性的化合物。

當(dāng)被放置在熱表面上時(shí)，在動(dòng)物達(dá)到疼痛敏感度的閾值時(shí)，觀察到焦慮的運(yùn)動(dòng)應(yīng)答：爪子的彈開、爪子的舔舐和跳躍。在該測(cè)試中，考慮從將動(dòng)物放置在熱表面上至第一次舔舐爪子的等待時(shí)間。該方法使得能夠測(cè)定參數(shù)：測(cè)試目標(biāo)的鎮(zhèn)痛活性、鎮(zhèn)痛的峰值時(shí)間、鎮(zhèn)痛的持續(xù)時(shí)間。

在研究中使用balb/c系的小鼠，雌性，重15-22克，18周齡。在研究中形成包括對(duì)照組的17組動(dòng)物，每個(gè)組由3只小鼠組成：

1-陰性對(duì)照(注射鹽水)

2-pvax1seq3

3-pvr1012seq4

4-pvr1012seq5

5-pvax1seq6

6-pvr1012seq9

7-pvax1seq10

8-pvax1seq11

9-pvr1012seq12

10-pcdna3.1+seq11,

11-pcdna3.1+(var)seq12

12-安乃近(50mg/kg)

13-鹽酸嗎啡(10mg/kg)

14–pvax1

15-pvr1012

16-pcdna3.1+

17-pcdna3.1+(var)

注射5mg/kg的質(zhì)粒dna。

使用器械加熱板-計(jì)量?jī)x(hotplateanalgesiameter,columbusinstruments,usa)。

在研究之前，給予測(cè)試系統(tǒng)10分鐘以適應(yīng)在室內(nèi)研究進(jìn)行。動(dòng)物僅使用一次，這是因?yàn)榈诙伟仓脛?dòng)物在恒溫板上誘導(dǎo)對(duì)表面接觸的即時(shí)反應(yīng)。恒溫器溫度設(shè)置為55℃。在注射測(cè)試物質(zhì)之后，將動(dòng)物輕輕地放置在加熱的板上，并且同時(shí)按下控制面板上的“啟動(dòng)”按鈕。記錄舔舐前腿和后腿的等待時(shí)間(從將動(dòng)物放置在設(shè)備的表面上到第一次舔舐之前)。在那之后，按下“停止”按鈕，并且將動(dòng)物從熱表面移走。忽略其它行為響應(yīng)。為了降低爪墊的熱損傷的可能性，實(shí)驗(yàn)的最大時(shí)間不超過(guò)60秒。為了測(cè)定制品的鎮(zhèn)痛作用的峰值時(shí)間，在對(duì)照組(鹽水)(時(shí)間0)中，和在測(cè)試組中制品施用后2h、12h、24h測(cè)量舔舐前爪和后爪的等待時(shí)間。器械的表面使用被消毒劑(70％乙醇中0.5％洗必泰-雙葡萄糖酸鹽)弄濕的布擦拭，然后在其上安置下一個(gè)動(dòng)物[methodicalrecommendationsforthestudents.thepharmaceuticalfacultyofgouvpommaim.i.m.sechenovoftherussianministryofhealth.—moscow.—2006]。

進(jìn)行制品的鎮(zhèn)痛活性測(cè)定數(shù)據(jù)的分析。對(duì)于已經(jīng)顯示了最佳結(jié)果的質(zhì)粒dna，測(cè)定ed50，即證明達(dá)到制品的50％鎮(zhèn)痛活性需要的劑量。

實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖1中示出。所有分析的編碼防御素hnp-1或hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna的制品展現(xiàn)了顯著的鎮(zhèn)痛作用，在效力上不比嗎啡差并且超過(guò)了安乃近的鎮(zhèn)痛活性。在注射質(zhì)粒之后2h內(nèi)觀察到小程度的鎮(zhèn)痛，然后鎮(zhèn)痛得到加強(qiáng)，并且在12和24h內(nèi)觀察到相同高水平的鎮(zhèn)痛，這表明作用的維持。

在應(yīng)用多種劑量的質(zhì)粒dna(pvax1seq3)——其在先前的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)顯示了最佳結(jié)果——的實(shí)驗(yàn)中，證明了在1到10mg/kg范圍內(nèi)鎮(zhèn)痛的劑量依賴性性質(zhì)(圖2)。其中在12小時(shí)之后，指標(biāo)——當(dāng)使用1mg/kg的最低濃度的質(zhì)粒dnapvax1seq3時(shí)——幾乎與使用10mg/kg的鹽酸嗎啡組中的那些相同。在24h之后，最低濃度的質(zhì)粒dna的組中的指標(biāo)超過(guò)了使用10mg/kg鹽酸嗎啡組中的指標(biāo)，幾乎是其2倍。在施用鎮(zhèn)痛劑之后，僅在2h后才觀察到安乃近的作用，12h和24h后的響應(yīng)與對(duì)照組中的響應(yīng)類似。當(dāng)使用5mg/kg和10mg/kg的濃度的質(zhì)粒dnapvax1seq3時(shí)，與使用最低濃度的質(zhì)粒dna的組相比，觀察到等待時(shí)期的顯著增加(多達(dá)15％)，其中這兩個(gè)組之間的差別是小的。

3.2.小鼠血清中β-內(nèi)啡肽濃度的研究。

由于血漿中β-內(nèi)啡肽的濃度改變可以充當(dāng)用于評(píng)估鎮(zhèn)痛效力的標(biāo)準(zhǔn)[beta-endorphinisamarkeroftheeffectivenessofanalgesiaforacutepainandchronicpainsyndromeincancerpatients/z.v.pavlova[andothers]//problemsofclinicalmedicine.—2007.—n1.—s.36-40.—issn1817-8359]，因此使用用于β-內(nèi)啡肽(bep)小家鼠(小鼠)cea806mu的試劑盒elisakit(lifescienceinc.)，進(jìn)行注射質(zhì)粒dna后小鼠血清中β-內(nèi)啡肽濃度的研究，同時(shí)引入編碼hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna(pvr1012seq4)作為實(shí)例。

研究的結(jié)果在圖3中示出?？梢娨胭|(zhì)粒dnapvr1012seq4，β-內(nèi)啡肽的水平顯著地增加，盡管事實(shí)：引入該質(zhì)粒dna之后不插入靶基因，并且在對(duì)照組中貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有觀察到β-內(nèi)啡肽水平的顯著增加。

因而，證明了創(chuàng)建編碼hnp-1或hnp-2或hnp-3的質(zhì)粒dna的不同變體的可能性、借助于細(xì)菌生產(chǎn)者獲得它們、和這樣的質(zhì)粒dna的鎮(zhèn)痛作用——在匹配規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的任何變體中，甚至在1mg/kg的最低濃度下(比鹽酸嗎啡低10倍)，并且也證明了使用這樣的質(zhì)粒的安全性：動(dòng)物存活，沒(méi)有觀察到副作用。

序列表

<110>i·v·杜克浩林夫，a·i·奧爾洛夫

<120>編碼hnp-1或hnp-2或hnp-3的dna質(zhì)粒、細(xì)菌生產(chǎn)者、鎮(zhèn)痛劑(變體)

<130>

<150>ru2014145169

<151>2014-11-10

<160>12

<210>1

<211>94

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>中性粒細(xì)胞防御素1前蛋白原

<400>1

metargthrleualaileleualaalaileleuleuvalalaleugln

151015

alaglnalagluproleuglnalaargalaaspgluvalalaalaala

202530

progluglnilealaalaaspileprogluvalvalvalserleuala

354045

trpaspgluserleualaprolyshisproglyserarglysasnmet

505560

alacystyrcysargileproalacysilealaglygluargargtyr

65707580

glythrcysiletyrglnglyargleutrpalaphecyscys

8590

<210>2

<211>94

<212>prt

<213>智人

<220>

<223>中性粒細(xì)胞防御素3前蛋白原

<400>2

metargthrleualaileleualaalaileleuleuvalalaleugln

151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

glythrcysiletyrglnglyargleutrpalaphecyscys

8590

<210>3

<211>417

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素1前蛋白原的dna[智人]被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，天然終止序列

<400>3

atgagaaccctggccatcctggccgccatcctgctggtggccctgcaggcccaggccgag60

cccctgcaggccagagccgacgaggtggccgccgcccccgagcagatcgccgccgacatc120

cccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaagcaccccggcagc180

agaaagaacatggcctgctactgcagaatccccgcctgcatcgccggcgagagaagatac240

ggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgagcttgcagaaaaaga300

aaaatgagctcaaaatttgctttgagagctacagggaattgctattactcctgtaccttc360

tgctcaatttcctttcctcatcccaaataaatgccttgaaaaaaaaaaaaaaaatga417

<210>4

<211>417

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素3前蛋白原的dna[智人]被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，天然終止序列

<400>4

atgagaaccctggccatcctggccgccatcctgctggtggccctgcaggcccaggccgag60

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cccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaagcaccccggcagc180

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tgctcaatttcctttcctcatctcaaataaatgccttgttacaaaaaaaaaaaatga417

<210>5

<211>288

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素1前蛋白原的dna[智人]被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，終止密碼子

<400>5

atgagaaccctggccatcctggccgccatcctgctggtggccctgcaggcccaggccgag60

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cccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaagcaccccggcagc180

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ggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgataa288

<210>6

<211>288

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素3前蛋白原的dna[智人]被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，終止密碼子

<400>6

atgagaaccctggccatcctggccgccatcctgctggtggccctgcaggcccaggccgag60

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cccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaagcaccccggcagc180

agaaagaacatggactgctactgcagaatccccgcctgcatcgccggcgagagaagatac240

ggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgataa288

<210>7

<211>98

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>中性粒細(xì)胞防御素1蛋白原[智人]，其具有tpa信號(hào)序列

<400>7

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserprosergluproleuglnalaargalaaspglu

202530

valalaalaalaprogluglnilealaalaaspileprogluvalval

354045

valserleualatrpaspgluserleualaprolyshisproglyser

505560

arglysasnmetalacystyrcysargileproalacysilealagly

65707580

gluargargtyrglythrcysiletyrglnglyargleutrpalaphe

859095

cyscys

<210>8

<211>98

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>中性粒細(xì)胞防御素3蛋白原[智人]，其具有tpa信號(hào)序列

<400>8

metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly

151015

alavalphevalserprosergluproleuglnalaargalaaspglu

202530

valalaalaalaprogluglnilealaalaaspileprogluvalval

354045

valserleualatrpaspgluserleualaprolyshisproglyser

505560

arglysasnmetaspcystyrcysargileproalacysilealagly

65707580

gluargargtyrglythrcysiletyrglnglyargleutrpalaphe

859095

cyscys

<210>9

<211>429

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素1蛋白原的dna[智人]，其具有tpa信號(hào)序列，被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，天然終止序列

<400>9

atggacgccatgaagagaggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagcgagcccctgcaggccagagccgacgaggtggccgccgcccccgagcagatc120

gccgccgacatccccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaag180

caccccggcagcagaaagaacatggcctgctactgcagaatccccgcctgcatcgccggc240

gagagaagatacggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgagct300

tgcagaaaaagaaaaatgagctcaaaatttgctttgagagctacagggaattgctattac360

tcctgtaccttctgctcaatttcctttcctcatcccaaataaatgccttgaaaaaaaaaa420

aaaaaatga429

<210>10

<211>429

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素3蛋白原的dna[智人]，其具有tpa信號(hào)序列，被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，天然終止序列

<400>10

atggacgccatgaagagaggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagcgagcccctgcaggccagagccgacgaggtggccgccgcccccgagcagatc120

gccgccgacatccccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaag180

caccccggcagcagaaagaacatggactgctactgcagaatccccgcctgcatcgccggc240

gagagaagatacggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgagct300

tgcagaaaaagaaaaatgagctcaaaatttgctttgagagctacagggaattgctattac360

tcctgtaccttctgctcaatttcctttcctcatctcaaataaatgccttgttacaaaaaa420

aaaaaatga429

<210>11

<211>300

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素1蛋白原的dna[智人]，其具有tpa信號(hào)序列，被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，終止密碼子

<400>11

atggacgccatgaagagaggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagcgagcccctgcaggccagagccgacgaggtggccgccgcccccgagcagatc120

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caccccggcagcagaaagaacatggcctgctactgcagaatccccgcctgcatcgccggc240

gagagaagatacggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgataa300

<210>12

<211>300

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼中性粒細(xì)胞防御素3蛋白原的dna[智人]，其具有tpa信號(hào)序列，被優(yōu)化在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的密碼子，終止密碼子

<400>12

atggacgccatgaagagaggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagcgagcccctgcaggccagagccgacgaggtggccgccgcccccgagcagatc120

gccgccgacatccccgaggtggtggtgagcctggcctgggacgagagcctggcccccaag180

caccccggcagcagaaagaacatggactgctactgcagaatccccgcctgcatcgccggc240

gagagaagatacggcacctgcatctaccagggcagactgtgggccttctgctgctgataa300

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