發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于增殖丙肝病毒(hcv)的系統(tǒng)和方法以及其用途。

發(fā)明背景

hcv為黃病毒科(flaviviridae)的包膜正鏈rna病毒。它含有9.6kb基因組，其始于非翻譯區(qū)(5’-utr)，接著是編碼結(jié)構(gòu)蛋白(核心、e1和e2)和包括p7、ns2、ns3、ns4和ns5在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)(ns)蛋白的序列(關(guān)于綜述，參見參考文獻(xiàn)^1，2)。與乙肝病毒(hbv)的感染不一樣，hcv感染為具有肝內(nèi)表現(xiàn)和肝外表現(xiàn)兩者的多層面疾病³，并且hcv可駐留在非肝細(xì)胞^4-6，其可在病毒持續(xù)性和再活化中起一定作用。然而，研究hcv的肝外復(fù)制的體外系統(tǒng)嚴(yán)重有限。就原代細(xì)胞而言，僅在人和黑猩猩肝細(xì)胞中證明血清攜帶的hcv(hcvser)的直接感染，人和黑猩猩肝細(xì)胞難以在培養(yǎng)物中維持，并且還具有在細(xì)胞特性上顯著的供體間的變化。此外，大多數(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)方法利用分子克隆，而不是天然病毒(關(guān)于綜述，參見參考文獻(xiàn)⁷)。這些模型還在非原代細(xì)胞中生長病毒，包括最近經(jīng)報(bào)道支持臨床hcv分離株的感染的hlz01肝癌細(xì)胞系⁸。因此，這些數(shù)據(jù)可外推至實(shí)際臨床病毒-宿主相互作用的程度仍是一個(gè)擔(dān)憂。

因此，仍需要增殖血清攜帶的丙肝病毒(hcv)的備選系統(tǒng)和方法。

發(fā)明概述

提供本概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述，從而簡要地指出本發(fā)明的性質(zhì)和實(shí)質(zhì)。在理解其不用于解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義的情況下提出該概述。

在一方面，本公開內(nèi)容提供用于增殖丙肝病毒(hcv)的基于人脂肪衍生的干細(xì)胞(hadsc)的系統(tǒng)，其包括hadsc、適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基和hcv。在一些實(shí)施方案中，hadsc為原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞，優(yōu)選第1-15代細(xì)胞，更優(yōu)選第1-6代細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，hadsc對(duì)特異性標(biāo)記物dlk-1(即pref-1)呈陽性。在一些實(shí)施方案中，hcv來源于感染hcv的個(gè)體的血液、血清、血漿或體液，或?yàn)榕R床hcv分離株。在一些實(shí)施方案中，hcv具有選自以下的基因型：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何組合，優(yōu)選基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)支持hcv的完全復(fù)制，包括感染病毒的產(chǎn)生。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供用于增殖丙肝病毒(hcv)的方法，其包括在適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基中在適于hcv復(fù)制的條件下使用hadsc增殖hcv。在一些實(shí)施方案中，hadsc為原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞，優(yōu)選第1-15代細(xì)胞，更優(yōu)選第1-6代細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，hadsc對(duì)特異性標(biāo)記物dlk-1(即pref-1)呈陽性。在一些實(shí)施方案中，hcv來源于感染hcv的個(gè)體的血液、血清、血漿或體液，或?yàn)榕R床hcv分離株。在一些實(shí)施方案中，hcv具有選自以下的基因型：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何組合，優(yōu)選基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。在一些實(shí)施方案中，所述方法支持hcv的完全復(fù)制。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供hadsc用于增殖hcv或進(jìn)行hcv生命周期分析或診斷hcv感染或篩選抗病毒化合物或表征感染hcv的受試者的這種hcv的用途。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供hadsc在制備用于診斷hcv感染或增殖hcv或進(jìn)行hcv生命周期分析或篩選抗病毒化合物或表征感染hcv的受試者的這種hcv的試劑盒中的用途。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供用于診斷受試者中的hcv感染的方法，其包括以下步驟：

a)提供hadsc，

b)在適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基中使hadsc與獲自受試者的生物樣品一起孵育，

c)培養(yǎng)所述hadsc達(dá)足以允許hcv復(fù)制的時(shí)間，和

d)檢測(cè)hcv復(fù)制的水平，

其中檢測(cè)到hcv復(fù)制表明所述受試者感染hcv。

在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品來源于血液、血清、血漿或體液。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供用于篩選抗hcv化合物的方法，其包括以下步驟：

a)使hadsc在第一容器的培養(yǎng)基中與hcv在不存在候選化合物的情況下接觸；

b)確定在不存在候選化合物的情況下在第一容器的培養(yǎng)基中hcv的水平；

c)使hadsc在第二容器的培養(yǎng)基中與hcv在存在候選化合物的情況下接觸；

d)確定在存在候選化合物的情況下在第二容器的培養(yǎng)基中hcv的水平；

e)比較在存在候選化合物的情況下的hcv水平與在不存在候選化合物的情況下的hcv水平；和

f)當(dāng)在存在候選化合物的情況下的hcv水平低于在不存在候選化合物的情況下的hcv水平時(shí)將該候選化合物鑒定為抗hcv化合物。

在一些實(shí)施方案中，hcv水平通過測(cè)量hcv滴度、hcv核酸水平或hcv多肽水平而確定。

在一些實(shí)施方案中，候選化合物為選自以下的至少一種：化合物、蛋白、肽、肽模擬物、抗體、核酸、反義核酸、shrna、核酶和小分子化合物。

在一些實(shí)施方案中，hcv為選自以下的hcv基因型中的至少一種：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何組合，優(yōu)選基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b。

其它方面描述于下文。

附圖簡述

當(dāng)結(jié)合通過舉例而非限制的方式所包含的附圖閱讀時(shí)能更好地理解前述概述和下列詳述。

圖1：hcv在體內(nèi)靶定人脂肪衍生的dlk-1⁺干細(xì)胞。(a)3名hcv(+)個(gè)體的脂肪組織(表1)收獲自手術(shù)傷口并且將rna提取出用于hcv特異性5’-utr(223bp)的rt-pcr。也對(duì)收獲自3名hcv(-)個(gè)體的脂肪組織進(jìn)行平行研究用于比較，hcv(+)血清用作陽性對(duì)照。(b)將hcv(+)個(gè)體的脂肪組織切碎、勻漿并離心成漂浮物、緩沖液和細(xì)胞沉淀的層。將細(xì)胞沉淀的紅細(xì)胞進(jìn)一步裂解以收獲svf。將rna從各細(xì)胞群中提取出并進(jìn)行5’-utr的rt-pcr。在svf細(xì)胞中而未在漂浮物中檢測(cè)到病毒轉(zhuǎn)錄物(左圖)。svf細(xì)胞進(jìn)一步免疫分離成dlk-1^-和dlk-1⁺細(xì)胞，并將rna單獨(dú)提取出用于rt-pcr。病毒轉(zhuǎn)錄物存在于dlk-1⁺細(xì)胞中，而不存在于dlk-1^-細(xì)胞(右圖)。數(shù)據(jù)代表利用來自3名hcv(+)供體的細(xì)胞的3個(gè)實(shí)驗(yàn)。(c)將分離自3名hcv感染個(gè)體的dlk-1^-和dlk-1⁺細(xì)胞的rna提取出用于hcv負(fù)鏈rna的rt-pcr。分離自hcv(+)個(gè)體的原代人干細(xì)胞(phh)用作陽性對(duì)照。(d)將分離自hcv(-)和hcv(+)個(gè)體的dlk-1^-(圖b和e)和dlk-1⁺細(xì)胞(圖c和f)離心到細(xì)胞離心涂片器載玻片(cytospinslide)上用于病毒ns5的免疫細(xì)胞化學(xué)(c中的棕色標(biāo)記)和蘇木精染色(核中的藍(lán)色標(biāo)記)。用小鼠igg1對(duì)照抗體染色未分級(jí)分離的svf細(xì)胞(圖a和d)用作陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)代表來自3名hcv(+)和3名hcv(-)供體的樣品。(e)將來自hcv(+)或hcv(-)個(gè)體的脂肪組織在同一切片上針對(duì)dlk-1(紅色標(biāo)記，在圖b、c和h中的箭頭)和針對(duì)病毒ns5(棕色標(biāo)記，在圖e和f中的箭頭)和蘇木精(藍(lán)色標(biāo)記，圖d-f和i-j)進(jìn)行序貫染色。在hcv(+)脂肪組織中dlk-1⁺細(xì)胞(紅色標(biāo)記，箭頭，圖b和c)共表達(dá)ns5ag(棕色標(biāo)記，箭頭，圖e和f)。在hcv(-)脂肪組織中dlk-1⁺細(xì)胞(圖h，箭頭)并不表達(dá)ns5(圖j，箭頭；h對(duì)比j)。用兔igg(圖a和g)或小鼠igg1(圖d和i)進(jìn)行的染色用作陰性對(duì)照。圖b，e和c，f來自不同的供體。數(shù)據(jù)代表3名hcv(+)和3名hcv(-)供體。(f)分離自4名hcv(+)個(gè)體脂肪組織的dlk-1⁺細(xì)胞離體培養(yǎng)49天，并每7天將上清液收集用于5’-utr的qrt-pcr。數(shù)據(jù)表示為各時(shí)間點(diǎn)的一式三份的平均值±sd。

圖2：幼稚dlk-1⁺hadsc在體外允許血清攜帶的hcv感染。(a)原代人肝細(xì)胞(phh)分離自hcv(-)供體，并置于皿中達(dá)3天，然后用hcvser(泳道“+”，左圖)或hcv(-)對(duì)照血清(泳道“-“，左邊)脈沖。在3h脈沖后，將phh培養(yǎng)額外5天，并將rna提取出用于5’-utr的rt-pcr(左圖)。平行地將分離自hcv(-)供體的p-3或p-4dlk-1⁺hadsc通過hcvser以0.2moi懸浮脈沖，每7天更換培養(yǎng)基。在所示時(shí)間點(diǎn)，將上清液和細(xì)胞分開收獲并將rna提取出用于5’-utr的rt-pcr。數(shù)據(jù)代表10個(gè)實(shí)驗(yàn)。也將hcv(+）血清的rna提取出用于rt-pcr作為對(duì)照。(b)收集d14和d28hcvser-1b感染的hadsc的上清液和細(xì)胞，并提取rna用于hcv-特異性負(fù)鏈rna的rt-pcr。數(shù)據(jù)代表4個(gè)實(shí)驗(yàn)。*：第0天培養(yǎng)上清液在用hcvser感染后的洗滌后1h收獲。(c)將hcvser-1b或hcv(-)對(duì)照血清脈沖的d14hadsc離心到細(xì)胞離心涂片器載玻片上用于在同一切片上的兔抗人dlk-1抗體(紅色標(biāo)記，圖b和f)，接著小鼠抗ns5抗體(圖d和h；在d中的棕色標(biāo)記)和蘇木精(藍(lán)色標(biāo)記，c，d，g和h)的三重染色。hcvser感染的dlk-1⁺hadsc包含ns5a(圖b對(duì)比d)，而hcv(-)對(duì)照血清脈沖的細(xì)胞表達(dá)dlk-1而無ns5(圖f對(duì)比h)。兔igg和小鼠igg1的染色用作陰性對(duì)照(分別為圖a和e以及c和g)。結(jié)果代表4個(gè)實(shí)驗(yàn)。(d)d14(圖b和c)和d21(圖e和f)hcvser-1b感染的hadsc的透射電子顯微照片。暴露于hcv(-)對(duì)照血清的d14和d21細(xì)胞顯示于圖a和d。圖b-f中的插圖為黃色正方形或黃色箭頭的放大圖。圖b、c、e和f的插圖中的白色箭頭指示病毒顆粒，圖d的插圖中的白色箭頭指示未感染hadsc的洋蔥形膜結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)代表來自hcvser-1b感染的2個(gè)實(shí)驗(yàn)和來自hcvser-2a感染的1個(gè)實(shí)驗(yàn)。(e)每7天收集的hcvser-1b感染的hadsc的細(xì)胞裂解物(左圖)和上清液(右圖)中的病毒5’-utr的qrt-pcr。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。(f)在連續(xù)培養(yǎng)1-4周的hcvser-1b感染hadsc的上清液中定量病毒5’-utr拷貝數(shù)(通過qrt-pcr)。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。

圖3：hcvser感染對(duì)細(xì)胞為非供體特異性的且對(duì)于病毒為跨越基因型的，并且通過除mir-122外的各種宿主因子介導(dǎo)。(a)將“供體1”的p-2hadsc用hcvser-1b感染，并將21天的上清液(標(biāo)記為“hcvadsc(1)”)過濾通過0.22-μm孔濾器和用于感染“供體2”的p-3hadsc，其21天的上清液(標(biāo)記為“hcvadsc(2))用于感染“供體3”的p-6hadsc。21天的上清液的病毒拷貝數(shù)通過qrt-pcr定量。數(shù)據(jù)表示為各批次的感染hadsc的一式三份的平均值±sd。(b)p2、p6、p9和p15的hadsc由hcvser-1b感染，并將21天的上清液(左)和細(xì)胞裂解物(右)中的病毒轉(zhuǎn)錄物通過qrt-pcr確定。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。(c)p0、p2、p6、p9和p15hadsc的dlk-1表達(dá)的rt-pcr。所有批次的細(xì)胞來自同一供體。n：作為陰性對(duì)照的無反轉(zhuǎn)錄酶。數(shù)據(jù)代表利用來自3個(gè)不同供體的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。(d)p5的hadsc用混合的基因型2a+2b的hcvser感染并連續(xù)培養(yǎng)。在d21和d56天，將細(xì)胞收集用于rt-pcr以檢測(cè)編碼基因型特異性核心抗原的mrna(對(duì)于基因型2a為174bp，左，和對(duì)于基因型2b為123bp，右)。n：hcv(-)對(duì)照血清脈沖的d21細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。p：hcv(+)血清本身作為陽性對(duì)照(混合的基因型2a+2b)。m：標(biāo)記物。數(shù)據(jù)代表利用來自兩個(gè)hcvser基因型2a+2b感染供體的血清的實(shí)驗(yàn)。(e)p0、p2和p6hadsc的cd81、ldl-r、sr-b1和egfr的表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)。黑線：同種型對(duì)照ab。紅線：抗cd81，-ldl-r，-sr-b1或-egfrab。數(shù)據(jù)代表各代細(xì)胞的3個(gè)實(shí)驗(yàn)。(f)p0、p2和p6hadsc的閉合蛋白(ocln)、緊蛋白-1(cldn1)、npc1l1和mir-122的表達(dá)的rt-pcr(左圖)。數(shù)據(jù)代表來自3個(gè)供體的hadsc。n：作為陰性對(duì)照的無反轉(zhuǎn)錄酶。p：分離自hcv(-)個(gè)體的原代人肝細(xì)胞，作為陽性對(duì)照。與huh7.5或hcv(-)原代人肝細(xì)胞(phh，右圖)相比較，也通過qrt-pcr在p0、p2、p6hadsc中確定mir-122表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為分別使用來自3個(gè)不同供體的hadsc和phh的以平均值±sd計(jì)的相對(duì)于p0hadsc的表達(dá)水平。(g)將p2hadsc用所示濃度的封閉單克隆抗cd81(克隆js-81)、抗ldl-r(克隆c7)、抗egfrab(克隆la1)或多克隆抗sr-b1ab預(yù)處理1h，然后用hcvser-1b脈沖。對(duì)于封閉apo-e，將指示濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)添加至hcvser，隨后將其用于和hadsc進(jìn)行3-小時(shí)孵育。定量確定21天的上清液的病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物。同種型：用同種型對(duì)照抗體(100μg/ml)處理。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)實(shí)驗(yàn)的抑制分?jǐn)?shù)平均值±sd(與用同種型ab的處理相對(duì)比)。還通過錐蟲藍(lán)評(píng)估每次處理后的細(xì)胞成活力。(h)p2hadsc用對(duì)ocln、cldn1、npc1l1或dgat-1有特異性的sirna轉(zhuǎn)染。將用亂序rna轉(zhuǎn)染用作對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，洗滌細(xì)胞和通過hcvser-1b感染，并定量確定21天的上清液中的病毒5’-utr拷貝。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行ocln和cldn1的敲減，而在分開的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行npc1l1或dgat-1的敲減。每次轉(zhuǎn)染后通過錐蟲藍(lán)排除測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞成活力，與通過亂序sirna的轉(zhuǎn)染相比，其未明顯改變。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。(i)通過hcvser-1b感染附著的p4-p5hadsc，和連續(xù)21天在培養(yǎng)中添加分級(jí)劑量的利巴韋林、特拉匹韋和環(huán)孢菌素a。還將hadsc與分級(jí)濃度的ifnα一起孵育16h，然后暴露于hcvser-1b。每次處理后通過錐蟲藍(lán)評(píng)估細(xì)胞成活力。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。

圖4：hcvadsc在物理性質(zhì)上不同于jfh1/hcvcc和對(duì)原代人肝細(xì)胞具有感染性。(a)hcvadsc(基因型2a)自21天的hcvser-2a感染的hadsc上清液收獲，和通過在10-40％碘克沙醇中平衡離心進(jìn)行密度梯度測(cè)定法。還平行進(jìn)行hcvser(基因型2a)和jfh1/hcvcc的密度梯度測(cè)定法用于對(duì)比。數(shù)據(jù)代表5個(gè)實(shí)驗(yàn)。(b)當(dāng)以重量(ng)/病毒拷貝表示時(shí)，hcvcc級(jí)分13具有最低量的hdl和ldl/vldl。數(shù)據(jù)代表3個(gè)供體的hcvser和它們的相應(yīng)hcvadsc。(c)apoe和b的測(cè)量證明，hcvser的主要級(jí)分具有最高的apoe含量，接著是hcvadsc，而hcvcc級(jí)分13幾乎沒有可檢測(cè)的apoe(左圖)。相比之下，apob僅在hcvser級(jí)分2中被檢出(右圖)。數(shù)據(jù)是使用hcvser(基因型2a)和其相應(yīng)hcvadsc的一個(gè)實(shí)驗(yàn)(即，hcvadsc通過hcvser-感染的hadsc產(chǎn)生)，和代表3個(gè)hcvser供體。(d)將在6-cm培養(yǎng)皿中的p2hadsc暴露于hcvser(基因型2a)或hcvcc。將感染的hadsc連續(xù)培養(yǎng)14或21天(無培養(yǎng)基更換)，和在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)通過qrt-pcr定量確定在上清液(左圖)和細(xì)胞裂解物(右圖)中的5’-utr拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，在hadsc中hcvcc未有效地感染/復(fù)制。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。(e)在hcvcc-感染的或未感染的huh7.5培養(yǎng)物的上清液中以及在hcvcc-或hcvser-感染的hadsc的21天的上清液中病毒5’-utr的rt-pcr。數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)。(f)將自hcv(-)患者分離的phh放置3天以允許附著，然后暴露于自被hcvser-1b或hcvser-2b感染的hadsc收集的21天的上清液中3h，或被對(duì)照血清脈沖。感染后5天，提取細(xì)胞rna用于5’-utr的rt-pcr。hcvser-1b本身用作陽性對(duì)照。數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)。(g)將自3個(gè)hcv(-)供體(供體1、2和3)分離的1x10⁴/孔的phh置于6-孔板中3天以允許細(xì)胞附著，在第4天通過hcvser-1b的3個(gè)不同批次(自3個(gè)單獨(dú)的供體收集)之一分別感染phh。使用hcvser-1b以產(chǎn)生相應(yīng)的hcvadsc，其也用于平行感染phh。hcvser和其相應(yīng)hcvadsc成對(duì)感染同一批次的phh。感染后5天，收集phh上清液和定量確定5’-utr拷貝。將phh暴露于hcv(-)對(duì)照血清(亦來自3個(gè)不同的供體)用作陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)表示為每次感染的一式三份的平均值±sd。

圖5：通過離心分離人脂肪組織的勻漿物成不同層。按所述⁹，hcv(+)個(gè)體的脂肪組織經(jīng)離心并分成以下的層：漂浮物、緩沖液和細(xì)胞沉淀(左圖)。漂浮群體含有成熟的脂肪細(xì)胞。收集細(xì)胞沉淀，和用rbc裂解緩沖液處理以裂解紅細(xì)胞，收獲基質(zhì)血管級(jí)分(svf)細(xì)胞，和將svf細(xì)胞進(jìn)行dlk-1⁺人脂肪形成的干細(xì)胞(hadsc)的免疫選擇，所述干細(xì)胞可被認(rèn)為是原代(第0代)hadsc。

圖6：所選級(jí)分的純度和針對(duì)dlk-1的rt-pcr。(a)通過使用mofloxdp流式細(xì)胞儀(bectoncoulter，ca，usa)測(cè)定在dlk-1⁺(左)和dlk-1^-(右)級(jí)分中dlk-1⁺細(xì)胞的百分比，和用submit軟件進(jìn)行分析。使用dlk-1⁺和dlk-1^-級(jí)分的99.5％自體熒光的消除設(shè)置門控，以測(cè)定在各級(jí)分中陽性染色的細(xì)胞。使用與同種型對(duì)照抗體(兔igg)一起孵育的未分級(jí)分離的svf細(xì)胞，獲得類似的結(jié)果。數(shù)據(jù)代表6個(gè)實(shí)驗(yàn)。(b)自未分級(jí)分離的svf細(xì)胞提取rna，選擇dlk-1^-和dlk-1⁺細(xì)胞¹⁰和進(jìn)行針對(duì)dlk-1的rt-pcr(引物按所述¹¹)。相比于在dlk-1⁺細(xì)胞中的豐富表達(dá)，dlk-1^-細(xì)胞幾乎不表達(dá)dlk-1mrna。數(shù)據(jù)代表4個(gè)實(shí)驗(yàn)。

圖7：hcv-感染的原代人肝細(xì)胞(phh)表達(dá)ns5抗原。自hcv(-)或hcv(+)供體(分別為圖a和b以及c和d)收獲phh并接種到膠原-i包被的孔中用于培養(yǎng)。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)了ns5染色對(duì)新鮮分離自hcv(+)或hcv(-)供體和在無精氨酸williamse培養(yǎng)基(invitrogen，ca，usa)中培養(yǎng)的原代人肝細(xì)胞(phh；接種數(shù)1x10⁴細(xì)胞/孔)的特異性。在第9天，洗滌細(xì)胞和使用與所述用于在細(xì)胞離心涂片器載玻片上染色細(xì)胞的類似方法(參見“方法”)，在孔中進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)。數(shù)據(jù)代表使用來自3個(gè)hcv(+)和3個(gè)hcv(-)供體的phh的3個(gè)實(shí)驗(yàn)。

注意：在過去在感染的肝組織中難以檢出hcv抗原。然而，染色分離的細(xì)胞未顯示與對(duì)肝組織染色一樣那么非特異性，只要適當(dāng)控制顯色時(shí)間(參見“方法”)。

圖8：在hcv-感染的個(gè)體的脂肪組織中dlk-1⁺細(xì)胞共表達(dá)hcvns5抗原。自hcv-感染的個(gè)體收獲脂肪組織(表1)，和按方法中所述，用抗dlk-1ab(紅色標(biāo)記，白色箭頭，圖a和b)，接著用抗ns5ab(棕色標(biāo)記，白色箭頭，圖c和d)和蘇木精(在圖c和d中藍(lán)色標(biāo)記)對(duì)同一切片進(jìn)行免疫染色。在檢查的hcv(+)脂肪組織的所有切片中，在高倍視場(chǎng)(400x)中能檢出約0-4個(gè)dlk-1⁺ns5⁺細(xì)胞。圖a和c來自供體2和圖b和d來自供體3。用同種型對(duì)照抗體染色的圖片類似于在圖1e中顯示的那些。

圖9：感染懸浮hadsc的方案。自hcv(-)個(gè)體制備hadsc，和按所述^12，13進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以0.2moi將第2-6代hadsc暴露于hcvser(表2)(1x10⁵hcv5’-utr拷貝數(shù)對(duì)比5x10⁵hadsc細(xì)胞)，通過用新鮮培養(yǎng)基稀釋hcv(+)血清進(jìn)行調(diào)整。在3h后，用pbs洗滌細(xì)胞5次，之后在6-ml新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第7、14、21和28天收獲上清液和細(xì)胞裂解物，提取rna用于5’-utr的rt-pcr。

圖10：用hcvser感染附著在塑料上的hadsc。將hadsc置于6-cm培養(yǎng)皿中1天以允許細(xì)胞附著。之后以2ml培養(yǎng)基的終體積添加hcvser以以0.5moi孵育細(xì)胞3h(1x10⁵5’-utr拷貝對(duì)比2x10⁵hadsc細(xì)胞)。在溫和洗滌后，在有或沒有每7天更換培養(yǎng)基的情況下(分別為途徑a或b)，將hcvser-感染的hadsc在5ml新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

圖11：p2和p6hadsc的病毒復(fù)制效率優(yōu)于p9和p15細(xì)胞的病毒復(fù)制效率。將不同代的hadsc懸浮暴露于hcvser-1a或-2a。感染后，21天的上清液和細(xì)胞裂解物(連續(xù)培養(yǎng))的病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物通過qrt-pcr測(cè)定。結(jié)果顯示，與p2和p6細(xì)胞相對(duì)比，在細(xì)胞裂解物和上清液中p9和p15的細(xì)胞具有明顯更少的病毒拷貝。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。

圖12：cd81、ldlr、sr-b1和egfr的阻斷以及apoe的中和減少在21天的hcvser-感染的hadsc培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解物中的病毒拷貝。p-2hadsc用分級(jí)劑量的針對(duì)cd81(克隆js-81)、ldl-r(克隆c7)、egfr(克隆la1)的單克隆ab或針對(duì)sr-b1的多克隆ab預(yù)處理1h，然后在用hcvser-1b脈沖之前洗滌。對(duì)于apoe阻斷，按所述¹⁴在室溫下將各種濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)添加至hcv(+)血清1h，然后用于與hadsc一起孵育3h。與上清液中的測(cè)量(圖3g)一致，在hcv(+)血清中hadsc的cd81、ldl-r、sr-b1、egfr的阻斷和apoe的中和以劑量依賴方式顯著降低在細(xì)胞裂解物中的病毒轉(zhuǎn)錄物的量。同時(shí)，抗體本身的處理未顯著影響hadsc成活力。數(shù)據(jù)表示為每次處理的一式三份的平均值±sd。

圖13：sirna轉(zhuǎn)染后的rt-pcr和在敲減閉合蛋白(ocln)、緊蛋白-1(cldn1)、npc1l1或dgat-1后在21天的細(xì)胞裂解物中的病毒拷貝數(shù)。(a)按所述^15，16進(jìn)行閉合蛋白、緊蛋白-1或npcll1的敲減，和按所述^16，17進(jìn)行rt-pcr。在同一實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行ocln和cldn1的敲減，而在分開的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行npcll1的敲減。數(shù)據(jù)代表3個(gè)實(shí)驗(yàn)。(b)dgat1的sirna探針是來自ambion的預(yù)設(shè)計(jì)的sirna(目錄號(hào)11782和11784)。按所述¹⁸進(jìn)行亂序rna和對(duì)dgat1有特異性的sirna的轉(zhuǎn)染、qrt-pcr和蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd，并表示為標(biāo)準(zhǔn)化至18srrna的相對(duì)比率。(c)在敲減之后，將hadsc暴露于hcvser-1b，和通過qrt-pcr測(cè)定21天的細(xì)胞裂解物的5’-utr拷貝數(shù)。與用亂序sirna的轉(zhuǎn)染相比，sirna轉(zhuǎn)染本身未明顯影響細(xì)胞成活力，其在轉(zhuǎn)染后48h通過錐蟲藍(lán)排除試驗(yàn)測(cè)定。顯然，在上清液中dgat1敲減具有比在細(xì)胞中更突出的抑制作用(圖c對(duì)比圖3h)。這與以下發(fā)現(xiàn)一致：dgat1敲減損害細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和釋放兩者，但病毒釋放似乎更顯著受到影響¹⁹。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd，表示為與亂序?qū)φ崭腥镜南鄬?duì)比率。

圖14：hadsc中親環(huán)蛋白a表達(dá)的rt-pcr。按所述²⁰在p0-p6hadsc中進(jìn)行親環(huán)蛋白a(cypa)的rt-pcr。幼稚huh7.5細(xì)胞用作陽性對(duì)照。數(shù)據(jù)代表4個(gè)實(shí)驗(yàn)。

圖15：hcvser、jfh1/hcvcc和hcvadsc的主要級(jí)分(通過密度梯度)的總脂質(zhì)含量。通過hdl和ldl/vldl膽固醇測(cè)定試劑盒(abcam)檢測(cè)hdl和ldl/vldl的水平。按照制造商的說明書，通過elisa人apob免疫測(cè)定試劑盒和elisa人apoe免疫測(cè)定試劑盒(r&d)測(cè)量apob和apoe的量。還將不同級(jí)分的hdl和ldl/vldl、apob和apoe的量標(biāo)準(zhǔn)化至重量/拷貝。(a)hcvser(特別是級(jí)分2)具有比hcvcc或hcvadsc更高的hdl和ldl/vldl“總”量。(b)和(c)另外2個(gè)批次的hcvser和hcvadsc的分析表明相同模式的脂質(zhì)和apoe/b含量。

圖16：jfh1/hcvcc有效感染huh7.5。將4x10⁵huh7.5細(xì)胞/孔置于6-孔板中過夜。1天后，將細(xì)胞洗滌并與hcvcc病毒接種物(0.5moi)一起孵育3h。洗滌后，將細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清(fbs)和1％非必需氨基酸的dmem中培養(yǎng)。在感染后第3天，收獲上清液和提取rna用于5’-utr轉(zhuǎn)錄物的qrt-pcr。將未暴露于病毒接種物的幼稚huh7.5細(xì)胞用作陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)表示為3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證用于感染hadsc的hcvcc接種物的感染性(圖4d)。

本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述

參照用于說明的示例性應(yīng)用，下文描述了本發(fā)明的幾個(gè)方面。應(yīng)理解，陳述了許多具體的細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法以提供對(duì)本發(fā)明的充分理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可在沒有一個(gè)或多個(gè)特定細(xì)節(jié)的情況下或與其它方法一起實(shí)施。本發(fā)明不受行為或事件的順序限制，因?yàn)橐恍┬袨榭梢圆煌捻樞虬l(fā)生和/或與其它行為或事件同時(shí)發(fā)生。此外，并非需要所有例舉的行為或事件以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。

定義

除非另有定義，否則本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語以及命名法具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。一般而言，細(xì)胞培養(yǎng)、感染、分子生物學(xué)方法等的程序是本領(lǐng)域使用的常見方法。這樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可見于參考手冊(cè)例如sambrook等(1989，molecularcloning-alaboratorymanual，coldspringharborlaboratories)和ausubel等(1994，currentprotocolsinmolecularbiology，wiley，newyork)。

如本文所用的單數(shù)形式″一個(gè)″、″一種″和″所述″意欲也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚另外指明。此外，在術(shù)語″包括″、″包含″、″具有″、″有″、″含有″或其變體用于詳細(xì)描述和/或權(quán)利要求的情況下，這樣的術(shù)語意欲以類似于術(shù)語″包含(comprising)″的方式包括在內(nèi)。

如本文所用的術(shù)語“約”當(dāng)涉及可測(cè)量的值例如量、短暫持續(xù)時(shí)間等時(shí)，意指包括與指定值的±20％或±10％的變化，更優(yōu)選±5％，甚至更優(yōu)選±1％和還更優(yōu)選±0.1％的變化，因?yàn)檫@樣的變化適合進(jìn)行所公開的方法。

如本文所用的術(shù)語“脂肪組織”定義具有初級(jí)代謝重要性的彌散器官，其由白色脂肪、黃色脂肪或褐色脂肪構(gòu)成。脂肪組織具有脂肪細(xì)胞和基質(zhì)。脂肪組織存在于整個(gè)動(dòng)物身體。例如，在哺乳動(dòng)物中，脂肪組織存在于網(wǎng)膜、骨髓、皮下空間和包圍大部分器官。

如本文所用的術(shù)語“干細(xì)胞”定義成體未分化細(xì)胞，其可產(chǎn)生自身和進(jìn)一步分化的后代細(xì)胞。

術(shù)語″人脂肪衍生的干細(xì)胞″、″hadsc″、″人脂肪衍生的dlk-1⁺干細(xì)胞″和″人脂肪形成的dlk-1⁺細(xì)胞″可互換使用，如本文所用，是人成體干細(xì)胞，其是或具有獲自含脂肪組織的組織來源的親本細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)特定的標(biāo)記物dlk-1(即pref-1)——表皮生長因子樣家族的一個(gè)成員²¹，對(duì)于脂肪形成是關(guān)鍵的，并且所述表達(dá)在成熟脂肪細(xì)胞中被完全廢除^22-24。

如本文所用的術(shù)語“原代細(xì)胞”是指直接源自個(gè)體的細(xì)胞或組織的細(xì)胞。如本文所用的“傳代細(xì)胞”是指從原代細(xì)胞再次培養(yǎng)的細(xì)胞。如本文所用的“傳代數(shù)”是指細(xì)胞從原代細(xì)胞再次培養(yǎng)的次數(shù)。例如第1代細(xì)胞(p1細(xì)胞)是指通過直接再次培養(yǎng)原代細(xì)胞獲得的細(xì)胞，和第2代細(xì)胞(p2細(xì)胞)是指通過直接再次培養(yǎng)第1代細(xì)胞獲得的細(xì)胞，等等。

如本文所用的術(shù)語″培養(yǎng)″、″培育″、″生長″、″增殖″和″繁殖″可互換使用，是指細(xì)胞在配制的培養(yǎng)基中體外生長。如本文所用的術(shù)語″培養(yǎng)系統(tǒng)″、″培育系統(tǒng)″、″增殖系統(tǒng)″和″繁殖系統(tǒng)″可互換使用，是指包括生成病毒顆粒的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。具體而言，本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)中生成hcv的hadsc。所述系統(tǒng)支持hcv的完全復(fù)制(例如附著、進(jìn)入細(xì)胞、復(fù)制、成熟等)，包括產(chǎn)生有感染性的病毒，特別是病毒進(jìn)入、包括(-)和(+)鏈合成的復(fù)制、病毒蛋白合成、病毒裝配、病毒運(yùn)輸或病毒釋放。

如本文所用的術(shù)語″樣品″或″生物樣品″意指自受試者分離的或自體外培養(yǎng)物分離的生物材料。生物樣品可包含適于檢測(cè)受試者或體外細(xì)胞培養(yǎng)物中的核酸、多肽或生物、生理或病理過程的其它標(biāo)記物的任何生物材料，可包括獲自受試者或體外細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基、體液、組織和細(xì)胞和/或非細(xì)胞材料。

如本文所用的術(shù)語″診斷″是指確定疾病或病癥的存在。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供用于作出診斷的方法，其允許確定特定的疾病或病癥的存在。

如本文所用的術(shù)語″患者″、″受試者″、″個(gè)體″等可互換使用，是指可適于本文所述方法的任何動(dòng)物。在某些非限制性實(shí)施方案中，所述患者、受試者或個(gè)體是人。

描述

本發(fā)明涉及hadsc容許被hcv感染這一發(fā)現(xiàn)。

hadsc

人脂肪衍生的干細(xì)胞是中胚層來源的多能成體干細(xì)胞和可容易大量獲得⁹。這些細(xì)胞表達(dá)特定的標(biāo)志物dlk-1(即pref-1)——表皮生長因子樣家族的一個(gè)成員²¹，對(duì)于脂肪形成是關(guān)鍵的，并且所述表達(dá)在成熟脂肪細(xì)胞中被完全廢除^22-24。越來越多的證據(jù)表明，人脂肪形成的dlk-1⁺細(xì)胞(hadsc)可分化成多種細(xì)胞譜系(關(guān)于綜述，參見參考文獻(xiàn)^25，26)，這使hadsc成為用于設(shè)計(jì)再生療法的有前景的工具。還已報(bào)道，各種解剖腔室中的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)病毒感染敏感^27-32。然而，尚未探究hadsc在病毒疾病中的作用。

一般而言，hadsc可獲自任何可得的來源。在一個(gè)實(shí)施方案中，hadsc自合適的組織來源分離。hadsc的合適的組織來源包括但不限于任何包含脂肪的組織，例如褐色或白色脂肪組織，例如皮下白色脂肪組織。通常，人脂肪組織使用手術(shù)切除或吸脂術(shù)從活的供體獲得。在一些實(shí)施方案中，脂肪組織從受試者的預(yù)選擇區(qū)域獲得，即腹部、臀部、腹股溝和腹膜，或其任何組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，hadsc自腹部或臀部皮下脂肪組織分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，hadsc是原代細(xì)胞，即直接源自個(gè)體的脂肪組織的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hadsc是經(jīng)傳代的細(xì)胞，例如第1-15代細(xì)胞，優(yōu)選第1-6代細(xì)胞。

分離、隔離和擴(kuò)繁adsc例如hadsc的方法是本領(lǐng)域已知的，和描述于例如美國專利號(hào)6,391,2971b1；6,777,231b1；美國專利號(hào)5,786,207；美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2005/0076396a1；burris等(1999)molendocrinol13：410-7；erickson等(2002)biochembiophysrescommun.jan.18，2002290(2)：763-9；gronthos等(2001)journalofcellularphysiology，189：54-63；halvorsen等(2001)metabolism50：407-413；halvorsen等(2001)tissueeng.7(6)：729-41；harp等(2001)biochembiophysrescommun281：907-912；saladin等(1999)cellgrowth&diff10：43-48；sen等(2001)journalofcellularbiochemistry81：312-319；zhou等(1999)biotechnol.techniques13：513-517；erickson等(2002)biochembiophysrescommun.1月18日，2002；290(2)：763-9；gronthos等(2001)journalofcellularphysiology，189：54-63；halvorsen等(2001)metabolism50：407-413；halvorsen等(2001)tissueeng.12月7日，2001(6)：729-41；harp等(2001)biochembiophysrescommun281：907-912；saladin等(1999)cellgrowth&diff10：43-48；sen等(2001)journalofcellularbiochemistry81：312-319；zhou等(1999)biotechnol.techniques13：513-517；zuic等(2001)tissueeng.7：211-228；hauner等(1987)j.clin.endocrinol.metabol.64：832-835；katz等(1999)clin.plast.surg.26：587-603。

僅用于說明的目的，幾種基于形態(tài)學(xué)的、生物化學(xué)的或分子的方法可用于分離所述細(xì)胞。在一方面，基于細(xì)胞大小和粒度分離hadsc，因?yàn)閔adsc小并且為顆粒?；蛘?，因?yàn)楦杉?xì)胞趨于具有比分化的細(xì)胞更長的端粒，因此hadsc可通過測(cè)定端粒的長度或通過測(cè)定端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性分離。

或者，hadsc可在免疫組織化學(xué)上通過選擇hadsc-特異性細(xì)胞標(biāo)記物與其它細(xì)胞分離。hadsc表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物cd10、cd13、cd29、cd34、cd44、cd54、cd71、cd90、cd105、cd106、cd117和stro-1。對(duì)于造血譜系標(biāo)記物cd45、cd14、cd16、cd56、cd61、cd62e、cd104和cd106以及對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞(ec)標(biāo)記物cd31、cd144和vonwillebrand因子而言，它們是陰性的(zuk等，molbiolcell13(12)：4279-4295，2002；musina等，bullexpbiolmed139(4)：504-509，2005；romanov等，bullexpbiolmed140(1)：138-143，2005)。在形態(tài)學(xué)上，它們是成纖維細(xì)胞樣的，并且在體外擴(kuò)繁后保持它們的形狀(zuk等，molbiolcell13(12)：4279-4295，2002；arrigoni等，celltissueres338(3)：401-411，2009；zannettino等，jcellphysiol214(2)：413-421，2008)。在多個(gè)方面，hadsc通過dlk-1⁺的免疫選擇分離。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，hadsc自市售可得的來源或已建立的hadsc系獲得。這樣的hadsc的非限制性實(shí)例為例如poietics^tm人脂肪衍生的干細(xì)胞(目錄號(hào)pt-5006，lonzagroupltd.)和pcs-500-011^tm。

細(xì)胞培養(yǎng)

一般而言，hadsc可在本領(lǐng)域可得和眾所周知的培養(yǎng)基中維持和擴(kuò)繁。這樣的培養(yǎng)基包括但不限于角質(zhì)形成細(xì)胞-sfm(k-培養(yǎng)基)、dulbecco′smodifiedeagle′s(dmem)、dmemf12eagle′sminimumessentialf-12kiscove′smodifieddulbecco′srpmi-1640間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pcs-500-030^tm)和間充質(zhì)干細(xì)胞生長試劑盒-低血清(pcs-500-040^tm)。

本發(fā)明還考慮用哺乳動(dòng)物血清補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基，優(yōu)選胎牛血清。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，這樣的哺乳動(dòng)物血清濃度范圍為0vol％-20vol％，優(yōu)選5vol％-15vol％，更優(yōu)選10vol％。血清的實(shí)例包括胎牛血清(fbs)、牛血清(bs)、小牛血清(cs)、胎牛血清(fcs)、新生牛血清(ncs)、山羊血清(gs)、馬血清(hs)、人血清、小雞血清、豬血清、綿羊血清、兔血清、血清代替品和牛胚胎液。

其它補(bǔ)充物例如生長因子、激素、氨基酸、脂質(zhì)、礦物質(zhì)等也可有利地使用以供給細(xì)胞最佳生長和擴(kuò)繁所必需的痕量元素。這樣的補(bǔ)充物是市售可得的。確定這些補(bǔ)充物的合適濃度完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。

hcv

本發(fā)明的hcv可以是可感染hadsc的任何hcv或可自hcv感染的個(gè)體分離的任何hcv。在一個(gè)實(shí)施方案中，hcv是選自以下的hcv基因型的至少一種：基因型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a，或其任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hcv是選自以下的hcv基因型的至少一種：基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b。

在一方面，本發(fā)明包括用于增殖hcv的基于hadsc的系統(tǒng)，其包括hadsc。在另一方面，本發(fā)明包括以下方法：將hadsc或本發(fā)明的hcv培養(yǎng)系統(tǒng)用于增殖hcv、或進(jìn)行hcv生命周期分析、或診斷hcv感染、或篩選抗病毒化合物、或表征被hcv感染的受試者的hcv。

hcv的水平可通過本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)來確定。這樣的技術(shù)可包括抗hcvelisa測(cè)定法(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)，其檢測(cè)hcv蛋白?？墒褂猛ㄟ^擴(kuò)增所測(cè)定的rna來檢測(cè)hcv復(fù)制(例如聚合酶鏈反應(yīng)或pcr，分支dna測(cè)定法)。hcv的rna的合成實(shí)際上可通過在單一步驟中使用經(jīng)設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)pcr的裝置的rt-pcr或通過在濾器上使用hcv-特異性放射性探針的rna雜交來分析。例如，可將分離的rna進(jìn)行使用能夠擴(kuò)增hcv基因組的特異性寡核苷酸引物的偶聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，例如逆轉(zhuǎn)錄和通過聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)的擴(kuò)增。然后，可進(jìn)行直接測(cè)序以確定已經(jīng)感染所述受試者的hcv的基因型。

在各種實(shí)施方案中，hcv的水平通過測(cè)量hcv滴度、hcv核酸的水平或hcv多肽的水平來確定。

在各種實(shí)施方案中，在候選化合物存在時(shí)觀察到的hcv水平相對(duì)于在候選化合物不存在時(shí)觀察到的hcv水平降低，表示候選化合物的抑制活性。

根據(jù)本發(fā)明，候選化合物包括而不限于化合物、蛋白、肽、肽模擬物、抗體、核酸、反義核酸、shrna、核酶和小分子化合物。

如本文所公開，使用篩選方法鑒定的抗hcv化合物可進(jìn)一步在敏感性動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試。

試劑盒

在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明還提供用于增殖hcv，或進(jìn)行hcv生命周期分析，或診斷hcv感染，或篩選抗病毒化合物，或表征被hcv感染的受試者的hcv的試劑盒，其包括本文所述的hadsc和適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基。

本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例進(jìn)行說明。這些實(shí)施例僅意欲說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。對(duì)于以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，它們?cè)诔Ｒ?guī)條件例如由sambrook等在moleculeclone：alaboratorymanual，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989中描述的那些下或按制造商所指示那樣進(jìn)行，除非另有說明。

實(shí)施例

材料和方法

臨床樣品

所有臨床脂肪組織和肝樣品在機(jī)構(gòu)研究委員會(huì)的批準(zhǔn)下獲自kaohsiungmedicaluniversityhospital(kmuh-irb-960477、kmuh-irb-960343和kmuh-irb-20120404)。在該程序之前，書面的知情同意書獲自所有供體。

新鮮脂肪組織的分級(jí)分離和dlk-1⁺細(xì)胞的培養(yǎng)

hcv(+)脂肪組織獲自用于切除肝細(xì)胞癌的外科創(chuàng)傷(剖腹術(shù))。對(duì)于hcv(-)脂肪組織，如之前所述¹³，樣品獲自已在乳腺癌的乳房切除之后立即接受乳房再造術(shù)的女性的橫向腹直肌肌皮瓣。hcv(-)脂肪組織還獲自正接受吸脂術(shù)的肥胖人(表1)。無一患者已經(jīng)接受輔助化學(xué)療法或放射療法以在手術(shù)前治療乳腺癌。

樣品收獲后，組織用無菌生理鹽水洗滌和將樣本置于無菌袋中并立即送出用于制備。如所述^{12，13，33}，將新鮮脂肪組織固定用于免疫組織化學(xué)或通過離心(800g，10min)用于分級(jí)分離成在頂部的漂浮層(漂浮物)(其含有成熟的脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織)、在中間的緩沖液層和在底部的沉降的細(xì)胞沉淀。簡言之，用剪刀將脂肪組織充分切碎成小塊，和用不含鈣和鎂的pbs洗滌，隨后通過在37℃在pbs中持續(xù)攪拌30min用0.075％膠原酶(37.5mg/ml；sigma-aldrich)消化。

如所述^12，34收集在底層的細(xì)胞沉淀(即svf細(xì)胞)和用rbc裂解溶液處理(以裂解紅細(xì)胞)，和隨后通過100-μmsteriflip(millipore)濾器過濾。在用錐蟲藍(lán)染色后，svf細(xì)胞的數(shù)量和成活力使用countesscell計(jì)數(shù)器(invitrogen)確定。然后如所述¹⁰通過免疫磁珠，將svf細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)dlk-1⁺細(xì)胞的陽性選擇，提取細(xì)胞rna用于rt-pcr或qrt-pcr。還將dlk-1+細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(針對(duì)病毒ns5抗原)。

對(duì)于所有樣品，從脂肪取樣至細(xì)胞分離的間隔時(shí)間是3h或更少。對(duì)于培養(yǎng)dlk-1⁺細(xì)胞，按所述¹³將1x10⁵個(gè)細(xì)胞置于6-cm培養(yǎng)皿中49天，每7天收獲上清液(與培養(yǎng)基更換同步)用于rna提取。

dlk-1⁺細(xì)胞的免疫選擇

將自hcv-感染的或未感染的個(gè)體制備的rbc-裂解的未分級(jí)分離svf細(xì)胞與多克隆兔抗dlk1抗體(abcam，usa)在4℃一起孵育30分鐘。按所述¹⁰，將細(xì)胞在含有0.8mmol/lmgcl2、20mmol/lhepes、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的hbss中洗滌兩次，和與磁性微珠結(jié)合的山羊抗兔igg(miltenyibiotecinc，auburn，ca)在4℃一起孵育30分鐘。將細(xì)胞懸浮液洗滌，并通過在midimacsseparator(miltenyibiotec)中的柱，結(jié)果dlk-1⁺細(xì)胞保留在柱中，而dlk-1^-細(xì)胞通過柱。將兩種細(xì)胞級(jí)分在hbss中洗滌兩次。dlk-1⁺和dlk-1^-級(jí)分的細(xì)胞成活力分別為＞96％和＞97％。提取rna用于rt-pcr或qrt-pcr。在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞固定至細(xì)胞離心涂片器載玻片上用于免疫細(xì)胞化學(xué)(5-7×10³個(gè)細(xì)胞/載片)。在體外感染的實(shí)驗(yàn)中，在暴露于hcv(+)血清(hcvser)之后，培養(yǎng)并傳代(再次培養(yǎng)，按所述¹³)dlk-1⁺細(xì)胞指定的時(shí)間周期。然后提取rna用于病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物的rt-pcr或qrt-pcr。

用hcvser的hadsc感染

在本研究中采用兩種方案：

(1)方案1，懸浮感染-我們使用第2代(p-2)至第6代的幼稚hadsc用于hcvser感染。以0.2的感染復(fù)數(shù)(moi)，在eppendorf管中，添加總計(jì)200μl的hcv血清(含1x10⁵5’-utr拷貝)至懸浮在800μl新鮮培養(yǎng)基中的5x10⁵個(gè)hadsc，隨后在37℃孵育3小時(shí)。用pbs洗滌細(xì)胞3次和進(jìn)一步培養(yǎng)7、14、21和28天，收獲上清液和細(xì)胞裂解物中的rna用于5’-utr的rt-pcr。還收集細(xì)胞用于免疫細(xì)胞化學(xué)和透射電子顯微術(shù)(tem)研究。

(2)方案2，附著形式的感染-將p-2至p-6幼稚hadsc接板于6-cm培養(yǎng)皿中1天以允許細(xì)胞附著，在0.5moi(1x10⁵5’-utr拷貝對(duì)比2x10⁵hadsc細(xì)胞)，以終體積2-ml培養(yǎng)基添加hcvset達(dá)3h。在溫和洗滌后，在有或沒有每7天更換培養(yǎng)基的情況下，將細(xì)胞在5ml新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

5’-utr的rt-pcr和定量rt-pcr

用viralrnaminikit(qiagen，basle，switzerland)，從140μlhcv(+)血清或hcvser-感染的hadsc培養(yǎng)物的上清液提取rna。按照制造商的說明書，使用rnaminikit(ambion，carlsbad，ca，usa)分離來自細(xì)胞裂解物的rna。然后用高容量cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna轉(zhuǎn)換成單鏈cdna，接著用gotaqmastermix(promega，wi，usa)進(jìn)行pcr。對(duì)于定量病毒拷貝，使用appliedviia^tm7real-timepcrsystem，用丙肝病毒高級(jí)試劑盒(primerdesignltd.，uk)進(jìn)行pcr。hcv-特異性逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增引物按照abiprimer3.0expresssoftword進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物5′-actcgcaagcaccctatcag-3′用于逆轉(zhuǎn)錄，用于pcr和實(shí)時(shí)pcr的引物與不同hcv基因型的高度保守的5’-非翻譯區(qū)(utr)匹配，如所述³⁵。

人脂肪組織的免疫組織化學(xué)(ihc)

從外科創(chuàng)傷收獲新鮮脂肪組織，在福爾馬林中固定和在石蠟中包埋。將組織切成5μm切片和脫石蠟，然后浸入檸檬酸鹽緩沖液(10mm檸檬酸ph6.0)中和通過微波加熱用于抗原恢復(fù)。在用5％bsa在室溫下封閉30min后，在4℃施用多克隆兔抗dlk1抗體(1∶150；目錄號(hào)ab21682，abcam，usa)或兔iggab(1∶150；目錄號(hào)ab-105-c，r&d)過夜，接著在室溫下施用堿性磷酸酶綴合的抗兔igg第二抗體(1∶500；jasonimmunoresearch)達(dá)1h和隨后用固紅底物系統(tǒng)(sigma-aldrich)顯色。對(duì)于連續(xù)ns5染色，將樣品浸入pbs中10min以除去蓋玻片，和在室溫下將載玻片在0.3％h2o2中孵育30min以減少內(nèi)源過氧化物酶的非特異性背景。在用5％bsa在室溫下封閉30min后，在4℃添加小鼠抗ns5抗體(1∶200，克隆bgn/1246/5g7，目錄號(hào)0200-0423，abdserotec)或小鼠igg1同種型ab(1∶100，目錄號(hào)14-4714，ebioscience)過夜。在我們的經(jīng)驗(yàn)中，對(duì)于脂肪組織的ns5染色而言，細(xì)胞浸透程序不是必需的，因?yàn)橹皹悠芬驯话裨谑炛?。然后在室溫下將切片與辣根過氧化物酶聚合物quanto試劑(抗小鼠，即用型；thermoscientific)一起孵育7min和用ultravisionquantodetectionsystem(含dab顯色底物；thermoscientific)顯色。之后，切片用蘇木精染色和放回蓋玻片，其導(dǎo)致細(xì)胞輪廓的輕微改變(如圖1e所示)。dlk1和ns5a染色的電子圖片通過高質(zhì)量顯微鏡(zeiss)、快速計(jì)算機(jī)硬件和高分辨率顯示屏以及tissuefaxs掃描軟件(tissuegnostics)捕獲。隨后選擇圖片中的相同視場(chǎng)和將其可視化用于共定位的對(duì)比和分析。

在脂肪組織(圖1e)中，顯色所需的最佳時(shí)間在不同供體的組織間顯著不同(即供體和供體之間變化)，不管hcv感染狀態(tài)如何。我們已改進(jìn)所述方法多次，發(fā)現(xiàn)顯色時(shí)間是關(guān)鍵的。我們遵循的原理是，首先確定顯色的最大時(shí)間，對(duì)于同種型ab染色(兔igg或小鼠igg1)這得到最少的顏色信號(hào)；然后采用該時(shí)間用于抗dlk-1ab或抗ns5ab染色的顯色。這將確保幾乎沒有底物過度顯色引起的假陽性，和獲得同種型ab染色的低背景。

在我們對(duì)hcv(+)供體1(表1)的脂肪組織的研究中，在顯著顏色信號(hào)出現(xiàn)之前，兔igg染色的顯色的最大時(shí)間是40-50秒，因此設(shè)置dlk-1染色的顯色為40-50秒。類似地，沒有明顯顏色信號(hào)的小鼠igg1染色的顯色的最大時(shí)間短至15秒，這被設(shè)置為抗ns5ab染色的顯色時(shí)間。相比之下，在供體2和供體3的脂肪組織上，兔igg染色的最佳顯色時(shí)間是30秒和小鼠igg1染色的最佳顯色時(shí)間為僅10秒，因此這些時(shí)間分別設(shè)置用于抗dlk-1和抗ns5ab染色的顯色。當(dāng)染色hcv(-)樣品時(shí)遵循類似的原理。

免疫細(xì)胞化學(xué)(icc)

對(duì)于未分級(jí)分離的svf細(xì)胞或dlk-1⁺hadsc或dlk-1^-細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)，遵循與ihc類似的原理，和如上所述在每個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中預(yù)確定最佳顯色時(shí)間。在指定的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和通過細(xì)胞離心涂片器附著至聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上，隨后用4％福爾馬林固定20分鐘。對(duì)于dlk-1染色，在37℃通過0.05％胰蛋白酶溶液處理30min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抗原恢復(fù)，然后通過ddw漂洗3次。在用ultravblock緩沖液(在ultravisionquantodetectionsystem中的試劑，thermo，usa)封閉5min后，在4℃將細(xì)胞與兔抗dlk1抗體或兔igg一起孵育過夜，接著在室溫下與堿性磷酸酶綴合的抗兔igg第二抗體一起孵育1h和用固紅底物系統(tǒng)(sigma-aldrich)顯色5-6min(在大多數(shù)情況下)。對(duì)于hcv-特異性ns5(其在相同載玻片上進(jìn)行染色，如圖2c所示)的單次或連續(xù)染色，將載玻片置于pbs中10min以除去蓋玻片和洗出封固介質(zhì)，將細(xì)胞用含0.3％tritox-100和1％bsa的pbs滲透和封閉30min，然后應(yīng)用ultravisionquantodetectionsystem(thermoscientific，fremont，ca，usa)。然后將細(xì)胞在hydrogenperoxideblock(abcam，ma，usa)中孵育10分鐘以降低由于內(nèi)源過氧化物酶引起的非特異性背景染色。在洗滌后，將細(xì)胞用ultravblock(thermoscientific，ma，usa)孵育5分鐘以封閉非特異性背景染色，在4℃與含小鼠單克隆抗ns5抗體的稀釋緩沖液孵育過夜。將用小鼠igg1進(jìn)行的染色用作陰性對(duì)照。下一天，將細(xì)胞與第一抗體amplifierquanto溶液一起孵育10分鐘，和與hrppolymerquanto一起孵育另外10分鐘，在每次試劑施用之間通過pbs洗滌。最終，將30μldabquanto色原添加至1mldabquanto底物，通過渦旋混合，并施用至細(xì)胞2-3分鐘(在大多數(shù)情況下)用于顯色。在洗滌后，用永久封固介質(zhì)固定載玻片，通過蓋玻片覆蓋，和使用tissuefaxs顯微術(shù)(zeiss)可視化和照相。

血清hcv-感染的hadsc的透射電子顯微術(shù)

對(duì)于tem研究，按所述³⁶收集和制備hadsc，和通過透射電子顯微鏡(jem2000exii；jeol，tokyo，japan)檢查。

編碼hcv2a和2b的核心抗原的mrna的rt-pcr

按制造商的說明書，使用rnaminikit(ambion，carlsbad，ca，usa)分離hadsc的rna。用高容量cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(appliedbiosystems)將rna轉(zhuǎn)換成單鏈cdna。用于逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物是5′-atgtaccccatgaggtcggc-3′。用于pcr的引物與不同hcv基因型的核心蛋白區(qū)相匹配。含(正向)5′-cgcgcgactaggaagacttc-3′和(反向)5′-cgcgcgacgcgtaaaacttc-3′的引物混合物用于第一次pcr，熱概況如下設(shè)置：94℃2分鐘，接著94℃45秒、55℃45秒和72℃90秒的35個(gè)循環(huán)，然后72℃7分鐘用于最終延伸。在第二次pcr中用于基因型鑒定的類型特異性反義引物是5′-ccaagagggacgggaacctc-3′(類型2a)和5′-accctcgtttccgtacagag-3′(類型2b)，熱概況如下設(shè)置：95℃2分鐘，接著95℃30秒、60℃30秒和72℃30秒的30個(gè)循環(huán)，然后72℃7分鐘用于最終延伸^37，38。

流式細(xì)胞術(shù)和封閉實(shí)驗(yàn)

不同代的懸浮的0.5-1x10⁵hadsc用小鼠抗人cd81單克隆ab(克隆js-81，bdbiosciences)、抗ldl-rab(克隆c7，millipore)、抗egfrab(克隆la1，millipore)或兔多克隆抗srb1ab(novusbiologicals)在4℃染色1h。各自的對(duì)照是小鼠igg1或多克隆兔igg。洗滌后，將細(xì)胞進(jìn)一步與異硫氰酸熒光素(fitc)綴合的第二ab(jacksonimmunoresearchlaboratories，pa，usa)一起孵育和通過cellquanta^tmsc高分辨率流式細(xì)胞儀(beckmancoulterfullerton，ca，usa)分析。為封閉細(xì)胞表面分子，在37℃用1ml含指定劑量(1-100μg/ml)的抗體的無血清k-培養(yǎng)基預(yù)處理2x10⁵hadsc(附著在孔中)。將用各自同種型抗體的處理用作對(duì)照。在1h后，將未稀釋的hcv(+)血清添加至eppendorf管中，使moi為0.2，以在抗體存在下孵育3h。之后，洗滌細(xì)胞和接板于6-cm培養(yǎng)皿中用于連續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于apoe封閉，按所述¹⁴在室溫下添加各種濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)至hcv(+)血清達(dá)1h，然后與hadsc一起孵育3h。在21天的持續(xù)培養(yǎng)后收集上清液和細(xì)胞，提取rna以定量病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，孔中的hadsc用指定劑量的ifnα(sigma-aldrich，mo，usa)在k培養(yǎng)基中一式三份預(yù)處理16h，然后暴露于基因型1a、1b、2a和2b的hcv(+)血清。21天后，在細(xì)胞裂解物中的5’-utr轉(zhuǎn)錄物通過qrt-pcr定量測(cè)定，結(jié)果計(jì)算為與用溶媒(pbs)對(duì)照處理的細(xì)胞相比的抑制分?jǐn)?shù)。

用于mir-122的rt-pcr的rna提取

按所述³⁹制備用于mir-122的rt-pcr的引物，并進(jìn)行rt-pcr。細(xì)胞的總rna用rna提取試劑rezol^tmc&t(protech，taipei，taiwan)分離。為確定mir-122水平，我們使用taqmanmicrornareversetranscriptionas試劑盒(appliedbiosystems)逆轉(zhuǎn)錄所提取的rna，和將cdna用作mir-122的taqmanmicrorna測(cè)定法的實(shí)時(shí)pcr分析的模板。

合成的sirna和基因沉默

按所述^{15，40，41}，對(duì)閉合蛋白和緊蛋白-1具有特異性的sirna通過dharmacon合成。它們各自的靶序列為uaacauuaggaccuuagaa(緊蛋白-1)和gugaagaguacauggcugc(閉合蛋白)。按所述¹⁶制備npc1l1，和按所述¹⁹制備dgat-1的sirna。在6-孔細(xì)胞板的孔中使用xfect轉(zhuǎn)染試劑(clontech)將特異性sirna轉(zhuǎn)染至hadsc。hcv感染通過與hcvser一起在37℃孵育sirna-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞3h進(jìn)行，然后用pbs洗出hcvser。按所述^{15，19，40，41}，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，裂解細(xì)胞用于rt-pcr以確定基因沉默的程度。在21天的培養(yǎng)后收獲hcvser-感染的hadsc的細(xì)胞裂解物和上清液用于5’-utr的qrt-pcr。

jfh1/hcvcc和huh7.5細(xì)胞

將huh7.5細(xì)胞在含10％熱滅活的胎牛血清(invitrogen)和0.1mm非必需氨基酸(invitrogen)的dmem(invitrogen)中培養(yǎng)。按之前所述⁴²，體外轉(zhuǎn)錄基因組jfh-1rna和通過電穿孔遞送至細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至完全dmem中和每3-4天傳代。在通常的實(shí)踐中，來自用全長jfh1cdna轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基通過離心(3,000xg)10分鐘澄清，和在使用前無菌過濾(0.2μm乙酸纖維素，millipore)。對(duì)于較長期的貯存，將hcvcc等分和貯存在-80℃。通過添加1/4體積的在pbs中的無菌過濾的40％(w/v)聚乙二醇-8000在4℃過夜孵育來濃縮病毒。按所述⁴³，通過離心(8,000xg，15min)收集病毒沉淀物和重懸浮于pbs中。

藥物抑制測(cè)定法

抗病毒藥物利巴韋林、環(huán)孢菌素a和ifnα全都來自sigma-aldrich。特拉匹韋來自selleckchemicals，ma，usa。在培養(yǎng)皿中在第0天，將分級(jí)劑量的利巴韋林、特拉匹韋或環(huán)孢菌素a添加至hcvser-感染的hadsc的培養(yǎng)基中和培養(yǎng)21天。對(duì)于ifnα處理，hadsc用指定劑量的ifnα預(yù)處理16h，然后與hcvser一起孵育。然后定量測(cè)定細(xì)胞裂解物的病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物和計(jì)算為與用溶媒對(duì)照處理的細(xì)胞相比的抑制分?jǐn)?shù)。對(duì)于利巴韋林和ifnα，溶媒對(duì)照為pbs，對(duì)于環(huán)孢菌素a和特拉匹韋，溶媒對(duì)照為0.1％dmso。

hcvser、hcvadsc和hcvcc的浮力密度

按之前所述，hcvcc和hcvadsc的培養(yǎng)基通過peg-8000濃縮。將所有樣品重懸浮于500μl的無血清培養(yǎng)基中和在連續(xù)的碘克沙醇(optiprep，axis-shield，norway)密度梯度上分層，所述梯度為從10％至40％碘克沙醇(各0.5ml)，其用含10mmhepes(ph7.55)、150mmnacl和0.02％bsa的溶液制備，如之前所述⁴⁴。在4℃在sw-41轉(zhuǎn)子(beckmancoulter)中，將梯度在40,000rpm超速離心6小時(shí)。超速離心后，從梯度的頂部收集17個(gè)級(jí)分(各級(jí)分含有500u1)。最終，使用viralrnaminikit(qiagen，basle，switzerland)從各級(jí)分中分離總rna。將rna用于通過定量rt-pcr的hcvrna檢測(cè)。

apob、apoe和膽固醇的測(cè)定

根據(jù)制造商的說明書，將elisa人載脂蛋白b/apob免疫測(cè)定試劑盒和elisa人載脂蛋白e/apoe免疫測(cè)定試劑盒(r&dsystems)用于檢測(cè)apob和apoe表達(dá)。hdl和ldl/vldl的膽固醇通過hdl和ldl/vldl膽固醇測(cè)定試劑盒(abcam)檢測(cè)。在浮力密度的不同級(jí)分中apob、apoe和hdl和ldl/vldl的膽固醇的表達(dá)水平針對(duì)拷貝進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

用hcvser或hcvadsc感染人原代肝細(xì)胞(phh)

新鮮的非腫瘤性肝組織自針對(duì)hcv-相關(guān)或非相關(guān)的肝細(xì)胞癌手術(shù)切除的肝樣本獲取，和按所述⁴⁵分離和培養(yǎng)phh。將phh接板于膠原i包被的6-孔板中3天以允許細(xì)胞附著至該板上。在第4天，溫和洗滌細(xì)胞，和在終體積0.5ml的與hcvser或其相應(yīng)的d21hadsc-增殖的hcv(+)上清液(其含有1x10⁴hcv5’-utr拷貝)混合的無精氨酸williamse培養(yǎng)基(invitrogen，ca，usa)中培養(yǎng)3小時(shí)。感染后，洗滌細(xì)胞和進(jìn)一步在1ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到感染后第5天，其中每天更換新鮮培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞裂解用于rna提取，用于5’-utr的rt-pcr。

實(shí)施例1：hcv體內(nèi)靶向hadsc。

在臨床上，hcv感染的有意義的特征是hcv(+)患者在慢性感染的肝中可具有過度的脂肪積聚，即肝脂肪變性^46，47，肝脂肪變性的嚴(yán)重性似乎與肝纖維化的比率相關(guān)⁴⁸。新近的研究還說明，hcvrna復(fù)制可通過增加飽和脂肪酸的可用性刺激，通過多不飽和脂肪酸或脂肪酸合成的抑制劑抑制^49，50。這些發(fā)現(xiàn)表明，在hcv的生命周期中脂肪代謝起重要作用。因此我們猜測(cè)，脂肪組織的細(xì)胞組分可牽涉到體內(nèi)hcv感染。

為測(cè)試我們的猜測(cè)，我們從hcv-感染或未感染的個(gè)體(表1)收獲皮下脂肪組織和提取rna用于hcv-特異性5’-utr轉(zhuǎn)錄物的rt-pct，其使用hcvser基因型1b(hcvser-1b)作為陽性對(duì)照。

表1

a.皮下脂肪組織和肝組織的hcv(+)供體。所有患者接受針對(duì)肝細(xì)胞癌的外科切除的剖腹術(shù)。從外科創(chuàng)傷(剖腹術(shù))收獲脂肪組織[～(2-2.5cm)³]，和從切除的肝臟的非腫瘤性部分(遠(yuǎn)離損傷)收獲肝組織?；颊呔幪?hào)與圖1f中指出的相同。

注意：患者1-3的樣品用于圖1a-e，和患者1-4的樣品用于圖1f?；颊?的樣品大小比要求的小[～(0.6-1.3cm)³]，因此該樣品的分離的附著svf細(xì)胞僅用于延長培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(在圖1f中)。

b.hcv(-)肝組織的供體?；颊呤莌bv-相關(guān)的或非-b非-c的肝細(xì)胞癌的受害者并接受了肝切除。

注意：在表1a和1b中肝炎病毒感染的診斷在診斷肝細(xì)胞癌時(shí)作出，在組織收獲后給予抗病毒治療。

引人關(guān)注的是，hcv(+)個(gè)體(基因型1b或2a的患者編號(hào)1-3，表1)的脂肪組織含有病毒5’-utr(223bp，圖1a)，與hcv(-)個(gè)體的那些相反。為排除可能的來自血液的污染和確定表達(dá)病毒轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞來源，我們按所述^{12，13，33}通過離心分級(jí)分離脂肪組織成在頂部的含有成熟脂肪細(xì)胞的漂浮層(漂浮物)、在中間的緩沖液層和在底部的沉降的細(xì)胞沉淀(圖5)。收集細(xì)胞沉淀，和進(jìn)一步用rbc裂解緩沖液處理，以裂解紅細(xì)胞，收獲基質(zhì)血管級(jí)分(svf)細(xì)胞。然后從漂浮物層和rbc-裂解的svf細(xì)胞分別提取rna，但幾乎沒有rna能從緩沖液層中提取(數(shù)據(jù)未顯示)。rt-pcr證實(shí)，盡管在漂浮物層中無病毒5’-utr檢出，但病毒轉(zhuǎn)錄物在svf細(xì)胞中檢出(左圖，圖1b)。

接下來，我們按所述¹⁰通過免疫磁珠從svf細(xì)胞陽性選擇dlk-1⁺細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)＞99.7％的陽性選擇的細(xì)胞表達(dá)dlk-1(圖6)。隨后分別從dlk-1⁺和dlk-1^-細(xì)胞提取rna用于rt-pcr，這證實(shí)病毒轉(zhuǎn)錄物存在于dlk-1⁺細(xì)胞中，但不存在于dlk-1^-細(xì)胞中(右圖，圖1b)。我們還對(duì)hcv-特異性負(fù)鏈rna進(jìn)行rt-pcr⁵¹，使用自hcv(+)原代人肝細(xì)胞(phh)提取的rna作為陽性對(duì)照。數(shù)據(jù)證實(shí)，hcv復(fù)制中間體存在于所有的3個(gè)hcv(+)供體的dlk-1⁺細(xì)胞中，但不存在于dlk-1^-細(xì)胞中(375bp；圖1c)。dlk-1⁺和dlk-1^-細(xì)胞還被分別離心到細(xì)胞離心涂片器載玻片上，用于用小鼠抗hcvns5抗體(克隆bgn/1246/5g7)和蘇木精(描繪細(xì)胞核)的免疫細(xì)胞化學(xué)。還染色自hcv(-)個(gè)體分離的細(xì)胞用于比較。與5’-utr的mrna表達(dá)一致，自hcv(+)供體分離的dlk-1⁺細(xì)胞表達(dá)ns5抗原(棕色標(biāo)記，圖c，圖1e)，而dlk-1^-細(xì)胞的ns5表達(dá)接近背景，無論hcv感染狀態(tài)如何(圖b和e)。將用同種型抗體(小鼠igg1)染色的未分級(jí)分離的hcv(+)或hcv(-)svf細(xì)胞用作對(duì)照(圖a和d，圖1e)。蘇木精染色(藍(lán)色標(biāo)記)證實(shí)，ns5⁺細(xì)胞是真正的有核細(xì)胞(圖c，圖1e)，而不是細(xì)胞碎片?？筺s5抗體的特異性在hcv(+)phh的染色中得到證實(shí)(圖7)。

對(duì)于體內(nèi)驗(yàn)證，我們對(duì)自hcv-感染和未感染的個(gè)體收獲的皮下脂肪組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)。首先用抗dlk-1ab染色組織切片。在用pbs浸漬和洗滌后，用抗ns5ab和蘇木精染色相同的切片。結(jié)果顯示，dlk-1在自hcv-感染和未感染的個(gè)體兩者收獲的脂肪組織中在類似于小鼠脂肪組織中描述的位置⁵²中檢出(紅色標(biāo)記，白色箭頭，分別為圖b和c，和h，圖1e)。此外，ns5⁺細(xì)胞在hcv(+)脂肪組織中可見(棕色標(biāo)記，白色箭頭，圖e和f，圖1e)，但在hcv(-)樣品中不可見(圖j)。值得注意的是，在hcv(+)樣品中病毒ns5與dlk-1表達(dá)共定位(圖b對(duì)比e和c對(duì)比f，圖1e；b和e以及c和g來自單獨(dú)的供體；亦見圖8)。在檢查的所有切片中，在hcv(+)脂肪組織的每個(gè)高倍放大視場(chǎng)(400x)中，發(fā)現(xiàn)約0-4個(gè)dlk-1⁺ns5⁺細(xì)胞。

為了確定hcv(+)個(gè)體的hadsc是否產(chǎn)生病毒，我們培養(yǎng)自hcv(+)患者分離的dlk-1⁺細(xì)胞和每7天定量上清液中的病毒拷貝數(shù)。引人關(guān)注的是，盡管在前4周很少病毒轉(zhuǎn)錄物被檢出，但d28-d35之后它們變得在上清液中可檢出和拷貝數(shù)呈時(shí)間依賴性增加(至d49；圖1f)。此外，在延長培養(yǎng)時(shí)病毒轉(zhuǎn)錄物的量似乎與細(xì)胞從中分離的各個(gè)患者的血清病毒滴度相關(guān)(圖1f和表1)。

總之，我們的數(shù)據(jù)提供hcv體內(nèi)靶向hadsc的證據(jù)。

實(shí)施例2：幼稚hcv(-)hadsc在體外對(duì)hcvser感染和復(fù)制敏感

為檢查幼稚hcv(-)hadsc在體外是否對(duì)hcvser感染和復(fù)制敏感，我們從hcv(-)個(gè)體制備hadsc和對(duì)其傳代培養(yǎng)。懸浮的第3代(p-3)或p-4細(xì)胞(在eppendorf管中)與hcvser(表2)在0.2moi以終體積1ml一起孵育(即1x10⁵5’-utr拷貝數(shù)對(duì)比5x10⁵hadsc細(xì)胞)。

表2.用于本研究的hcv(+)血清的hcv基因型和5’-utr拷貝數(shù)。所有患者沒有感染hiv或乙肝病毒的證據(jù)。他們也沒有急性感染性疾病的征兆。從2011年9月至2014年2月收集血清并立即使用或貯存在-80℃直到使用。患者編號(hào)1-5的血清用于圖2a-d，和剩余的血清用于圖2e-f、圖3和圖4。

3h后，洗滌細(xì)胞和轉(zhuǎn)移至6-cm培養(yǎng)皿中用于培養(yǎng)，每7天更換培養(yǎng)基，和在第7、14、21和28天收獲上清液和細(xì)胞裂解物用于rna提取(圖9中的方案)。作為hcvser感染性的對(duì)照，將自非腫瘤肝組織(按所述⁴⁵和表1)分離的hcv(-)phh接板于孔中3天，以允許細(xì)胞附著，然后在第4天與hcvser或hcv(-)對(duì)照血清(血型ab)一起孵育3h；洗滌后，將phh進(jìn)一步培養(yǎng)5天，然后進(jìn)行細(xì)胞rna提取。結(jié)果顯示，暴露于hcvser的phh的確表達(dá)病毒5’utr(標(biāo)記為“+”，左，圖2a)，而暴露于hcv(-)對(duì)照血清的細(xì)胞不表達(dá)(標(biāo)記為“-”)。

在感染后的培養(yǎng)中，病毒轉(zhuǎn)錄物不能在d7-上清液或d7-細(xì)胞裂解物中檢出，但是在所有實(shí)驗(yàn)的d14-細(xì)胞裂解物中變得可檢出，還在18個(gè)實(shí)驗(yàn)的10個(gè)的上清液中可檢出(右，圖2a；總計(jì)18個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用來自8個(gè)供體的hadsc，表3)。同時(shí)，5’-utr在所有實(shí)驗(yàn)的d21和d28上清液兩者中以及在細(xì)胞裂解物中始終被檢出(右，圖2a)。

我們還檢查了hcv-特異性負(fù)鏈rna，結(jié)果證實(shí)d14和d28hcvser-1b感染的hadsc表達(dá)復(fù)制中間體，按所預(yù)期的，其不存在于上清液中(圖2b)。自hcv-感染的患者分離的phh用作陽性對(duì)照。

為進(jìn)一步證實(shí)，將感染的hadsc離心到玻璃載玻片上用于連續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)研究。細(xì)胞首先用抗dlk-1抗體染色，接著在相同切片上用抗ns5抗體和蘇木精染色。結(jié)果顯示，d14hcvser-1b感染的hadsc的確表達(dá)dlk-1(紅色標(biāo)記，圖b，圖2c)，和與rt-pcr發(fā)現(xiàn)相一致，它們還表達(dá)ns5(棕色標(biāo)記，圖d，圖2c)，這與對(duì)照血清脈沖的表達(dá)dlk-1(圖f)但不表達(dá)ns5(圖h)的hadsc相反。用同種型抗體兔igg和小鼠igg1(分別為抗dlk-1和抗ns5抗體的對(duì)照)染色證實(shí)了背景顏色(分別為圖a和c以及e和g)。因?yàn)閹缀跛衕cvser-感染的dlk-1⁺細(xì)胞表達(dá)ns5(圖b對(duì)比d)，因此hadsc對(duì)臨床分離株的感染的許可似乎是一個(gè)普遍化的性質(zhì)，而不是限制于僅一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞子集。

還通過透射電子顯微術(shù)研究了d14和d21hcvser-hadsc。與暴露于hcv(-)對(duì)照血清的hadsc(圖a和d，圖2d)相比，≈50-60nm直徑的病毒顆粒能夠在hadsc的外部(插圖中的白色箭頭，圖b和e，圖2d)和內(nèi)部(插圖中的白色箭頭，圖c和f，圖2d)可見。在細(xì)胞外部鑒定的病毒顆粒被包裹在由雙膜(黃色箭頭和在插圖中放大，圖b)或電子致密膜狀結(jié)構(gòu)(黃色箭頭和在插圖中放大，圖e)構(gòu)成的膜狀囊泡中。相比之下，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的病毒顆粒呈無膜狀包裹的游離形式(黃色正方形和在插圖中放大，圖c；病毒顆粒通過白色箭頭指出)或被多個(gè)環(huán)狀同心膜包圍(“洋蔥形的”，黃色正方形和在插圖中放大，圖f；病毒顆粒通過白色箭頭指出)。

除了感染懸浮的hadsc之外(圖2，a-d)，我們還感染附著的hadsc，即通過將它們接板于6-cm培養(yǎng)皿中1天，然后用hcvser以0.5moi(1x10⁵5’-utr拷貝對(duì)比2x10⁵hadsc細(xì)胞)在終體積2ml中脈沖細(xì)胞3h。在溫和洗滌后，將細(xì)胞在5ml的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每7天更換培養(yǎng)基(圖10)。在第7、14、21和28天提取上清液和細(xì)胞裂解物中的rna并進(jìn)行qrt-pcr。結(jié)果顯示，在第7天病毒轉(zhuǎn)錄物始終在細(xì)胞裂解物中可檢出，盡管它們不存在于上清液中(左圖對(duì)比右圖，圖2e)。此外，在細(xì)胞裂解物中的病毒拷貝在第2周最顯著增加(左圖，圖2e)，而在上清液中的增加以一周的滯后即第3周最明顯(右圖，圖2e)。

為測(cè)量通過該系統(tǒng)生產(chǎn)的總病毒拷貝，我們持續(xù)培養(yǎng)hcvser-感染的hadsc而無培養(yǎng)基更換(圖10)和在指定的培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)收集上清液。qrt-pcr證實(shí)，最多的病毒釋放(至上清液中)發(fā)生在第3周，在28天的培養(yǎng)后總拷貝數(shù)為～3x10⁵/ml(圖2f)。

表3.幼稚hadsc的供體的特征

*tram瓣：橫向腹直肌肌皮瓣

實(shí)施例3：hadsc產(chǎn)生的病毒體是顯示臨床分離株的生物學(xué)性質(zhì)的真正的“病毒體”

為了檢查hadsc產(chǎn)生的病毒體(標(biāo)記為“hcvadsc”)的感染性，我們用hcvser-1b感染了“供體1”的p2hadsc和在第21天收集上清液(標(biāo)記為“hcvadsc(1)”)。通過0.22-μm孔濾器過濾后，使用hcvadsc(1)感染“供體2”的hadsc以制備hcvadsc(2)，其隨后用于感染“供體3”的hadsc。結(jié)果證實(shí)，hcvadsc對(duì)不同供體的幼稚hadsc具有感染性，具有如hcvser初始感染中見到的相對(duì)一致的復(fù)制效率(圖3a)。還對(duì)源自初始被hcvser-1a、-2a和-2b感染的hadsc的上清液的hcvadsc獲得了類似的觀察結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

接下來我們通過用hcvser-1b感染p2、p6、p9和p15hadsc研究了不同傳代數(shù)的hadsc的許可性和在21天的持續(xù)培養(yǎng)后測(cè)量了病毒拷貝。結(jié)果顯示，與p2和p6細(xì)胞相對(duì)比，在上清液和細(xì)胞裂解物兩者中p9和p15hadsc具有極低水平的病毒轉(zhuǎn)錄物(分別為左圖和右圖，圖3b)。對(duì)用hcvser-1a和-2a的感染獲得了類似的觀察結(jié)果(圖11)。在確定幼稚[hcv(-)]hadsc的dlk-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，dlk-1表達(dá)可從p0至p6檢出，但在p9時(shí)降低和在p15時(shí)不可檢出(圖3c)，遵循如對(duì)于hcv感染的許可性所注意到的類似的趨勢(shì)。

此外，hadsc似乎對(duì)基因型1或2的感染沒有偏愛(圖3b和圖11)。為對(duì)其做進(jìn)一步檢查，我們用混合的基因型2a+2b的hcvser感染了p5hadsc和收集細(xì)胞用于rt-pcr以檢測(cè)編碼基因型特異性核心抗原的mrna。事實(shí)上，混合的2a+2bhcvser本身(作為陽性對(duì)照)表達(dá)編碼基因型2a和2b兩者的核心抗原的mrna(174和123bp，泳道“p”，分別為左圖和右圖；圖3d)，其也在基因型2a+2b感染的hadsc的d21和d56細(xì)胞裂解物中被檢出。在該實(shí)驗(yàn)中，通過hcv(-)對(duì)照血清脈沖的細(xì)胞用作陰性對(duì)照(標(biāo)記為“n”)。因此，hadsc對(duì)于被臨床分離株感染的許可性是跨越基因型的，至少對(duì)于基因型1a、1b、2a和2b是如此。

宿主因子，包括四跨膜蛋白(tetraspanin)cd81、ldl-r、sr-b1、表皮生長因子受體(egfr)、載脂蛋白(apo)e、閉合蛋白、緊蛋白-1、niemann-pickc1-樣1(npc1l1)膽固醇吸收受體和二?；视鸵阴＾D(zhuǎn)移酶-1(dgat-1)，已顯示在病毒附著或附著后步驟中介導(dǎo)在人肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞系中的hcv感染/復(fù)制^{15，16，19，53-58}。我們通過流式細(xì)胞術(shù)或rt-pcr檢查了這些分子在hadsc中的表達(dá)。

流式細(xì)胞術(shù)顯示，p0(即附著的svf細(xì)胞)、p2和p6hadsc明顯表達(dá)cd81、ldl-r、sr-b1和egfr(圖3e)。rt-pcr也證實(shí)編碼閉合蛋白(ocln)、緊蛋白-1(cldn1)和npc1l1而非mir-122的mrna的表達(dá)(左，圖3f)。相比之下，mir-122在huh7.5肝癌細(xì)胞中大量表達(dá)(為hadsc的～60倍高)和在phh中甚至更高豐度(～2000倍高；右，圖3f)。

為了確定這些分子的作用，我們用分級(jí)劑量的針對(duì)cd81(克隆js-81)、ldl-r(克隆c7)、egfr(克隆la-1)的單克隆ab或針對(duì)sr-b1的多克隆ab預(yù)處理p2hadsc達(dá)1h，然后通過hcvser-1b脈沖。對(duì)于apoe阻斷，按所述¹⁴在室溫下將各種濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)添加至hcv(+)血清達(dá)1h，然后用于感染。在21天的上清液中的病毒轉(zhuǎn)錄物的定量顯示，在hcv(+)血清中的cd81、ldl-r、sr-b1、egfr的阻斷和還有apoe的中和以劑量依賴方式顯著降低病毒拷貝的量；同時(shí)，處理本身未顯著影響細(xì)胞成活力(圖3g)。還注意到在細(xì)胞裂解物的病毒拷貝中的類似的劑量-響應(yīng)降低(圖12)。

在通過hcvser-1b感染之前，我們還按所述^15，16用對(duì)閉合蛋白或緊蛋白-1具有特異性的sirna或在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中用對(duì)npc1l1具有特異性的sirna轉(zhuǎn)染p2hadsc。我們還檢查了dgat-1的作用，dgat-1是運(yùn)輸hcv核衣殼核心至脂質(zhì)小滴所需要的分子，對(duì)于在肝癌細(xì)胞系中hcv的產(chǎn)生是重要的¹⁹。rt-pcr證實(shí)mrna敲減的影響(圖13)，其隨后降低在21天的培養(yǎng)后的上清液(圖3h)和細(xì)胞裂解物(圖13)中的病毒拷貝。

最后，我們檢查了抗病毒藥物的抑制作用。將p4-5的細(xì)胞接板于孔中，暴露于hcvser-1b，和將分級(jí)濃度的包括利巴韋林、特拉匹韋或環(huán)孢菌素a(親環(huán)蛋白a抑制劑)在內(nèi)的抗病毒藥物添加至培養(yǎng)基中。對(duì)于ifnα處理，hadsc用指定劑量的ifnα預(yù)處理16h，然后與hcvser一起孵育。然后測(cè)定21天的細(xì)胞裂解物中的病毒轉(zhuǎn)錄物，并計(jì)算為與用溶媒對(duì)照處理的細(xì)胞相比的抑制分?jǐn)?shù)。結(jié)果證實(shí)，hcv復(fù)制以劑量-響應(yīng)方式受到利巴韋林、特拉匹韋、環(huán)孢菌素a和ifnα抑制(圖3i)。在我們的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)了在p0、p2和p6hadsc中親環(huán)蛋白a的表達(dá)(圖14)。因此，hcvadsc是顯示臨床分離株的生物學(xué)性質(zhì)的真正的“病毒體”。

實(shí)施例4：hadsc是允許完全的hcv復(fù)制的體內(nèi)hcv貯庫

為了表征hcvadsc的物理性質(zhì)，我們按所述⁴³通過平衡離心比較了hcvser、hcvcc和hcvadsc的浮力密度特征。研究的所有病毒源自基因型2a。與之前報(bào)道^{43，59，60}相一致，hcvser在較低密度1.039(級(jí)分2)和1.080(級(jí)分7)的級(jí)分中具有大量的rna，而hcvcc的rna在1.132(級(jí)分13；圖4a)達(dá)到峰值。hcvadsc的最大量的rna在密度1.080(級(jí)分7)中見到，接著是在較高密度1.124和1.156(級(jí)分12和15)中的兩個(gè)峰。引人關(guān)注的是，在hcvadsc的1.080處的峰與hcvser相同(圖4a)。因此，hcvadsc的物理性質(zhì)比hcvcc更類似于臨床分離株。

我們還確定了各主要級(jí)分的脂質(zhì)和載脂蛋白(apo)特征，包括hdl、vldl/ldl和apoe和apob。與hcvcc和hcvadsc相比，hcvser似乎具有最高的總脂質(zhì)量(圖15)，這不是意外的，因?yàn)椴《驹鲋车奈h(huán)境不同(血清對(duì)比培養(yǎng)基)。此外，當(dāng)表示為重量(ng)/病毒拷貝時(shí)，hcvcc級(jí)分13具有最低的hdl和ldl/vldl含量(圖4b)。hcvser的主要級(jí)分還具有最高的apoe含量(按照pg/拷貝計(jì))，接著是hcvadsc，hcvcc級(jí)分13幾乎沒有可檢出的apoe水平(圖4c)。因此，在病毒顆粒相關(guān)的脂質(zhì)含量中，hcvadsc還顯示與hcvser比與hcvcc更多的相似性。引人關(guān)注的是，在hcvadsc的任何級(jí)分中未檢出apob，暗示apob可能對(duì)于hadsc中的感染不是必需的，這與apoe相反(圖3g)。

我們還通過用jfh1/hcvcc的病毒接種物以及hcvser感染p2hadsc比較了各種病毒對(duì)hadsc的感染性。平行進(jìn)行作為對(duì)照的在huh7.5細(xì)胞中的hcvcc復(fù)制。我們發(fā)現(xiàn)，與在huh7.5細(xì)胞中的hcvcc的有效復(fù)制(圖16)相反，hcvcc-感染的hadsc在14天或21天的培養(yǎng)后在上清液或細(xì)胞裂解物中產(chǎn)生很少的5’-utr轉(zhuǎn)錄物(圖4d)，hadsc的hcvser感染顯示與之前類似的復(fù)制動(dòng)力學(xué)(圖4d對(duì)比3a)。還收集幼稚huh7.5和hcvcc-感染的huh7.5細(xì)胞的21天的上清液以及hcvcc或hcvser感染的hadsc的那些上清液用于rna提取和進(jìn)行rt-pcr。結(jié)果證實(shí)，在hcvcc-感染的hadsc上清液中無病毒轉(zhuǎn)錄物被檢出(泳道3，體4e)，這與huh7.5的hcvcc感染和hadsc的hcvser感染相反(分別為泳道2和4，圖4e)。

接下來我們檢查了hcvadsc對(duì)幼稚phh的感染性。phh按所述⁴⁵自hcv(-)個(gè)體分離，培養(yǎng)3天(1x10⁴細(xì)胞/皿)以允許細(xì)胞附著，隨后暴露于自hcvser-1b感染的hadcs培養(yǎng)物的21天的上清液制備的hcvadsc。感染后5天提取細(xì)胞rna用于rt-pcr。結(jié)果顯示，與通過對(duì)照血清脈沖的hadsc的上清液的感染(作為陰性對(duì)照，泳道“1”，圖4f)相反，hcvadsc-感染的phh的確表達(dá)病毒5’-utr(標(biāo)記為“2”和“3”，圖4f)。

最后，按之前所述制備來自3個(gè)不同供體的phh，并接種到孔中。在第4天，通過hcv(-)對(duì)照血清(來自3個(gè)不同個(gè)體)、hcvser-1b(來自3個(gè)單獨(dú)的供體)和其相應(yīng)的hcvadsc感染細(xì)胞。hcvser和相應(yīng)的hcvadsc配對(duì)感染同一批次的phh。感染后5天收集上清液和定量5’-utr拷貝。phh暴露于hcv(-)對(duì)照血清用作陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，hcvser的感染產(chǎn)生高度變化的復(fù)制動(dòng)力學(xué)，如之前在用臨床分離株對(duì)phh的感染中所報(bào)道⁶¹。被hcvadsc的感染還導(dǎo)致病毒滴度增加，在hcvser感染的情況下病毒滴度高度變化(圖4g)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了hcvadsc對(duì)肝細(xì)胞的感染性。

總之，hadsc是體內(nèi)hcv貯庫，其允許完全的hcv復(fù)制和代表了之前未被認(rèn)識(shí)的臨床hcv-宿主相互作用位點(diǎn)。此外，hadsc是第一類非肝原代細(xì)胞，其允許臨床hcv分離株的體外增殖，其可成為用于解釋hcv生命周期和促進(jìn)抗病毒策略的發(fā)展的新工具。

本說明書中提及的所有出版物和專利通過引用結(jié)合到本文中。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明的所述方法和系統(tǒng)的各種改變和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。盡管已結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過度限制于這樣的特定實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種變化，意欲包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

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