發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、分析和處理核酸的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生和使用雜交探針的組合物和方法。

背景

fish（熒光原位雜交）是用于檢測(cè)和定位特定dna序列在染色體上存在與否的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。fish使用這樣的熒光探針，所述熒光探針僅結(jié)合它們與其顯示高度序列互補(bǔ)性的染色體的那些部分。熒光顯微術(shù)可用于發(fā)現(xiàn)熒光探針結(jié)合染色體的部位。fish經(jīng)常用于發(fā)現(xiàn)用于遺傳咨詢、醫(yī)學(xué)和物種鑒定的dna中的特定特征。fish也可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和組織樣品中的特定rna靶標(biāo)（mrna、lncrna和mirna）。在本上下文中，其可以幫助確定在細(xì)胞和組織中基因表達(dá)的時(shí)空模式。

人基因組dna是在整個(gè)基因組中以多個(gè)拷貝存在的唯一序列和重復(fù)序列的混合物。在一些應(yīng)用中，期望產(chǎn)生僅與染色體上的目標(biāo)唯一序列退火的雜交探針。唯一序列探針的制備受到整個(gè)生物基因組中大量類別的重復(fù)序列的存在的擾亂(hood等人,molecμlarbiologyofeucaryoticcells(benjamin/cummingspublishingcompany,menlopark,calif.1975)。雜交探針中重復(fù)序列的存在降低了探針的特異性，因?yàn)樘结樀牟糠纸Y(jié)合目標(biāo)序列之外發(fā)現(xiàn)的其他重復(fù)序列。因此，為了確保雜交探針與特定目標(biāo)序列的結(jié)合，需要缺少重復(fù)序列的探針。

近期的貢獻(xiàn)通過(guò)使用未標(biāo)記的阻斷核酸抑制重復(fù)序列的雜交而解決這一問(wèn)題（美國(guó)專利號(hào)5,447,841和美國(guó)專利號(hào)6,596,479)。在雜交中使用阻斷核酸是昂貴的，不會(huì)完全阻止重復(fù)序列的雜交，并且可能使基因組雜交模式產(chǎn)生偏差(newkirk等人,“distortionofquantitativegenomicandexpressionhybridizationbycot-1dna:mitigationofthiseffect,”nucleicacidsres.vol33(22):el91(2005))。因此，需要不使用阻斷dna而阻止重復(fù)序列的雜交的方法用于最優(yōu)雜交。

實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的一個(gè)方法是在雜交之前從雜交探針中去除不想要的重復(fù)區(qū)段。之前已經(jīng)描述了涉及去除高度重復(fù)序列的技術(shù)。吸收劑如羥磷灰石提供用于從提取的dna中去除高度重復(fù)序列的方法。羥磷灰石層析基于雙鏈體再結(jié)合條件諸如溫度、鹽濃度或其他嚴(yán)格性來(lái)將dna分級(jí)。這一程序是麻煩的且隨不同序列而不同。重復(fù)dna也可以通過(guò)雜交至固定dna來(lái)去除(brison等人,“generalmethodsforcloningamplifieddnabydifferentialscreeningwithgenomicprobes,”molecularandcellularbiology,vol.2,pp.578-587(1982))。在所有這些程序中，物理去除重復(fù)序列將取決于基于dna序列的堿基組成用內(nèi)在不同嚴(yán)格優(yōu)化條件。

已經(jīng)描述了用于從雜交探針中去除重復(fù)序列的若干其他方法。一種方法涉及使用交聯(lián)劑來(lái)交聯(lián)重復(fù)序列以直接阻止重復(fù)序列的雜交或以阻止重復(fù)序列在pcr反應(yīng)中的擴(kuò)增。（美國(guó)專利號(hào)6,406,850)。另一種方法使用pcr輔助的親和層析以從雜交探針中去除重復(fù)（美國(guó)專利號(hào)6,569,621)。這兩種方法都依賴于使用標(biāo)記的dna來(lái)去除重復(fù)序列，這使得這些方法復(fù)雜且難以重現(xiàn)。進(jìn)一步，兩種方法都是耗時(shí)的，需要多輪重復(fù)去除以產(chǎn)生適合用于熒光原位雜交（fish）或其他需要高度靶特異性的雜交反應(yīng)的功能探針。

因此，需要從探針中去除重復(fù)序列的方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、分析和處理核酸的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生和使用雜交探針的組合物和方法。

本技術(shù)的實(shí)施方案提供用于產(chǎn)生和使用選擇性產(chǎn)生或合成以排除非目標(biāo)序列和/或包括目標(biāo)序列的探針（例如，實(shí)質(zhì)上不含重復(fù)片段的核酸探針）的組合物、試劑盒和系統(tǒng)。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp（例如，至少100、200、至少300或至少400）的目標(biāo)核酸的不想要的序列（例如，無(wú)重復(fù)片段、非保守序列、保守序列、富含gc的序列、富含at的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)或編碼序列）且任選地彼此長(zhǎng)度不超過(guò)20%不同（例如，20%或更少、10%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、3%或更少、1%或更少、或相同長(zhǎng)度）的區(qū)域；和b）產(chǎn)生（例如經(jīng)擴(kuò)增、克隆、合成或其組合）對(duì)應(yīng)于實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含以下步驟的一個(gè)或多個(gè)：c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；和d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集以產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的探針（例如，缺少例如不想要的重復(fù)序列的ish探針）。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括d）根據(jù)大小分開(kāi)探針的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述分開(kāi)使用層析或電泳進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分離探針的子集的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述子集基于分開(kāi)的核酸的大小。在一些實(shí)施方案中，探針連接核酸銜接子。在一些實(shí)施方案中，銜接子是擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，將擴(kuò)增引物功能化用于下游應(yīng)用（例如通過(guò)添加標(biāo)記、結(jié)合位點(diǎn)或限制位點(diǎn)）。在一些實(shí)施方案中，將探針?lè)珠_(kāi)和將探針子集分離。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增是pcr。在一些實(shí)施方案中，使用計(jì)算機(jī)軟件和計(jì)算機(jī)處理器鑒定實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)超聲處理將含探針的核酸片段化（盡管可以使用多種其他化學(xué)、物理方法或其他方法的任一種）。在一些實(shí)施方案中，所述分開(kāi)通過(guò)電泳或?qū)游鲞M(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度為約100至500bp，盡管也可以使用其他長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，探針是標(biāo)記的（例如，用熒光標(biāo)記）。在一些實(shí)施方案中，探針為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%不含不想要的核酸序列。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；d）將銜接子連接至探針；和任選地e）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；和任選地d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

另外的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域，其中所述不想要的區(qū)域?yàn)槔玳L(zhǎng)度為至少100bp的重復(fù)序列、非保守序列、保守序列、富含gc的序列、富含at的序列、二級(jí)序列或編碼序列；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；和c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；和任選地d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

仍其他的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；d）通過(guò)大小分開(kāi)探針；e）分離探針的子集；和任選地e）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

還其他的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；d）通過(guò)大小分開(kāi)探針；e）分離探針的子集，其中所述子集包含長(zhǎng)度為80-300bp的核酸（例如，長(zhǎng)度大約150bp）；和任選地e）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

另外的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；任選地d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集產(chǎn)生探針組；和e）用所述探針組進(jìn)行雜交測(cè)定（例如ish測(cè)定）。

本文進(jìn)一步提供通過(guò)上述方法產(chǎn)生的不含不想要的序列的一組核酸探針（例如雜交探針（例如，原位雜交（ish）探針））和包含所述探針的試劑盒和系統(tǒng)。本公開(kāi)不限于具體測(cè)定或靶標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，探針檢測(cè)癌基因的表達(dá)或染色體非整倍性。

本文另外提供進(jìn)行雜交測(cè)定的方法，包括將靶核酸與通過(guò)上述方法產(chǎn)生的探針（例如ish探針）接觸。

本文還提供任何通過(guò)上述方法產(chǎn)生的探針（例如ish探針）在雜交（例如ish）測(cè)定中的用途。

本文描述了另外的實(shí)施方案。

附圖說(shuō)明

圖1顯示本發(fā)明的實(shí)施方案的示例性標(biāo)記的探針的圖示。

圖2顯示her3基因座的圖譜。

圖3顯示從her基因座擴(kuò)增無(wú)重復(fù)片段的探針。

圖4顯示來(lái)自her2基因座的片段化的探針。

圖5顯示銜接的(adapted)her2探針的擴(kuò)增。

圖6顯示her2無(wú)重復(fù)片段探針。

圖7顯示使用本發(fā)明的實(shí)施方案的探針的her2基因座的fish雜交。

圖8顯示選擇用于設(shè)計(jì)her-2探針的her-2基因的80bp部分。

圖9顯示示例性的無(wú)重復(fù)片段的p16探針的圖譜。

定義

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上不含不想要的核酸”指實(shí)質(zhì)上不含（例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%不含）不想要的核酸的核酸。不想要的核酸包括但不限于重復(fù)核酸、非保守序列、保守序列、富含gc的序列、富含at的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)或編碼序列。

如所用，術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上不含重復(fù)片段(repeatfree)的核酸序列”或“不含重復(fù)片段(freeofrepeats)的核酸”指實(shí)質(zhì)上不含（例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%不含）重復(fù)的核酸序列的核酸區(qū)域。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“樣品”以其最廣泛的含義使用。在一種含義中，其意指包括細(xì)胞（例如，人、細(xì)菌、酵母和真菌）、生物、獲自任何來(lái)源的樣本或培養(yǎng)物、以及生物樣品。生物樣品可以獲自動(dòng)物（包括人）并且指其中發(fā)現(xiàn)的生物材料或組合物，包括但不限于骨髓、血液、血清、血小板、血漿、間隙液、尿液、腦脊液、核酸、dna、組織、及其純化或過(guò)濾形式。然而，這些實(shí)例不應(yīng)解釋為限定可用于本發(fā)明的樣品類型。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指可用于提供可檢測(cè)的（優(yōu)選可定量的）效果且可以連接至核酸或蛋白的任何原子或分子。標(biāo)記包括但不限于染料；放射性標(biāo)記，諸如³²p；結(jié)合部分諸如生物素；半抗原諸如地高辛；發(fā)光、發(fā)磷光或發(fā)熒光部分；和單獨(dú)的熒光染料或與可以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）抑制或移動(dòng)發(fā)射光譜的部分組合的熒光染料。標(biāo)記可以提供可通過(guò)熒光、放射性、比色、重量測(cè)定、x射線衍射或吸收、磁性、酶活性等檢測(cè)的信號(hào)。標(biāo)記可以是帶電荷的部分（正電荷或負(fù)電荷）或可選地，可以是電荷中性的。標(biāo)記可以包括核酸或蛋白序列或由其組合，只要包含標(biāo)記的序列是可檢測(cè)的。在一些實(shí)施方案中，核酸在沒(méi)有標(biāo)記的情況下直接檢測(cè)（例如，直接讀取序列）。

如文本所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”指任何包含核酸的分子，包括但不限于dna或rna。該術(shù)語(yǔ)涵蓋包含dna和rna的任何已知堿基類似物的序列，所述類似物包括但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-（羧基羥基甲基）尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、n6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、氧基丁氧基胸苷（oxybutoxosine）、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交”用于指互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交和雜交強(qiáng)度（即核酸之間結(jié)合的強(qiáng)度）受此類因素如核酸之間的互補(bǔ)性程度、所涉及的條件的嚴(yán)格性、形成的雜交物的tm以及核酸內(nèi)的g:c比率的影響。在其結(jié)構(gòu)內(nèi)含有互補(bǔ)核酸的配對(duì)的單一分子將是“自雜交的”。

術(shù)語(yǔ)“引物”指寡核苷酸，無(wú)論其是在經(jīng)純化的限制性消化物中天然存在或是合成產(chǎn)生的，所述寡核苷酸當(dāng)置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(shí)（例如，存在核苷酸和誘導(dǎo)劑諸如dna聚合酶和在合適的溫度和ph下），能夠作為合成的起始點(diǎn)而起作用。引物優(yōu)選是單鏈的用于擴(kuò)增的最大效率，但可選地也可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，則在用于制備延伸產(chǎn)物前首先將引物處理以分開(kāi)其鏈。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物應(yīng)足夠長(zhǎng)以在誘導(dǎo)劑存在的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長(zhǎng)度將取決于許多因素包括溫度、引物來(lái)源和方法的使用。例如，在一些實(shí)施方案中，引物范圍為10-100或更多個(gè)核苷酸（例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50個(gè)核苷酸等）。

在一些實(shí)施方案中，引物包含不與目標(biāo)核酸雜交的另外的序列。術(shù)語(yǔ)“引物”包括化學(xué)修飾的引物、熒光修飾的引物、功能引物（融合引物）、序列特異性引物、隨機(jī)引物、具有特異性和隨機(jī)序列的引物、和dna和rna引物。

術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增（amplifying或amplification）”在核酸的上下文中指產(chǎn)生多個(gè)拷貝的多核苷酸、或多核苷酸的部分，通常從少量的多核苷酸開(kāi)始（例如，少至單個(gè)多核苷酸分子），其中擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增子通常是可檢測(cè)的。多核苷酸的擴(kuò)增包括多種化學(xué)和酶促方法。在聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）、滾環(huán)擴(kuò)增（rca）或連接酶鏈反應(yīng)（lcr）過(guò)程中從一個(gè)或幾個(gè)拷貝的靶dna或模板dna分子產(chǎn)生多個(gè)dna拷貝是擴(kuò)增的形式。擴(kuò)增不限于起始分子的嚴(yán)格復(fù)制。例如，使用逆轉(zhuǎn)錄(rt)-pcr從樣品中有限量的rna產(chǎn)生多個(gè)cdna分子是擴(kuò)增的形式。此外，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程期間從單一dna分子產(chǎn)生多個(gè)rna分子也是擴(kuò)增的形式。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“固體支持物”用于指試劑諸如抗體、抗原和其他測(cè)試組分與其連接的任何固體或固定的材料。固體支持物的實(shí)例包括顯微鏡載玻片、微量滴定板的孔、蓋玻片、珠粒、顆粒、細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及任何其他合適的物品。

本發(fā)明實(shí)施方案詳述

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)、分析和處理核酸的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生和使用雜交探針的組合物和方法。

本技術(shù)的實(shí)施方案提供用于產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的探針（例如，缺少不想要的序列諸如重復(fù)序列的fish探針）的組合物和方法，其解決了通過(guò)提供多步驟或另外繁瑣方法從探針中去除不想要的序列的現(xiàn)有方法中的限制。

舉例說(shuō)明用于產(chǎn)生無(wú)重復(fù)片段的ish探針的本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解所公開(kāi)的方法也可以應(yīng)用于其他不想要的序列和其他探針應(yīng)用。

fish探針中存在重復(fù)序列導(dǎo)致含相似重復(fù)片段的其他基因座中的背景信號(hào)。此外，這不必要地增加了fish探針的量(bulk)，導(dǎo)致浪費(fèi)材料。最后，不論重復(fù)序列，fish探針通常從直接產(chǎn)生自長(zhǎng)度超過(guò)100kb的bac序列的dna制備。本文提供的方法允許選擇非重復(fù)序列，對(duì)于目標(biāo)基因組區(qū)域是特異的，規(guī)避了獲得覆蓋目標(biāo)基因組區(qū)域的bac中的潛在問(wèn)題并且克服了產(chǎn)生無(wú)重復(fù)片段的探針的現(xiàn)有方法中的缺點(diǎn)（參見(jiàn)例如rogan等人,genomeresearch11:1086-1094,2001;commerciallyavailableprobesfromkreatech,durham,nc;sealey等人nuc.acid.res.volume13number61985;dorman等人,nucleicacidsresearch,2013,vol.41,no.7;boyle等人,chromosomeres.2011oct;19(7):901-9;和craig等人,humgenet(1997)100:472-476)。

本文描述的探針提供了相對(duì)于現(xiàn)有探針的以下優(yōu)點(diǎn)：降低來(lái)自重復(fù)序列的干擾；消除了對(duì)于人dna阻斷劑的需要；更快的雜交時(shí)間；更高的雜交溫度（例如，更容易去除探針且更均一的雜交溫度），導(dǎo)致更快的雜交時(shí)間；經(jīng)擴(kuò)增制備（例如pcr）實(shí)現(xiàn)更迅速、更便宜、更可靠的制造；并且，一旦制備，模板可以在按比例擴(kuò)大和制造應(yīng)用中使用。

i.探針的產(chǎn)生

下文描述產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的探針的示例性方法。舉例說(shuō)明用于產(chǎn)生ish（例如fish）探針的本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解所公開(kāi)的方法也可以應(yīng)用于其他不想要的序列和其他探針應(yīng)用。

本技術(shù)的實(shí)施方案提供用于產(chǎn)生和使用選擇性產(chǎn)生或合成以排除非目標(biāo)序列和/或包括目標(biāo)序列的探針（例如，實(shí)質(zhì)上不含重復(fù)片段的核酸探針）的組合物、試劑盒和系統(tǒng)。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp（例如，至少100、200、至少300或至少400）的目標(biāo)核酸的不想要的序列（例如，無(wú)重復(fù)片段、非保守序列、保守序列、富含gc的序列、富含at的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)或編碼序列）且任選地彼此長(zhǎng)度不超過(guò)20%不同（例如，20%或更少、10%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、3%或更少、1%或更少、或相同長(zhǎng)度）的區(qū)域；和b）產(chǎn)生（例如經(jīng)擴(kuò)增、克隆、合成或其組合）對(duì)應(yīng)于實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟的一個(gè)或多個(gè)：c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；和d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集以產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的探針（例如，缺少例如不想要的重復(fù)序列的ish探針）。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括d）根據(jù)大小分開(kāi)探針的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述分開(kāi)使用層析或電泳進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分離探針的子集的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述子集基于分開(kāi)的核酸的大小。在一些實(shí)施方案中，探針連接核酸銜接子。在一些實(shí)施方案中，銜接子是擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，將擴(kuò)增引物功能化用于下游應(yīng)用（例如通過(guò)添加標(biāo)記、結(jié)合位點(diǎn)或限制位點(diǎn)）。在一些實(shí)施方案中，將探針?lè)珠_(kāi)和將探針子集分離。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增是pcr。在一些實(shí)施方案中，使用計(jì)算機(jī)軟件和計(jì)算機(jī)處理器鑒定實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)超聲處理將含探針的核酸片段化（盡管可以使用多種其他化學(xué)、物理方法或其他方法的任一種）。在一些實(shí)施方案中，所述分開(kāi)通過(guò)電泳或?qū)游鲞M(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度為約100至500bp，盡管也可以使用其他長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記探針（例如，用熒光標(biāo)記）。在一些實(shí)施方案中，探針為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%不含不想要的核酸序列。

在一些實(shí)施方案中，探針長(zhǎng)度為大約50-1000bp。例如，在一些實(shí)施方案中，探針為50-900bp、50-800bp、50-700bp、50-600bp、50-500bp、50-450bp、50-400bp、50-350bp、50-300bp、50-250bp、50-200bp、50-150bp、50-100bp、80-900bp、80-800bp、80-700bp、80-600bp、80-500bp、80-450bp、80-400bp、80-350bp、80-300bp、80-250bp、80-200bp、80-150bp、80-100bp、100-900bp、100-800bp、100-700bp、100-600bp、100-500bp、100-450bp、100-400bp、100-350bp、100-300bp、100-250bp、100-200bp、100-150bp、150-900bp、150-800bp、150-700bp、150-600bp、150-500bp、150-450bp、150-400bp、150-350bp、150-300bp、150-250bp、150-200bp、150-150bp、或80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、或150bp。在一些實(shí)施方案中，探針為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%不含不想要的核酸序列。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；d）將銜接子連接至探針；和任選地e）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；和任選地d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

另外的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域，其中所述不想要的區(qū)域?yàn)槔玳L(zhǎng)度為至少100bp的重復(fù)序列、非保守序列、保守序列、富含gc的序列、富含at的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)或編碼序列；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；和c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；和任選地d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

仍其他的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；d）通過(guò)大小分開(kāi)探針；e）分離探針的子集；和任選地e）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

還其他的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；d）通過(guò)大小分開(kāi)探針；e）分離探針的子集，其中所述子集包含長(zhǎng)度為80-300bp的核酸（例如，長(zhǎng)度大約150bp）；和任選地e）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集。

另外的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)核酸的探針的方法，其包括：a）鑒定目標(biāo)核酸靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)上不含長(zhǎng)度為至少100bp的不想要的序列的區(qū)域；b）產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所述實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的區(qū)域的多個(gè)含探針的核酸；c）將所述含探針的核酸片段化以產(chǎn)生探針；任選地d）進(jìn)一步擴(kuò)增探針的子集產(chǎn)生探針組；和e）用所述探針組進(jìn)行雜交測(cè)定（例如ish測(cè)定諸如fish）。

本文進(jìn)一步提供通過(guò)上述方法產(chǎn)生的無(wú)不想要的序列的一組核酸探針（例如ish探針）和包含所述探針的試劑盒和系統(tǒng)。

本文另外提供進(jìn)行雜交測(cè)定的方法，包括將靶核酸與通過(guò)上述方法產(chǎn)生的探針（例如ish探針）接觸。

本文還提供任何通過(guò)上述方法產(chǎn)生的探針（例如ish探針）在雜交（例如ish）測(cè)定中的用途。

下文詳細(xì)地描述了產(chǎn)生探針的示例性方法。

a.探針

本發(fā)明在一些實(shí)施方案中提供了產(chǎn)生探針文庫(kù)的方法。在一些實(shí)施方案中，探針長(zhǎng)度為大約100-400bp（例如，長(zhǎng)度100-300bp）。

在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生與靶序列的不同區(qū)域互補(bǔ)的探針的文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，文庫(kù)中所有的探針具有相似的長(zhǎng)度（例如，在長(zhǎng)度1%、2%、3%、4%或5%、10%、20%之內(nèi)或長(zhǎng)度相同）。

探針可以包含任何數(shù)目的修飾的堿基、修飾的骨架（包括小溝結(jié)合劑）和標(biāo)記（例如，如下文更詳細(xì)所述）。此類類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-o-甲基核糖核苷酸和肽-核酸（pna）。

b.不想要的序列的鑒定

本發(fā)明不限于具體類型的不想要的序列。在一些實(shí)施方案中，不想要的序列例如是重復(fù)序列、非保守序列、保守序列、富含gc的序列、富含at的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)和編碼序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，將無(wú)重復(fù)片段的序列去除以優(yōu)化探針結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，首先鑒定目標(biāo)區(qū)域中基因組dna的實(shí)質(zhì)上不含重復(fù)片段或其他不想要的區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)區(qū)域中基因組dna的連續(xù)的無(wú)重復(fù)片段的區(qū)段通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定。本發(fā)明不限于具體的生物信息學(xué)方法。在一些實(shí)施方案中，采用商業(yè)軟件包諸如例如repeatmaskerfunctionofucscgenomebrowser(可獲自thenationalcancerinstitute'scenterforbiomedicalinformaticsandinformationtechnology)，盡管也具體考慮其他商業(yè)或非商業(yè)軟件包。

在一些實(shí)施方案中，使用repeat-maskerfunctionofgenomebrowser來(lái)通過(guò)將重復(fù)序列以小寫字母呈現(xiàn)且將非重復(fù)序列以大寫字母呈現(xiàn)來(lái)區(qū)分重復(fù)與非重復(fù)部分，并且下載序列。使用外部軟件程序或序列信息的手動(dòng)檢查來(lái)去除序列的重復(fù)部分并以其長(zhǎng)度次序呈現(xiàn)連續(xù)非重復(fù)序列的段。丟棄更短的段（通常少于300bp），并且鑒定大量更長(zhǎng)的段使得它們組合的序列長(zhǎng)度足以制備具有可接受的標(biāo)記密度用于預(yù)期用途的探針。

c.探針的產(chǎn)生

鑒定不想要的序列后，設(shè)計(jì)實(shí)質(zhì)上不含不想要的序列的探針。可以使用任何合適的方法來(lái)產(chǎn)生探針。在一些實(shí)施方案中，使用下面所述的方法擴(kuò)增探針。

在一些實(shí)施方案中，合成探針文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，合成探針包含與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域和不與靶序列互補(bǔ)的標(biāo)記區(qū)域（參見(jiàn)例如圖1）。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記的區(qū)域在探針文庫(kù)中是相同的。在一些實(shí)施方案中，用為分支的或另一種非直鏈構(gòu)型的標(biāo)記區(qū)域產(chǎn)生探針。

在一些實(shí)施方案中，合成用于擴(kuò)增方法或探針產(chǎn)生的寡核苷酸。用于寡核苷酸合成的示例性方法描述于本文。為了獲得期望的寡核苷酸，將構(gòu)建模塊以產(chǎn)物序列所要求的次序順序偶聯(lián)至生長(zhǎng)中的寡核苷酸鏈。自從20世紀(jì)70年代晚期，該方法已完全自動(dòng)化。完成鏈裝配后，將產(chǎn)物從固相釋放至溶液，去保護(hù)并收集。產(chǎn)物通常通過(guò)高效液相層析（hplc）分離來(lái)獲得高純度的期望的寡核苷酸。通常，合成的寡核苷酸是長(zhǎng)度約為15-25個(gè)堿基的單鏈dna或rna分子。

在一些實(shí)施方案中，核苷間鍵的形成的選擇性和速率通過(guò)使用核苷的3'-o-(n,n-二異丙基)亞磷酰胺)衍生物（核苷亞磷酰胺）（其用作亞磷酸三酯法中的構(gòu)建模塊）來(lái)改進(jìn)。為了阻止不想要的副反應(yīng)，核苷中存在的所有其他官能團(tuán)通過(guò)連接保護(hù)基團(tuán)而變得無(wú)反應(yīng)性的（受保護(hù)的）。完成寡核苷酸鏈裝配后，去除所有保護(hù)基團(tuán)以產(chǎn)生期望的寡核苷酸。

示例性保護(hù)基團(tuán)和核苷亞磷酰胺構(gòu)建模塊包括但不限于酸不穩(wěn)定的dmt（4,4'-二甲氧基三苯甲基）保護(hù)基團(tuán)。胸腺嘧啶和尿嘧啶，分別為胸苷和尿苷的核堿基，不具有環(huán)外氨基并因此不需要任何保護(hù)。

盡管鳥(niǎo)苷和2'-脫氧鳥(niǎo)苷的核堿基不具有環(huán)外氨基，但其堿性低至一定程度使得其在偶聯(lián)反應(yīng)條件下不與亞磷酰胺反應(yīng)。然而，衍生自n2未保護(hù)的5'-o-dmt-2'-脫氧鳥(niǎo)苷的亞磷酰胺在乙腈（通常用于寡核苷酸合成中的溶劑）中溶解度差。相反，相同化合物的n2保護(hù)形式充分溶解于乙腈中并因此被廣泛使用。核堿基腺嘌呤和胞嘧啶攜帶在偶聯(lián)反應(yīng)條件下與活化的亞磷酰胺反應(yīng)的環(huán)外氨基。通過(guò)使用合成周期中的額外步驟或可選的偶聯(lián)劑和溶劑系統(tǒng)，使用da和dc亞磷酰胺與未保護(hù)的氨基進(jìn)行寡核苷酸鏈裝配。在一些實(shí)施方案中，核苷中的環(huán)外氨基在寡核苷酸鏈裝配的整個(gè)長(zhǎng)度上保持永久受保護(hù)。

環(huán)外氨基的保護(hù)通常與5'-羥基的保護(hù)是正交的(orthogonal)，因?yàn)楹笳咴诿恳缓铣芍芷诮Y(jié)束時(shí)去除。最容易實(shí)現(xiàn)且因此最廣泛接受的是其中環(huán)外氨基攜帶堿不穩(wěn)定保護(hù)的策略。最經(jīng)常地，使用兩種保護(hù)方案。

在一些實(shí)施方案中，對(duì)于a、da、c和dc使用bz（苯甲?；┍Ｗo(hù)，而用異丁?；Ｗo(hù)g和dg。更近期，經(jīng)常用ac（乙?；﹣?lái)保護(hù)c和dc。

在第二種、溫和的保護(hù)方案中，用異丁酰基或苯氧基乙?；╬ac）保護(hù)a和da。c和dc攜帶乙酰基保護(hù)，和g和dg用4-異丙基苯氧基乙?；╥pr-pac）或二甲基亞胺甲基氨（dmf）基團(tuán)保護(hù)。溫和的保護(hù)基團(tuán)比標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)更容易去除。然而，攜帶這些基團(tuán)的亞磷酰胺當(dāng)在溶液中儲(chǔ)存時(shí)更不穩(wěn)定。

在一些實(shí)施方案中，亞磷酸基團(tuán)被堿不穩(wěn)定的2-氰基乙基保護(hù)。一旦亞磷酰胺已經(jīng)與固體支持物結(jié)合的寡核苷酸偶聯(lián)并且亞磷酸部分已經(jīng)轉(zhuǎn)化為p(v)種類，存在磷酸保護(hù)對(duì)于成功進(jìn)行進(jìn)一步的偶聯(lián)反應(yīng)不再是強(qiáng)制性的。

非核苷亞磷酰胺是設(shè)計(jì)用于在合成的寡核苷酸的末端或在序列中間的核苷酸殘基之間引入不同官能度的亞磷酰胺試劑。為了被引入到序列內(nèi)部，非核苷改性劑需要具有至少兩個(gè)羥基，其中一個(gè)通常用dmt基團(tuán)保護(hù)而另一個(gè)攜帶反應(yīng)性亞磷酰胺部分。

使用非核苷亞磷酰胺來(lái)引入在天然核苷中不存在的或可以使用更簡(jiǎn)單的化學(xué)設(shè)計(jì)更容易地引入的期望的基團(tuán)。

寡核苷酸合成通過(guò)逐步添加核苷酸殘基至生長(zhǎng)中的鏈的5'末端來(lái)進(jìn)行直至裝配完期望的序列。每一添加稱為合成周期并且由四個(gè)化學(xué)反應(yīng)組成：

步驟1：去阻斷（脫三苯甲基化）

用酸溶液諸如2%三氯乙酸（tca）或3%二氯乙酸（dca）在惰性溶劑（二氯甲烷或甲苯）中去除dmt基團(tuán)。將形成的橙色的dmt陽(yáng)離子洗去；該步驟導(dǎo)致攜帶游離5'末端羥基的固體支持物結(jié)合的寡核苷酸前體。進(jìn)行脫三苯甲基化持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間或用比推薦的酸溶液更強(qiáng)的來(lái)進(jìn)行導(dǎo)致固體支持物結(jié)合的寡核苷酸的脫嘌呤并因此降低了期望的全長(zhǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)率。

乙腈中的核苷亞磷酰胺（或若干亞磷酰胺的混合物）的溶液隨后通過(guò)酸性唑(acidicazole)催化劑1h-四唑、2-乙基硫代四唑、2-芐基硫代四唑、4,5-二氰基咪唑或多種類似化合物來(lái)活化?；旌贤ǔ７浅６虝呵以诠押塑账岷铣蓛x的流體線中發(fā)生，同時(shí)組分被遞送至含有固體支持物的反應(yīng)器。相對(duì)于支持物結(jié)合材料1.5-20倍過(guò)量的活化的亞磷酰胺隨后與起始固體支持物接觸（第一偶聯(lián)）或與支持物結(jié)合的寡核苷酸前體接觸（隨后偶聯(lián)），所述寡核苷酸前體的5'-羥基與進(jìn)入的核苷酸亞磷酰胺的活化的亞磷酰胺部分反應(yīng)以形成亞磷酸三酯鍵。2'-脫氧核苷亞磷酰胺的偶聯(lián)非常迅速且對(duì)于其完成在小規(guī)模上需要約20秒。相反，位阻的2'-o-保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺利用更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)以高產(chǎn)率偶聯(lián)。反應(yīng)對(duì)于水的存在也是高度敏感的，特別是當(dāng)使用亞磷酰胺的稀釋溶液時(shí)，且通常在無(wú)水的乙腈中進(jìn)行。通常，合成的規(guī)模越大，使用亞磷酰胺的過(guò)量越低且濃度越高。相反，活化劑的濃度主要由其在乙腈中的溶解度決定且與合成規(guī)模無(wú)關(guān)。完成偶聯(lián)后，通過(guò)洗滌去除任何未結(jié)合的試劑和副產(chǎn)物。

封端步驟在亞磷酰胺方法中通過(guò)用乙酸酐和1-甲基咪唑或更少見(jiàn)地dmap的混合物作為催化劑處理固體支持物結(jié)合的材料來(lái)進(jìn)行，有兩個(gè)目的。

完成偶聯(lián)反應(yīng)后，小百分比的固體支持物結(jié)合的5'-oh基團(tuán)（0.1至1%）保持未反應(yīng)且需要從進(jìn)一步的鏈延長(zhǎng)中永久阻斷以防止通常稱為（n-1）短聚物(shortmer)的具有內(nèi)部堿基缺失的寡核苷酸的形成。未反應(yīng)的5'-羥基在很大程度上通過(guò)封端混合物乙?；?。

還已經(jīng)報(bào)道用1h-四唑活化的亞磷酰胺在較小程度上與鳥(niǎo)苷的o6位反應(yīng)。用i2/水氧化后，這一副產(chǎn)物可能經(jīng)o6-n7遷移經(jīng)歷脫嘌呤。因此形成的無(wú)嘌呤位點(diǎn)在堿性條件下（見(jiàn)下文）在寡核苷酸的最終去保護(hù)過(guò)程中容易地被切割以產(chǎn)生兩個(gè)較短的寡核苷酸，因此降低了全長(zhǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)率。o6修飾通過(guò)用封端試劑處理容易地被去除，只要在用i2/水氧化前進(jìn)行封端步驟。

寡核苷酸硫代磷酸酯（ops）的合成不涉及用i2/水氧化，并且分別不經(jīng)受上述副反應(yīng)。另一方面，如果封端步驟在硫化前進(jìn)行，則固體支持物包含在封端步驟后留下的殘留的乙酸酐和n-甲基咪唑。封端混合物干擾硫轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其導(dǎo)致磷酸三酯核苷內(nèi)鍵的大量形成替代了期望的ps三酯。因此，對(duì)于ops的合成，建議在封端步驟前進(jìn)行硫化步驟。

新形成的三配位的亞硫酸三酯鍵不是天然的且在寡核苷酸合成的條件下具有有限的穩(wěn)定性。用碘和水在弱堿（吡啶、二甲基吡啶或三甲吡啶）存在的情況下處理支持物結(jié)合的材料氧化亞磷酸三酯為四配位的磷酸三酯，其為天然存在的磷酸二酯核苷間鍵的受保護(hù)的前體。氧化可以在無(wú)水條件下使用叔丁基過(guò)氧化氫或更有效地使用(1s)-(+)-(10-樟腦磺酰)-氧氮環(huán)丙烷(cso)進(jìn)行。氧化步驟用硫化步驟替代以獲得寡核苷酸硫代磷酸酯。在后一種情況中，硫化步驟最好在封端前進(jìn)行。

在固相合成中，裝配的寡核苷酸經(jīng)其3'末端羥基共價(jià)結(jié)合至固體支持物材料并且在鏈裝配整個(gè)過(guò)程中保持與其連接。固體支持物包含在柱內(nèi)，所述柱的直徑取決于合成規(guī)模且可以在0.05ml至若干升之間改變。絕大多數(shù)寡核苷酸以40nmol至1μmol范圍的小規(guī)模合成。更近期，其中固體支持物包含在多孔板（最常見(jiàn)地，96或384孔/板）的孔內(nèi)的高通量寡核苷酸合成成為以小規(guī)模平行合成寡核苷酸的方法選擇。在鏈裝配結(jié)束時(shí)，寡核苷酸從固體支持物上釋放并從柱或孔上洗脫。

與有機(jī)固相合成和肽合成不同，寡核苷酸的合成在無(wú)膨脹或低膨脹的固體支持物上進(jìn)行最好。兩種最常用的固相材料是可控孔度玻璃（cpg）和大孔聚苯乙烯（mpps）。

cpg通常由其孔徑定義。在寡核苷酸化學(xué)中，使用500、1000、1500、2000和3000?的孔徑以允許分別制備約50、80、100、150和200聚體(mer)的寡核苷酸。為了制備適合于進(jìn)一步加工的天然cpg，將材料表面用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷處理以產(chǎn)生氨基丙基cpg。氨基丙基臂可以進(jìn)一步延伸以產(chǎn)生長(zhǎng)鏈氨基烷基(lcaa)cpg。隨后將氨基用作適合于寡核苷酸合成的接頭的錨定點(diǎn)（見(jiàn)下文）。

適合于寡核苷酸合成的mpps是低膨脹的、高度交聯(lián)的聚苯乙烯，其通過(guò)將二乙烯基苯（最少60%）、苯乙烯和4-氯甲基苯乙烯在成孔劑(porogeneousagent)存在的情況下聚合來(lái)獲得。將獲得的大孔氯甲基mpps轉(zhuǎn)化為氨基甲基mpps。

為了制備適合于寡核苷酸合成的固體支持物材料，將非核苷接頭或核苷琥珀酸酯共價(jià)連接至氨基丙基cpg、lcaacpg或氨基甲基mpps中的反應(yīng)性氨基。剩余未反應(yīng)的氨基用乙酸酐封端。通常，使用固體支持物的三種概念上不同的基團(tuán)。

在更近期、更方便且更廣為使用的方法中，合成開(kāi)始于通用支持物，其中非核苷接頭連接至固體支持物材料。3'末端核苷殘基各自的亞磷酰胺在寡核苷酸鏈裝配的第一合成周期中使用標(biāo)準(zhǔn)方案偶聯(lián)至通用固體支持物。鏈裝配隨后持續(xù)直至完成，之后將固體支持物結(jié)合的寡核苷酸去保護(hù)。通用固體支持物的特征性特點(diǎn)在于寡核苷酸的釋放通過(guò)連接3'末端核苷酸殘基的3'-o與通用接頭的p-o鍵的水解切割發(fā)生，如方案6中所示。這一方法的主要優(yōu)點(diǎn)是使用相同的固體支持物，而與待合成的寡核苷酸序列無(wú)關(guān)。對(duì)于從裝配的寡核苷酸中完全去除接頭和3'末端磷酸酯，固體支持物1和若干相似的固體支持物需要?dú)鈶B(tài)氨、氫氧化銨水溶液、甲胺水溶液、或其混合物，且是可商購(gòu)的。固體支持物利用無(wú)水甲醇中的氨溶液并且是可商購(gòu)的。

通常，3'末端核苷殘基的3'-羥基經(jīng)（最常見(jiàn)地）如化合物3中的3'-o-琥珀酰臂連接至固體支持物。寡核苷酸鏈裝配起始于各自對(duì)于從3'末端第二的核苷酸殘基的亞磷酰胺構(gòu)建模塊的偶聯(lián)。核苷固體支持物上合成的寡核苷酸中3'末端羥基在稍微比適用于通用固體支持物的條件更溫和的條件下進(jìn)行去保護(hù)。然而，核苷固體支持物必須以序列特異性方式選擇這一事實(shí)降低了整個(gè)合成方法的通量且增加了人為錯(cuò)誤的可能性。

寡核苷酸硫代磷酸酯（ops）是修飾的寡核苷酸，其中磷酸部分中的一個(gè)氧原子被硫所取代。只有在非橋接位置具有硫的硫代磷酸酯是廣泛使用的且可以商購(gòu)的。用硫取代非橋接的氧產(chǎn)生在磷處的新的手性中心。在二核苷酸的簡(jiǎn)單情況中，這導(dǎo)致形成sp-和rp-二核苷單硫代磷酸酯的非對(duì)映體對(duì)。在其中所有（n-1）核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵的n-聚體寡核苷酸中，非對(duì)映體的數(shù)目m計(jì)算為m=2(n–1)。作為核酸的非天然類似物，ops對(duì)于通過(guò)核酸酶（通過(guò)斷裂磷酸二酯部分的橋連p-o鍵來(lái)破壞核酸的酶類）的水解基本上更穩(wěn)定。該性質(zhì)決定了在其中廣泛暴露于核酸酶是不可避免的體外和體內(nèi)應(yīng)用中ops作為反義寡核苷酸的用途。類似地，為了提高sirna的穩(wěn)定性，通常在有義鏈和反義鏈的3'-末端引入至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵。在手性純ops中，全sp非對(duì)映體比其全部rp類似物對(duì)于酶促降解更加穩(wěn)定。然而，手性純ops的制備仍然是合成挑戰(zhàn)。在實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，通常使用ops的非對(duì)映體的混合物。

ops的合成與天然寡核苷酸的合成非常相似。不同之處在于氧化步驟被硫轉(zhuǎn)移反應(yīng)（硫化）代替，并且封端步驟在硫化之后進(jìn)行。在許多報(bào)道的能夠有效轉(zhuǎn)移硫的試劑中，只有三種可商購(gòu)：

3-（二甲氨基亞甲基）氨基）-3h-1,2,4-二噻唑-3-硫酮，ddtt（3）提供快速的硫化動(dòng)力學(xué)和溶液中的高穩(wěn)定性。也稱為beaucage試劑的3h-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物（4）在乙腈中顯示更好的溶解度和較短的反應(yīng)時(shí)間。然而，試劑在溶液中的穩(wěn)定性有限，并且在硫化rna鍵中效率較低。

n,n,n'n'-二硫化四乙基秋蘭姆（tetd）可溶于乙腈且可商購(gòu)。然而，核苷間dna鍵與tetd的硫化反應(yīng)需要15分鐘。

在過(guò)去，在溶液中或固相上手動(dòng)進(jìn)行寡核苷酸合成。使用其形狀類似于低壓層析柱的微型玻璃柱或裝配有多孔過(guò)濾器的注射器作為固相的容器進(jìn)行固相合成。目前，使用計(jì)算機(jī)控制儀器（寡核苷酸合成儀）自動(dòng)進(jìn)行固相寡核苷酸合成且技術(shù)上以柱、多孔板和陣列格式實(shí)現(xiàn)。柱格式最適合于不需要高通量的研究和大規(guī)模應(yīng)用。多孔板格式專門設(shè)計(jì)用于小規(guī)模的高通量合成，以滿足工業(yè)和學(xué)術(shù)界對(duì)合成寡核苷酸不斷增長(zhǎng)的需求。許多用于小規(guī)模合成和中等至大規(guī)模合成的寡核苷酸合成儀是可商購(gòu)的。

下面描述擴(kuò)增方法，盡管可以使用其它方法。接下來(lái)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增（例如pcr）引物以從使用生物信息學(xué)方法鑒定的最長(zhǎng)的無(wú)重復(fù)片段的區(qū)段中擴(kuò)增序列的段。在一些實(shí)施方案中，使用基因組或基因組衍生的bacdna作為擴(kuò)增模板來(lái)擴(kuò)增這些區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，（例如，在較長(zhǎng)的段的情況下）使用多個(gè)重疊引物組。

核酸擴(kuò)增技術(shù)的說(shuō)明性非限制性實(shí)例包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（rt-pcr）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（tma）、連接酶鏈反應(yīng)（lcr）、鏈置換擴(kuò)增（sda）和基于核酸序列的擴(kuò)增（nasba）。

通常，擴(kuò)增方法使用dna聚合酶、引物和dntp。示例性dna聚合酶包括但不限于phi29dna聚合酶、taqdna聚合酶、dna聚合酶i、t7dna聚合酶、t7dna聚合酶、t4dna聚合酶、pfudna聚合酶和bsmdna聚合酶。

聚合酶鏈反應(yīng)（美國(guó)專利號(hào)4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，其各自以其整體通過(guò)引用并入本文），通常稱為pcr，使用多個(gè)循環(huán)的變性、引物對(duì)與相對(duì)鏈的退火、和引物延伸以指數(shù)增加靶核酸序列的拷貝數(shù)。在稱為rt-pcr的變化中，逆轉(zhuǎn)錄酶（rt）用于從mrna制備互補(bǔ)dna（cdna），然后通過(guò)pcr擴(kuò)增cdna以產(chǎn)生多個(gè)dna拷貝。對(duì)于pcr的其他各種改變，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,683,195、4,683,202和4,800,159;mullis等人,meth.enzymol.155:335(1987);和murakawa等人,dna7:287(1988)，其各自以其整體通過(guò)引用并入本文。

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（美國(guó)專利號(hào)5,480,784和5,399,491，其各自以其整體通過(guò)引用并入本文），通常稱為tma，在基本上恒定的溫度、離子強(qiáng)度和ph的條件下自催化合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)rna拷貝自催化產(chǎn)生額外的拷貝。參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,399,491和5,824,518，其各自以其整體通過(guò)引用并入本文。在美國(guó)公開(kāi)號(hào)20060046265（以其整體通過(guò)引用并入本文）中描述的變化中，tma任選地并入使用阻斷部分、終止部分和其它修飾部分以提高tma方法的靈敏度和精度。

連接酶鏈反應(yīng)(weiss,r.,science254:1292(1991)，以其整體通過(guò)引用并入本文)，通常稱為lcr，使用兩組與靶核酸的鄰近區(qū)域雜交的互補(bǔ)dna寡核苷酸。通過(guò)dna連接酶在熱變性、雜交和連接的重復(fù)循環(huán)中共價(jià)連接dna寡核苷酸以產(chǎn)生可檢測(cè)的雙鏈連接的寡核苷酸產(chǎn)物。

鏈置換擴(kuò)增(walker,g.等人,proc.natl.acad.sci.usa89:392-396(1992)；美國(guó)專利號(hào)5,270,184和5,455,166，其各自以其整體通過(guò)引用并入本文)，通常稱為sda，使用引物序列對(duì)與靶序列的相對(duì)鏈的退火、在dntp存在下的引物延伸的循環(huán)以產(chǎn)生雙鏈體半硫代磷酸化的引物延伸產(chǎn)物，半修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的切口，以及從切口的3'末端的聚合酶介導(dǎo)的引物延伸以置換現(xiàn)有的鏈并產(chǎn)生用于下一輪引物退火、切口和鏈置換的鏈，導(dǎo)致產(chǎn)物的幾何擴(kuò)增。嗜熱sda（tsda）在基本相同的方法中在較高溫度下使用嗜熱內(nèi)切核酸酶和聚合酶（歐洲專利號(hào)0684315）。

其他擴(kuò)增方法包括，例如：基于核酸序列的擴(kuò)增（美國(guó)專利號(hào)5,130,238，以其整體通過(guò)引用并入本文），通常稱為nasba；使用rna復(fù)制酶擴(kuò)增探針?lè)肿幼陨淼臄U(kuò)增方法(lizardi等人,biotechnol.6:1197(1988)，以其整體通過(guò)引用并入本文)，通常稱為qβ復(fù)制酶；基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法(kwoh等人,proc.natl.acad.sci.usa86:1173(1989))；和，自維持序列復(fù)制(guatelli等人,proc.natl.acad.sci.usa87:1874(1990)，其各自以其整體通過(guò)引用并入本文)。對(duì)于已知擴(kuò)增方法的進(jìn)一步討論，參見(jiàn)persing,davidh.,“invitronucleicacidamplificationtechniques”于diagnosticmedicalmicrobiology:principlesandapplications(persing等人編輯),第51-87頁(yè)(americansocietyformicrobiology,washington,dc(1993))。

在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增是等溫?cái)U(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增方法是固相擴(kuò)增、群落擴(kuò)增(polonyamplification)、菌落擴(kuò)增、乳液pcr、珠粒rca、表面rca、表面sda等，如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)可。在一些實(shí)施方案中，使用導(dǎo)致擴(kuò)增溶液中的游離dna分子或通過(guò)dna分子的僅一個(gè)末端拴系至合適的基材的dna分子的擴(kuò)增方法。在一些實(shí)施方案中，使用依賴于橋式pcr的方法，其中兩條pcr引物均連接至表面（參見(jiàn)例如wo2000/018957,u.s.7,972,820;7,790,418和adessi等人,nucleicacidsresearch(2000):28(20):e87；其各自以其整體通過(guò)引用并入本文）。在一些情況下，本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生“聚合酶菌落技術(shù)”或“群落(polony)”，指保持相同擴(kuò)增子的空間聚類的多路擴(kuò)增（參見(jiàn)harvardmoleculartechnologygroupandlippercenterforcomputationalgenetics網(wǎng)站）。這例如包括原位群落(mitra和church,nucleicacidresearch27,e34,dec.15,1999)、原位滾環(huán)擴(kuò)增(rca)(lizardi等人,naturegenetics19,225,july1998)、橋式pcr(美國(guó)專利號(hào)5,641,658),皮滴定pcr(picotiterpcr)(leamon等人,electrophoresis24,3769,november2003)和乳液pcr(dressman等人,pnas100,8817,jul.22,2003)。

適合用于本發(fā)明的實(shí)施方案的核酸聚合酶的實(shí)例包括但不限于dna聚合酶（klenow片段，t4dna聚合酶）、熱穩(wěn)定的dna聚合酶(perlerf.b.等人,adv.proteinchem.1996,48:377-435)，其鑒定并克隆了多種熱穩(wěn)定細(xì)菌(諸如taq、vent、pfu、tfldna聚合酶)及其遺傳學(xué)修飾的衍生物(taqgold、ventexo、pfuexo)。用于菌落引物延伸的核酸聚合酶優(yōu)選在引物和模板雜交結(jié)果足夠特異以避免模板的不完全或假擴(kuò)增的溫度下是穩(wěn)定的。

擴(kuò)增溶液優(yōu)選含有脫氧核糖核苷三磷酸，例如datp、dttp、dctp、dgtp，其為天然或非天然存在的，例如用熒光或放射性基團(tuán)修飾的。為了提高核酸的可檢測(cè)性和/或功能多樣性，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種各樣的合成修飾的核酸用于化學(xué)和生物學(xué)方法。這些功能化/修飾的分子（例如核苷酸類似物）可以與天然聚合酶完全相容，保持天然對(duì)應(yīng)物的堿基配對(duì)和復(fù)制性質(zhì)，如最近所綜述的(thumo等人,angew.chem.int.ed.2001,40(21):3990-3993)。

因此，將擴(kuò)增溶液的其他組分加入到核酸聚合酶的選擇中，并且它們基本上對(duì)應(yīng)于本領(lǐng)域已知的有效支持每種聚合酶活性的化合物。化合物如二甲基亞砜（dmso）、牛血清白蛋白（bsa）、聚乙二醇（peg）、甜菜堿、tritonx-100或mgcl2的濃度由于對(duì)于產(chǎn)生最佳擴(kuò)增是重要的，因此在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，且因此操作人員可以基于下面給出的實(shí)例容易地調(diào)整用于本發(fā)明方法的此類濃度。

d.片段化

在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增前和擴(kuò)增后，隨后將dna片段化（例如，通過(guò)超聲處理或其他合適的方法諸如dna酶i）至大約50-5000bp范圍的長(zhǎng)度（例如50-4000、50-3000、50-2500、50-2000、50-1500、50-1000、100-5000、100-4000、1000-3000、100-2500、100-2000、100-1500、100-1000或100-500bp），并且所得的無(wú)重復(fù)片段的dna文庫(kù)連接（例如經(jīng)連接、化學(xué)、延伸反應(yīng)等）至銜接子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針為大約150bp（例如，50-900bp、50-800bp、50-700bp、50-600bp、50-500bp、50-450bp、50-400bp、50-350bp、50-300bp、50-250bp、50-200bp、50-150bp、50-100bp、80-900bp、80-800bp、80-700bp、80-600bp、80-500bp、80-450bp、80-400bp、80-350bp、80-300bp、80-250bp、80-200bp、80-150bp、80-100bp、100-900bp、100-800bp、100-700bp、100-600bp、100-500bp、100-450bp、100-400bp、100-350bp、100-300bp、100-250bp、100-200bp、100-150bp、150-900bp、150-800bp、150-700bp、150-600bp、150-500bp、150-450bp、150-400bp、150-350bp、150-300bp、150-250bp、150-200bp、150-150bp、或80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、或150bp等）。在一些實(shí)施方案中，隨后將銜接的文庫(kù)分級(jí)（例如通過(guò)電泳、層析、或其他分開(kāi)方法）以產(chǎn)生含有多種片段大小的所有所選序列的庫(kù)。將對(duì)應(yīng)于期望的片段大小的級(jí)分（例如凝膠片）分離。

f.擴(kuò)增

在一些實(shí)施方案中，將所需大小的級(jí)分用作在準(zhǔn)備擴(kuò)增條件下用對(duì)應(yīng)于銜接子的擴(kuò)增（例如，本文所述的pcr或另一種方法）引物的模板。

所有選擇的無(wú)重復(fù)片段的序列都代表在擴(kuò)增的文庫(kù)中。然后將探針（例如，在片段化或任選的進(jìn)一步擴(kuò)增后分離的）標(biāo)記（例如，用熒光標(biāo)記、生物素、量子點(diǎn)標(biāo)記或用于比色或銀染檢測(cè)的標(biāo)記）用于使用（例如，作為fish試劑）。

在一些實(shí)施方案中，將探針文庫(kù)克隆到表達(dá)載體中（例如，每個(gè)載體一個(gè)或多個(gè)探針）。在一些實(shí)施方案中，這些表達(dá)載體可用于將來(lái)生成文庫(kù)（例如通過(guò)擴(kuò)增或表達(dá)）。

ii.探針的用途

本文所述的探針可用于多種診斷、研究、臨床和篩選應(yīng)用中。所描述的核酸雜交探針廣泛用于通過(guò)使用核酸雜交探針實(shí)現(xiàn)的所有形式的核酸檢測(cè)。核酸雜交探針用于檢測(cè)溶液中的核酸序列靶標(biāo)或與固定的支持物結(jié)合的核酸序列靶標(biāo)。組合物和方法可用于檢測(cè)溶液中核酸序列靶標(biāo)的應(yīng)用實(shí)例包括pcr、實(shí)時(shí)pcr、定量pcr、pna鉗介導(dǎo)pcr和數(shù)字pcr。組合物和方法可用于檢測(cè)固定于固體支持物上的核酸序列靶標(biāo)的應(yīng)用實(shí)例包括northern印跡、southern印跡、斑點(diǎn)印跡，槽印跡、微陣列、基于粒子的測(cè)定、原位雜交測(cè)定（ish），諸如例如色原原位雜交（cish）、rna原位雜交（rish）、快速fish、銀原位雜交（sish）和fish測(cè)定。此類應(yīng)用適用于許多領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)診斷、分子醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、標(biāo)本和生物編目、以及微生物病原體流行病學(xué)。

本發(fā)明不限于特定的靶標(biāo)。本文描述的組合物和方法可用于檢測(cè)多種靶核酸（例如人或哺乳動(dòng)物基因組核酸），細(xì)菌靶核酸，病毒靶核酸等。

探針也可以用作固定在固體表面（例如硝酸纖維素）上的分離的核酸，如在acgh中。在一些實(shí)施方案中，探針可以是例如在wo96/17958中所述的核酸陣列的成員，wo96/17958以其整體通過(guò)引用并入本文并且具體涉及其對(duì)陣列cgh的描述。能夠產(chǎn)生高密度陣列的技術(shù)是眾所周知的（參見(jiàn)例如fodor等人science767-773(1991)和美國(guó)專利號(hào)5,143,854），其兩者對(duì)于其描述均通過(guò)引用并入本文。

利用核酸雜交探針的詳細(xì)描述在下文對(duì)于fish應(yīng)用進(jìn)行呈現(xiàn)，盡管探針也可用于其它應(yīng)用。

fish和其他原位雜交方法可以在各種樣品類型上進(jìn)行。實(shí)例包括但不限于福爾馬林固定石蠟包埋（ffpe）組織）、新鮮組織、冷凍組織、細(xì)胞（例如真核或原核細(xì)胞）；其使用任何合適的固定劑制備。在一些實(shí)施方案中，采用印片制備(touchprep)或刷涂(brushing)（參見(jiàn)例如smoczynski等人,gastrointestendosc.2012jan;75(1):65-73）。

印片制備樣本通過(guò)涂抹或壓在載玻片上，向組織施加壓力并在冷卻溫度下固定在乙醇中而產(chǎn)生。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，手術(shù)提取組織并通過(guò)對(duì)腫瘤組織施加相對(duì)弱的壓力并對(duì)正常組織施加相對(duì)強(qiáng)的壓力將其涂抹在載玻片上，然后在約4℃下固定在約100％乙醇中約10分鐘。另一個(gè)具體實(shí)施方案中，將通過(guò)本發(fā)明的方法分析的樣品最初在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在約-80℃。

對(duì)于典型的ish應(yīng)用，以下內(nèi)容代表典型的程序。收獲樣本的細(xì)胞，洗滌并沉淀。沉淀物的細(xì)胞通常在磷酸緩沖鹽水（pbs）中洗滌。將細(xì)胞懸浮在pbs中并通過(guò)離心再收集。細(xì)胞可以例如固定在酸醇溶液、酸丙酮溶液、或醛諸如甲醛、低聚甲醛和戊二醛中。例如，含有分別為3:1比例的甲醇和冰醋酸的固定液可用作固定液。也可以使用中性緩沖的福爾馬林溶液，并且包括在磷酸鈉的水溶液中大約1%-10%的37-40%甲醛。含有細(xì)胞的載玻片可以通過(guò)去除大部分固定液，保留懸浮在僅部分溶液中的濃縮細(xì)胞來(lái)制備。

將細(xì)胞懸液施加到載玻片上使得細(xì)胞不會(huì)在載玻片上重疊。細(xì)胞密度可以通過(guò)光或相差顯微鏡來(lái)測(cè)量。這些孔中的細(xì)胞密度隨后用相差顯微鏡來(lái)評(píng)估。如果含有最大體積的細(xì)胞懸液的孔不具有足夠的細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液濃縮并置于另一孔中。

在原位雜交前，將染色體探針和包含在細(xì)胞內(nèi)的染色體dna各自變性。變性過(guò)程以幾種方式進(jìn)行。例如，可以用具有升高的ph、具有升高的溫度（例如，溫度從約70℃至約95℃）、或具有有機(jī)溶劑如甲酰胺、碳酸亞乙酯和四烷基鹵化銨、或其組合的緩沖溶液實(shí)現(xiàn)變性。例如，染色體dna可以通過(guò)高于70℃的溫度（例如約73℃）和含有70％甲酰胺和2×ssc（0.3m氯化鈉和0.03m檸檬酸鈉）的變性緩沖液的組合而變性。變性條件通常這樣確立使得保留細(xì)胞形態(tài)。染色體探針可以通過(guò)熱來(lái)變性。例如，可以將探針加熱至約73℃持續(xù)約五分鐘。

在去除變性化學(xué)品或條件后，探針在雜交條件下與染色體dna退火?！半s交條件”是促進(jìn)探針和核酸序列靶標(biāo)之間退火的條件。雜交條件取決于探針的濃度、堿基組成、復(fù)雜性和長(zhǎng)度以及鹽濃度、溫度和孵育時(shí)間而有所不同。探針的濃度越大，形成雜交物的概率就越大。例如，原位雜交通常在含有1-2×ssc、50％甲酰胺和封閉dna的雜交緩沖液中進(jìn)行，以抑制非特異性雜交。通常，如上所述的雜交條件包括約25℃至約55℃的溫度和約0.5小時(shí)至約96小時(shí)的孵育時(shí)間。更具體地，可以在約37℃至約40℃進(jìn)行約2至約16小時(shí)的雜交。

染色體探針與目標(biāo)區(qū)域外的dna的非特異性結(jié)合可以通過(guò)一系列洗滌來(lái)去除。每次洗滌中鹽的溫度和濃度取決于所需的嚴(yán)格性。例如，對(duì)于高嚴(yán)格條件，洗滌可以在約65℃至約80℃下進(jìn)行，使用0.2×ssc至約2×ssc和約0.1％至約1％的非離子型去污劑如nonidetp-40（np40）或其他合適的表面活性劑。通過(guò)降低洗滌溫度或通過(guò)增加洗滌中的鹽濃度可以降低嚴(yán)格性。

含有樣品的載玻片通常在2×ssc中在37℃下孵育10-30分鐘。然后將載玻片在0.2mg/ml胃蛋白酶中于37℃溫育20分鐘。隨后將載玻片在pbs中在室溫下洗滌兩次2分鐘。細(xì)胞在2.5％中性緩沖的福爾馬林中在室溫下固定5分鐘。隨后將載玻片在pbs中在室溫下洗滌兩次2分鐘。通過(guò)在室溫下在70％、85％和100％乙醇的溶液中連續(xù)接觸1分鐘，使載玻片脫水。之后立即使用載玻片或在室溫下在黑暗中儲(chǔ)存。

可以使用hybrite方法或常規(guī)方法進(jìn)行雜交。在hybrite方法中，使用來(lái)自abbottmolecular（downersgrove，il）的hybritetm系統(tǒng)。

用于探針與其核酸靶標(biāo)特異性雜交的條件通常包括在給定雜交程序中可用于產(chǎn)生特異性雜交物的條件的組合，該條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。這些條件通常涉及受控的溫度、液相和染色體探針與靶標(biāo)之間的接觸。雜交條件取決于許多因素而不同，包括探針濃度、靶標(biāo)長(zhǎng)度、靶標(biāo)和探針g-c含量、溶劑組成、溫度和培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間。至少一個(gè)變性步驟可能在探針與靶標(biāo)接觸之前。或者，探針和核酸靶標(biāo)兩者可以在彼此接觸的同時(shí)經(jīng)歷變性條件，或者隨后探針與生物樣品接觸。雜交可以通過(guò)隨后在約25至約55℃的溫度范圍下將探針/樣品溫育在例如2-4×ssc和甲酰胺的約50:50體積比混合物的液相中持續(xù)說(shuō)明性地在約0.5-約96小時(shí)范圍內(nèi)的時(shí)間，或者更優(yōu)選在約32-約40℃的溫度下持續(xù)約2-約16小時(shí)范圍的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了增加特異性，使用封閉劑諸如美國(guó)專利號(hào)5,756,696中所述的未標(biāo)記的封閉核酸（所述專利內(nèi)容以其整體通過(guò)引用并入本文，并且具體涉及封閉核酸的使用的描述），可以與本發(fā)明的方法聯(lián)合使用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，其他條件可以容易地用于將探針與存在于樣品中的其核酸靶標(biāo)特異性雜交。

在合適的孵育期完成后，染色體探針與樣品dna的非特異性結(jié)合可以通過(guò)一系列洗滌來(lái)除去。適當(dāng)?shù)剡x擇溫度和鹽濃度以達(dá)到所需的嚴(yán)格性。所需的嚴(yán)格性水平取決于與基因組序列相關(guān)的特異性探針序列的復(fù)雜度，并且可以通過(guò)將探針與已知遺傳組成的樣品系統(tǒng)雜交來(lái)確定。通常，高嚴(yán)格性洗滌可以在約65至約80℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行，用約0.2×至約2×ssc和約0.1％至約1％的非離子型去污劑例如nonidetp-40（np40）。如果需要較低的嚴(yán)格性洗滌，洗滌可以在較低溫度且增加的鹽濃度下進(jìn)行。

可以用可檢測(cè)標(biāo)記直接標(biāo)記染色體探針?？蓹z測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括熒光團(tuán)，例如吸收光后發(fā)熒光的有機(jī)分子以及放射性同位素，例如³²p和³h。熒光團(tuán)可以在通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如切口平移、隨機(jī)引發(fā)和pcr標(biāo)記將標(biāo)記的核苷酸摻入探針中共價(jià)連接至核苷酸后而被直接標(biāo)記?；蛘?，探針內(nèi)的脫氧胞苷核苷酸可以用接頭轉(zhuǎn)氨化。熒光團(tuán)可以隨后共價(jià)連接至轉(zhuǎn)氨化的脫氧胞苷核苷酸。參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,491,224，bittner等人，其通過(guò)引用并入本文。可用的探針標(biāo)記技術(shù)描述于molecularcytogenetics:protocolsandapplications,y.-s.fan,編輯,第2章,“l(fā)abelingfluorescenceinsituhybridizationprobesforgenomictargets”,l.morrison等人,p.21-40,humanapress,?2002(下文引用為“morrison-2002”)，其通過(guò)引用并入本文。

熒光團(tuán)與核酸探針的連接是本領(lǐng)域中熟知的且可以通過(guò)任何可用的方法完成。熒光團(tuán)可以共價(jià)連接到特定的核苷酸，例如，并且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（例如切口平移，隨機(jī)引發(fā)，pcr標(biāo)記等）將標(biāo)記的核苷酸摻入探針中?；蛘?，熒光團(tuán)可以經(jīng)由接頭共價(jià)連接到已經(jīng)被轉(zhuǎn)氨化的探針的脫氧胞苷核苷酸上。用于標(biāo)記探針的方法描述于美國(guó)專利號(hào)5,491,224和molecularcytogenetics:protocolsandapplications(2002),y.-s.fan,編輯,第2章“l(fā)abelingfluorescenceinsituhybridizationprobesforgenomictargets,”l.morrison等人,p.21-40,humanapress，其兩者均對(duì)于其關(guān)于標(biāo)記探針的描述通過(guò)引用并入本文。

可用于標(biāo)記探針的示例性熒光團(tuán)包括texasred(molecularprobes,inc.,eugene,oreg.)、cascadeblueaectylazide(molecularprobes,inc.,eugene,oreg.)、spectrumorange^tm?(abbottmolecular,desplaines,ill.)和spectrumgold^tm?(abbottmolecular)。

可用于本文描述的方法中的熒光團(tuán)的另外實(shí)例是：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(amca)；5-(和-6)-羧基-x-羅丹明、麗絲胺羅丹明b、5-(和-6)-羧基熒光素；熒光素-5-異硫氰酸酯(fitc)；7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、四甲基-羅丹明-5-(和-6)-異硫氰酸酯；5-(和-6)-羧基四甲基羅丹明；7-羥基香豆素-3-羧酸；6-[熒光素5-(和-6)-酰胺基]己酸；n-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a二氮雜-3-引達(dá)省丙酸(indacenepropionicacid)；曙紅-5-異硫氰酸酯；赤蘚紅-5-異硫氰酸酯；5-(和-6)-羧基羅丹明6g；和cascadesblueaectylazide(molecularprobes，inc.，eugene，oreg.)。

可以使用熒光顯微鏡和每種熒光團(tuán)的適當(dāng)濾光片或通過(guò)使用雙重或三重帶通濾光片組來(lái)觀察多種熒光團(tuán)以觀察探針。參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,776,688，bittner等人，其通過(guò)引用并入本文?？梢允褂萌魏魏线m的顯微鏡成像方法來(lái)顯現(xiàn)雜交探針，包括自動(dòng)數(shù)字成像系統(tǒng)，例如可從metasystems或appliedimaging獲得的那些?；蛘撸梢允褂眉夹g(shù)諸如流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢查染色體探針的雜交模式。

也可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法例如用生物素或地高辛間接地標(biāo)記探針。然而，隨后使用二級(jí)檢測(cè)分子或進(jìn)一步處理來(lái)可視化標(biāo)記的探針。例如，用生物素標(biāo)記的探針可以通過(guò)與可檢測(cè)標(biāo)記物例如熒光團(tuán)綴合的抗生物素蛋白來(lái)檢測(cè)。此外，抗生物素蛋白可以與酶標(biāo)記物如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶綴合。可以使用酶的底物在標(biāo)準(zhǔn)比色反應(yīng)中檢測(cè)此類酶標(biāo)記物。堿性磷酸酶的底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基藍(lán)四唑鎓。二氨基苯甲酸酯可用作辣根過(guò)氧化物酶的底物。雜交的生物素或其他間接標(biāo)記的探針的熒光檢測(cè)可以通過(guò)使用市售的酪胺放大系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以使用其它試劑或染料代替熒光團(tuán)作為含標(biāo)記的部分?？梢愿街谔结樀暮线m的標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)簽、電子致密顆粒、磁性顆粒、自旋標(biāo)記、發(fā)射發(fā)光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子和酶底物。發(fā)光劑包括例如放射性發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和含磷光標(biāo)記的部分?；蛘?，可以使用通過(guò)間接方法可視化的檢測(cè)部分。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法用生物素或地高辛標(biāo)記探針，然后進(jìn)一步處理用于檢測(cè)。含有生物素的探針的可視化可以通過(guò)與可檢測(cè)標(biāo)記物綴合的抗生物素蛋白的隨后結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。可檢測(cè)標(biāo)記物可以是熒光團(tuán)，在這種情況下可以如上文針對(duì)ish所述實(shí)現(xiàn)探針的可視化和辨別。

在一些實(shí)施方案中，探針被設(shè)計(jì)成具有在整個(gè)核酸中以共同間隔放置的標(biāo)記（例如每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)一個(gè)標(biāo)記組）。

在一些實(shí)施方案中，探針文庫(kù)包含具有不同可檢測(cè)標(biāo)記（例如，不同顏色的熒光信號(hào)）的探針。

與目標(biāo)區(qū)域雜交的探針可以可選地通過(guò)標(biāo)記部分與合適底物的酶反應(yīng)用于生產(chǎn)不溶性顏色產(chǎn)物來(lái)顯現(xiàn)?？梢酝ㄟ^(guò)隨后與綴合至堿性磷酸酶（ap）或辣根過(guò)氧化物酶（hrp）的抗生物素蛋白和合適底物孵育來(lái)檢測(cè)組內(nèi)的含生物素的探針。5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基藍(lán)四唑鎓（nbt）用作堿性磷酸酶的底物，而二氨基聯(lián)苯胺作為hrp的底物。

在使用熒光團(tuán)標(biāo)記的探針或探針組合物的實(shí)施方案中，檢測(cè)方法可以涉及熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)或用于確定探針雜交的其它方法。任何合適的顯微鏡成像方法可以結(jié)合本發(fā)明的方法使用用于觀察多種熒光團(tuán)。在使用熒光顯微鏡的情況下，可以在適合于激發(fā)每種熒光團(tuán)的光下并且使用合適的一種或多種濾光片來(lái)觀察雜交樣品。可選地可以使用自動(dòng)數(shù)字成像系統(tǒng)諸如metasystems、bioview或appliedimaging系統(tǒng)。

在陣列cgh中，探針未被標(biāo)記，而是固定在基底上的不同位置，如wo96/17958中所述。在這種情況下，探針通常被稱為“靶核酸”。樣品核酸通常被標(biāo)記以允許檢測(cè)雜交復(fù)合物。用于雜交的樣品核酸可以在雜交反應(yīng)之前被可檢測(cè)地標(biāo)記。或者，可以選擇結(jié)合雜交產(chǎn)物的可檢測(cè)標(biāo)記。在雙色或多色acgh中，靶核酸陣列同時(shí)或連續(xù)地與不同標(biāo)記的核酸的兩個(gè)或多個(gè)集合雜交。例如，樣品核酸和參考核酸各自用獨(dú)立且可區(qū)分的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記?？梢詸z測(cè)每個(gè)靶核酸斑點(diǎn)處的每個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度差異作為拷貝數(shù)差異的指示。盡管任何合適的可檢測(cè)標(biāo)記可用于acgh，但熒光標(biāo)記通常是最方便的。

在wo93/18186中描述了可視化信號(hào)的示例性方法，其對(duì)于該描述通過(guò)引用并入本文。為了便于顯示結(jié)果和提高檢測(cè)熒光強(qiáng)度微小差異的靈敏度，可以使用數(shù)字圖像分析系統(tǒng)。示例性系統(tǒng)是quips（定量圖像處理系統(tǒng)的首字母縮略詞），其是基于配備有自動(dòng)化階段、焦點(diǎn)控制和濾光輪的標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡的自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（ludlelectronicproducts，ltd.，hawthorne，ny.）。濾光輪固定在顯微鏡的熒光激發(fā)路徑上用于選擇激發(fā)波長(zhǎng)。分色鏡中的特殊濾光片（chromatechnology，brattleboro，vt.）允許激發(fā)多種染料而無(wú)圖像配準(zhǔn)位移。顯微鏡有兩個(gè)相機(jī)端口，其中一個(gè)具有加強(qiáng)的ccd相機(jī)（quantexcorp.，sunnyvale，calif.）用于靈敏的高速視頻圖像顯示，其用于在載玻片上找到興趣區(qū)域以及用于聚焦。另一相機(jī)端口具有冷卻ccd相機(jī)（型號(hào)200，來(lái)自photometricsltd.,tucson,ariz.），其以高分辨率和靈敏度用于實(shí)際圖像采集。冷卻ccd相機(jī)通過(guò)vme總線連接到sun4/330工作站（sunmicrosystems，inc.，mountainview，calif.）。使用圖像處理軟件包scil-image（delftcenterforimageprocessing，delft，netherlands）控制多色圖像的整個(gè)采集。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于擴(kuò)增和/或分析核酸的試劑盒和系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括用于分析和檢測(cè)拷貝數(shù)或基因表達(dá)變化必需的、足夠的或可用的試劑（例如引物、探針、錨(anchors)、固體支持物、試劑、對(duì)照、說(shuō)明書等）。例如，在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于擴(kuò)增和測(cè)序興趣區(qū)域和對(duì)照區(qū)域的引物和錨。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括分析軟件（例如，以分析測(cè)序數(shù)據(jù)）。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)含有試劑、引物、探針、錨、固體支持物、緩沖液等的容器。在一些實(shí)施方案中，試劑盒的每個(gè)組分包裝在單獨(dú)的容器中。在一些實(shí)施方案中，容器被包裝和/或運(yùn)輸在相同的試劑盒或盒中以一起使用。在一些實(shí)施方案中，試劑盒的一種或多種組分被分開(kāi)運(yùn)輸和/或包裝。

可適用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)(pointofcare)測(cè)定系統(tǒng)（包括abbott'spointofcare(i-stat^tm)電化學(xué)免疫測(cè)定系統(tǒng)免疫傳感器）或?qū)ζ鋬?yōu)化的測(cè)定和試劑盒以及制造它們和在一次性測(cè)試裝置中操作它們的方法例如描述于美國(guó)專利號(hào)5,063,081和公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030170881、20040018577、20050054078和20060160164中（對(duì)于其關(guān)于所述內(nèi)容的教導(dǎo)通過(guò)引用并入本文）。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包括自動(dòng)化樣品和試劑處理裝置（例如機(jī)器人）。

實(shí)驗(yàn)

實(shí)施例1

探針的產(chǎn)生

使用ucsc基因組瀏覽器來(lái)鑒定坐標(biāo)為hg18_dna范圍chr17：35004678-35230380的her2基因座區(qū)域中的序列。將該序列下載，編碼，使得由repeatmasker鑒定的區(qū)域被掩蔽為小寫字母。將225703個(gè)堿基的序列用軟件程序進(jìn)行處理，該軟件程序刪除了具有多于連續(xù)3個(gè)小寫字母的所有序列，返回?zé)o重復(fù)片段的序列的段及其在原始序列中的位置（圖2）。

這些序列的大小從非常小到5615個(gè)堿基。僅選擇最長(zhǎng)的片段來(lái)生成序列庫(kù)。1200bp的最小長(zhǎng)度截止值產(chǎn)生35個(gè)序列，其包含76904bp的序列。

預(yù)期每個(gè)單獨(dú)序列的pcr擴(kuò)增根據(jù)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度產(chǎn)生序列亞結(jié)構(gòu)域的可變的產(chǎn)量，因此將序列分成多個(gè)重疊子序列，各1200bp。所有亞片段被設(shè)計(jì)為包括與相鄰亞片段至少100bp重疊以適應(yīng)引物位置的變化。該處理產(chǎn)生95個(gè)候選序列。

對(duì)于每個(gè)序列，使用基于網(wǎng)絡(luò)的程序“batchprimer3”設(shè)計(jì)引物對(duì)，所述程序?qū)ふ彝ㄓ靡镆援a(chǎn)生這樣的擴(kuò)增子：最小800，最佳1200，最大1200；引物長(zhǎng)度最小22，最佳25，最大30；tm最小65，最佳70，最大75。引物序列作為xls文件下載并復(fù)制到電子表格中以調(diào)整格式使其適合放置訂單。

引物從idt訂購(gòu)為混合的正向和反向引物12nmole，各自在深孔板中干燥的。向每個(gè)孔中加入240μl水（5prime2900132）以得到各自50um。根據(jù)pcr需要制備稀釋液。

基因組dna的pcr對(duì)于僅約一半的孔產(chǎn)生干凈的1200聚體產(chǎn)物，因此使用含有期望的基因座的bacdna的制備物來(lái)產(chǎn)生高得多的成功率。覆蓋該基因座的大腸桿菌中的bac克隆從genomesystems，inc.st.louis獲得，進(jìn)行培養(yǎng)物生長(zhǎng)并通過(guò)“mini-prep”分離dna。

pcr主混合物：使用含有phirehotstartiidna聚合酶（thermof-122l）的pcr試劑盒。它含有400μl5x反應(yīng)緩沖液+40μl25mmdntp（rochediagnostics，indianapolis，in）+40μlphire聚合酶+60μldmso+1260μl水+0.5ugbacdna模板。

pcr：向96孔板的孔中加入2μl每個(gè)引物對(duì)5um+18μl主混合物；將孔蓋上蓋，放在熱循環(huán)儀上，程序?yàn)?8度30秒，30x（98度8秒，72度30秒，72度2分鐘），72度10分鐘，4度。在完成后，將5μl的每個(gè)反應(yīng)物取樣到具有痕量的6xdna上樣染料（thermor0611）的20μl水中，將20μl轉(zhuǎn)移到egel96瓊脂糖凝膠（lifetechnologies）的孔中，并電泳8分鐘。96個(gè)孔中的94個(gè)在期望的mw顯示干凈的條帶（圖3）。

擴(kuò)大pcr以將產(chǎn)量最大化。向含有來(lái)自電泳樣品的剩余5μl的每個(gè)孔中，加入10μl相同的5um引物+10μl水+25μl的dreamtaqgreen2xpcrmm，并將管蓋上蓋并放置在具有程序10x（95度30秒，55度30秒，72度2分鐘）72度6分鐘的熱循環(huán)儀上。完成后，向每個(gè)孔加入6μl的(30μl1mmgcl2+192μl25mmdntp+378μl水+100μldreamtaqgreen2xpcrmm)并將管蓋上蓋并放置在具有程序6x（95度30秒，55度30秒，72度2分鐘）72度10分鐘的熱循環(huán)儀上。

將柱的內(nèi)容物合并以得到表示基因組范圍不同基因座的6個(gè)擴(kuò)增子混合物，并通過(guò)用異丙醇沉淀分離dna，并重懸于水中，得到含有52-75μgdna的100μl溶液。

通過(guò)超聲處理片段化：將來(lái)自pcr孔1-48和49-96的約180μgdna1200聚體在管中與水合并以得到400μl，且乙酸鈉為300mm。將管放置在超聲波儀柜內(nèi)的冰水燒杯中，超聲處理（超聲波儀branson450）輸出控制3,30％占空比16分鐘。超聲處理產(chǎn)物用異丙醇沉淀，并重懸于200μl的20mmtrisph8.2中的600mmnacl中。通過(guò)以下將樣品分級(jí)：具有monoq柱的hplc（gelifesciences），緩沖液a=20mmtrisph8.2；緩沖液b=a+2.0mnacl，0.4ml/min％b=40-50經(jīng)32分鐘，收集級(jí)分。dna洗脫在寬峰中，中心為約15分鐘。合并級(jí)分得到各自7個(gè)合并物。用溴化乙錠顯現(xiàn)的3％瓊脂糖凝膠上的電泳顯示范圍為約80bp至約400bp的級(jí)分（標(biāo)記的h15、h18、h21、h24、h27、h30、h33）（圖4）。

片段化的dna的胺化：合并的級(jí)分通過(guò)異丙醇沉淀濃縮，重懸于20μl水中并通過(guò)在沸水中加熱1分鐘來(lái)變性。向20μl變性的dna中加入180μl的1000μl水、600μl三氟乙酸（sigma，stlouismo）348μl乙二胺和190mg焦亞硫酸鈉的混合物，并將混合物在65℃下孵育20分鐘。然后將混合物通過(guò)sephadexg25脫鹽，并將脫鹽產(chǎn)物通過(guò)異丙醇沉淀濃縮并再懸浮于水中。

通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法，用羧基四甲基羅丹明使用其nhs酯（lifetechnologiesc1171）將胺化的產(chǎn)物標(biāo)記。通過(guò)使用10kda濾器（nanosep10omega，pallcorporation，annarbor，mi）的超濾從剩余的未結(jié)合染料中分離標(biāo)記的產(chǎn)物，然后經(jīng)0.22u過(guò)濾器（milliporeufc30gv00，billerica，ma）過(guò)濾。

經(jīng)銜接子介導(dǎo)的pcr制備探針

還通過(guò)連接銜接子并使用產(chǎn)物作為pcr模板使用對(duì)應(yīng)于銜接子序列的引物修飾所需大小的片段。這提供了產(chǎn)生更大量的期望大小的產(chǎn)物的有效方法，以及提供將額外官能團(tuán)偶聯(lián)到產(chǎn)物上的方法。該方法由以下組成：修飾片段以產(chǎn)生5'磷酸化的平末端，然后連接期望序列的銜接子。銜接子可以被設(shè)計(jì)成含有限制位點(diǎn)，使得dsdnapcr產(chǎn)物可以用合適的限制性酶切割以除去不想要的銜接子序列或以露出適于連接另外的基團(tuán)的粘性末端。

通過(guò)使用thermofastdnaendrepairkitk0771根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行片段的末端修復(fù)，用4ug各級(jí)分h18、h24、h30開(kāi)始。使用離心柱（invitrogenk310001）分離平端產(chǎn)物。處理4ug超聲處理的分級(jí)的dna產(chǎn)生約3.5ug平端產(chǎn)物h18b、h24b、h30b，各自的濃度為74、66、70ng/μl。

通過(guò)將每種寡核苷酸g6a、g6b、gc6a、gc6b、bspd、bstb、bspdc、bstbc與20mmtrisph8.0和250mmnacl組合來(lái)制備銜接子混合物，將混合物在沸水中加熱1分鐘并冷卻至室溫。t4dna連接酶（invitrogena13726，含有以5單位/μl的連接酶和反應(yīng)緩沖液的試劑盒）用于將銜接子連接到各平端的dna級(jí)分：向10μl平端的dna級(jí)分中加入5μl銜接子混合物、2μl10x連接酶緩沖液、2μl50％peg4000和1μl，并將混合物在室溫下放置過(guò)夜。使用旋轉(zhuǎn)柱（invitrogenk310001）在50μl洗脫緩沖液中洗脫來(lái)分離銜接產(chǎn)物，且標(biāo)記的h18t、h24t、h30t各自濃度為37、39、30ng/μl。

銜接的her2級(jí)分的pcr以20μl規(guī)模各自使用1μl的銜接模板h18t、h25t、h30t和商購(gòu)pcrmastermix(dreamtaqgreenthermok1081)進(jìn)行。各反應(yīng)物含有5或10um的單一引物g6a或bspd。循環(huán)條件為24x（95度30秒，52度30秒，72度30秒）。通過(guò)向4μl產(chǎn)物中加入1μl1m氫氧化鈉使產(chǎn)物變性，并在3％瓊脂糖/etbr凝膠上分析。對(duì)于所有測(cè)試的引物和引物濃度，pcr產(chǎn)物顯示對(duì)應(yīng)于模板大小的條帶（圖5）。

使用圖5所示的pcr的產(chǎn)物作為使用10umbspd24引物擴(kuò)增的模板；加入10μl的bspd10-18、bspd10-24和bspd5-30以得到在最終的1x主混合物中的800μl。將其分成8×100μl份，并用循環(huán)條件12x（95度30秒，60度30秒，72度2分鐘）擴(kuò)增。向每個(gè)孔中加入額外體積2.1μl的41.5μl25mmdntp（rochediagnostics，indianapolis，in）和13μl1.0m氯化鎂（sigma，stlouismo）的混合物，并將混合物進(jìn)行額外的8x（95度30秒，60度30秒，72度4分鐘）。將合并的產(chǎn)物用異丙醇沉淀，各自再懸浮于200μl水中，并用聚乙二醇進(jìn)一步沉淀以從引物分離pcr產(chǎn)物。將最終pcr產(chǎn)物溶于200μl水中，標(biāo)記h18b、h24b、h30b，濃度測(cè)量為1126、1270、1357ng/μl。

pcr產(chǎn)物的限制性消化以減少銜接子部分：使用限制酶bspdi（newenglandbiolabsipswichma）。向260μl水中加入40μl10scutsmart緩沖液bspdi（newenglandbiolabsipswichma）、100μl上述pcr產(chǎn)物h18b、h24b、h30b和10μl10u/μlbspdi，并將混合物在37℃下孵育16小時(shí)。將反應(yīng)物標(biāo)記為h18r、h24r、h30r。

16小時(shí)孵育后，取各樣品用于電泳，比較消化與未消化的產(chǎn)物。向pcr條的孔中加入8μl2x上樣染料(thermofisherscientific)、0.6μl(h18b、h24b、h30b)、2.4μl(h18r、h24r、h30r)+水至10μl；各混合物分為各自2x5μl，所有中均加入4μl水。向每一個(gè)中加入1μl1mnaoh并加熱95度30秒以變性。各自5μl上樣到3%瓊脂糖/etbr凝膠的孔中并電泳。在凝膠圖像中，“-”和“+”對(duì)應(yīng)于不存在和存在naoh。所有消化產(chǎn)物都顯示對(duì)于bspdi成功切割所預(yù)期的較小大小和末端片段的存在（可能來(lái)自與殘留引物的退火片段的雙體(doublet)）。naoh的變性顯示對(duì)未消化和消化的產(chǎn)物兩者大小的進(jìn)一步降低。通過(guò)變性消除來(lái)自片段延長(zhǎng)退火的較高分子量的彌散(smear)。

產(chǎn)物h18b、h24b、h30b、h18r、h24r、h30r用異丙醇沉淀，再懸浮于20μl水中，并通過(guò)上述程序進(jìn)行胺化和用羧基四甲基羅丹明標(biāo)記。

fish雜交條件

靶向探針與結(jié)合玻璃顯微鏡載玻片的淋巴細(xì)胞中的人染色體dna雜交。在典型的實(shí)驗(yàn)中，試劑混合物由以下組成：7μl的lsi/wcp雜交緩沖液（abbottmolecular（desplaines，il））和3μl含有2000ng超聲處理的人胎盤dna、500ngcot-1dna（lifetechnologies^tm（grandisland，ny））、50ng的探針cep17-sg緩沖液（abbottmolecular（desplaines，il））和100ng的測(cè)試探針的水。

將顯微鏡載玻片通過(guò)連續(xù)浸入70％、85％和100％乙醇中脫水，然后風(fēng)干。將測(cè)試溶液（10μl）放置在載玻片上并用22×22mm的蓋玻片覆蓋，使溶液鋪展在覆蓋區(qū)域上。施加橡膠膠水以將邊緣密封并將載玻片放置在控制溫度的儀器中。將溫度升至70℃持續(xù)5分鐘以使樣品和試劑的dna變性，然后降至45℃1小時(shí)，以允許試劑與其靶標(biāo)雜交的時(shí)間。雜交時(shí)間完成后，去除橡膠膠水和蓋玻片，將載玻片在0.4×ssc和0.3％np40的溶液中在73℃下洗滌2分鐘，然后在2×ssc、0.1％np40中在室溫下洗滌1分鐘，然后風(fēng)干。

通過(guò)將10μl的dapi溶液置于目標(biāo)區(qū)域上并用蓋玻片覆蓋來(lái)制備載玻片用于觀察。用裝有適合于目標(biāo)熒光團(tuán)的濾光片的熒光顯微鏡觀察載玻片。

所得的雜交圖案的熒光顯微術(shù)

將10μl的dapi-ii（abbottmolecular（desplaines，il））置于載玻片上靶標(biāo)位置處，用22×22mm蓋玻片覆蓋，并在配備有允許同時(shí)顯現(xiàn)dapi、熒光素（綠色）和tamra（橙色）信號(hào)的濾光片的熒光顯微鏡下觀察。照片（圖7）顯示橙色和綠色信號(hào)的圖案與對(duì)于由測(cè)試探針染色的her2基因座（橙色）和由cep17-sg染色的著絲粒位置（綠色）所預(yù)期的那些相符。在中期染色體上，橙色和綠色信號(hào)位于同一染色體上的相鄰位置，而間期核在任意距離對(duì)各自顯示兩個(gè)強(qiáng)信號(hào)。對(duì)于經(jīng)相同hplc級(jí)分的銜接子介導(dǎo)的pcr制備的探針可以看到類似的結(jié)果。在標(biāo)記之前通過(guò)限制性消化去除銜接子末端產(chǎn)生具有無(wú)法區(qū)分的性能特征的探針。

用于1200聚體片段的引物序列

銜接子修飾和銜接子介導(dǎo)的pcr中所用的序列

實(shí)施例2

基于用于比較的可獲得的bac探針，使用模型靶標(biāo)p53、her2和p16進(jìn)行設(shè)計(jì)。用ucsc基因組瀏覽器鑒定與靶標(biāo)相對(duì)應(yīng)且標(biāo)記了重復(fù)序列用于去除的基因組序列。

對(duì)于pcr探針，使用計(jì)算機(jī)應(yīng)用來(lái)分離序列的無(wú)重復(fù)片段部分，并鑒定針對(duì)靶標(biāo)的片段用于制備為“千聚體(kilomers)”。使用基于網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用“batchprimer3”產(chǎn)生引物序列以擴(kuò)增盡可能多的每個(gè)千聚體序列，并且通過(guò)idt以96孔格式合成鑒定的引物序列。對(duì)于寡聚物和寡聚物-pcr雜交探針，進(jìn)一步處理序列的無(wú)重復(fù)片段部分以鑒定指定大小和gc含量的片段。該處理使用excel電子表格來(lái)附加通用銜接子序列、分選和將序列列表格式化用于放置合成訂單。

通過(guò)寡聚物合成、寡聚物-pcr雜交或通過(guò)1步或2步pcr產(chǎn)生以最終探針結(jié)束的大量dna。1步pcr方法如下：在使用bac或基因組dna模板的pcr后，將產(chǎn)物合并并通過(guò)超聲處理片段化以得到可通過(guò)與基于bac的fish探針使用的相同的方法進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記的產(chǎn)物。這樣制備的fish探針在結(jié)構(gòu)上與ambac探針相同—唯一的區(qū)別是pcr探針排除了bacdna中存在的重復(fù)序列和載體序列。2步方法如下：將超聲處理的產(chǎn)物與銜接子連接以制備含有所有選擇的靶序列的單一模板混合物。該模板然后可用于使用單一組引物的單一pcr反應(yīng)以產(chǎn)生用于胺化和標(biāo)記的大量dna。在這種情況下，超聲處理不再需要，因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)是期望的大小。將模板制備一次，無(wú)限期存儲(chǔ)并為每個(gè)新制劑采集樣品。銜接子序列存在于產(chǎn)物的5'和3'末端。雖然它們可以通過(guò)限制性消化來(lái)去除，但測(cè)試顯示它們的存在不會(huì)損害fish測(cè)定中的性能。

通過(guò)在pcr反應(yīng)中包含氨基烯丙基dutp或通過(guò)化學(xué)胺化引入用于連接熒光團(tuán)標(biāo)記的胺基?；瘜W(xué)胺化通過(guò)使用am探針的亞硫酸氫鹽/tfa/乙二胺方法進(jìn)行，但例外是在將反應(yīng)混合物脫鹽之后但在乙醇沉淀之前加入少量的四甲基乙二胺。這替代殘留的未連接的乙二胺，否則乙二胺會(huì)在標(biāo)記反應(yīng)中競(jìng)爭(zhēng)熒光團(tuán)。

用熒光團(tuán)標(biāo)記胺化的dna是通過(guò)更適合于許多小規(guī)模反應(yīng)的已建立方法的改變來(lái)完成。在該改變中，將胺化的dna與四甲基乙二胺和氯化鈉在25％dmso中的反應(yīng)緩沖液合并，加入活性熒光團(tuán)，并將混合物在60℃下孵育2小時(shí)。通過(guò)乙醇沉淀分離產(chǎn)物，并進(jìn)行75℃72小時(shí)甲酰胺處理標(biāo)準(zhǔn)。

her2pcr探針：

對(duì)于her2pcr探針，產(chǎn)生三種變體，均使用76kb的無(wú)重復(fù)片段的序列。對(duì)于最簡(jiǎn)單的“1步pcr”探針，將pcr產(chǎn)生的dna與常規(guī)探針中的bacdna相同處理：通過(guò)超聲處理片段化，然后進(jìn)行化學(xué)胺化和標(biāo)記。對(duì)于“2步pcr”探針，將超聲處理片段連接到銜接子以制備模板。用單一引物擴(kuò)增該模板以產(chǎn)生準(zhǔn)備進(jìn)行胺化和標(biāo)記的大量dna。在第三種形式中，“用氨基烯丙基dutp的2步pcr”，在氨基烯丙基dutp存在下用引物對(duì)擴(kuò)增該相同的模板以生成胺化的產(chǎn)物，準(zhǔn)備用于用任何期望的熒光團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。

her2基因座中無(wú)重復(fù)片段序列的產(chǎn)生：

使用通過(guò)p1克隆pvys174c,e,h,i限定的基因座鑒定her2pcr形式的序列。這些克隆包括在hg18_dna范圍chr17:35004678-35230380的226kb。這些坐標(biāo)被輸入到ucsd基因組瀏覽器中，并且使用repeatmasker功能呈現(xiàn)相應(yīng)的序列以將已知為重復(fù)序列的部分呈現(xiàn)為小寫字母。使用應(yīng)用復(fù)制大寫字母的“唯一”序列部分，以選出大寫字母唯一子序列，保留各自的位置信息。這產(chǎn)生了長(zhǎng)于1200bp（1234至5615bp）的35個(gè)序列，總計(jì)為76904bp。用另一個(gè)應(yīng)用處理這些序列，將所有序列分成總共95個(gè)序列，每個(gè)序列1200bp，且具有至少300bp重疊。將1200bp序列輸入基于網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用“batchprimer3”，調(diào)整設(shè)置以產(chǎn)生具有至少65度的tm的引物，以在擴(kuò)增子中包含盡可能多的（至少800bp）的每個(gè)序列。

合成鑒定的引物序列并將其作為引物對(duì)置于96孔板形式中。將引物溶解在水中并制備以得到各5um的引物，同時(shí)仍在96孔板形式中。pcr以如引物對(duì)的相同形式在96孔板中使用含有phire聚合酶、由p1克隆pvys174c,e,h,i的混合物組成的模板和以0.5um的引物的主混合物進(jìn)行。（注意，可以使用基因組dna作為模板，但優(yōu)選基因座特異性克隆諸如bac和pac的）。通過(guò)96孔egel分析產(chǎn)物，并在95個(gè)孔的94個(gè)顯示強(qiáng)且干凈(strongclean)的條帶。當(dāng)使用taq聚合酶時(shí)，95個(gè)反應(yīng)中僅87個(gè)顯示產(chǎn)物。

her-2無(wú)重復(fù)片段序列的片段化：

合并pcr孔的內(nèi)含物并通過(guò)乙醇沉淀和peg沉淀分離dna1200聚體。將1200聚體混合物通過(guò)用于將其他am探針的bacdna片段化的相同方法進(jìn)行超聲處理，并將超聲處理的產(chǎn)物通過(guò)具有離子交換柱的hplc分級(jí)以得到范圍在約120-約400bp的窄大小級(jí)分。在一些實(shí)施方式中，取消分級(jí)步驟。

來(lái)自1步pcr方法的her-2探針：

為了制備探針5/13-76a，將中心位于150bp的級(jí)分通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序胺化并用spectrumorange標(biāo)記。

來(lái)自2步pcr方法的her-2探針：

為了從兩步法制備her-2探針，將一部分相同的150bphplc級(jí)分用平端化劑處理并與銜接子連接。在第二次pcr反應(yīng)中使用銜接產(chǎn)物作為模板，這次僅使用單一引物，其序列對(duì)應(yīng)于銜接子。使用單一引物擴(kuò)增銜接模板通過(guò)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)抑制最短片段的擴(kuò)增，并產(chǎn)生富集較長(zhǎng)片段的產(chǎn)物。將pcr產(chǎn)物胺化并用spectrumorange標(biāo)記，然后進(jìn)行75℃72小時(shí)甲酰胺處理。

經(jīng)氨基烯丙基dutp胺化的her-2pcr探針：

為了通過(guò)氨基烯丙基dutp胺化制備her-2pcr探針，將超聲處理的1200聚體的hplc級(jí)分重組（以模擬未分級(jí)片段），用平端化劑處理并連接到包含含有bspqi限制位點(diǎn)的通用5'末端的銜接子上。在第二次pcr反應(yīng)中使用銜接產(chǎn)物作為模板，這次使用對(duì)應(yīng)于銜接子序列的兩個(gè)引物，并且用氨基烯丙基dutp替代一半的dttp。用限制性酶bspqi處理pcr產(chǎn)物以消化共同的末端，并用spectrumorange標(biāo)記的dna產(chǎn)物，然后進(jìn)行75℃72小時(shí)甲酰胺處理。

her-2寡聚物探針：

設(shè)計(jì)her-2寡聚物探針開(kāi)始于如her2pcr探針的相同無(wú)重復(fù)片段序列。使用應(yīng)用來(lái)選擇該序列的無(wú)重疊80個(gè)堿基的部分，均具有大約50%gc含量(g+c最小=39，最大=41)。發(fā)現(xiàn)總計(jì)401個(gè)此類序列。將這些輸入網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用quickfold，參數(shù)為na+=0.05m,mg++=0.001m,最大1折疊(folding)且結(jié)果復(fù)制為文本和δg。使用excel的發(fā)現(xiàn)特色來(lái)標(biāo)記含有去除某些限制位點(diǎn)的序列（以允許這些序列用于銜接子而不干擾靶序列）。其余序列通過(guò)δg分選，并選擇具有最低折疊傾向的288（三個(gè)96孔板）用于進(jìn)一步處理和通過(guò)基因組定位分選。80聚體序列通過(guò)通用20個(gè)堿基連接序列成對(duì)連接，并且還將不同的通用20個(gè)堿基加入到該對(duì)的3'端，使總共待合成200個(gè)堿基。全部288個(gè)80聚體（圖代表144個(gè)單獨(dú)的“正向”200聚體。還計(jì)算了靶標(biāo)80聚體和通用20聚體的互補(bǔ)體，并以相同的方式裝配以提供144個(gè)單獨(dú)的“反向”200聚體。這些裝配被設(shè)計(jì)成使得在混合時(shí)，序列應(yīng)以交錯(cuò)的方式形成雙鏈體，產(chǎn)生退火產(chǎn)物的長(zhǎng)鏈。

核酸通過(guò)上述程序進(jìn)行化學(xué)胺化，并用spectrumorange標(biāo)記。通過(guò)凝膠電泳純化標(biāo)記產(chǎn)物以除去截短的合成產(chǎn)物，并將全長(zhǎng)產(chǎn)物組合以得到最終探針。

額外的her2寡聚物探針的設(shè)計(jì)開(kāi)始于與her2pcr探針的相同序列，掩蔽重復(fù)序列。引入額外的掩蔽來(lái)標(biāo)記去除其他不需要的子序列：5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的“g”或“c”堿基，以及與bspqi限制位點(diǎn)“gctcttc”和“gaagagc”相對(duì)應(yīng)的序列。處理剩余的序列以鑒定具有55-65％gc的60個(gè)堿基的段。在序列下游40kb中發(fā)現(xiàn)非常少的可接受的序列，因此只有1-180kb范圍內(nèi)的序列進(jìn)入到下一階段。使用互補(bǔ)引物向每個(gè)序列的3'末端加入堿基“ggttgaagag”聚合酶。使用基于網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用“zipfold”來(lái)測(cè)定折疊的能量。在評(píng)估的1027個(gè)60聚體中，保留具有最低折疊傾向的960個(gè)。根據(jù)折疊能量將它們分成5組（每組192個(gè)成員=兩個(gè)96孔板），每組按整個(gè)基因組序列中的位置分選。將寡核苷酸溶解在水中，并根據(jù)折疊趨勢(shì)組合成組。每個(gè)組的樣品用含有對(duì)應(yīng)于通用3'末端序列的引物和phire聚合酶進(jìn)行退火，以延伸各自至平端雙鏈體混合物。這些通過(guò)離子交換hplc純化以除去截短的寡聚物的產(chǎn)物。

p53pcr探針：

與her-2探針相同，基于相應(yīng)的bacp53探針的bac的序列設(shè)計(jì)了p53pcr探針。千聚體通過(guò)pcr產(chǎn)生，合并并通過(guò)超聲處理片段化。對(duì)于1步pcr探針，將超聲處理片段簡(jiǎn)單地胺化并標(biāo)記。對(duì)于2步pcr變體，將超聲處理片段平端化并與銜接子連接以制備模板。為了產(chǎn)生用于胺化和標(biāo)記的大量dna，使用對(duì)應(yīng)于銜接子序列的引物擴(kuò)增模板。從相同模板（但在反應(yīng)混合物中包含氨基烯丙基dutp）制備含有胺用于標(biāo)記的大量dna。對(duì)于另外的變體，通過(guò)用對(duì)于包含在銜接子中的識(shí)別位點(diǎn)特異性的限制酶消化pcr產(chǎn)物來(lái)除去銜接子序列。

p53基因座中無(wú)重復(fù)片段序列的產(chǎn)生：

使用通過(guò)bac克隆pvys173i限定的基因座鑒定p53pcr形式的序列。該克隆由在hg18_dna范圍chr17:7435119-7606823的172kb組成。這些坐標(biāo)被輸入到ucsd基因組瀏覽器中，并且使用repeatmasker功能呈現(xiàn)相應(yīng)的序列以將已知為重復(fù)序列的部分呈現(xiàn)為小寫字母。下表1顯示了引物序列。

如上所述復(fù)制大寫字母的“唯一”序列部分，以選出大寫字母“唯一”子序列，保留各自的位置信息。這產(chǎn)生長(zhǎng)于1200bp的僅17個(gè)序列，總計(jì)35930bp。向這些中加入13個(gè)具有長(zhǎng)度800-1200的片段和10個(gè)650-800bp的片段以得到最終總計(jì)55661bp。對(duì)第一組使用應(yīng)用“seqchop3”以產(chǎn)生具有400個(gè)堿基重疊的1200聚體，得到65個(gè)序列。具有200個(gè)堿基重疊的800聚體的第二組（800-1200）產(chǎn)生26個(gè)序列。為了完成96孔板，接受650-800堿基區(qū)域中的額外5個(gè)序列。調(diào)整這樣產(chǎn)生的序列以得到tm至少65度的引物，以在擴(kuò)增子中包括盡可能多的每個(gè)序列。將引物溶解在水中以得到各5um的引物，同時(shí)仍在96孔板形式中。pcr以如引物對(duì)的相同形式在96孔板中使用含有phire聚合酶、由bac克隆pvys173i組成的模板和以0.5um的引物的主混合物進(jìn)行。pcr完結(jié)時(shí)，加入額外引物、taq聚合酶和dntp，并將板進(jìn)行額外8個(gè)循環(huán)以增加產(chǎn)物產(chǎn)率。通過(guò)96孔egel分析產(chǎn)物，并在96個(gè)孔的91個(gè)顯示強(qiáng)且干凈(strongclean)的條帶。合并pcr孔的內(nèi)含物并通過(guò)乙醇沉淀和peg沉淀分離dna。通過(guò)用于將其他探針的bacdna片段化的相同方法將混合物超聲處理。

來(lái)自1步pcr方法的p53探針：

為了從1步pcr方法制備p53探針，將超聲處理的產(chǎn)物胺化并用spectrumorange標(biāo)記，隨后進(jìn)行75℃72h甲酰胺處理。

來(lái)自2步pcr方法的p53探針：

為了從2步pcr方法制備p53探針，將超聲處理的產(chǎn)物的一部分使用一次性硅膠基離心柱(purelinkpcrpurificationkit)分級(jí)，但調(diào)整結(jié)合緩沖液以分離范圍在100-300bp的級(jí)分。該級(jí)分的一部分用平端化劑處理并連接至銜接子。在第二次pcr反應(yīng)中使用該銜接產(chǎn)物作為模板，這次僅使用單一引物，其序列對(duì)應(yīng)于銜接子。將pcr產(chǎn)物胺化，用spectrumorange標(biāo)記，并進(jìn)行75℃72小時(shí)甲酰胺處理。

經(jīng)氨基烯丙基dutp胺化的p53pcr探針：

如上所述制備該探針，例外是pcr步驟包括加入到pcr混合物中的氨基烯丙基dutp。將pcr產(chǎn)物用spectrumorange標(biāo)記，并進(jìn)行75℃72小時(shí)甲酰胺處理。

將一部分超聲處理的平端化的無(wú)重復(fù)片段的p53dna連接至含有bspqi限制位點(diǎn)的銜接子。將產(chǎn)物用作在含有氨基烯丙基dutp的pcr反應(yīng)（具有一對(duì)對(duì)應(yīng)于銜接子的引物）中的模板，并將產(chǎn)物暴露于bspqi限制酶以去除銜接子末端。僅含有p53特異性序列的消化產(chǎn)物用spectrumorange標(biāo)記，然后進(jìn)行7℃72小時(shí)甲酰胺處理。

p53的寡聚物pcr探針

p53寡核苷酸探針的序列如上鑒定；然而，在這種情況下，除了掩蔽重復(fù)序列之外，掩蔽了5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的“g”和“c”的所有子序列。設(shè)置參數(shù)以鑒定長(zhǎng)度為140且gc含量為45-60％的子序列。將鑒定的289個(gè)序列進(jìn)行ncbiblast以找到與人基因組中其他基因座的匹配。此后仍有281個(gè)唯一序列。向這些中的280個(gè)附加了各25個(gè)堿基并含有限制位點(diǎn)的通用正向和反向序列以得到各190個(gè)堿基的280個(gè)序列。將這些序列送到idt用于以96孔板格式合成為“超聚體(μltramers)”。將產(chǎn)物合并，并在pcr中用作用對(duì)應(yīng)于銜接子的引物序列的模板。通過(guò)用限制酶消化去除銜接子末端，并將產(chǎn)物胺化，用spectrumorange標(biāo)記，并進(jìn)行75℃72小時(shí)甲酰胺處理。

表2顯示了190bp序列。

。

表3顯示探針設(shè)計(jì)和下游/清除(cleanup)方法的概述。

表3

測(cè)試結(jié)果

探針首先在雄性淋巴細(xì)胞載玻片上測(cè)試，并且評(píng)價(jià)探針密度、特異性、背景和交叉雜交，用對(duì)應(yīng)的bac探針作為對(duì)照。

所有測(cè)試的探針通過(guò)了在淋巴細(xì)胞載玻片上的交叉雜交測(cè)試。一旦探針設(shè)計(jì)在淋巴細(xì)胞載玻片上通過(guò)，則隨后將其在ffpe載玻片上測(cè)試。所有探針在乳腺癌組織ffpe載玻片上測(cè)試。一些探針在乳腺和胃部載玻片上測(cè)試。對(duì)于所有ffpe載玻片使用通用的預(yù)處理方法。使用來(lái)自am庫(kù)存的her2和p53bac探針作為所有實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。bac對(duì)照探針通過(guò)了在淋巴細(xì)胞載玻片和ffpe組織載玻片上的過(guò)夜雜交，但沒(méi)有通過(guò)在兩種載玻片類型上的1小時(shí)雜交。

結(jié)果表明rfpcr探針設(shè)計(jì)優(yōu)于通過(guò)直接合成或寡聚物pcr雜交物設(shè)計(jì)的合成寡聚物的性能。直接合成的her2寡聚物探針和寡聚物pcr雜交物p53探針沒(méi)有通過(guò)1小時(shí)ffpe，而寡聚物pcr雜交物her2探針沒(méi)有通過(guò)所有質(zhì)量評(píng)價(jià)?；谶@些數(shù)據(jù)，將寡聚物探針設(shè)計(jì)從進(jìn)一步評(píng)價(jià)中排除，而rfpcr方法用于選擇最佳探針設(shè)計(jì)。

所有rfpcr設(shè)計(jì)均通過(guò)了在淋巴細(xì)胞和ffpe載玻片上的1小時(shí)和過(guò)夜雜交的質(zhì)量評(píng)價(jià)，除了在淋巴細(xì)胞載玻片上觀察到的一些次優(yōu)特異性數(shù)據(jù)點(diǎn)。

2步pcr設(shè)計(jì)具有若干下游或清除選項(xiàng)，諸如超聲處理后的dna片段分級(jí)、用氨基烯丙基dutp的第二pcr和第二pcr后的銜接子去除。表1列出了每一探針設(shè)計(jì)的所有下游或清除步驟。對(duì)于兩種her22步探針，不同的分級(jí)大小、第二pcr具有或不具有氨基烯丙基dutp和第二pcr后去除或不去除銜接子對(duì)于最終探針質(zhì)量沒(méi)有正面影響。

與三種p532步pcr探針相同，第二pcr具有氨基烯丙基dutp相對(duì)于胺化和第二pcr后去除或不去除銜接子不影響最終探針質(zhì)量。

無(wú)重復(fù)片段的pcrfish探針設(shè)計(jì)和制備的最終程序如下。

1:在基因組瀏覽器上鑒定期望的基因座坐標(biāo)。

2:下載具有重復(fù)片段掩蔽為n的序列。

3:將序列輸入序列處理程序中。

4:處理以鑒定千聚體的唯一序列，并對(duì)batchprimer3格式化。

5:使用batchprimer3（網(wǎng)絡(luò)）以鑒定各千聚體的f和r引物。

6:訂購(gòu)以96孔板形式的混合的引物。

7:使用phusion聚合酶在板中pcr，通過(guò)egel-96評(píng)估。

8:合并pcr產(chǎn)物，通過(guò)超聲處理片段化。

9:將超聲處理的dna平端化。

10:連接銜接子以制備模板。

11:用以下pcr：銜接子引物以制備大量用于胺化、標(biāo)記的dna。

或銜接子引物和aadutp以制備用于標(biāo)記的胺化的dna。

13:（如需要）胺化

14:標(biāo)記，甲酰胺處理。

實(shí)施例3

該實(shí)施例描述了靶向p16的無(wú)重復(fù)片段的探針的開(kāi)發(fā)。p16探針的圖譜顯示在圖9中。引物序列顯示于表4中。

表4

1200聚體用phusion的pcr：向2μl各p16rf5um加入18μlphusionmm并置于熱循環(huán)儀，程序?yàn)?8度20秒，25x(98℃8秒，68℃30秒，72度1分鐘),72℃10分鐘，4℃。延伸pcr：向各孔加入2μl的相同5μm引物和2μl(80μl2xpcrmm+60μldntp+20μl1mmgcl2)并進(jìn)行熱循環(huán)：10x(98℃8秒，68℃30秒，72℃2分鐘)。將3μl上樣至egel的孔，電泳8分鐘。大部分孔（68/73）顯示出預(yù)期（相同）mw處的強(qiáng)且干凈的條帶。然而，一些顯示緊密靠近的雙帶(doublet)。將p16rfphusionpcr的孔合并至總共1200μl，在管中分成3×400μl，并加入40μl3mnaac和1mletoh，并將管置于-20℃。將管以15000rpm4℃離心12分鐘，在400μl70％etoh中洗滌沉淀，真空離心機(jī)干燥，合并，再懸浮于200μl水中，置于65℃烘箱中5分鐘，以4000rpm離心5min沉淀聚合酶。將上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入300μlpegrgt。15分鐘后，將管以14000rpm離心5分鐘，將沉淀重懸于400μl水。電泳顯示條帶與1200聚體混合物一致。

將p16-1200聚體超聲處理：(保留20μl用作模板)向380μlp16-1200聚體加入40μl3mnaac，將管以3,30%占空比2x10分鐘超聲處理，并加入1mletoh。將管以15000rpm4℃離心10分鐘，將沉淀在400μl70%etoh中洗滌，干燥，并重懸于100μl水中。將管隨后以15000rpm4℃離心5分鐘以沉淀來(lái)自超聲儀探頭的殘留物。電泳顯示大約50-400bp的大小范圍。

分級(jí)：向10μl超聲處理的1200聚體中加入40μl水和10μl緩沖液，將管混合并吸取至離心柱1，14000rpm離心1分鐘；向流出液加入10μl緩沖液，混合，吸取至離心柱2，14000rpm離心1分鐘；向流出液加入10μl緩沖液中，混合，吸取至離心柱3，14000rpm離心1分鐘。將柱用2x200μl洗滌緩沖液洗滌并用50μl洗脫緩沖液洗脫。電泳顯示大約100-300bp的大小。

使用fastdnaendrepairkit將p16son和p16s2平端化：向于40μl水中的3μl的上述物質(zhì)加入5μl的10x緩沖液2.5μl的酶混合物并將管渦旋并置于20℃水浴持續(xù)20分鐘。根據(jù)說(shuō)明書使用inversepcr純化試劑盒(lifetechnologies)來(lái)分離產(chǎn)物于50μl緩沖液中。

連接銜接子至p16sonb,p16s2b:將1μl各1000μmpadbspd1、cadbspd1、padecor1、cadecor1、5μl10x連接酶緩沖液、5μl50%peg4000、5μl7/28(p16sonb,p16s2b)加入各管中，將管渦旋并加入1μl連接酶。使用inversepcr純化試劑盒來(lái)分離產(chǎn)物。

銜接的p16的pcr：向條的孔中加入(8,8,2,8,2)μl水和(1μl各20μm,2,8μl20umpadbspd1;2,8μl20umpadecor1)。向孔中加入10μl的50μldreamtaqgreen2xpcrmm+2μl的以上探針。熱循環(huán)用程序25x（95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒）進(jìn)行。分析顯示來(lái)自p16sona模板的產(chǎn)物條帶比來(lái)自p16p2a的產(chǎn)物條帶稍微更寬。對(duì)于兩者，2μm的單一引物得到類似于8μm的產(chǎn)量；padbspd1和padecor1引物之間沒(méi)有差別。padecor1產(chǎn)生最佳的總體性能。

用padecor1單一引物5μm的銜接p16的制備(prep)pcr。向條的孔中加入100μl(400μl水+4μl1000μmpadecor1+2μl(p16sona,p16s2a)+200μldreamtaq2xpcrmm)，加蓋，置于熱循環(huán)儀上，程序?yàn)?5x(95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)。隨后，向每孔中加入額外3.0μl(30μl25mmdntp+10μl1mmgcl2+8μl1000μmpadecor1)并用以下程序進(jìn)行熱循環(huán)：10x(94℃30秒，55℃30秒，72℃2分鐘)。將產(chǎn)物沉淀并如上重懸。

將p16制備物胺化：轉(zhuǎn)移50μl以上p16son至管中并用真空離心機(jī)降低體積至20μl。將其和剩余20μl7/29p16sp,p16sp2p置于沸水浴中1分鐘，向各自中加入180μl(500μl水+300μltfa+174μl乙二胺+95mgna2s2o3并置于65℃水浴持續(xù)15分鐘。隨后，將溶液脫鹽入水中并收集450μl的各納滴(nanodrop)。加入tmed/nacl，將管置于65℃浴中5分鐘，加入50μl3mnaac和1ml異丙醇。將所得溶液沉淀并重懸于水中。

用tamra,cr6g標(biāo)記胺化的p16產(chǎn)物：向上述中加入1μl1mnaoh；1分鐘后，加入25μl(75μltmed/nacl+75μldmso)，將管渦旋并加入2μl(100mmtamra,100mmcr6g)。將所得溶液沉淀并重懸于水+15μl20xssc和105μl甲酰胺以得到2xssc中的150μl。所得溶液如上純化。

本申請(qǐng)?zhí)峒昂?或下文列出的所有公開(kāi)和專利均通過(guò)引用并入本文。所述的特征和實(shí)施方案的各種改變、重組和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，且不會(huì)背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已經(jīng)描述了具體的實(shí)施方案，但應(yīng)理解要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度地限于此類具體的實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域中的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所述方式和實(shí)施方案的各種改變均旨在以下權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。