相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年12月5日提交的序列號(hào)為62/088,309的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，在此將其全部?jī)?nèi)容引入本文以供參考，并要求其優(yōu)先權(quán)。

本發(fā)明公開的主題提供用于治療癌癥的方法和組合物。其涉及特異性靶向b-細(xì)胞成熟抗原(bcma)的嵌合抗原受體(car)、包括該car的免疫應(yīng)答細(xì)胞以及使用這些細(xì)胞用于治療癌癥(例如，多發(fā)性骨髓瘤)的方法。

背景技術(shù)：

基于細(xì)胞的免疫療法是對(duì)癌癥治療具有治療潛力的療法。t細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞可以通過引入編碼針對(duì)抗原的人工或合成受體的遺傳物質(zhì)被修飾為靶向腫瘤抗原，所述受體稱為嵌合抗原受體(car)，其對(duì)所選擇的抗原具有特異性。使用car的靶向t細(xì)胞療法已經(jīng)顯示最近在治療惡性血液病中獲得臨床成功。

多發(fā)性骨髓瘤(mm)是第二常見的惡性血液病⁸。大約25％的患者具有高風(fēng)險(xiǎn)細(xì)胞遺傳學(xué)，這預(yù)示著中位生存期小于2年^9,10。盡管最近取得進(jìn)展，且不論細(xì)胞遺傳學(xué)，在同種異體移植的移植物抗骨髓瘤(gvm)效應(yīng)以外，該疾病仍被視為是不能治愈的。但是，同種異體移植受不適格(ineligibility)及移植相關(guān)的高致病率和高死亡率所限¹¹。與gvm效應(yīng)類似，通過自體過繼(adoptive)t細(xì)胞療法，可能治愈的t細(xì)胞效應(yīng)可以通過最小的毒性實(shí)現(xiàn)。

骨髓瘤可以是檢驗(yàn)過繼t細(xì)胞療法的理想病癥。首先，如上文所示，同種異體移植表明即使用最少的或無伴行的化療例如在非清髓性移植或移植后供體淋巴細(xì)胞輸注之后，t細(xì)胞也可以是治愈性治療方式。第二，可能通過消耗調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(tregs)而進(jìn)行的調(diào)節(jié)化療提高了過繼t細(xì)胞療法的效力^4,12，這樣，剛完成自體移植后的期間可以是給予t細(xì)胞的最佳時(shí)間，骨髓瘤是為數(shù)不多的自體干細(xì)胞移植是標(biāo)準(zhǔn)治療的疾病之一。第三，免疫調(diào)節(jié)藥物來那度胺(lenalidomide)可以改善基于car的療法，如已在小鼠中所示¹³，來那度胺常用于治療mm。第四，當(dāng)與實(shí)體瘤或髓外cll相比⁴，過繼t細(xì)胞療法在骨髓為主的疾病例如all中作用最好^6,7，與all類似，骨髓瘤是骨髓的疾病。

盡管有各種原因預(yù)計(jì)過繼t細(xì)胞療法可以在mm中作用良好，但將過繼t細(xì)胞療法擴(kuò)展至骨髓瘤仍面臨獨(dú)特的挑戰(zhàn)。與其他b細(xì)胞惡性腫瘤不類似，僅在2％的骨髓瘤患者中觀察到cd19的表達(dá)¹⁴。而且，與cd19不類似，骨髓瘤中常見的細(xì)胞外免疫表型標(biāo)志物(cd138、cd38和cd56)均在其他的基本的細(xì)胞類型中得以共表達(dá)，我們預(yù)料針對(duì)任何這些靶標(biāo)的car將導(dǎo)致不能接受的“脫腫瘤/在靶(offtumor,ontarget)”毒性⁶，這即使在抗體良好耐受的靶標(biāo)中也是致命的，靶向her2的car既是如此¹⁵。因此，需要有新的治療策略以設(shè)計(jì)針對(duì)在mm細(xì)胞中高度表達(dá)而在正常組織中限制性表達(dá)的抗原的car用于治療多發(fā)性骨髓瘤，該策略能夠以最小的毒性和免疫原性誘導(dǎo)有效的腫瘤根除。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開的主題通常提供與b-細(xì)胞成熟抗原(bcma)特異性結(jié)合的嵌合抗原受體(car)、包括該car的免疫應(yīng)答細(xì)胞以及這些car和免疫應(yīng)答細(xì)胞用于治療多發(fā)性骨髓瘤的用途。

本發(fā)明公開的主題提供car。在一非限定性實(shí)施例中，car包括細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是與b細(xì)胞成熟抗原(bmca)特異性結(jié)合的人單鏈可變片段(scfv)。在某些實(shí)施方式中，人scfv以大約1x10^-9m至大約3x10^-6m的結(jié)合親和力(kd)與bmca特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，人scfv以大約1x10^-9m至大約1x10^-8m的結(jié)合親和力(kd)與bcma特異性結(jié)合。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括與選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性為至少大約80％、大約81％、大約82％、大約83％、大約84％、大約85％、大約86％、大約87％、大約88％、大約89％、大約90％、大約91％、大約92％、大約93％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％或大約99％的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括與選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性為至少大約80％、大約81％、大約82％、大約83％、大約84％、大約85％、大約86％、大約87％、大約88％、大約89％、大約90％、大約91％、大約92％、大約93％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％或大約99％的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括與選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性為至少大約80％、大約81％、大約82％、大約83％、大約84％、大約85％、大約86％、大約87％、大約88％、大約89％、大約90％、大約91％、大約92％、大約93％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％或大約99％的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包括與選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性為至少大約80％、大約81％、大約82％、大約83％、大約84％、大約85％、大約86％、大約87％、大約88％、大約89％、大約90％、大約91％、大約92％、大約93％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％或大約99％的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列及其保守修飾的重鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列及其保守修飾的輕鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列及其保守修飾的重鏈可變區(qū)；和(b)包括選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列及其保守修飾的輕鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：(a)包括具有seqidno:1所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(b)包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(c)包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(d)包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(e)包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(f)包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(g)包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(h)包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(i)包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(j)包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(k)包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(l)包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(m)包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(n)包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(o)包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；(p)包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)；或(q)包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)，和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)；和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。

在某些非限定性實(shí)施方式中，人scfv包括所述重鏈和輕鏈二者，任選地具有接頭(linker)序列，例如，在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有接頭肽。例如，在某些非限定性實(shí)施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和(ii)包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭肽。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和(ii)包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭肽。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和(ii)包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭肽。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和(ii)包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭肽。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和(ii)包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭肽。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括選自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)cdr3；和(b)包括選自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括選自seqidno:90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180和186的氨基酸序列及其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和(b)包括選自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列及其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括選自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列及其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；和(b)包括選自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列及其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括選自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)cdr1；(b)包括選自seqidno:90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180和186的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)cdr2；(c)包括選自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)cdr3；(d)包括選自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)cdr1；(e)包括選自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)cdr2；和(f)包括選自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(b)包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(c)包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(d)包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(e)包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(f)包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(g)包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(h)包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(i)包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(j)包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(k)包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(l)包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(m)包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(n)包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(o)包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；(p)包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3；或(q)包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸或其保守修飾的重鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(b)包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(c)包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(d)包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(e)包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(f)包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(g)包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(h)包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(i)包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(j)包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(k)包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(l)包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(m)包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(n)包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(o)包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；(p)包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3；或(q)包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸或其保守修飾的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：(a)包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(b)包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(c)包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(d)包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(e)包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(f)包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(g)包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(h)包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(i)包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(j)包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(k)包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(l)包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(m)包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(n)包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(o)包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；(p)包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3；或(q)包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。在某些實(shí)施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr2；包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)cdr3；包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在某些實(shí)施方式中，bcma包括seqidno:71所示的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，人scfv與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的人scfv包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的vlcdr3。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接。細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括與細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的5’端共價(jià)連接的信號(hào)肽。在某些實(shí)施方式中，car的跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd8多肽、cd28多肽、cd3ζ多肽、cd4多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、ctla-4多肽、pd-1多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于與免疫應(yīng)答有關(guān)的蛋白質(zhì))或其組合。在某些實(shí)施方式中，跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd8多肽。在某些實(shí)施方式中，跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd28多肽。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括cd3ζ多肽。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域還包括至少一個(gè)信號(hào)區(qū)。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)信號(hào)區(qū)包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、pd-1多肽、ctla-4多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于與免疫應(yīng)答有關(guān)的蛋白質(zhì))或其組合。在某些實(shí)施方式中，信號(hào)區(qū)是共刺激信號(hào)區(qū)。在某些實(shí)施方式中，共刺激信號(hào)區(qū)包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽或其組合。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)共刺激信號(hào)區(qū)包括cd28多肽。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)共刺激信號(hào)區(qū)包括4-1bb多肽。在一具體的非限定性實(shí)施方式中，跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd28多肽，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括cd3ζ多肽，至少一個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域包括cd28多肽。

在某些實(shí)施方式中，car被重組表達(dá)。car可以由載體表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，載體是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

本發(fā)明公開的主題還提供分離的包括上述的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，分離的免疫應(yīng)答細(xì)胞用car轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，car在免疫應(yīng)答細(xì)胞的表面上被組成性地表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，分離的免疫應(yīng)答細(xì)胞進(jìn)一步用至少一種共刺激配體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得免疫應(yīng)答細(xì)胞表達(dá)至少一種共刺激配體。在某些實(shí)施方式中，至少一種共刺激配體選自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14及其組合。在某些實(shí)施方式中，分離的免疫應(yīng)答細(xì)胞進(jìn)一步用至少一種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得免疫應(yīng)答細(xì)胞分泌至少一種細(xì)胞因子。在某些實(shí)施方式中，至少一種細(xì)胞因子選自il-2、il-3、il-6、il-7、il-11、il-12、il-15、il-17、il-21及其組合。在某些實(shí)施方式中，分離的免疫應(yīng)答細(xì)胞選自t細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞、淋巴祖細(xì)胞、t細(xì)胞-前體細(xì)胞和可以由其分化出淋巴細(xì)胞的多能干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答細(xì)胞是t細(xì)胞。

本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明公開的car的核酸分子、包括該核酸分子的載體以及表達(dá)該核酸分子的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:207所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:208所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:209所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:229所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:230所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:231所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:232所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:233所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:234所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，核酸分子包括具有seqidno:235所示序列的核酸。在某些實(shí)施方式中，載體是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是t細(xì)胞。

而且，本發(fā)明公開的主題提供使用上述免疫應(yīng)答細(xì)胞降低受試者的腫瘤負(fù)荷的方法。例如，本發(fā)明公開的主題提供降低受試者的腫瘤負(fù)荷的方法，其中該方法包括將有效量的本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞給予受試者，從而誘導(dǎo)受試者的腫瘤細(xì)胞死亡。在某些實(shí)施方式中，該方法降低腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。在另一實(shí)施方式中，該方法減小腫瘤的尺寸。在再另一實(shí)施方式中，該方法根除受試者的腫瘤。在某些實(shí)施方式中，腫瘤選自多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血癥。在某些實(shí)施方式中，腫瘤是多發(fā)性骨髓瘤。在某些實(shí)施方式中，受試者是人。在某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答細(xì)胞是t細(xì)胞。

而且，本發(fā)明公開的主題提供使用上述免疫應(yīng)答細(xì)胞增加或延長(zhǎng)具有瘤形成的受試者的生存期的方法。例如，本發(fā)明公開的主題提供增加或延長(zhǎng)具有瘤形成的受試者的生存期的方法，其中該方法包括將有效量的本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞給予受試者，從而增加或延長(zhǎng)受試者的生存期。在某些實(shí)施方式中，瘤形成選自多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血癥。在某些實(shí)施方式中，瘤形成是多發(fā)性骨髓瘤。在某些實(shí)施方式中，該方法降低或根除受試者的腫瘤負(fù)荷。

本發(fā)明公開的主題還提供產(chǎn)生與bcma結(jié)合的免疫應(yīng)答細(xì)胞的方法。在一非限定性實(shí)施例中，該方法包括向免疫應(yīng)答細(xì)胞中導(dǎo)入編碼包括細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)的核酸序列，其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括與bcma特異性結(jié)合的人scfv。

本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步提供藥物組合物，其包括有效量的本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞和藥學(xué)可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方式中，藥物組合物用于治療瘤形成。在某些實(shí)施方式中，瘤形成選自多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血癥。在某些實(shí)施方式中，瘤形成是多發(fā)性骨髓瘤。

本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步提供用于治療瘤形成的藥盒，其包括本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，藥盒還包括用于使用免疫應(yīng)答細(xì)胞治療瘤形成的書面說明書。在某些實(shí)施方式中，瘤形成選自多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血癥。在某些實(shí)施方式中，瘤形成是多發(fā)性骨髓瘤。

附圖說明

以下可以結(jié)合附圖理解以舉例方式給出的具體實(shí)施方式，但無意于將本發(fā)明限定為所描述的具體的實(shí)施方式。

圖1表示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的靶向bcma的嵌合抗原受體。

圖2顯示正常組織和人癌細(xì)胞系中的人bcma表達(dá)。

圖3顯示本發(fā)明公開的bcmacar在人t細(xì)胞上的表達(dá)。

圖4顯示靶向人bcma的人scfv與小鼠bcma的交叉反應(yīng)活性。

圖5顯示本發(fā)明公開的bcma對(duì)于過量表達(dá)bcma的3t3細(xì)胞的殺傷活性。

圖6顯示本發(fā)明公開的bcma對(duì)于人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的殺傷活性。

圖7表示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的靶向bcma的嵌合抗原受體。

圖8顯示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的編碼靶向bcma的car的核酸分子。

圖9顯示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的編碼靶向bcma的car的核酸分子。

圖10顯示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的編碼靶向bcma的car的核酸分子。

圖11顯示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的編碼靶向bcma的car的核酸分子。

圖12顯示根據(jù)本發(fā)明公開主題的一個(gè)非限定性實(shí)施方式的編碼靶向bcma的car的核酸分子。

圖13顯示靶向bcma的cart細(xì)胞對(duì)于人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。

圖14顯示靶向bcma的cart細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)。

圖15顯示靶向bcma的cart細(xì)胞的抗腫瘤活性。

圖16a和16b顯示靶向bcma的cart細(xì)胞的殺傷活性。(a)表示時(shí)間0時(shí)gfp⁺腫瘤系的百分比。(b)表示時(shí)間36小時(shí)時(shí)殺傷gfp⁺腫瘤系的百分比。

圖17描述et140-3的表位定位。

圖18描述et140-24的表位定位。

圖19描述et140-54的表位定位。

圖20描述et140-3、et140-24和et140-54的表位定位。

圖21描述et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54的elisa篩選數(shù)據(jù)。

圖22描述et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54的fcas篩選數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開的主題通常提供靶向bcma的嵌合抗原受體(car)。在一非限定性實(shí)例中，car包括細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與bcma特異性結(jié)合。本發(fā)明公開的主題還提供表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如，t細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞和可由其分化出淋巴樣細(xì)胞的多能干細(xì)胞)，以及使用這些免疫應(yīng)答細(xì)胞治療腫瘤例如多發(fā)性骨髓瘤的方法。

i.定義

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。以下參考文獻(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義：singleton等，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(第二版，1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walker編，1988)；theglossaryofgenetics，第五版，r.rieger等(編)，springerverlag(1991)；和hale&marham，theharpercollinsdictionaryofbiology(1991)。除非另有說明，本文使用的以下術(shù)語(yǔ)具有下文給出的含義。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”是指在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的特定值的可接受誤差范圍內(nèi)，這將部分地取決于如何測(cè)量或確定該值，即測(cè)量系統(tǒng)的局限性。例如，根據(jù)本領(lǐng)域的慣例，“約”可以指在3個(gè)或多于3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍內(nèi)?；蛘撸凹s”可以表示給定值的高達(dá)20％、優(yōu)選高達(dá)10％、更優(yōu)選高達(dá)5％、再更優(yōu)選高達(dá)1％的范圍?；蛘?，特別是關(guān)于生物系統(tǒng)或過程，該術(shù)語(yǔ)可以表示在數(shù)值的一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)、優(yōu)選在5倍以內(nèi)、更優(yōu)選在2倍以內(nèi)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞群體”是指表達(dá)相似或不同表型的至少兩種細(xì)胞的組。在非限定性實(shí)例中，細(xì)胞群體可以包括至少約10個(gè)、至少約100個(gè)、至少約200個(gè)、至少約300個(gè)、至少約400個(gè)、至少約500個(gè)、至少約600個(gè)、至少約700個(gè)、至少約800個(gè)、至少約900個(gè)、至少約1000個(gè)表達(dá)相似或不同表型的細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”不僅指完整的抗體分子，而且指保留免疫原結(jié)合能力的抗體分子片段。此類片段在本領(lǐng)域中也是眾所周知的，并且在體外和體內(nèi)常規(guī)使用。因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”不僅指完整的免疫球蛋白分子，而且指眾所周知的活性片段f(ab')2和fab。缺少完整抗體的fc片段的f(ab')2和fab片段，更快地從循環(huán)中清除，并且可能具有更少的完整抗體的非特異性組織結(jié)合(wahl等，j.nucl.med.24：316～325(1983))。本發(fā)明的抗體包括完整天然抗體、雙特異性抗體；嵌合抗體；fab、fab’、單鏈v區(qū)片段(scfv)、融合多肽和非常規(guī)抗體。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“單鏈可變片段”或“scfv”是免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重鏈(vh)和輕鏈(vl)的可變區(qū)的融合蛋白，其共價(jià)連接形成vh::vl異源二聚體。重鏈(vh)和輕鏈(vl)直接連接或通過肽編碼接頭(例如，10、15、20、25個(gè)氨基酸)連接，該肽編碼接頭將vh的n-端與vl的c-端連接，或者將vh的c-端與vl的n-端連接。接頭通常富含用于柔性的甘氨酸，以及用于溶解性的絲氨酸或蘇氨酸。接頭可以連接細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。接頭的非限定性的例子公開于以下文獻(xiàn)中：shen等,anal.chem.80(6):1910-1917(2008)和wo2014/087010，在此將其內(nèi)容全文并入作為參考。在某些實(shí)施方式中，接頭是g4s接頭。

在某些非限制性實(shí)例中，接頭包括具有如下文所提供的seqidno:210所示序列的氨基酸：

ggggsggggsggggs[seqidno:210]。

在某些實(shí)施方式中，編碼氨基酸序列seqidno:210的核酸序列在下面提供的seqidno:211中給出：

ggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatct[seqidno:211]。

在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有如下提供的seqidno:69中所示序列的氨基酸。

srggggsggggsggggslema[seqidno:69]。

在某些實(shí)施方式中，編碼氨基酸序列seqidno:69的核酸序列在下面提供的seqidno:70中給出：

tctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcc[seqidno:70]。

盡管去除了恒定區(qū)并引入了接頭，scfv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特異性。單鏈fv多肽抗體可以由包括vh-和vl-編碼序列的核酸表達(dá)，如huston等人所述(proc.nat.acad.sci.usa，85：5879～5883，1988)。還可參見美國(guó)專利第5,091,513、5,132,405和4,956,778號(hào)；以及美國(guó)專利公開第20050196754和20050196754號(hào)。具有抑制活性的拮抗性scfv已有描述(參見例如，zhao等，hyrbidoma(larchmt)200827(6)：455～51；peter等，jcachexiasarcopeniamuscle2012年8月12日；shieh等，jimunol2009183(4)：2277～85；giomarelli等，thrombhaemost200797(6)：955～63；fife等，jclininvst2006116(8)：2252～61；brocks等，immunotechnology19973(3)：173～84；moosmayer等，therimmunol19952(10：31～40)。具有刺激活性的激動(dòng)性scfv已有描述(參見，例如，peter等，jbioichern200325278(38)：36740～7；xie等，natbiotech199715(8)：768～71；ledbetter等，critrevimmunol199717(5-6)：427～55；ho等，biochimbiophysacta20031638(3)：257～66)。

本文使用的“f(ab)”是指結(jié)合抗原、但是是單價(jià)的并且不具有fc部分的抗體結(jié)構(gòu)的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗體產(chǎn)生兩個(gè)f(ab)片段和一個(gè)fc片段(例如，重(h)鏈恒定區(qū)；不結(jié)合抗原的fc區(qū))。

本文使用的“f(ab')2”是指由胃蛋白酶消化完整igg抗體產(chǎn)生的抗體片段，其中該片段具有兩個(gè)抗原結(jié)合(ab')(二價(jià))區(qū)，其中每個(gè)(ab')區(qū)包括兩條分開的氨基酸鏈，h鏈的一部分通過s-s鍵與輕(l)鏈連接用于結(jié)合抗原，其中h鏈的剩余部分連接在一起?！癴(ab')2”片段可以分裂成兩個(gè)單獨(dú)的fab'片段。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指任何遺傳元件，例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒顆粒等，其當(dāng)關(guān)聯(lián)有適當(dāng)?shù)目刂圃r(shí)能夠復(fù)制，并且其可以將基因序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)載體，以及病毒載體和質(zhì)粒載體。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指一種重組核酸序列，即重組dna分子，其含有所需的編碼序列和在特定宿主生物體中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所必需的適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄?。用于在原核生物中表達(dá)所必需的核酸序列通常包括啟動(dòng)子、操縱子(可選的)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，通常伴有其它序列。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子及聚腺苷酸化信號(hào)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“cdr”定義為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，其為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高變區(qū)。參見例如，kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,4thu.s.departmentofhealthandhumanservices,nationalinstitutesofhealth(1987)。通常，抗體在可變區(qū)中包括三個(gè)重鏈和三個(gè)輕鏈cdr或cdr區(qū)。cdr提供了大多數(shù)使抗體與抗原或表位結(jié)合的接觸殘基。在某些實(shí)施方式中，cdr區(qū)利用kabat系統(tǒng)加以界定(kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“親和力”(affinity)是指結(jié)合強(qiáng)度的量度。不受理論的束縛，親和力取決于抗體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇之間的立體化學(xué)匹配的緊密程度、它們之間接觸區(qū)域的大小以及帶電和疏水基團(tuán)的分布。親和力還包括術(shù)語(yǔ)“親合力”(avidity)，其是指形成可逆復(fù)合物后抗原-抗體鍵的強(qiáng)度。用于計(jì)算抗體對(duì)抗原的親和力的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括使用結(jié)合實(shí)驗(yàn)來計(jì)算親和力。功能試驗(yàn)(例如，流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn))中的抗體活性也反映抗體親和力。可以使用功能試驗(yàn)(例如，流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn))對(duì)抗體和親和力進(jìn)行表型鑒定和比較。

可用于本發(fā)明方法的核酸分子包括任何編碼本發(fā)明多肽或其片段的核酸分子。此類核酸分子不需要與內(nèi)源核酸序列100％相同，但通常表現(xiàn)出基本同一性。與內(nèi)源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能夠與雙鏈核酸分子的至少一條鏈雜交?！半s交”是指在各種嚴(yán)格條件下，在互補(bǔ)多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其部分之間配對(duì)形成雙鏈分子。(參見，例如，wahl，g.m.和s.l.berger(1987)methodsenzymol，152：399；kimmel，a.r.(1987)methodsenzymol，152：507)。

例如，嚴(yán)格的鹽濃度通常小于約750mmnacl和75mm檸檬酸三鈉，優(yōu)選小于約500mmnacl和50mm檸檬酸三鈉，更優(yōu)選小于約250mmnacl和25mm檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格雜交可以在不存在有機(jī)溶劑例如甲酰胺的情況下獲得，而高嚴(yán)格雜交可以在至少約35％甲酰胺、更優(yōu)選至少約50％甲酰胺的存在下獲得。嚴(yán)格溫度條件通常包括至少約30℃、更優(yōu)選至少約37℃、最優(yōu)選至少約42℃的溫度。改變其它參數(shù)，例如雜交時(shí)間、洗滌劑例如十二烷基硫酸鈉(sds)的濃度、以及載體dna的包含或排除，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。通過根據(jù)需要組合這些不同條件來實(shí)現(xiàn)各種嚴(yán)格的水平。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交將在30℃在750mmnacl、75mm檸檬酸三鈉和1％sds中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交將在37℃在500mmnacl、50mm檸檬酸三鈉、1％sds、35％甲酰胺和100μg/ml變性鮭魚精子dna(ssdna)中發(fā)生。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜交將在42℃在250mmnacl、25mm檸檬酸三鈉、1％sds、50％甲酰胺和200μg/mlssdna中發(fā)生。這些條件的有用改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。

對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，雜交后的洗滌步驟也將在嚴(yán)格性上變化。洗滌嚴(yán)格性條件可以通過鹽濃度和溫度來定義。如上文，可以通過降低鹽濃度或通過升高溫度來提高洗滌嚴(yán)格性。例如，洗滌步驟的嚴(yán)格的鹽濃度優(yōu)選小于約30mmnacl和3mm檸檬酸三鈉，最優(yōu)選小于約15mmnacl和1.5mm檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴(yán)格溫度條件通常包括至少約25℃、更優(yōu)選至少約42℃、甚至更優(yōu)選至少約68℃的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，洗滌步驟將在25℃在30mmnacl、3mm檸檬酸三鈉和0.1％sds中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，洗滌步驟將在42℃在15mmnacl、1.5mm檸檬酸三鈉和0.1％sds中發(fā)生。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，洗滌步驟將在68℃在15mmnacl、1.5mm檸檬酸三鈉和0.1％sds中發(fā)生。這些條件的其他變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且描述于例如benton和davis(science196：180，1977)；grunstein和rogness(proc.natl.acad.sci.，usa72：3961，1975)；ausubel等(currentprotocolsinmolecularbiology，wileyinterscience，newyork，2001)；berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques，1987，academicpress，newyork)；和sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，newyork。

“基本同一性”是指與參照氨基酸序列(例如，本文所述的任何一種氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一種核酸序列)表現(xiàn)出至少50％同一性的多肽或核酸分子。優(yōu)選地，此類序列在氨基酸水平或核酸水平上與用于比較的序列的同一性為至少60％，更優(yōu)選80％或85％，更優(yōu)選90％、95％或甚至99％相同。

序列同一性通常使用序列分析軟件(例如，sequenceanalysissoftwarepackageofthegeneticscomputergroup，universityofwisconsinbiotechnologycenter，1710universityavenue，madison，wis.53705、blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)測(cè)量。此類軟件通過對(duì)各種取代、缺失和/或其它修飾指定同源性程度來匹配相同或相似的序列。在確定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，e-3和e-100之間的概率得分表示密切相關(guān)的序列。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“類似物”是指結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽或核酸分子，其具有參照多肽或核酸分子的功能。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“配體”是指結(jié)合受體的分子。具體地，配體結(jié)合另一個(gè)細(xì)胞上的受體，使細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別和/或相互作用。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“疾病”是指破壞或干擾細(xì)胞、組織或器官的正常功能的任何病癥或障礙。疾病的實(shí)例包括瘤形成或細(xì)胞的病原體感染。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以具有治療效果的量。在某些實(shí)施方式中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制瘤形成的持續(xù)增殖、生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移(例如，侵襲或遷移)的量。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源性核酸分子或多肽”是指在正常情況下不存在于細(xì)胞或獲自細(xì)胞的樣品中的核酸分子(例如cdna、dna或rna分子)或多肽。該核酸可以來自另一有機(jī)體，或者其可以是，例如，在細(xì)胞或樣品中通常不表達(dá)的mrna分子。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答細(xì)胞”是指在免疫應(yīng)答中發(fā)揮功能的細(xì)胞或其祖細(xì)胞或子代。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指正向或負(fù)向地改變。示例性調(diào)節(jié)包括約1％、約2％、約5％、約10％、約25％、約50％、約75％或約100％的變化。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“增加”是指正向地改變至少約5％，包括但不限于正向地改變約5％、約10％、約25％、約30％、約50％、約75％、或約100％。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“減少”是指負(fù)向地改變至少約5％，包括但不限于負(fù)向地改變約5％、約10％、約25％、約30％、約50％、約75％或約100％。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的細(xì)胞”是指與天然地伴隨細(xì)胞的分子和/或細(xì)胞組分分離的細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”、“純化的”或“生物純的”是指材料不同程度地不含在其天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的通常伴隨其的組分?！胺蛛x”表示與原始來源或環(huán)境的分開程度?！凹兓北硎颈确蛛x更高的分開程度?！凹兓摹被颉吧锛兊摹钡鞍踪|(zhì)充分地不含其它物質(zhì)，使得沒有任何雜質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的生物特性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響或引起其他不利后果。也就是說，如果本發(fā)明的核酸或肽在通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基，或化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，則其是純化的。純度和均一性通常使用分析化學(xué)技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“純化的”可以表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一條帶。對(duì)于可以進(jìn)行修飾例如磷酸化或糖基化的蛋白質(zhì)，不同的修飾可以產(chǎn)生不同的分離蛋白，其可以分別純化。

如本文所用，“分泌的”是指多肽通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體經(jīng)由分泌通路從細(xì)胞中釋放，以及作為暫時(shí)融合在細(xì)胞質(zhì)膜處并將蛋白質(zhì)釋放到細(xì)胞外部的囊泡而釋放。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性與…結(jié)合”或“特異性靶向”是指多肽或其片段識(shí)別并結(jié)合所關(guān)注的生物分子(例如多肽)，但基本上不識(shí)別并結(jié)合樣品中的其他分子，例如天然地包括本發(fā)明多肽的生物樣品中的其他分子。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療(treating、treatment)”是指試圖改變所治療的個(gè)體或細(xì)胞的疾病進(jìn)程的臨床干預(yù)，并且可以用于預(yù)防，或在臨床病理過程期間進(jìn)行。治療的治療效果包括，但不限于，預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、防止轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展的速度、改善或減輕疾病狀態(tài)、以及緩解或改善預(yù)后。通過預(yù)防疾病或病癥的進(jìn)展，治療可以防止受影響或經(jīng)診斷的受試者或疑似患有該病癥的受試者中的病癥引起的惡化，而且治療還可以防止具有該病癥風(fēng)險(xiǎn)或疑似患有該病癥的受試者中病癥的發(fā)作或病癥癥狀。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)，其包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等(例如，其將是特定治療的接受者、或從其中收獲細(xì)胞)。

ii.b細(xì)胞成熟抗原(bcma)

bcma是過繼t細(xì)胞療法(例如car療法)的理想靶標(biāo)，因?yàn)閎cma參與b細(xì)胞分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且已知在非惡性分化的b細(xì)胞和漿細(xì)胞上表達(dá)。盡管誘導(dǎo)b細(xì)胞發(fā)育不全可能有風(fēng)險(xiǎn)，cd19car誘導(dǎo)的b細(xì)胞發(fā)育不全已經(jīng)顯著地耐受良好。一些研究小組已經(jīng)確認(rèn)了bcma的多發(fā)性骨髓瘤(mm)表面表達(dá)，一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)它是作為來自新鮮或冷凍的患者骨髓樣品中的惡性漿細(xì)胞的facs標(biāo)志物的cd138的替代物，平均相對(duì)平均熒光強(qiáng)度(mfi)為9-16(n＝35)^1,2。

在某些非限定性實(shí)施方式中，bcma是具有seqidno:71所示氨基酸序列的人bcma或其片段。

seqidno:71提供如下：

mlqmagqcsqneyfdsllhacipcqlrcssntppltcqrycnasvtnsvkgtnailwtclglsliislavfvlmfllrkinseplkdefkntgsgllgmanidleksrtgdeiilprgleytveectcedcikskpkvdsdhcfplpameegatilvttktndyckslpaalsateieksisar[seqidno:71]。

iii.嵌合抗原受體(car)

嵌合抗原受體(car)是工程化的受體，其將感興趣的特異性移植或賦予到免疫效應(yīng)細(xì)胞。car可以用于通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體促進(jìn)其編碼序列的轉(zhuǎn)移將單克隆抗體的特異性移植到t細(xì)胞上。

具有三代car。“第一代”car通常由細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如單鏈可變片段(scfv))與跨膜結(jié)構(gòu)域融合、再與t細(xì)胞受體鏈的胞質(zhì)/細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合而構(gòu)成。“第一代”car通常具有來自cd3ζ鏈的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其是來自內(nèi)源性tcr的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要傳遞者?！暗谝淮眂ar可以提供從頭(denovo)的抗原識(shí)別，并通過其在單個(gè)融合分子中的cd3ζ鏈信號(hào)結(jié)構(gòu)域?qū)е耤d4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的激活，而不依賴于hla介導(dǎo)的抗原遞呈?！暗诙眂ar將來自各種共刺激分子(例如cd28、4-1bb、icos、ox40)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域添加到car的胞質(zhì)尾區(qū)，以向t細(xì)胞提供額外的信號(hào)。“第二代”car包括既提供共刺激(例如cd28或4-1bb)又提供激活(cd3ζ)的那些car。臨床前研究表明，“第二代”car可以提高t細(xì)胞的抗腫瘤活性。例如，在慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)和急性淋巴細(xì)胞白血病(all)患者中，靶向cd19分子的臨床試驗(yàn)證實(shí)了“第二代”car修飾的t細(xì)胞的強(qiáng)烈功效?！暗谌眂ar包括提供多種共刺激(例如cd28和4-1bb)和激活(cd3ζ)的那些car。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，car包括細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與bcma結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是scfv。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是任選地交聯(lián)的fab。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域是f(ab)2。在某些實(shí)施方式中，任何前述分子均可以包括在具有異源序列的融合蛋白中以形成細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一具體的非限定性實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括與人bcma特異性結(jié)合的人scfv。

在某些非限定性實(shí)施方式中，car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)cma具有高結(jié)合特異性以及高結(jié)合親和力。例如，在這些實(shí)施方式中，car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如以人scfv或其類似物實(shí)施者)以約3x10^-6m或更低的解離常數(shù)(kd)與bcma結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，kd為約1x10^-6m或更低、約1x10^-7m或更低、約1x10^-8m或更低、約1x10^-9m或更低、約1x10^-10m或更低、或者約1x10^-11m或更低。在某些實(shí)施方式中，kd為約1x10^-8m或更低。在某些實(shí)施方式中，kd為約1x10^-11m至約3x10^-6m，例如約1x10^-11m至約1x10^-10m、約1x10^-10m至約1x10^-9m、約1x10^-9m至約1x10^-8m、約1x10^-8m至約1x10^-7m、或者約1x10^-7m至約1x10^-6m、或者約1x10^-6m至約3x10^-6m。在某些實(shí)施方式中，kd為約1x10^-9m至約1x10^-8m。在某些實(shí)施方式中，kd為約1x10^-9m至約1.5x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約1.2x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約4x10^-9m至約5x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約5x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約4.8x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約8x10^-9m至約9x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約8x10^-9m。在某些實(shí)施方式中，kd為約8.1x10^-9m。

本發(fā)明公開的car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如以人scfv或其類似物的實(shí)施方式)與bcma的結(jié)合可以通過例如酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、放射免疫法(ria)、facs分析、生物檢測(cè)法(例如，生長(zhǎng)抑制)或westernblot檢測(cè)來確認(rèn)。這些檢測(cè)中的每一種通常通過使用對(duì)目的復(fù)合物具有特異性的標(biāo)記試劑(例如，抗體或scfv)來檢測(cè)特定目的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，scfv可以被施加放射性標(biāo)記，并用于放射免疫法(ria)(見例如weintraub，b.，principlesofradioimmunoassays，seventhtrainingcourseonradioligandassaytechniques，theendocrinesociety，march，1986，其引入本文以供參考)。放射性同位素可以通過例如使用γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或者通過放射自顯影術(shù)的方法檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，用熒光標(biāo)志物標(biāo)記bcma靶向的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。熒光標(biāo)志物的非限定性實(shí)例包括綠色熒光蛋白(gfp)、藍(lán)色熒光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalama1)、青色熒光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)和黃色熒光蛋白(例如yfp、citrine、venus和ypet)。在某些實(shí)施方式中，用gfp標(biāo)記靶向bcma的人scfv。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括單鏈可變片段(scfv)。在一具體的非限定性實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括與人bcma特異性結(jié)合的人scfv。在某些實(shí)施方式中，通過用bcma-fc融合蛋白篩選scfv噬菌體文庫(kù)來鑒定scfv。

car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)。編碼氨基酸序列seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的核酸序列分別為seqidno:3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63和67。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)。編碼氨基酸序列seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的核酸序列分別為seqidno:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64和68。序列seqidno:1-68示于下表1-17中。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括：包括與本文所述并如表1-17所公開的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。例如，不加以任何限定，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括：包括與選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括：包括與選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括：(a)包括與選自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包括與選自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步提供包括如本文表1-17所公開的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)cdr例如cdr1、cdr2和cdr3的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)。cdr結(jié)構(gòu)域使用kabat系統(tǒng)加以界定(kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)。本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步提供包括本文公開的抗體序列的保守修飾的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)。例如，不加以任何限定，本發(fā)明公開主題的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括：包括cdr1、cdr2和cdr3序列的重鏈可變區(qū)和包括cdr1、cdr2和cdr3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些cdr序列中的一個(gè)或多個(gè)包括本文公開的特定氨基酸序列或其保守修飾，其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域保留所需的功能特性。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的主題提供一種包括重鏈可變區(qū)的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)，其中重鏈可變區(qū)包括：(a)包括選自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列及其保守修飾的cdr1；(b)包括選自seqidno:90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180和186的氨基酸序列及其保守修飾的cdr2；和(c)包括選自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列及其保守修飾的cdr3。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括輕鏈可變區(qū)，其中輕鏈結(jié)構(gòu)區(qū)包括：(a)包括選自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列及其保守修飾的cdr1；(b)包括選自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列及其保守修飾的cdr2；和(c)包括選自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列及其保守修飾的cdr3。

本發(fā)明公開的主題提供一種細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)，其包括：包括cdr1、cdr2和cdr3序列的重鏈可變區(qū)和包括cdr1、cdr2和cdr3序列的輕鏈可變區(qū)，其中：(a)重鏈可變區(qū)cdr3包括選自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列及其保守修飾；且(b)輕鏈可變區(qū)cdr3包括選自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列及其保守修飾；其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與bcma多肽(例如人bcma多肽)特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，重鏈可變區(qū)cdr2包括選自seqidno:125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221、227、233、239、245、251、257、263、305、317、329、341、353、365、377和389的氨基酸序列及其保守修飾；且(b)輕鏈可變區(qū)cdr2包括選自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列及其保守修飾；其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與bcma多肽(例如人bcma多肽)特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中。重鏈可變區(qū)cdr1包括選自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列及其保守修飾；且(b)輕鏈可變區(qū)cdr1包括選自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列及其保守修飾；其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與bcma多肽(例如人bcma多肽)特異性結(jié)合。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:72，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-192scfv(也稱作“et140-42scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:1所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表1的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:1所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：具有seqidno:1所示序列的氨基酸的vh，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:2所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的vl，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:1所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的vl，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表1所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表1

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:73，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-197scfv(也稱作“et140-47scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表2的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:5所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的vh，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:6所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的vl，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的vl，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表2所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表2

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:74，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-180scfv(也稱作“et140-30scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表3的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:9所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的vh，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:10所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的vl，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的vl，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表3所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表3

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:75，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-172scfv(也稱作“et140-22scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表4的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:13所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的vh，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:14所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的vl，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的vl，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表4所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表4

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:76，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-157scfv(也稱作“et140-7scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表5的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:17所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的vh，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:18所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的vl，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的vl，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表5所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表5

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:77，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-153scfv(也稱作“et140-3scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表6的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:21所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:22所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表6所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表6

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:78，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-201scfv(也稱作“et140-51scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表7的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:25所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的vh，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:26所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的vl，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的vl，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表7所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表7

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:79，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-167scfv(也稱作“et140-17scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表8的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:29所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的vh，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:30所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的vl，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的vl，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表8所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表8

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:80，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-163scfv(也稱作“et140-13scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表9的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:33所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的vh，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:34所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的vl，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的vl，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表9所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表9

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:81，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-127scfv(也稱作“et140-57scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表10的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:37所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的vh，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:38所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的vl，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的vl，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表10所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表10

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:82，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-165scfv(也稱作“et140-15scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表11的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:41所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的vh，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:42所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的vl，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的vl，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表11所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表11

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:83，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-188scfv(也稱作“et140-38scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表12的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:45所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的vh，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:46所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的vl，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的vl，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表12所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表12

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:84，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-196scfv(也稱作“et140-46scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表13的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:49所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的vh，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:50所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的vl，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的vl，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表13所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表13

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:85，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-204scfv(也稱作“et140-54scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表14的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:53所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的vh，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:54所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的vl，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的vl，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表14所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表14

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:86，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-190scfv(也稱作“et140-40scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表15的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:57所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的vh，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:58所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的vl，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的vl，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表15所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表15

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:87，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-187scfv(也稱作“et140-37scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表16的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:61所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的vh，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:62所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的vl，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的vl，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表16所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表16

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:88，并與bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特異性結(jié)合，其命名為et140-174scfv(也稱作“et140-24scfv”)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表17的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:65所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的vh，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括與seqidno:66所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的vl，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的vl，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:187所示序列或的氨基酸其保守修飾的vhcdr3，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3，如表17所示。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表17

包括與上述序列的vh和vl區(qū)具有高度(即80％或更高)同源性的vh和/或vl區(qū)的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv)可以通過突變(例如，定點(diǎn)突變或pcr介導(dǎo)的突變)獲得，然后使用本文所述的結(jié)合試驗(yàn)測(cè)試所編碼的改變的scfv保留的功能(即結(jié)合親和力)。在某些實(shí)施方式中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相對(duì)于參照序列含有取代(例如，產(chǎn)生序列保守修飾的保守取代)、插入或缺失，但是細(xì)胞外抗原結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括保持與bcma多肽結(jié)合的能力的序列。在某些實(shí)施方式中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列相對(duì)于參照序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是細(xì)胞外抗原結(jié)構(gòu)域(例如scfv)包括保持與bcma多肽結(jié)合的能力的序列。在某些實(shí)施方式中，在公開的序列中共計(jì)大約1至大約10個(gè)氨基酸已被取代、插入和/或缺失。例如，不加以任何限定，vh序列或vl序列可以具有至多大約1個(gè)、至多大約2個(gè)、至多大約3個(gè)、至多大約4個(gè)、至多大約5個(gè)、至多大約6個(gè)、至多大約7個(gè)、至多大約8個(gè)、至多大約9個(gè)或至多大約10個(gè)修飾和/或取代的氨基酸殘基。保守修飾的非限定性例子提供如下，例如提供于表18。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“保守序列修飾”是指不會(huì)顯著影響或改變包括氨基酸序列的本發(fā)明公開的car(例如細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合特征的氨基酸修飾。這種保守修飾包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，比如定點(diǎn)突變和pcr介導(dǎo)的突變，將修飾引入到本發(fā)明公開主題的人scfv中。可以根據(jù)氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)如電荷和極性將氨基酸分組。保守氨基酸取代是其中氨基酸殘基被相同組內(nèi)的氨基酸取代。例如，氨基酸可以通過電荷分類：帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性電荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。此外，氨基酸可以通過極性分類：極性氨基酸包括精氨酸(堿性極性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性極性)、谷氨酸(酸性極性)、谷氨酰胺、組氨酸(堿性極性)、賴氨酸(堿性極性)、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；非極性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和纈氨酸。因此，cdr區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被來自相同組的其他氨基酸殘基替換，并且可以使用本文所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)改變的抗體保留的功能(即，以上(c)至(l)中所述的功能)。在某些實(shí)施方式中，在特定序列或cdr區(qū)內(nèi)改變不超過一個(gè)、不超過兩個(gè)、不超過三個(gè)、不超過四個(gè)、不超過五個(gè)殘基。示例性保守氨基酸取代示于表18中。

表18

在某些非限定性實(shí)施方式中，car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括連接細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的接頭。本文使用的術(shù)語(yǔ)“接頭(linker)”是指共價(jià)連接兩個(gè)或多個(gè)多肽或核酸使得它們彼此連接的官能團(tuán)(例如，化學(xué)的或多肽)。本文使用的“肽接頭”是指用于將兩個(gè)蛋白偶聯(lián)在一起(例如，偶聯(lián)vh和vl結(jié)構(gòu)域)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。肽接頭的非限定性例子公開于shen等人,anal.chem.80(6):1910-1917(2008)和wo2014/087010。

在一非限定性實(shí)例中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，編碼氨基酸序列seqidno:69的核苷酸序列示于seqidno:70中。在一非限定性實(shí)例中，接頭包括具有seqidno:210所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，編碼氨基酸序列seqidno:98的核苷酸序列示于seqidno:211中。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:212所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggs[seqidno:212]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:213所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

sggsggs[seqidno:213]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:214所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsgggs[seqidno:214]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:215所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsggggs[seqidno:215]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:216所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsggggsgggggggs[seqidno:216]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:217所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsggggsggggsggggs[seqidno:217]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:218所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsggggsggggsggggsggggs[seqidno:218]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:219所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsggggsggggsggggsggggsggggs[seqidno:219]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:220所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs[seqidno:220]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:220所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

epkscdkthtcppcp[seqidno:220]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:221所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

ggggsgggsepkscdkthtcppcp[seqidno:222]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:223所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

elktplgdtthtcprcpepkscdtpppcprcpepkscdtpppcprcpepkscdtpppcprcp[seqidno:223]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:224所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

gsgsgs[seqidno:224]。

在某些實(shí)施方式中，包括具有seqidno:225所示序列的氨基酸的接頭如下文提供：

aaa[seqidno:225]。

此外，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括將新生蛋白質(zhì)導(dǎo)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的前導(dǎo)序列或信號(hào)肽。如果car要被糖基化并錨定在細(xì)胞膜中，信號(hào)肽或前導(dǎo)序列可能是必需的。信號(hào)序列或前導(dǎo)序列可以是存在于新合成的蛋白質(zhì)n-端的肽序列(長(zhǎng)度約5、約10、約15、約20、約25或約30個(gè)氨基酸)，其引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌通路。在非限定性實(shí)例中，信號(hào)肽與細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的5’端共價(jià)連接。在某些實(shí)施方式中，信號(hào)肽包含cd8多肽，其包括具有如下文所提供的seqidno:191所示序列的氨基酸。

malpvtalllplalllhaar[seqidno:191]。

編碼氨基酸序列seqidno:191的核苷酸序列如下文所提供的seqidno:192所示：

atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagctcgt[seqidno:192]

在另一實(shí)施方式中，信號(hào)肽包括具有如下文所提供的seqidno:205所示序列的氨基酸。

metdtlllwvlllwvpgstg[seqidno:205]

編碼氨基酸序列seqidno:205的核苷酸序列如下文所提供的seqidno:206所示：

atggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccaggatccacagga[seqidno:206]

在某些實(shí)施方式中，人scfv包括重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的接頭肽、以及his-標(biāo)簽和ha-標(biāo)簽。在某些實(shí)施方式中，his-標(biāo)簽和ha-標(biāo)簽的氨基酸序列包括如下文提供的氨基酸序列seqidno:275：

tsgqagqhhhhhhgaypydvpdyas[seqidno:275]

編碼seqidno:275的核苷酸序列是下文提供的seqidno:276：

actagtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacgcttct[seqidno:276]

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)與包括seqidno:71所示氨基酸序列的人bcma多肽結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)與seqidno:71所示氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)與選自seqidno:71的氨基酸8-22、9-23、10-24、11-25、12-26、13-27、14-28和8-28的1、2、3、4、5、6或7個(gè)表位區(qū)結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)，其任選地在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間具有(iii)接頭序列，例如接頭多肽。在某些實(shí)施方式中，接頭包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表6的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有選自表6的vh和vl區(qū)或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全長(zhǎng)人igg。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括與seqidno:21所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括與seqidno:22所示氨基酸序列的同一性為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修飾的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修飾的vlcdr3。在某些實(shí)施方式中，與包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位區(qū)結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的vlcdr3。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是et140-3(或“et140-153”)scfv。

car的跨膜結(jié)構(gòu)域

在某些非限定性實(shí)施方式中，car的跨膜結(jié)構(gòu)域包括跨越至少一部分膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)е虏煌氖荏w穩(wěn)定性。在抗原識(shí)別之后，受體聚簇且信號(hào)被傳送至細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明公開的主題，car的跨膜結(jié)構(gòu)域可以包括cd8多肽、cd28多肽、cd3ζ多肽、cd4多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、ctla-4多肽、pd-1多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于與免疫應(yīng)答有關(guān)的蛋白質(zhì))或其組合。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car的跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd28多肽。cd28多肽可以具有與序列ncbi參照no:p10747或np_006130(seqidno:193)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。在某些實(shí)施方式中，cd28多肽可以具有作為seqidno:193保守部分的氨基酸序列，其長(zhǎng)度為至少20、或者至少30、或者至少40、或者至少50并且至多220個(gè)氨基酸。另外可選地或者額外地，在非限定性的各種實(shí)施方式中，cd28多肽具有seqidno:193的氨基酸1-220、1-50、50-100、100-150、150-200或200-220的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car包括：包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域和包括有包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd28具有seqidno:193的氨基酸114-220的氨基酸序列。

seqidno:193提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“cd28核酸分子”是指編碼cd28多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明公開的car的跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(例如共刺激信號(hào)區(qū))中包括的cd28多肽(seqidno:193的氨基酸114-220)的cd28核酸分子包括具有下文提供的seqidno:194所示序列的核酸。

attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc[seqidno:194]

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car的跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd8多肽。cd8多肽可以具有與序列ncbi參照no:aah25715(seqidno:226)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。在非限定性實(shí)施方式中，cd8多肽可以具有作為seqidno:226保守部分的氨基酸序列，其長(zhǎng)度為至少20、或者至少30、或者至少40、或者至少50、或者至少70、或者至少100、或者至少150、或者至少200并且至多235個(gè)氨基酸。另外可選地或者額外地，在非限定性的各種實(shí)施方式中，cd28多肽具有seqidno:226的氨基酸1-235、1-50、50-100、100-150、150-200、130-210或200-235的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽具有seqidno:226的氨基酸137-207的氨基酸序列。

seqidno:226提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“cd8核酸分子”是指編碼cd8多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明公開的car跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽(seqidno:226的氨基酸137-207)的cd8核酸分子包括具有下文提供的seqidno:227所示序列的核酸。

cccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaaccccggcgcccacgatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccctggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaac[seqidno:227]

在某些非限定性實(shí)施方式中，car還可以包括連接細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域的間隔區(qū)。間隔區(qū)的柔性可以足以使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在不同的方向取向，以促進(jìn)抗原識(shí)別。間隔區(qū)可以是來自igg1的鉸鏈區(qū)，或者免疫球蛋白的ch2ch3區(qū)和cd3部分。

car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

在某些非限定性實(shí)施方式中，car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以包括可以激活或刺激細(xì)胞(例如，淋巴樣譜系細(xì)胞如t細(xì)胞)的cd3ζ多肽。cd3ζ包括3個(gè)itam，在結(jié)合抗原之后將激活信號(hào)傳送至細(xì)胞(例如，淋巴樣譜系細(xì)胞如t細(xì)胞)。cd3ζ多肽可以具有與seqidno:195所示序列的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。在非限定性實(shí)施方式中，cd3ζ肽可以具有作為seqidno:195保守部分的氨基酸序列，其長(zhǎng)度為至少20、或者至少30、或者至少40、或者至少50并且至多163個(gè)氨基酸。另外可選地或者額外地，在非限定性的不同實(shí)施方式中，cd3ζ多肽具有seqidno:195的氨基酸1-163、1-50、50-100、100-150或150-163的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ζ具有seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列。

seqidno:195提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“cd3ζ核酸分子”是指編碼cd3ζ多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明公開的car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ζ多肽(seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列)的cd3ζ核酸分子包括具有下文提供的seqidno:196所示序列的核酸。

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa[seqidno:196]

在某些非限定性實(shí)施方式中，car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包括至少一個(gè)信號(hào)區(qū)。至少一個(gè)信號(hào)區(qū)可以包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、pd-1多肽、ctla-4多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于與免疫應(yīng)答有關(guān)的蛋白質(zhì))或其組合。

在某些實(shí)施方式中，信號(hào)區(qū)是共刺激信號(hào)區(qū)。在某些實(shí)施方式中，共刺激區(qū)包括至少一個(gè)共刺激分子，其可以提供最佳的淋巴細(xì)胞激活。如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴細(xì)胞對(duì)抗原有效響應(yīng)所需的抗原受體或其配體以外的細(xì)胞表面分子。至少一種共刺激信號(hào)區(qū)可以包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽或其組合。共刺激分子可以與共刺激配體結(jié)合，該共刺激配體是一經(jīng)與其受體結(jié)合便產(chǎn)生共刺激響應(yīng)的在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)，上述共刺激響應(yīng)即為當(dāng)抗原與其car分子結(jié)合時(shí)提供的影響刺激的細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)。共刺激配體包括，但不限于cd80、cd86、cd70、ox40l、4-1bbl、cd48、tnfrsf14和pd-l1。作為一實(shí)例，4-1bb配體(即4-1bbl)可以與4-1bb(也稱作“cd137”)結(jié)合，用于提供與car信號(hào)結(jié)合誘導(dǎo)car⁺t細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。包括具有包括4-1bb、icos或dap-10的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的car公開于u.s.7,446,190中(例如，編碼4-1bb的核苷酸序列示于seqidno:15，編碼icos的核苷酸序列示于seqidno:16，編碼dap-10的核苷酸序列示于seqidno:17)，在此將其全文并入作為參考。在某些實(shí)施方式中，car的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)。在某些實(shí)施方式中，car的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有包括兩種共刺激分子cd28和4-1bb或者cd28和ox40的共刺激信號(hào)區(qū)。

4-1bb可以作為腫瘤壞死因子(tnf)配體發(fā)揮作用，并具有刺激活性。4-1bb多肽可以具有與序列ncbi參考號(hào)p41273或np_001552的序列(seqidno:197)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽具有seqidno:197的氨基酸214-255的氨基酸序列。

seqidno:197提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“4-1bb核酸分子”是指編碼4-1bb多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明公開的car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽(seqidno:197的氨基酸214-255)的4-1bb核酸分子包括具有如下提供的seqidno:228所示序列的核酸。

aaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg[seqidno:228]

ox40多肽可以具有與序列ncbi參考號(hào)p43489或np_003318(seqidno:198)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:198提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“ox40核酸分子”是指編碼ox40多肽的多核苷酸。

icos多肽可以具有與序列ncbi參考號(hào)np_036224(seqidno:199)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:199提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“icos核酸分子”是指編碼icos多肽的多核苷酸。

ctla-4是激活的t細(xì)胞所表達(dá)的抑制性受體，其在被其對(duì)應(yīng)的配體(分別為cd80和cd86；b7-l和b7-2)占據(jù)時(shí)介導(dǎo)激活的t細(xì)胞抑制或無免疫反應(yīng)性。在臨床前和臨床研究中，ctla-4經(jīng)由全身性抗體輸注的阻斷，盡管會(huì)增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤應(yīng)答，但在臨床環(huán)境中具有重大無法預(yù)料的毒性。

ctla-4含有細(xì)胞外v結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)。編碼不同的同種型的可替代的剪接變體已經(jīng)被鑒定。膜結(jié)合的同種型作為由二硫鍵互連的同型二聚體發(fā)揮功能，而可溶性同種型作為單體發(fā)揮作用。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與cd28的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域類似，在于其沒有固有的催化活性，含有一個(gè)能夠結(jié)合pi3k、pp2a和shp-2的yvkm基序和一個(gè)能夠結(jié)合含sh3蛋白質(zhì)的富含脯氨酸的基序。ctla-4在抑制t細(xì)胞反應(yīng)中的一個(gè)作用似乎是直接經(jīng)由tcr-近端的信號(hào)蛋白質(zhì)例如cd3和lat的shp-2和pp2a去磷酸化。ctla-4也可以經(jīng)由與cd28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cd80/86而間接影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外已經(jīng)顯示ctla-4與pi3k、cd80、ap2m1和ppp2r5a結(jié)合和/或相互作用。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，ctla-4多肽可以具有與uniprotkb/swiss-protref.no.:p16410.3(seqidno:200)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列(本文的同源性可以使用標(biāo)準(zhǔn)軟件例如blast或fasta確定)或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:200提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“ctla-4核酸分子”是指編碼ctla-4多肽的多核苷酸。

pd-1是在與其對(duì)應(yīng)的表達(dá)在內(nèi)源性巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上的配體pd-l1和pd-l2接合時(shí)的活化t細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)物。pd-l是268個(gè)氨基酸的i型膜蛋白。pd-1具有兩種配體，pd-l1和pd-l2，其為b7家族的成員。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞外igv結(jié)構(gòu)域，然后是跨膜區(qū)和胞內(nèi)尾區(qū)。胞內(nèi)尾區(qū)含有兩個(gè)位于基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序內(nèi)和基于免疫受體酪氨酸的開關(guān)基序內(nèi)的磷酸化位點(diǎn)，該pd-1對(duì)tcr信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。shp-i和shp-2磷酸酶在配體結(jié)合時(shí)與pd-1的胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)合。pd-l1的上調(diào)是腫瘤細(xì)胞可以逃避(evade)宿主免疫系統(tǒng)的一種機(jī)制。在臨床前和臨床試驗(yàn)中，拮抗性抗體所引起的pd-1阻斷誘發(fā)經(jīng)宿主內(nèi)源性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，pd-1多肽可以具有與ncbi編號(hào)np_005009.2(seqidno:201)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:201提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“pd-1核酸分子”是指編碼pd-1多肽的多核苷酸。

淋巴細(xì)胞激活蛋白3(lag-3)是免疫細(xì)胞的負(fù)免疫調(diào)節(jié)物。lag-3屬于免疫球蛋白(ig)超家族并含有4個(gè)細(xì)胞外ig樣結(jié)構(gòu)域。lag3基因含有8個(gè)外顯子。序列數(shù)據(jù)、外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和染色體定位均表明lag3與cd4有密切關(guān)系。lag3也稱作cd223(分化簇223)。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，lag-3多肽可以具有與uniprotkb/swiss-protref.no.:p18627.5(seqidno:202)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:202提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“l(fā)ag-3核酸分子”是指編碼lag-3多肽的多核苷酸。

自然殺傷細(xì)胞受體2b4(2b4)介導(dǎo)在nk細(xì)胞和t細(xì)胞亞型上的非mhc限制的細(xì)胞殺死。迄今為止，2b4的功能仍在研究中，據(jù)認(rèn)為2b4-s同種型是激活性受體，據(jù)認(rèn)為2b4-l同種型是免疫細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)物。2b4在與其高親和性配體cd48結(jié)合時(shí)被占據(jù)。2b4含有酪氨酸類開關(guān)基序，即使蛋白質(zhì)與各種磷酸酶結(jié)合的分子開關(guān)。2b4也被稱作cd244(分化簇244)。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，2b4多肽可以具有與uniprotkb/swiss-protref.no.:q9bzw8.2(seqidno:203)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:203提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“2b4核酸分子”是指編碼2b4多肽的多核苷酸。

b-和t-淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)在t細(xì)胞的激活過程中被誘導(dǎo)，btla保持在th1細(xì)胞上表達(dá)，但在th2細(xì)胞上不表達(dá)。類似于pd1和ctla4，btla與b7同系物b7h4相互作用。但是，與pd-1和ctla-4不同，btla經(jīng)由與腫瘤壞死家族受體(tnf-r)、而不僅僅是細(xì)胞表面受體的b7家族相互作用表現(xiàn)出t-細(xì)胞抑制。btla是腫瘤壞死因子(受體)超家族成員14(tnfrsf14)也稱作單純皰疹病毒侵入介導(dǎo)子(hvem)的配體。btla-hvem復(fù)合物對(duì)t-細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。btla激活已經(jīng)顯示抑制人cd8⁺癌癥特異性t細(xì)胞的功能。btla也稱作cd272(分化簇272)。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，btla多肽可以具有與uniprotkb/swiss-protref.no.:q7z6a9.3(seqidno:204)的同源性為至少約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任選地包括至多1個(gè)或至多2個(gè)或至多3個(gè)保守氨基酸取代。

seqidno:204提供如下：

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，“btla核酸分子”是指編碼btla多肽的多核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，car包括：包括與人bcma特異性結(jié)合的人scfv的細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括cd3ζ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如圖1所示。如圖1所示，car還包括與細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的5’端共價(jià)連接的信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。在某些實(shí)施方式中，信號(hào)肽包括具有seqidno:205所示序列的氨基酸。

在某些實(shí)施方式中，car包括：包括與人bcma特異性結(jié)合的人scfv的細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、包括cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括cd3ζ多肽和包括4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如圖7所示。如圖7所示，car還包括與細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的5’端共價(jià)連接的信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。在某些實(shí)施方式中，信號(hào)肽包括具有seqidno:205所示序列的氨基酸。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開主題的car可以進(jìn)一步包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，用于在人細(xì)胞中表達(dá)核酸序列。用于表達(dá)car基因的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，例如泛素c(ubicc)啟動(dòng)子。

本發(fā)明公開的主題還提供分離的核酸分子，其編碼本文所述的靶向bcma的car或其功能性部分。在某些實(shí)施方式中，分離的核酸分子編碼本發(fā)明公開的靶向bcma的car，該car包括：與人bcma特異性結(jié)合的人scfv、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括cd3ζ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:207所示序列的核酸：

caatctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgcgtctcctggacagtcgatcgccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggttggtatcaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgaggacagtaagcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgcagctcaaatacaagaagcagcactttggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggccgaagtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaagcctggggcctcactgaagctctcctgcaaggcttctggatacaccttcatcgactactatgtatactggatgcgacaggcccctggacaagggcttgagtccatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacaccgccatgtattactgtgcgcgctcccagcgtgacggttacatggattactggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc[seqidno:207]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:208所示序列的核酸：

cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttttgatgtacactggtaccagcagcttccaggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacagcaatcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagcctgagtggttatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccaggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaacggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcaggacaggatcaccgtgaccagggacacctccagcaacacaggctacatggagctgaccaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgcgctctccgtactctggtgttctggataaatggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc[seqidno:208]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:209所示序列的核酸：

tcctatgagctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatgtcttgttctggaaccagctccaacatcggaagtcactctgtaaactggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctatactaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtggcctccagtctgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatggcagcctgaatggtctggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggccgaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccacgtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgcgctactctggttctttcgataactggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc[seqidno:209]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:229所示序列的核酸：

ccttctctaggcgcccccatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctga

catgacaagagttactaacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctacttagtccagcacgaagtctggagac

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[seqidno:229]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:230所示序列的核酸：

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ttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcact[seqidno:230]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:231所示序列的核酸：

ccttctctaggcgcccccatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctga

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在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:232所示序列的核酸：

ccttctctaggcgcccccatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctga

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ctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcact[seqidno:232]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:233所示序列的核酸：

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gttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcact[seqidno:233]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:234所示序列的核酸：

atggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccaggatccacaggactgcctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggacgcagttccaacatcgggagtaattctgttaactggtatcgacaactcccaggagcggcccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggcccccaggggtccctgtgcgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaagatgaggccacttattactgtgcaacatgggatgacaatctgaatgttcactatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaaggatcatccctatccttggtatagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcggtggttactactctcatgacatgtggtctgaagattggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa[seqidno:234]

在一具體的非限定性實(shí)施例中，分離的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:235所示序列的核酸：

atggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccaggatccacaggacaggctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaagtaattacgtattctggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgagtgcctcttatgttttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaaggatcatccctatccttggtacagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgctctggttacggttcttaccgttgggaagattcttggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa[seqidno:235]

具有seqidno:207所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的28zcar54)，該car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭，其中包括跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)區(qū)的cd28區(qū)包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:208所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的28zcar40)，該car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭，其中包括跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)區(qū)的cd28區(qū)包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:209所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的28zcar24)，該car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭，其中包括跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)區(qū)的cd28區(qū)包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:234所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的28zcar3)，該car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭，其中包括跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)區(qū)的cd28區(qū)包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:235所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的28zcar37)，該car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭，其中包括跨膜結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)區(qū)的cd28區(qū)包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:229所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的bbzcar3)，該car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭。seqidno:229的核苷酸序列270-1031編碼人scfv。seqidno:229的核苷酸序列1041-1253編碼跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽。seqidno:229的核苷酸序列1254-1379編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽。seqidno:229的核苷酸序列1380-1718編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:229的其他部分示于表19中。

表19

具有seqidno:230所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的bbzcar24)，該car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭。seqidno:230的核苷酸序列270-1015編碼人scfv。seqidno:230的核苷酸序列1023-1235編碼跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽。seqidno:230的核苷酸序列1236-1361編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽。seqidno:230的核苷酸序列1362-1700編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:230的其他部分示于表20中。

表20

具有seqidno:231所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的bbzcar37)，該car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭。seqidno:231的核苷酸序列270-1028編碼人scfv。seqidno:231的核苷酸序列1038-1250編碼跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽。seqidno:231的核苷酸序列1251-1376編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽。seqidno:231的核苷酸序列1377-1715編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:231的其他部分示于表21中。

表21

具有seqidno:232所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的bbzcar40)，該car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭。seqidno:232的核苷酸序列270-1024編碼人scfv。seqidno:232的核苷酸序列1032-1244編碼跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽。seqidno:232的核苷酸序列1245-1370編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽。seqidno:232的核苷酸序列1371-1709編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:232的其他部分示于表22中。

表22

具有seqidno:233所示核苷酸序列的分離的核酸分子編碼靶向bcma的car(稱作靶向bcma的bbzcar54)，該car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重鏈可變區(qū)、包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的具有氨基酸序列seqidno:69的接頭。seqidno:233的核苷酸序列270-1003編碼人scfv。seqidno:233的核苷酸序列1011-1223編碼跨膜結(jié)構(gòu)域中包括的cd8多肽。seqidno:233的核苷酸序列1224-1349編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的4-1bb多肽。seqidno:233的核苷酸序列1350-1688編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:233的其他部分示于表23中。

表23

在某些實(shí)施方式中，分離的核酸分子編碼本發(fā)明公開的靶向bcma的car的功能性部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“功能性部分”是指本發(fā)明公開的靶向bcma的car的保留靶向bcma的car(親本car)的生物活性的任意部分(portion)、一部分(part)或片段。例如，功能性部分包括靶向bcma的car在與親本car類似、相同甚至更高的程度上保留識(shí)別靶標(biāo)細(xì)胞、治療疾病例如多發(fā)性骨髓瘤的能力的部分、一部分或片段。在某些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明公開的靶向bcma的car的功能性部分的分離的核酸分子可以編碼包括例如親本car的約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％或更多的蛋白質(zhì)。

美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(nationalcancerinstitute，nci)進(jìn)行的一項(xiàng)i期臨床試驗(yàn)(nct02215967)使用抗bcmacar-轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤^33,34。nci的臨床試驗(yàn)中應(yīng)用的抗bcmacar包括與人bcma結(jié)合的小鼠scfv。使用小鼠抗體或小鼠scfv治療人可以導(dǎo)致抗小鼠抗體(hama)應(yīng)答，這可能是威脅生命的。不與nci的臨床試驗(yàn)類似，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的靶向bcma-的car包括人scfv，因此，與包括鼠科動(dòng)物抗體的car相比較(參見maus等人,cancerimmunolres(2003)；1(1):26-31，該文獻(xiàn)報(bào)道了源自鼠科動(dòng)物抗體的car潛在的免疫原性可能造成mrnacar的安全性問題)提供了大大降低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。

iii.免疫應(yīng)答細(xì)胞

本發(fā)明公開的主題提供了表達(dá)包括細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞，如上所述，其中細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與bcma(例如人bcma)特異性結(jié)合。免疫應(yīng)答細(xì)胞可以用本發(fā)明公開的car來轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得細(xì)胞表達(dá)car。本發(fā)明公開的主題還提供了使用此類細(xì)胞治療腫瘤例如多發(fā)性骨髓瘤(mm)的方法。本發(fā)明公開主題的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以是淋巴譜系細(xì)胞。包括b細(xì)胞、t細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞的淋巴譜系細(xì)胞，提供抗體的產(chǎn)生、細(xì)胞免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、血液中外來物質(zhì)的檢測(cè)、對(duì)宿主外源細(xì)胞的檢測(cè)等。淋巴譜系細(xì)胞的非限定性實(shí)例包括t細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和多能干細(xì)胞(例如，可分化成淋巴樣細(xì)胞的多能干細(xì)胞)。t細(xì)胞可以是在胸腺中成熟的淋巴細(xì)胞，并且主要負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。t細(xì)胞參與獲得性免疫系統(tǒng)。本發(fā)明公開主題的t細(xì)胞可以是任何類型的t細(xì)胞，包括但不限于輔助性t細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞(包括中心記憶t細(xì)胞、干細(xì)胞樣記憶t細(xì)胞(或干樣記憶t細(xì)胞)和兩種類型的效應(yīng)記憶t細(xì)胞(例如，tem細(xì)胞和temra細(xì)胞)、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(也稱為抑制性t細(xì)胞)、自然殺傷t細(xì)胞、粘膜相關(guān)恒定t細(xì)胞、和γδt細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，表達(dá)car的t細(xì)胞表達(dá)foxp3以實(shí)現(xiàn)和維持t調(diào)節(jié)表型。自然殺傷(nk)細(xì)胞可以是作為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的一部分、并且在先天免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用的淋巴細(xì)胞。nk細(xì)胞不需要預(yù)先激活，以便對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl或殺傷t細(xì)胞)是能夠誘導(dǎo)受感染的體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞死亡的t淋巴細(xì)胞的亞型。

本發(fā)明公開主題的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以表達(dá)與bcma(例如人bcma)特異性結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如人scfv、任選交聯(lián)的fab、或f(ab)2)，用于治療多發(fā)性骨髓瘤。此類免疫應(yīng)答細(xì)胞可以給予對(duì)其有需求的受試者(例如人受試者)，用于治療多發(fā)性骨髓瘤。在某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答細(xì)胞是t細(xì)胞。t細(xì)胞可以是cd4⁺t細(xì)胞或cd8⁺t細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，t細(xì)胞是cd4⁺t細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，t細(xì)胞是cd8⁺t細(xì)胞。

本公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以進(jìn)一步用至少一種共刺激配體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得免疫應(yīng)答細(xì)胞共表達(dá)或者誘導(dǎo)成共表達(dá)靶向bcma的car和至少一種共刺激配體。靶向bcma的car和至少一種共刺激配體之間的相互作用提供了對(duì)于免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如t細(xì)胞)的完全激活而言很重要的非抗原特異性信號(hào)。共刺激配體包括，但不限于，腫瘤壞死因子(tnf)超家族成員和免疫球蛋白(ig)超家族配體。tnf是參與全身性炎癥并刺激急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子。它的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞。tnf超家族的成員具有許多共同的特征。大多數(shù)tnf超家族成員被合成作為含有短胞質(zhì)鏈段和相對(duì)長(zhǎng)的細(xì)胞外區(qū)域的ii型跨膜蛋白(細(xì)胞外c端)。tnf超家族成員包括，但不限于，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、cd40l(cd40l)/cd154、cd137l/4-1bbl、tnf-α、cd134l/ox40l/cd252、cd27l/cd70、fas配體(fasl)、cd30l/cd153、腫瘤壞死因子β(tnfβ)/淋巴毒素-α(ltα)、淋巴毒素-β(ltβ)、cd257/b細(xì)胞激活因子(baff)/blys/thank/tall-1、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的tnf受體配體(gitrl)和tnf相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(trail)、light(tnfsf14)。免疫球蛋白(ig)超家族是一大類參與細(xì)胞識(shí)別、結(jié)合或粘附過程的細(xì)胞表面蛋白和可溶性蛋白。這些蛋白與免疫球蛋白共享結(jié)構(gòu)特征——它們具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(折疊)。免疫球蛋白超家族配體包括，但不限于，cd80和cd86、cd28的兩個(gè)配體、pd-1的配體pd-l1/(b7-h1)。在某些實(shí)施方式中，至少一種共刺激配體選自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14、pd-l1及其組合。在某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答細(xì)胞用一種共刺激配體4-1bbl轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答細(xì)胞用兩種共刺激配體4-1bbl和cd80轉(zhuǎn)導(dǎo)。用至少一種共刺激配體轉(zhuǎn)導(dǎo)的car描述于美國(guó)專利第8,389,282號(hào)中，在此將其全文并入作為參考。

而且，本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以進(jìn)一步用至少一種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得免疫應(yīng)答細(xì)胞分泌至少一種細(xì)胞因子并且表達(dá)靶向bcma的car。在某些實(shí)施方式中，至少一種細(xì)胞因子選自il-2、il-3、il-6、il-7、il-11、il-12、il-15、il-17和il-21。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞因子是il-12。

bcma特異性或者靶向bcma的人淋巴細(xì)胞可以用于外周供體淋巴細(xì)胞，例如以下文獻(xiàn)中所公開：sadelain,m.等人,2003natrevcancer3:35-45(公開了遺傳修飾成表達(dá)car的外周供體淋巴細(xì)胞)；morgan,r.a.等人,2006science314:126-129(公開了遺傳修飾成表達(dá)包括α和β異質(zhì)二聚體的全長(zhǎng)腫瘤抗原識(shí)別t細(xì)胞受體復(fù)合物)；panelli,m.c.等人,2000jimmunol164:495-504；panelli,m.c.等人,2000jimmunol164:4382-4392(公開了源自腫瘤活組織檢查中的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(til)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物)；和dupont,j.等人,2005cancerres65:5417-5427；papanicolaou,g.a.等人,2003blood102:2498-2505(公開了使用人工抗原呈遞細(xì)胞(aapc)或脈沖樹突細(xì)胞選擇性地在體外擴(kuò)增的抗原特異性外周血白細(xì)胞)。免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如t細(xì)胞)可以是自體的、非自體的(例如同種異體的)或者在體外得自工程化的祖細(xì)胞或干細(xì)胞。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如t細(xì)胞)表達(dá)約1至約4、約2至約4、約3至約4、約1至約2、約1至約3、或約2至約3個(gè)載體拷貝數(shù)/細(xì)胞的本發(fā)明公開的靶向bcma的car。

ctl的未純化來源可以是本領(lǐng)域任何已知的，例如骨髓、胎兒、新生兒或成人或其他造血細(xì)胞來源，例如胎肝、外周血或臍帶血?？梢圆捎酶鞣N技術(shù)來分離細(xì)胞。例如，陰性選擇方法可以在最初除去非ctl。對(duì)于陽(yáng)性選擇和陰性選擇，單克隆抗體對(duì)于識(shí)別與特定細(xì)胞譜系和/或分化階段相關(guān)的標(biāo)志物特別有用。

較大比例的終末分化的細(xì)胞可以通過相對(duì)較粗的分離在最初除去。例如，最初可以使用磁珠分離，以除去大量不相關(guān)的細(xì)胞。優(yōu)選地，至少約80％、通常至少70％的總造血細(xì)胞將在細(xì)胞分離之前被除去。

分離方法包括，但不限于，密度梯度離心；重調(diào)(resetting)；與改變細(xì)胞密度的顆粒結(jié)合；用涂有抗體的磁珠進(jìn)行磁性分離；親和色譜；與mab結(jié)合或聯(lián)合使用的細(xì)胞毒性劑，其包括但不限于補(bǔ)體和細(xì)胞毒素；和用附著于例如板、芯片的固體基質(zhì)的抗體淘選、淘析或任何其他傳統(tǒng)的技術(shù)。

分離和分析技術(shù)包括，但不限于，流式細(xì)胞術(shù)，其可以具有不同程度的改進(jìn)，例如多種色彩通道、低角度和鈍角光散射檢測(cè)通道、阻抗通道。

可以通過使用與死細(xì)胞相關(guān)的染料比如碘化丙啶(pi)，相對(duì)于死細(xì)胞來選擇細(xì)胞。優(yōu)選地，將細(xì)胞收集在包括2％胎牛血清(fcs)或0.2％牛血清白蛋白(bsa)的培養(yǎng)基或任何其它合適的優(yōu)選為無菌的等滲介質(zhì)中。

iv.載體

免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如，t細(xì)胞、ctl細(xì)胞、nk細(xì)胞)的遺傳修飾可以通過將基本上均質(zhì)的細(xì)胞組成用重組dna或rna構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如，γ逆轉(zhuǎn)錄病毒)，其用于將dna或rna構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞基因組中。例如，可以將編碼靶向bcma的car的多核苷酸克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，并且可以由其內(nèi)源性啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列或者替代的內(nèi)部啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。

也可使用非病毒載體或rna?？梢允褂秒S機(jī)染色體整合或靶向整合(例如使用核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(talen)、鋅指核酸酶(zfn)、和/或成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)物(crispr)或轉(zhuǎn)基因表達(dá)(例如使用天然或化學(xué)修飾的rna)。

對(duì)于細(xì)胞的初始遺傳修飾以提供表達(dá)靶向bcma的car的細(xì)胞，通常使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，然而可以使用任何其它合適的病毒載體或非病毒遞送系統(tǒng)。對(duì)于細(xì)胞的后續(xù)遺傳修飾以提供包括有包括至少兩種共刺激配體的抗原遞呈復(fù)合物的細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)導(dǎo))同樣證明是有效的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和合適的包裝系的組合也是合適的，其中衣殼蛋白作用于感染人細(xì)胞。已知各種產(chǎn)生雙嗜性病毒的細(xì)胞系，其包括但不限于pa12(miller等人(1985)mol.cell.biol.5：431～437)；pa317(miller等人(1986)mol.cell.biol.6：2895～2902)；和crip(danos等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：6460～6464)。非嗜性顆粒也是合適的，例如，用vsvg、rd114或galv外殼假型化的顆粒和本領(lǐng)域已知的任何其它顆粒。

可能的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法還包括將細(xì)胞與生產(chǎn)細(xì)胞直接共培養(yǎng)，例如，通過bregni等人(1992)blood80：1418～1422的方法，或者在存在或不存在合適的生長(zhǎng)因子和聚陽(yáng)離子的情況下與單獨(dú)的病毒上清液或濃縮載體儲(chǔ)備液一起培養(yǎng)，例如通過xu等人(1994)exp.hemat.22：223～230；和hughes等人(1992)j.clin.invest.89：1817的方法。

轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒載體可用于在免疫應(yīng)答細(xì)胞中表達(dá)共刺激共刺激配體(例如4-1bbl和il-12)。優(yōu)選地，所擇的載體表現(xiàn)出高的感染效率和穩(wěn)定的整合和表達(dá)(參見例如cayouette等人，humangenetherapy8：423～430，1997；kido等人，currenteyeresearch15：833～844，1996；bloomer等人，journalofvirology71：6641～6649，1997；naldini等人，science272：263～267，1996；和miyoshi等人，proc.natl.acad.sci.usa94：10319，1997)?？梢允褂玫钠渌《据d體包括例如腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒載體、牛痘病毒、牛乳頭瘤病毒或皰疹病毒，例如epstein-barr病毒(另外參見例如，以下的載體：miller，humangenetherapy15-14，1990；friedman，science244：1275～1281，1989；eglitis等人，biotechniques6：608～614，1988；tolstoshev等人，currentopinioninbiotechnology1：55～61，1990；sharp，thelancet337：1277～1278,1991；cornetta等人，nucleicacidresearchandmolecularbiology36：311～322，1987；anderson，science226：401～409，1984；moen，bloodcells17：407～416，1991；miller等，biotechnology7：980～990，1989；legallasalle等，science259：988～990，1993；和johnson，chest107：77s～83s，1995)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被特別好地開發(fā)，并已用于臨床環(huán)境中(rosenberg等人，n.engl.j.med323：370，1990；anderson等人，美國(guó)專利第5,399,346號(hào))。

在某些非限定性實(shí)施方式中，表達(dá)本發(fā)明公開的靶向bcma的car的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如，293galv9逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

也可以使用非病毒方法在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。例如，通過在脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的存在下給予核酸(feigner等人,proc.nat’l.acad.sci.u.s.a.84:7413,1987；ono等人,neuroscienceletters17:259,1990；brigham等人,am.j.med.sci.298:278,1989；staubinger等人.,methodsinenzymology101:512,1983)，通過脫唾液酸血清類粘蛋白-多賴氨酸綴合(wu等人,journalofbiologicalchemistry263:14621,1988；wu等人,journalofbiologicalchemistry264:16985,1989)，或者通過在外科手術(shù)條件下微注射(wolff等人,science247:1465,1990)，可以將核酸分子引入到細(xì)胞中。其他用于基因轉(zhuǎn)移的非病毒方式包括使用磷酸鈣、deae葡聚糖、電穿孔和原生質(zhì)體融合在體外轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體對(duì)于將dna遞送至細(xì)胞中也可以是潛在有益的。通過將正常核酸轉(zhuǎn)移至可培養(yǎng)的細(xì)胞型(例如，自體或異種原代細(xì)胞或其子代)中，之后將細(xì)胞(或其后代)注射到靶標(biāo)組織中或全身注射，也可以實(shí)現(xiàn)將正?；蛞浦驳绞茉囌叩氖芨腥窘M織中。也可以使用轉(zhuǎn)座酶或靶向核酸酶(例如，鋅指核酸酶、大范圍核酸酶或tale核酸酶)得到或獲得重組受體。通過rna電穿孔可以獲得暫時(shí)的表達(dá)。

用于多核苷酸治療方法的cdna表達(dá)可以由任何合適的啟動(dòng)子(例如人巨細(xì)胞病毒(cmv)、猿猴病毒(sv40)或金屬硫蛋白啟動(dòng)子)指導(dǎo)，并可以通過任何合適的哺乳動(dòng)物調(diào)控元件或內(nèi)含子(例如延長(zhǎng)因子1α增強(qiáng)子/啟動(dòng)子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu))調(diào)節(jié)。例如，如果需要，可以使用已知偏好在特定細(xì)胞類型中指導(dǎo)基因表達(dá)的增強(qiáng)子，以指導(dǎo)核酸的表達(dá)。使用的增強(qiáng)子可以包括，但不限于，鑒定為組織或細(xì)胞特異性增強(qiáng)子的那些增強(qiáng)子。另外可選地，如果使用基因組克隆作為治療構(gòu)件，則可以通過同源的調(diào)控序列，或者如果需要的話通過源自異源性來源的調(diào)控序列，包括任意上述的啟動(dòng)子或調(diào)控元件，對(duì)調(diào)節(jié)進(jìn)行介導(dǎo)。

所得的細(xì)胞可以在與未修飾細(xì)胞類似的條件下生長(zhǎng)，從而可以將修飾的細(xì)胞擴(kuò)增，并用于多種目的。

v.多肽和類似物和多核苷酸

本發(fā)明公開的主題中還包括與bcma(例如人bcma)特異性結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，scfv(例如人scfv)、fab或(fab)2)、cd3ζ、cd8、cd28等多肽或其片段、以及編碼其的多核苷酸，它們以當(dāng)在免疫應(yīng)答細(xì)胞中表達(dá)時(shí)增強(qiáng)其抗腫瘤活性的方式被修飾。本發(fā)明公開的主題提供了通過產(chǎn)生序列中的改變來優(yōu)化氨基酸序列或核酸序列的方法。此類改變包括某些突變、缺失、插入或翻譯后修飾。本發(fā)明公開的主題還包括本發(fā)明公開主題的任何天然存在的多肽的類似物。類似物可以通過氨基酸序列差異、通過翻譯后修飾或通過兩者而不同于本發(fā)明公開主題的天然存在的多肽。本發(fā)明公開主題的類似物通?？梢员憩F(xiàn)出與本發(fā)明公開主題的天然存在的氨基酸序列的全部或部分至少約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高的同一性。序列比較的長(zhǎng)度為至少5、10、15、20、25、50、75、100或更多個(gè)氨基酸殘基。此外，在確定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，e^-3和e^-100之間的概率得分表示密切相關(guān)的序列。修飾包括多肽的體內(nèi)和體外化學(xué)衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；此類修飾可以在多肽合成或用分離的修飾酶的處理中或處理之后發(fā)生。類似物還可以通過一級(jí)序列的改變而不同于本發(fā)明公開主題的天然多肽。這些改變包括天然和誘導(dǎo)的遺傳變體(例如，產(chǎn)生自通過照射或暴露于甲磺酸乙酯的隨機(jī)突變，或者通過定點(diǎn)突變，如以下文獻(xiàn)所述：sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning:alaboratorymanual(第二版)cshpress，1989；或ausubel等人，同上)。另外包括的是含有除l-氨基酸外的殘基例如d-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸例如β或γ氨基酸的環(huán)肽、分子和類似物。

除全長(zhǎng)多肽以外，本發(fā)明公開的主題還提供本發(fā)明公開主題的多肽或肽結(jié)構(gòu)域中任一者的片段。片段可以是至少5、10、13或15個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，片段是至少20個(gè)連續(xù)氨基酸、至少30個(gè)連續(xù)氨基酸或至少50個(gè)相連的氨基酸。在某些實(shí)施方式中，片段是至少60至80、100、200、300或更多個(gè)相連的氨基酸。本發(fā)明公開主題的片段可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，或者可以由普通的蛋白質(zhì)加工產(chǎn)生(例如從新生多肽中除去生物活性不需要的氨基酸，或者通過另外可選的mrna剪接或另外可選的蛋白質(zhì)加工事件除去氨基酸)。

非蛋白質(zhì)類似物具有設(shè)計(jì)成模擬本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能活性的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這些類似物根據(jù)本發(fā)明公開主題的方法而施用。這些類似物可以超過原始多肽的生理活性。類似物設(shè)計(jì)方法是本領(lǐng)域公知的，并且可以根據(jù)這些方法通過修飾化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行類似物的合成，使得當(dāng)在免疫應(yīng)答細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所生成的類似物增加原始多肽的抗腫瘤活性。這些化學(xué)修飾包括但不限于取代另外可選的r基團(tuán)，和改變參考多肽特定碳原子的飽和度。蛋白質(zhì)類似物可以相對(duì)耐受體內(nèi)降解，導(dǎo)致施用時(shí)治療效果更加延長(zhǎng)。用于測(cè)量功能活性的試驗(yàn)包括但不限于下面實(shí)施例中描述的那些。

根據(jù)本發(fā)明公開的主題，編碼與bcma(例如，人bcma)特異性結(jié)合的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如scfv(例如人scfv)、fab或(fab)2)、cd3ζ、cd8、cd28)的多核苷酸可以通過密碼子優(yōu)化進(jìn)行修飾。密碼子優(yōu)化可以改變天然存在的和重組的基因序列，以在任何給定的表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)最高可能水平的生產(chǎn)能力。涉及蛋白質(zhì)表達(dá)不同階段的因素包括密碼子適應(yīng)性、mrna結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯中的各種順式元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的密碼子優(yōu)化方法或技術(shù)均可用于修飾本發(fā)明公開主題的多核苷酸，其包括，但不限于，optimumgene^tm、encor優(yōu)化和blueheron。.

vi.給藥

可以全身性地或直接地向受試者提供本發(fā)明公開主題的靶向bcma的car和表達(dá)它的免疫應(yīng)答細(xì)胞，用于治療或預(yù)防瘤形成。在某些實(shí)施方式中，將靶向bcma的car和表達(dá)它的免疫應(yīng)答細(xì)胞直接注射到所關(guān)注的器官(例如，受瘤形成影響的器官)中。另外可選地或額外地，將靶向bcma的car和表達(dá)它的免疫應(yīng)答細(xì)胞通過例如施用到循環(huán)系統(tǒng)中(例如，腫瘤血管系統(tǒng))間接地提供至所關(guān)注的器官?？梢栽诩?xì)胞和組合物給藥之前、過程中或之后，提供擴(kuò)增劑和分化劑，以增加體外或體內(nèi)t細(xì)胞的產(chǎn)生。

本發(fā)明公開主題的靶向bcma的car和表達(dá)它的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以在任何生理學(xué)可接受的媒介物中給藥，通常是血管內(nèi)給藥，盡管它們也可以被引入骨或細(xì)胞可以找到合適的再生和分化位點(diǎn)的其他方便的位點(diǎn)中(例如，胸腺)。通常，可以施用至少1×10⁵個(gè)細(xì)胞，最終達(dá)到1×10¹⁰個(gè)或更多。包括表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞群可以包括純化的細(xì)胞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地使用各種公知的方法例如熒光激活細(xì)胞分選(facs)確定細(xì)胞群中免疫應(yīng)答細(xì)胞的百分比。包含經(jīng)遺傳修飾的表達(dá)bcma特異性car的免疫應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞群中的純度范圍可以是約50％至約55％、約55％至約60％、約65％至約70％、約70％至約75％、約75％至約80％、約80％至約85％、約85％至約90％、約90％至約95％或約95至約100％。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地調(diào)整劑量(例如，純度降低可能需要增加劑量)。免疫應(yīng)答細(xì)胞可通過注射、導(dǎo)管等引入。如果需要，還可以包括因子，其包括，但不限于，白細(xì)胞介素，例如il-2、il-3、il6、il-11、il-7、il-12、il-15、il-21以及其它白細(xì)胞介素，集落刺激因子，例如g-、m-和gm-csf，干擾素，例如γ-干擾素。

本發(fā)明公開主題的組合物包括藥物組合物，其包括表達(dá)靶向cmma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞和藥學(xué)可接受的載體。給藥可以是自體的或非自體的。例如，表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞和包含它的組合物可以從一個(gè)受試者獲得，并施用給相同受試者或不同的相容的受試者?？梢酝ㄟ^局部注射，包括導(dǎo)管給藥、全身性注射、局部注射、靜脈內(nèi)注射或胃腸外給藥來給予本發(fā)明公開主題的源自外周血的t細(xì)胞或其子代(例如，體內(nèi)、先體外后體內(nèi)或體外獲得的)。當(dāng)施用本發(fā)明公開主題的藥物組合物(例如，包括表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞的藥物組合物)時(shí)，可以將其配制成單位劑量可注射形式(溶液、混懸液、乳液)。

vii.制劑

本發(fā)明公開主題的通常表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞和包含其的組合物可以方便地作為無菌液體制劑提供，例如等滲水溶液、混懸液、乳液、分散液或粘性組合物，其可以緩沖至選定的ph。液體制劑通常比凝膠、其它粘性組合物和固體組合物更容易制備。此外，液體組合物在一定程度上更方便給藥，特別是通過注射。另一方面，粘性組合物可以在適當(dāng)?shù)恼扯确秶鷥?nèi)配制，以提供與特定組織的更長(zhǎng)的接觸時(shí)間。液體或粘性組合物可以包括載體，其可以是含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)混合物的溶劑或分散介質(zhì)。

無菌可注射溶液可以通過以下方法來制備：將包括表達(dá)本發(fā)明公開主題的靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞的組合物引入到所需量的合適溶劑與如果需要的各種量的其它成分中。這些組合物可以與合適的媒介物、稀釋劑或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等混合。組合物也可以凍干。根據(jù)給藥途徑和所需制劑，組合物可以含有輔助性物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、ph緩沖劑、凝膠化或增粘添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、著色劑等?？梢詤⒖紭?biāo)準(zhǔn)教科書，例如在此并入本文以供參考的“remington’spharmaceuticalscience”，第17版，1985，以制備合適的制劑，而無需過度的實(shí)驗(yàn)。

可以加入增強(qiáng)組合物穩(wěn)定性和無菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑。通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以確保防止微生物的作用?？勺⑸渌幬镄问降难娱L(zhǎng)吸收可以通過使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠實(shí)現(xiàn)。然而，根據(jù)本發(fā)明，使用的任何載體、稀釋劑或添加劑必須與本發(fā)明公開主題的通常表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞相容。

組合物可以是等滲的，即它們可以具有與血液和淚液相同的滲透壓。本發(fā)明公開主題的組合物所需的等滲性可以使用氯化鈉或其它藥學(xué)上可接受的試劑例如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其它無機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)實(shí)現(xiàn)。氯化鈉對(duì)于含有鈉離子的緩沖液來說特別優(yōu)選。

如果需要，組合物的粘度可以使用藥學(xué)上可接受的增稠劑保持在選定的水平?？梢允褂眉谆w維素，因?yàn)樗菀踪?gòu)得且經(jīng)濟(jì)可行并且易于操作。其它合適的增稠劑包括，例如，黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等。增稠劑的濃度可以取決于所選擇的試劑。要點(diǎn)在于使用將會(huì)實(shí)現(xiàn)所選粘度的量。顯然，合適的載體和其它添加劑的選擇將取決于確切的給藥途徑和特定劑型例如液體劑型的性質(zhì)，(例如，是否將組合物配制成溶液、混懸液、凝膠或其他液體形式，例如延時(shí)釋放形式或液體填充形式)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，組合物的組分應(yīng)當(dāng)選擇成在化學(xué)上呈惰性，并且不會(huì)影響如本發(fā)明公開主題所述的免疫應(yīng)答細(xì)胞的存活力或功效。這一點(diǎn)對(duì)于化學(xué)和藥學(xué)原理的技術(shù)人員來說將不存在問題，或者從本公開內(nèi)容和本文引用的文獻(xiàn)通過參考標(biāo)準(zhǔn)教科書或通過簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)(不涉及過度實(shí)驗(yàn))，可以容易地避免問題。

關(guān)于本發(fā)明公開主題的免疫應(yīng)答細(xì)胞的治療用途的一個(gè)考慮是獲得最佳效果所必需的細(xì)胞的量。要施用的細(xì)胞的量將根據(jù)所治療的受試者而變化。在某些實(shí)施方式中，將約10⁴至約10¹⁰、約10⁵至約10⁹或約10⁶至約10⁸個(gè)本發(fā)明公開主題的免疫應(yīng)答細(xì)胞施用至受試者。更有效的細(xì)胞可以以甚至更少的量施用。在某些實(shí)施方式中，將至少約1x10⁸、至少約2x10⁸、約3x10⁸至約4x10⁸和約5x10⁸個(gè)本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞施用至人類受試者。何為有效劑量的精確確定可以基于對(duì)于每個(gè)受試者而言獨(dú)立的因素，包括具體受試者的體型大小、年齡、性別、體重和病癥。劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員從本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域的知識(shí)中容易地確定。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定組合物中以及要在本發(fā)明公開主題的方法中施用的細(xì)胞和任選的添加劑、媒介物和/或載體的量。通常，任何添加劑(除了活性細(xì)胞和/或試劑之外)在磷酸鹽緩沖鹽水中以約0.001wt％至約50wt％的溶液的量存在，活性成分以微克至毫克的數(shù)量級(jí)存在，例如約0.0001wt％至約5wt％、約0.0001wt％至約1wt％、約0.0001wt％至約0.05wt％、約0.001wt％至約20wt％、約0.01wt％至約10wt％或者約0.05wt％至約5wt％。對(duì)于要給予動(dòng)物或人的任何組合物，以及對(duì)于任何具體的給藥方法，應(yīng)當(dāng)確定毒性，例如通過在合適的動(dòng)物模型例如嚙齒動(dòng)物如小鼠中測(cè)定致死劑量(ld)和ld50；和引起適當(dāng)應(yīng)答的組合物的劑量、其中組分的濃度和給予組合物的時(shí)機(jī)來確定毒性。此類確定根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)、本公開內(nèi)容和本文引用的文獻(xiàn)并不需要過度實(shí)驗(yàn)。并且，可以在沒有過度實(shí)驗(yàn)的情況下確定依序給藥的時(shí)間。

viii.治療方法

腫瘤微環(huán)境。腫瘤具有敵對(duì)于宿主免疫應(yīng)答的微環(huán)境，其涉及惡性細(xì)胞一系列機(jī)制以保護(hù)自身免于免疫識(shí)別和清除。這種“敵對(duì)的腫瘤微環(huán)境”包括多種免疫抑制因子，包括浸潤(rùn)性調(diào)節(jié)性cd4⁺t細(xì)胞(treg)、骨髓衍生抑制細(xì)胞(mdsc)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tam)、包括il-10和tgf-β的免疫抑制性細(xì)胞因子，以及靶向由活化t細(xì)胞(ctla-4和pd-1)表達(dá)的免疫抑制性受體的配體的表達(dá)。這些免疫抑制機(jī)制在維持耐受性和抑制不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答中起作用，然而在腫瘤微環(huán)境內(nèi)，這些機(jī)制阻止有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。總之，在遇到靶向的腫瘤細(xì)胞時(shí)這些免疫抑制因子可以誘導(dǎo)過繼轉(zhuǎn)移的car修飾的t細(xì)胞顯著的無效能化或凋亡。

腫瘤免疫學(xué)的挑戰(zhàn)。有效的腫瘤免疫需要腫瘤抗原識(shí)別和免疫效應(yīng)細(xì)胞的無對(duì)抗的腫瘤清除。腫瘤抗原必須包含由腫瘤遞呈并且可以被特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)識(shí)別的肽表位。引發(fā)的ctl必須擴(kuò)增到足夠數(shù)量并遷移至腫瘤位點(diǎn)，在其中它們成熟為效應(yīng)物以發(fā)揮其功能，這種功能通過輔助性t細(xì)胞增強(qiáng)并被treg和抑制性巨噬細(xì)胞抑制。

用改造的t淋巴細(xì)胞的靶向t細(xì)胞治療。t細(xì)胞改造是開創(chuàng)性的策略，以潛在解決許多以前觀察到的早期免疫治療方法的缺陷。在過去一年中，研究人員報(bào)道了用靶向指定抗原(分別為cd19和ny-eso-1)的自體外周血t細(xì)胞獲得了在復(fù)發(fā)^16,17、化學(xué)耐藥性(chemorefractory)白血病和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤^18-20中的顯著的完全緩解。

遺傳方法的原理：細(xì)胞工程可以用于將t細(xì)胞重定向至腫瘤抗原并增強(qiáng)t細(xì)胞功能。遺傳性t細(xì)胞修飾的一個(gè)動(dòng)力是增強(qiáng)t細(xì)胞存活和擴(kuò)增并抵消t細(xì)胞死亡、無效能化和免疫抑制的潛力。還可以改進(jìn)t細(xì)胞的遺傳靶向以防止正常組織的不期望的破壞。

嵌合抗原受體(car)：通過轉(zhuǎn)移編碼car的基因，可以產(chǎn)生腫瘤特異性t細(xì)胞^21-26。第二代car包括與能夠激活t細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域融合的腫瘤抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及設(shè)計(jì)成增強(qiáng)t細(xì)胞效能和持續(xù)性的共刺激結(jié)構(gòu)域²⁷。因此car設(shè)計(jì)可以協(xié)調(diào)抗原識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)——生理上由兩個(gè)單獨(dú)的復(fù)合物tcr異質(zhì)二聚體和cd3復(fù)合物承擔(dān)的兩種功能。car的細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常來源于鼠單克隆抗體(mab)或來自受體或其配體。因此，抗原識(shí)別是非mhc限制的^28，29，因此使用相同的car可以適用于表達(dá)靶標(biāo)抗原的任何患者。通過car的抗原結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中基于免疫受體酪氨酸的激活基序(itam)的磷酸化，啟動(dòng)溶細(xì)胞誘導(dǎo)、細(xì)胞因子分泌和增殖所需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。由于抗原識(shí)別的mhc限制被繞開，car靶向t細(xì)胞的功能不受hla下調(diào)或抗原加工機(jī)制中缺陷的影響。

t細(xì)胞對(duì)于擴(kuò)增和存活的要求：腫瘤特異性t細(xì)胞的增殖在體內(nèi)外(exvivo)是需要的，并且在體內(nèi)可以說是希望有的。t細(xì)胞增殖必須伴隨有t細(xì)胞的存活，以允許絕對(duì)的t細(xì)胞擴(kuò)增和持續(xù)。為了響應(yīng)于抗原而增殖，t細(xì)胞必須接收兩種信號(hào)。一種是由抗原遞呈細(xì)胞(apc)表面上展示的抗原肽/mhc復(fù)合物的tcr識(shí)別提供²⁵。另一種由t細(xì)胞共刺激受體例如cd28或4-1bb受體提供。雖然t細(xì)胞的溶細(xì)胞活性不需要伴隨的共刺激，但如先前所證明，對(duì)于提供共刺激信號(hào)以維持過繼轉(zhuǎn)移t細(xì)胞的抗腫瘤功能，存在關(guān)鍵需求^23,27,30-32。

免疫監(jiān)測(cè)：淋巴細(xì)胞是多功能“藥物”，其在輸注后表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化效應(yīng)。在遇到抗原時(shí)，腫瘤特異性t細(xì)胞激活和/或釋放多種可以觸發(fā)腫瘤殺傷、t細(xì)胞增殖和其它免疫細(xì)胞的募集或免疫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。因此，測(cè)量哪些蛋白質(zhì)從哪些細(xì)胞以什么數(shù)量及在什么時(shí)間點(diǎn)分泌，對(duì)于具體患者為什么應(yīng)答或不應(yīng)答可以提供深入理解，并且為設(shè)計(jì)更有效的試驗(yàn)提供關(guān)鍵反饋。這些試驗(yàn)系統(tǒng)將允許直接和有意義的臨床方法比較，從而有助于設(shè)計(jì)合理的下一代治療策略。

對(duì)于治療，給予的量是產(chǎn)生所需效果有效的量。可以在一次或系列給藥中提供有效量。可以在推注或通過連續(xù)灌注提供有效量。

“有效量”(或“治療有效量”)是足以在治療時(shí)影響有益或期望的臨床結(jié)果的量。有效的量可以在一個(gè)或多個(gè)劑量中給予受試者。在治療方面，有效量是足以減輕、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)或減緩疾病的進(jìn)展或以其它方式減少疾病的病理學(xué)后果的量。有效量通常由醫(yī)生根據(jù)具體情況確定，并且在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。當(dāng)確定合適劑量以達(dá)到有效量時(shí)，通?？紤]若干因素。這些因素包括受試者的年齡、性別和體重、所治療的病癥、病癥的嚴(yán)重程度以及給予的免疫應(yīng)答細(xì)胞的劑型和有效濃度。

對(duì)于使用抗原特異性t細(xì)胞的過繼免疫治療，通常輸注約10⁶至約10¹⁰(例如約10⁹)范圍內(nèi)的細(xì)胞劑量。當(dāng)免疫應(yīng)答細(xì)胞被給予受試者并隨后分化時(shí)，免疫應(yīng)答細(xì)胞誘導(dǎo)為特異性地針對(duì)一種特定抗原(例如，bcma)。t細(xì)胞的“誘導(dǎo)”可以包括例如通過缺失或無效能化實(shí)現(xiàn)的抗原特異性t細(xì)胞的失活。失活對(duì)于建立或重建比如在自身免疫性疾病中的耐受性特別有用。本發(fā)明公開主題的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法給藥，包括但不限于胸膜給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、結(jié)節(jié)內(nèi)給藥、腫瘤內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、胸膜內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥和直接施用于胸腺。在某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答細(xì)胞和包括其的組合物在靜脈內(nèi)施用于需要的受試者。

本發(fā)明公開的主題提供使用表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)的各種方法。例如，本發(fā)明公開的主題提供減少受試者的腫瘤負(fù)荷的方法。在一個(gè)非限定性實(shí)例中，減少腫瘤負(fù)荷的方法包括將有效量的本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞給予受試者，從而在受試者中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以減少受試者的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量、減小腫瘤尺寸和/或根除腫瘤。合適的腫瘤的非限定性例子包括多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血癥。

本發(fā)明公開的主題還提供增加或延長(zhǎng)患有瘤形成的受試者的存活的方法。在一非限定性實(shí)例中，增加或延長(zhǎng)患有瘤形成的受試者的存活的方法包括將有效量的本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞給予受試者，從而增加或延長(zhǎng)受試者的存活。該方法可以減少或根除受試者的腫瘤負(fù)荷。本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步提供用于治療或預(yù)防受試者的瘤形成的方法，其包括將本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞給予受試者。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“瘤形成”是指特征在于細(xì)胞或組織的病理增殖及其隨后向其它組織或器官遷移或侵襲的疾病。瘤形成生長(zhǎng)通常是不受控制的和進(jìn)行性的，并且在不會(huì)引起或?qū)?dǎo)致正常細(xì)胞繁殖停止的條件下發(fā)生。瘤形成可以影響多種細(xì)胞類型、組織或器官，包括但不限于選自膀胱、結(jié)腸、骨、腦、乳腺、軟骨、神經(jīng)膠質(zhì)、食管、輸卵管、膽囊、心臟、腸、腎臟、肝臟、肺、淋巴結(jié)、神經(jīng)組織、卵巢、胸膜、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、子宮、和陰道的器官，或其組織或細(xì)胞類型。瘤形成包括癌癥，例如肉瘤(sarcomas)、癌(carcinoma)或漿細(xì)胞瘤(漿細(xì)胞的惡性腫瘤)。

使用本發(fā)明公開主題的免疫應(yīng)答細(xì)胞可以抑制其生長(zhǎng)的癌癥包括通常對(duì)免疫治療有應(yīng)答的癌癥。治療的癌癥的非限定性例子包括多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血癥。在某些實(shí)施方式中，癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。

另外，本發(fā)明公開的主題提供響應(yīng)于受試者中的癌細(xì)胞而增加免疫激活細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。在一非限定性實(shí)例中，該方法包括將本發(fā)明公開的免疫應(yīng)答細(xì)胞給予受試者。免疫激活細(xì)胞因子可以是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tnf-α、il-2、il-3、il-6、il-11、il-7、il-12、il-15、il-21、干擾素調(diào)節(jié)因子7(irf7)及其組合。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明公開主題的包括bcma特異性car的免疫應(yīng)答細(xì)胞增加gm-csf、ifn-γ和/或tnf-α的產(chǎn)生。

進(jìn)行治療的合適的人受試者通常包括可以通過臨床標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分的兩個(gè)治療組。具有“重度疾病”或“高腫瘤負(fù)荷”的受試者是具有臨床可測(cè)量的腫瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤)的受試者。臨床可測(cè)量的腫瘤是可以基于腫瘤質(zhì)量而檢測(cè)(例如通過觸診、cat掃描、聲波圖、乳房x線照片或x射線；陽(yáng)性生化或組織病理學(xué)標(biāo)志物本身不足以識(shí)別該群體)的腫瘤。將本發(fā)明公開主題所包含的藥物組合物給予這些受試者，以引起抗腫瘤應(yīng)答，目的是減輕他們的病癥。理想地，結(jié)果是發(fā)生腫瘤質(zhì)量的減少，但是任何臨床改善均構(gòu)成益處。臨床改善包括降低風(fēng)險(xiǎn)或進(jìn)展速率或者減少腫瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤)的病理后果。

第二組合適的受試者在本領(lǐng)域中稱為“輔助組”。他們是具有瘤形成史(例如多發(fā)性骨髓瘤)、但已對(duì)另一治療方式有響應(yīng)的個(gè)體。先前的治療可以包括，但不限于，手術(shù)切除、放療和傳統(tǒng)化療。結(jié)果，這些個(gè)體沒有臨床可測(cè)量的腫瘤。然而，他們被懷疑在原始腫瘤位點(diǎn)附近或通過轉(zhuǎn)移而處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中。該組可以進(jìn)一步細(xì)分為高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體和低風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體。根據(jù)在初始治療之前或之后觀察到的特征進(jìn)行細(xì)分。這些特征在臨床領(lǐng)域是已知的，并且針對(duì)每種不同的瘤形成有適當(dāng)?shù)亩x。通常的高風(fēng)險(xiǎn)亞組典型的特征是腫瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤)已侵入鄰近組織或者顯示牽涉到淋巴結(jié)的那些。另一組具有瘤形成(例如多發(fā)性骨髓瘤)的遺傳易感性，但尚未證實(shí)瘤形成的臨床體征。例如，對(duì)于在乳腺癌相關(guān)的基因突變測(cè)試中呈陽(yáng)性、但仍處于育齡年紀(jì)的婦女，可以希望預(yù)防性地接受本文所述的一種或多種抗原結(jié)合片段以防止瘤形成的發(fā)生，直到適合于進(jìn)行預(yù)防性手術(shù)。

受試者可以具有進(jìn)展形式的疾病(例如多發(fā)性骨髓瘤)，在這種情況下，治療目標(biāo)可以包括緩解或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展和/或減輕副作用。受試者可以具有病史，例如他們已經(jīng)經(jīng)過治療，在這種情況下，治療目標(biāo)通常包括復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的降低或延遲。

可以對(duì)表達(dá)靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)引入進(jìn)一步修飾，以避免或最小化免疫并發(fā)癥(被稱為“惡性t細(xì)胞轉(zhuǎn)化”)例如移植物抗宿主病(gvhd)的風(fēng)險(xiǎn)，或者當(dāng)健康組織表達(dá)與腫瘤細(xì)胞相同的靶標(biāo)抗原時(shí)，導(dǎo)致與gvhd相似的結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。這個(gè)問題的潛在解決方案是將自殺基因改造到表達(dá)car的t細(xì)胞中。合適的自殺基因包括，但不限于，單純皰疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、誘導(dǎo)型半胱天冬酶9自殺基因(icasp-9)和截短的人表皮生長(zhǎng)因子受體(egfrt)多肽。在某些實(shí)施方案中，自殺基因是egfrt多肽。egfrt多肽可以通過施用抗egfr單克隆抗體(例如西妥昔單抗(cetuximab))來使t細(xì)胞清除。egfrt可以共價(jià)連接到靶向bcma的car的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的3’端。自殺基因可以包括在包括編碼本發(fā)明公開的靶向bcma的car的核酸的載體中。以這種方式，施用設(shè)計(jì)成在惡性t細(xì)胞轉(zhuǎn)化期間(例如gvhd)激活自殺基因的前藥(例如，可以激活icasp-9的ap1903)，引發(fā)自殺基因激活的表達(dá)car的t細(xì)胞的凋亡。ix.藥盒

本發(fā)明公開的主題提供用于治療或預(yù)防瘤形成(例如多發(fā)性骨髓瘤)的藥盒。在某些實(shí)施方式中，藥盒包括治療性或預(yù)防性組合物，該組合物包括有效量的單位劑量形式的包含靶向bcma的car的免疫應(yīng)答細(xì)胞。在具體實(shí)施方式中，細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)至少一種共刺激配體。在一些實(shí)施方式中，藥盒包括含有治療性或預(yù)防性疫苗的無菌容器；此類容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩或本領(lǐng)域已知的其它合適的容器形式。此類容器可以由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔或適合于容納藥物的其它材料制成。

如果需要，將免疫應(yīng)答細(xì)胞與用于將細(xì)胞施用至具有瘤形成(例如多發(fā)性骨髓瘤)或有其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的受試者的說明書一起提供。說明書通常包括關(guān)于組合物用于治療或預(yù)防瘤形成(例如多發(fā)性骨髓瘤)的使用的信息。在其它實(shí)施方式中，說明書包括以下中的至少一種：對(duì)治療劑的說明；用于治療或預(yù)防瘤形成(例如多發(fā)性骨髓瘤)或其癥狀的劑量方案和給藥方法；注意事項(xiàng)；警告；適應(yīng)癥；禁忌癥；過量信息；不良反應(yīng)；動(dòng)物藥理學(xué)；臨床研究；和/或參考文獻(xiàn)。說明書可以直接印在容器上(當(dāng)存在時(shí))，或作為標(biāo)簽貼到容器上，或作為單獨(dú)的紙張、小冊(cè)子、卡片或折疊式印刷品，在容器中或與容器一起提供。

實(shí)施例

除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其均在本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的范圍內(nèi)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分解釋，比如“molecularcloning:alaboratorymanual”，第二版(sambrook，1989)；“oligonucleotidesynthesis”(gait，1984)；“animalcellculture”(freshney，1987)；“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir，1996)；“genetransfervectorsformammaliancells”(miller和calos，1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology”(ausubel，1987)；“pcr:thepolymerasechainreaction”，(mullis，1994)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan，1991)。這些技術(shù)適用于生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸和多肽，因此可以在制備和實(shí)施本發(fā)明時(shí)考慮。在下面的部分中將討論用于具體實(shí)施方式的特別有用的技術(shù)。

給出以下實(shí)施例，以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何進(jìn)行和利用本發(fā)明的試驗(yàn)、篩選和治療方法的充分公開和說明，并且無意于限定發(fā)明人視作其發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1-不同組織中的bcma表達(dá)

通過考察數(shù)據(jù)庫(kù)例如癌細(xì)胞系百科全書和biogps中的基因表達(dá)圖譜，在各種惡性和正常組織中評(píng)價(jià)人bcma的表達(dá)。如圖2所示，人bcma在淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤中得到高度表達(dá)，但在其他惡性組織中沒有。正常表達(dá)似乎限于b-細(xì)胞和漿細(xì)胞?；诎l(fā)明人的靶向cd19的cart細(xì)胞的患者經(jīng)驗(yàn)，這些正常細(xì)胞類型潛在的靶向bcma的cart細(xì)胞根除可能沒有顯著的不良反應(yīng)。任何生理抗體產(chǎn)生的缺乏可以用靜脈內(nèi)免疫球蛋白治療來解決。

實(shí)施例2-bcma特異性28zcar的構(gòu)建

產(chǎn)生多種獨(dú)特的針對(duì)bcma的完整人scfv，并產(chǎn)生基于這些scfv的car。通過用bcma-fc融合蛋白然后是表達(dá)人bcma的3t3細(xì)胞篩選完整人scfv噬菌體文庫(kù)(>6x10¹⁰scfv)，識(shí)別出多種scfv。進(jìn)行測(cè)序之后，從79個(gè)測(cè)序的陽(yáng)性克隆中發(fā)現(xiàn)57個(gè)獨(dú)特的bcma-fc陽(yáng)性克?。华?dú)特克隆率為72％。針對(duì)bcma-3t3的噬菌體抗體克隆和親代3t3細(xì)胞系的facs分析導(dǎo)致確認(rèn)了25個(gè)獨(dú)特的陽(yáng)性克隆。

分別使用et140-153scfv(或“et140-3scfv”)、et140-174scfv(或“et140-24scfv”)、et140-187scfv(或“et140-37scfv”)、et140-190scfv(或“et140-40scfv”)和et140-204scfv(或“et140-54scfv”)產(chǎn)生靶向bcma的28zcar3、24、37、40和54。這些靶向bcma的28zcar具有類似的結(jié)構(gòu)，例如，各自均具有包括cd28多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括：cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信號(hào)區(qū)，如圖1所示。將各個(gè)這些靶向bcma的car克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。然后可以將這些病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到hek293galv9病毒包裝細(xì)胞中，以產(chǎn)生用于產(chǎn)生car⁺t細(xì)胞的穩(wěn)定的包裝系。

將人t細(xì)胞(來自健康供體的未選擇的(cd4和cd8)人t細(xì)胞)用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，以表達(dá)這些靶向bcma的car中的每一種，使得t細(xì)胞表達(dá)這些靶向bcma的28zcar。靶向bcma的car在人t細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)通過結(jié)合綴合a647的bcma-fc融合蛋白確定。評(píng)價(jià)靶向bcma的28zcar24的細(xì)胞表面表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞表面檢測(cè)，如圖3所示。

評(píng)價(jià)17種人scfv在人bcma和小鼠bcma之間的交叉反應(yīng)活性。如圖4所示，某些scfv例如et140-153scfv(或“et140-3scfv”)和et140-192scfv(或“et140-42scfv”)與小鼠bcma交叉反應(yīng)，因此，該scfv可以用于同系小鼠研究。

實(shí)施例3-bcma特異性car的活性

對(duì)本發(fā)明公開的bcma特異性28zcar的抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。體外數(shù)據(jù)顯示，bcma特異性car特異性地殺死呈遞bcma的細(xì)胞，包括mm細(xì)胞系。例如，如圖5所示，表達(dá)bcma特異性28zcar24的t細(xì)胞殺死過量表達(dá)bcma的3t3細(xì)胞(但不殺死過量表達(dá)無關(guān)抗原的對(duì)照3t3)。如圖6所示，表達(dá)bcma特異性28zcar24、40和54的t細(xì)胞殺死人mm細(xì)胞系。

實(shí)施例4-抗bcma抗體的篩選數(shù)據(jù)

elisa篩選：圖21顯示了使用特異性scfv噬菌體抗體克隆(et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54)針對(duì)bcma抗原進(jìn)行蛋白質(zhì)elisa篩選的代表性結(jié)果。將elisa板分別用人bcmaecd-fc融合蛋白、對(duì)照-fc融合蛋白或者作為空白對(duì)照的僅pbs涂覆。將來自針對(duì)bcmaecd-fc融合蛋白富集的噬菌體展示淘選池的各個(gè)噬菌體克隆在涂覆的板中孵育。通過綴合hrp的抗m13抗體檢測(cè)噬菌體克隆的結(jié)合，并使用tmb底物顯色。讀取在450nm的吸光度。

facs篩選：圖22顯示了bcma特異性噬菌體抗體克隆et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54的facs分析的代表性的圖。將噬菌體克隆與3t3-bcma細(xì)胞系一起孵育，然后與抗m13小鼠抗體一起孵育。最后，再次洗滌之后，將apc標(biāo)記的抗小鼠igg第二抗體加入到反應(yīng)中。利用facs測(cè)量結(jié)合，并表示為平均熒光強(qiáng)度(mfi)。將細(xì)胞與單獨(dú)的第二抗體、與m13k01輔助噬菌體一起孵育、以及僅細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

實(shí)施例5-bcma特異性bbzcar的構(gòu)建

產(chǎn)生多種獨(dú)特的針對(duì)bcma的完整人scfv，如實(shí)施例2所述。分別使用et140-153scfv(或“et140-3scfv”)、et140-174scfv(或“et140-24scfv”)、et140-187scfv(或“et140-37scfv”)、et140-190scfv(或“et140-40scfv”)和et140-204scfv(或“et140-54scfv”)產(chǎn)生靶向bcma的28zcar3、24、37、40和54。這些靶向bcma的bbzcar各自均具有包括cd8多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括：cd3ξ多肽和包括4-1bb多肽的共刺激信號(hào)區(qū)，如圖7所示。將各個(gè)這些靶向bcma的car克隆到sfg逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，作為例子，含有car載體的4-1bb如圖8-12所示。

實(shí)施例6-靶向bcma的cart細(xì)胞的活性

如圖13所示，與無關(guān)地靶向4h11-28zmuc16的靶向cart細(xì)胞相比較，bcma特異性28zcar24溶解人mm細(xì)胞系l363、ncl-h929和u266。所觀察的bcma特異性28zcar24表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性對(duì)bcma有特異性，因?yàn)樗⒉蝗芙鈈cma陰性、cd19陽(yáng)性的rajiburkett淋巴瘤細(xì)胞系，如圖13所示。

實(shí)施例7-通過靶向bcma的cart細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌

將靶向bcma的28zcar24t細(xì)胞特異性地與mm細(xì)胞系共培養(yǎng)，誘導(dǎo)與t細(xì)胞激活一致的細(xì)胞因子分泌圖譜。圖14顯示了將cart細(xì)胞與人腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)24h(e:t比1:1)之后的il-2分泌。具有靶向cd19的cart細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)的淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(cd19⁺)和具有靶向bcma的28zcar24t細(xì)胞的mm細(xì)胞系顯示細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。ifng、il-6、tnfa、scd40l、gm-csf均具有類似的分泌圖譜(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)施例8-靶向bcma的cart細(xì)胞的抗腫瘤活性

1x10⁷u266人骨髓瘤細(xì)胞系細(xì)胞在第0天將iv注射到nsg小鼠。在第4天將1x10⁶靶向bcma或靶向cd19的二代cart細(xì)胞注射iv。第11天的圖像(第7天s/pcart細(xì)胞注射)顯示與不相關(guān)的靶向(cd19)的cart細(xì)胞，靶向bcma28zcar54t細(xì)胞可以介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答。參見圖15。

實(shí)施例9-靶向bcma的cart細(xì)胞的活性

測(cè)試了靶向bcma的cart細(xì)胞的特異性溶解人骨髓瘤細(xì)胞系(hmcl)的能力。靶向cd19的cart細(xì)胞或靶向bcma的28zcar24t細(xì)胞與表達(dá)gfp的腫瘤細(xì)胞系set2(急性骨髓性白血病(aml),cd19^-bcma^-)；bcwm1(淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤(lpl),cd19^-bcma^-)；l363(多發(fā)性骨髓瘤(mm),cd19^-bcma⁺)一起孵育。在時(shí)間0，gfp⁺腫瘤系的百分比示于圖16a。在36小時(shí)陽(yáng)性對(duì)照靶向cd19的cart細(xì)胞已經(jīng)特異性地殺死了gfp⁺lpl系，并且類似地靶向bcma的28zcar24t細(xì)胞已經(jīng)特異性地殺死了gfp⁺mm系。參見圖16b。

實(shí)施例10-抗bcma抗體的表位定位

基于具有n-端生物素+sgsg接頭+具有1個(gè)氨基酸間隔的15個(gè)氨基酸的ecd序列對(duì)bcma多肽進(jìn)行排序。肽庫(kù)示于表24中。

表24

將肽在pbst(pbs+0.05％tween-20)中以2ug/ml涂覆在鏈霉親和素板上。洗滌并用3％bsa阻斷之后，進(jìn)行洗滌，然后分別向孔中加入1ug/mlet140-3、et140-24、et140-54或et901migg1。所有實(shí)施例中使用的“migg1”表示可變區(qū)是完整人序列且fc部分是小鼠igg1。然后將hrp抗小鼠igg檢測(cè)抗體加入到每個(gè)孔中。最后，使用tmb底物顯色。記錄a450用于數(shù)據(jù)分析。結(jié)果示于圖17-20。如圖17和圖20所示，et140-3與seqidno:71的多肽7-13(即，氨基酸8-22、9-23、10-24、11-25、12-26、13-27和14-28)結(jié)合。如圖18和圖19所示，對(duì)于et140-24或et140-54沒有發(fā)現(xiàn)線性表位。

總結(jié)：將3et140抗體(migg1)與同種型對(duì)照et901migg1一起測(cè)試其對(duì)于bcma-ecd的結(jié)合表型。使用由39種肽(n-端生物素+sgsg接頭+15個(gè)氨基酸，1個(gè)氨基酸偏移)組成的肽庫(kù)用于表位定位elisa。這使得可以搜索bcma-ecd的線性結(jié)合表位。使用et901migg1作為每個(gè)肽的背景參考。僅et140-3可以識(shí)別其表位區(qū)：包括seqidno:71的氨基酸14-22的區(qū)域，例如seqidno:71的氨基酸8-28。

et140-24和et140-54沒有顯示任何顯著的對(duì)于肽庫(kù)的結(jié)合。這表明這兩種抗體識(shí)別構(gòu)象表位，而不是bcma的線性表位。

實(shí)施例11-通過表面等離子體共振的抗bcma抗體重組抗原

et140-153migg1(或“et140-3migg1”)、et140-174migg1(或“et140-24migg1”)、et140-204migg1(或“et140-54migg1”)和bcma重組抗原之間相互作用的動(dòng)力學(xué)使用biacorex100儀器測(cè)量。簡(jiǎn)言之，通過使biotincapture試劑以2μl/min流過流動(dòng)池5分鐘，將50μg/ml修飾的鏈霉親和素固定在傳感芯片chipcap上。將10ug/ml生物素酰化bcma-fc蛋白質(zhì)以30μl/min的速率上樣到流動(dòng)池上3分鐘。按照動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方案，進(jìn)行0.6至15μg/ml的esk1系列注射，每一步由以30μl/min注射3分鐘和解離3分鐘組成。之后，將表面用由75％v/v8m胍-hcl和25％v/v1mnaoh組成的溶液再生2分鐘。使用biacorex100評(píng)價(jià)軟件(2.0.1版)通過全局?jǐn)M合(1:1langmuir結(jié)合模型)得出動(dòng)力學(xué)常數(shù)。結(jié)合親和力數(shù)據(jù)示于表25。

表25

盡管前述本發(fā)明公開的主題已經(jīng)出于清楚理解的目的通過說明和實(shí)施例進(jìn)行了相當(dāng)程度的說明，說明書和實(shí)施例均不應(yīng)當(dāng)理解成對(duì)本發(fā)明公開的主題進(jìn)行限定。在此將本文引用的所有專利和科學(xué)文獻(xiàn)的公開內(nèi)容明確地全文并入作為參考。

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從前面的描述中，顯然可以對(duì)本文所述的本發(fā)明進(jìn)行變化和修改，以使它適用于各種用途和條件。這些實(shí)施方式也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

本說明書中提到的所有專利和出版物以及通過登錄號(hào)或參考號(hào)提到的序列均并入本文以供參考，其程度如同每個(gè)獨(dú)立的專利和出版物以及序列被具體地單獨(dú)指明并入本文以供參考。