本發(fā)明涉及腎發(fā)育。更具體地說，本發(fā)明涉及產(chǎn)生類腎體的體外方法，其包括腎單位和/或輸尿管芽和/或這些的祖細(xì)胞，其至少部分血管化并含有腎間質(zhì)區(qū)室。

背景技術(shù)：

在終末期腎病的流行率全球每年上升8％的情況下，迫切需要腎再生策略。腎臟是通過輸尿管芽(uretericbud,ub)的形成以及該芽與相鄰中段中胚層(intermediatemesoderm,im)來源的后腎間充質(zhì)(metanephricmesenchyme,mm)之間的相互作用而從im分化的中胚層器官。腎單位來自源于mm的腎單位祖細(xì)胞群。im或mm中的其他祖細(xì)胞被認(rèn)為有助于腎基質(zhì)/間質(zhì)和包括腎小球毛細(xì)血管在內(nèi)的腎血管系統(tǒng)的組分。im本身源于后原條(posteriorprimitivestreak)。盡管非常了解腎臟的發(fā)育起源，人腎中的腎單位形成在出生前已經(jīng)完成⁵。因此，沒有能夠替代丟失的腎單位的出生后的干細(xì)胞。

人多能干細(xì)胞對(duì)于產(chǎn)生用于腎病的基于細(xì)胞的治療具有巨大的潛力。然而，人多能干細(xì)胞作為臨床使用的細(xì)胞來源以及作為諸如腎病等的治療的實(shí)現(xiàn)已經(jīng)因缺乏對(duì)如何制備產(chǎn)生腎單位和腎的其它結(jié)構(gòu)所必需的細(xì)胞類型的理解而受到阻礙。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人使用正常胚胎發(fā)生期間使用的生長(zhǎng)因子，在完全化學(xué)限定的單層培養(yǎng)條件下成功地引導(dǎo)人多能干細(xì)胞通過后原條和中段中胚層(im)的分化。該分化方案導(dǎo)致輸尿管芽(ub)和后腎間充質(zhì)(mm)的同步誘導(dǎo)，所述同步誘導(dǎo)在體外形成自組織結(jié)構(gòu)，包括腎單位形成和分段，以形成遠(yuǎn)端小管、近端小管和鮑曼氏囊。類器官還含有間充質(zhì)源性腎基質(zhì)。這種hesc來源的組分顯示出廣泛的離體腎潛能，說明了基于多能干細(xì)胞的腎再生的潛力。此外，本發(fā)明人已經(jīng)引導(dǎo)類腎體內(nèi)的血管系統(tǒng)分化，包括分化的輸尿管芽(ub)、后腎間充質(zhì)(mm)和mm來源的腎單位和基質(zhì)。在特定形式中，本發(fā)明提供在縮短的培養(yǎng)期內(nèi)形成類腎體的聚集的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的生成。更具體地，本發(fā)明提供一種用于引導(dǎo)人多能干細(xì)胞形成復(fù)合多細(xì)胞類腎體的方法，所述復(fù)合多細(xì)胞類腎體包含由內(nèi)皮和腎間質(zhì)包圍的完全分段的腎單位，并且與人胎腎轉(zhuǎn)錄相似。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種生產(chǎn)腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的方法，所述方法包括使中段中胚層(im)細(xì)胞與以下接觸的步驟：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fgf20)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)；和任選選自由：骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bmp7)；肝素；wnt激動(dòng)劑；視黃酸(ra)，類似物或激動(dòng)劑；和ra拮抗劑組成的組的一種或多種劑；從而在誘導(dǎo)或促進(jìn)腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞聚集成一個(gè)或多個(gè)類腎體的條件下由im細(xì)胞產(chǎn)生腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞，由此類腎體至少部分血管化和/或包含血管祖細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，通過促進(jìn)或引導(dǎo)來自間充質(zhì)細(xì)胞或組織的血管內(nèi)皮或血管祖細(xì)胞的發(fā)育的條件來促進(jìn)至少部分血管化和/或血管祖細(xì)胞的存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包含一種或多種人多能干細(xì)胞和/或由其分化的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞來促進(jìn)類腎體的血管形成。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用促進(jìn)血管形成的合適的氧分壓(oxygentension)來促進(jìn)類腎體細(xì)胞的血管化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，im細(xì)胞衍生自或分化自后原條細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，后原條細(xì)胞衍生自或分化自人多能干細(xì)胞(hpsc)。hpsc的非限制性實(shí)例包括人胚胎干細(xì)胞(hesc)和誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞(ipsc)。

本發(fā)明的相關(guān)方面提供一種產(chǎn)生中胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：使hpsc與wnt激動(dòng)劑接觸，從而產(chǎn)生中胚層細(xì)胞。中胚層細(xì)胞可以是中胚層細(xì)胞例如定形中胚層(definitivemesoderm)和包括喙部im和/或尾部im的中段中胚層(im)的混合群體。

該方法可以進(jìn)一步包括使定形中胚層細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fgf20)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)接觸的后續(xù)步驟。

適當(dāng)?shù)?，使定形中胚層?xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fgf20)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)接觸的后續(xù)步驟有助于形成中段中胚層(im)，其隨后產(chǎn)生來自im細(xì)胞的輸尿管上皮細(xì)胞和腎單位祖細(xì)胞的分化。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括將細(xì)胞解離并再聚集成細(xì)胞團(tuán)用于在fgf2、fgf9和/或fgf20的存在下培養(yǎng)的后續(xù)步驟。適當(dāng)?shù)?，該步驟有利于生產(chǎn)包含腎單位的類腎體。在fgf2、fgf9和/或fgf20的存在下的培養(yǎng)可以在空氣/培養(yǎng)基界面處的浮動(dòng)過濾器上進(jìn)行。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括在除去fgf2、fgf9和/或fgf20之前添加wnt激動(dòng)劑，并且隨后在沒有生長(zhǎng)因子的情況下培養(yǎng)。該步驟進(jìn)一步促進(jìn)類腎體內(nèi)腎單位的形成。適當(dāng)?shù)兀谙鄬?duì)短的時(shí)間內(nèi)(如30-60分鐘)wnt激動(dòng)劑處在相對(duì)較高的濃度下。

任選地，在任何上述步驟中在wnt激動(dòng)劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fgf20)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞還可以包括以下的一種或多種：視黃酸(ra)拮抗劑，ra或ra激動(dòng)劑，骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bmp7)；和/或視黃酸。

優(yōu)選地，類腎體至少部分血管化。

優(yōu)選地，類腎體包括由內(nèi)皮、血管周圍細(xì)胞和腎間質(zhì)包圍的分段的腎單位。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包含一種或多種人多能干細(xì)胞和/或由其分化的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞來促進(jìn)類腎體的血管化。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用促進(jìn)血管化的合適的氧分壓來促進(jìn)類腎體的血管化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括鑒定活的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞的步驟。

在某些實(shí)施方案中，活的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞的鑒定包括作為活的腎單位和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物的多種核酸和/或蛋白質(zhì)的共表達(dá)的測(cè)定或檢測(cè)。

另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)前述方面的方法產(chǎn)生的分離的、富集的或純化的腎單位和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞和/或類腎體。

優(yōu)選地，類腎體包括由內(nèi)皮和腎間質(zhì)包圍的分段的腎單位。

還在另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生腎或者腎細(xì)胞或組織的方法，所述方法包括由前述方面的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞和/或類腎體分化腎或者腎細(xì)胞或組織的步驟，由此產(chǎn)生腎或者腎細(xì)胞或組織。

在一些實(shí)施方案中，腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞和/或類腎體可用于全器官脫細(xì)胞腎的再細(xì)胞化，從而產(chǎn)生重構(gòu)或替代的腎。

在其他實(shí)施方案中，腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞和/或類腎體可用作腎臟疾病和病況的細(xì)胞療法的來源。

在某些方面，腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞和/或類腎體可用作用于生物打印或生物工程全腎的細(xì)胞或組織的來源、用于腎移植或治療慢性腎損害或疾病的腎細(xì)胞和/或組織的來源。

一個(gè)特定方面提供一種生物打印腎結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括沉積本文公開的多個(gè)hpsc或其它祖細(xì)胞以形成腎結(jié)構(gòu)，所述腎結(jié)構(gòu)具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或者其能夠顯現(xiàn)腎或其組分的一種或多種功能特征。

適當(dāng)?shù)兀瞿I結(jié)構(gòu)至少部分血管化和/或包含血管祖細(xì)胞。

適當(dāng)?shù)?，hpsc或其它祖細(xì)胞經(jīng)受本文公開的方法用于產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)中的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。

該特定方面還提供生物打印的腎結(jié)構(gòu)，其具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或能夠顯現(xiàn)腎或其組分的一種或多種功能特征，通過前述方法產(chǎn)生。

另一個(gè)具體方面提供一種生物打印腎結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括沉積本文公開的多個(gè)腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞以形成腎結(jié)構(gòu)，所述腎結(jié)構(gòu)具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或能夠顯現(xiàn)腎或其組分的一種或多種功能特征。

適當(dāng)?shù)?，生物打印的腎結(jié)構(gòu)至少部分血管化和/或包含血管祖細(xì)胞。

適當(dāng)?shù)?，腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞已經(jīng)通過本文公開的方法由hpsc產(chǎn)生。

該特定方面還提供生物打印的腎結(jié)構(gòu)，其具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或能夠顯現(xiàn)腎或其成分的一種或多種功能特征，由上述方法產(chǎn)生。

本發(fā)明的另一方面提供具有平面幾何形狀的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管祖細(xì)胞的陣列。

所述陣列可以包括2-15個(gè)或更多個(gè)堆疊陣列。

所述陣列可以以棋盤格狀圖案堆疊。

本發(fā)明的相關(guān)方面提供通過使前述方面的陣列或其中的細(xì)胞成熟或分化而獲得的類腎體。

適當(dāng)?shù)?，類腎體至少部分血管化和/或包含血管祖細(xì)胞。

另一方面，本發(fā)明提供一種確定一種或多種化合物的腎毒性的方法，所述方法包括使所述一種或多種化合物與前述方面的分離或純化的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞、生物打印的腎結(jié)構(gòu)、陣列和/或類腎體、或由其分化或以其他方式獲得的腎細(xì)胞或組織接觸的步驟，從而確定所述一種或多種化合物是否是腎毒性的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方面提供腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞向用于腎毒性篩選的類腎體的生物打印。

附圖說明

圖1.用chir培養(yǎng)3、4或5天，然后單獨(dú)使用fgf9(b)或使用fgf9(b)與ra(a)或ra拮抗劑(c)一起培養(yǎng)的分化效果。

圖2.存在于形成腎單位之間的meis1⁺基質(zhì)群體的存在。紅色＝meis1；藍(lán)色＝核。

圖3.cd31⁺血管祖細(xì)胞的存在。紅＝nphs1(足細(xì)胞)，藍(lán)＝核，綠＝cd31。

圖4.相互連接的正常發(fā)育中的腎單位的所有區(qū)段包括收集管(gata3⁺pax2⁺ecad⁺)，遠(yuǎn)端小管(ecad⁺gata3^-ltl^-)，近端小管(ltl⁺aqp1⁺)和腎小球(wt1⁺nphs1⁺synpo⁺)的存在，提示正常的胚胎器官發(fā)生。粉色＝gata3，綠色＝ecad，藍(lán)色＝ltl，紅色＝wt1，收集管(粉色和綠色)，遠(yuǎn)端小管(綠色)，近端小管(藍(lán)色)，腎小球(紅色在核中)。

圖5.細(xì)胞成團(tuán)后11天培養(yǎng)的類腎體。a＝直徑3至5cm的亮視野圖像。b＝免疫熒光染色的圖像。綠色＝ecad，紅色＝nphs1，藍(lán)色＝ltl，遠(yuǎn)端小管(綠色)，近端小管(藍(lán)色)，腎小球(紅色)。

圖6.再聚集后立即加入高chir(5μm)的45分鐘脈沖，然后在含有或不含agn(視黃酸抑制劑)、bmp7、低chir或ra的fgf9中培養(yǎng)5天，然后沒有這些因子培養(yǎng)6天。a＝?jīng)]有chir的4天細(xì)胞團(tuán)；b＝45分鐘chir脈沖的4天細(xì)胞團(tuán)；c＝?jīng)]有chir的11天細(xì)胞團(tuán)；d＝45分鐘chir脈沖的11天細(xì)胞團(tuán)。

圖7.收集管或腎間充質(zhì)譜系的選擇性誘導(dǎo)。a，示意性說明胚胎發(fā)生中im的a-p模式化(patterning)機(jī)制¹³。psm細(xì)胞遷移的時(shí)間設(shè)置決定了暴露于fgf9和ra的時(shí)間設(shè)置，導(dǎo)致ai和pi之間的命運(yùn)選擇。psm，前體節(jié)中胚層；ai，前中段中胚層；pi，后中段中胚層；ue，輸尿管上皮；mm，后腎間充質(zhì)。b，三個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間線的示意圖。c，上述時(shí)間設(shè)置的分化的初始7天的時(shí)程qpcr。使用單層培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(平均±s.d.，n＝3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn))d，用ai標(biāo)志物gata3和pi標(biāo)志物hoxd11分化的第7天的免疫熒光。比例尺＝100μm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)＝3e，示意性說明后原條階段的ra信號(hào)傳導(dǎo)。ra代謝酶cyp26在psm區(qū)域表達(dá)以屏蔽psm細(xì)胞免受ra信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。f，三個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間線的示意圖。ra或agn193109(agn)在chir99021后加入fgf9，隨后將生長(zhǎng)因子撤出(無gf)。用單層培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。g，在3天chir99021后接著±ra/agn的分化第18天的免疫熒光。agn抑制早期遷移細(xì)胞的ai規(guī)格，導(dǎo)致后部化。在第18天，gata3和hoxd11分別標(biāo)志ue和mm(左圖)。gata3⁺pax2⁺ecad⁺細(xì)胞代表ue，而gata3^-pax2⁺細(xì)胞表示mm(ecad^-)及其衍生物(ecad⁺)(右圖)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)＝3。比例尺＝100μm。

圖8.體外產(chǎn)生相當(dāng)于人胎兒腎的類腎體。a，hpsc分化方案的示意圖。b，跨時(shí)間序列的自組織類腎體的全局亮視野觀察。類器官分化成功率為94.2％(138個(gè)類器官，5次實(shí)驗(yàn))。比例尺＝1mm。c，平掃掃描全類腎體的免疫熒光顯示結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。比例尺＝1mmd，大功率免疫熒光顯微鏡顯示腎單位分為4個(gè)區(qū)室，包括收集管(cd，gata3⁺ecad⁺)，遠(yuǎn)端小管(dt，gata3^-ecad⁺ltl^-)，近端小管(pt，ecad^-ltl⁺)和腎小球(g，wt1⁺)。比例尺＝100μm。e，共聚焦顯微鏡從第11天類腎體的底部到頂部產(chǎn)生串聯(lián)z-堆疊圖像(擴(kuò)展數(shù)據(jù)視頻1和2)。示意圖說明了類器官內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的位置。e'、e”和e”'是在e中指示的位置通過類器官拍攝的代表性圖像。如下所述，腎單位的每個(gè)區(qū)段都被標(biāo)志(或在示意圖中著色)：收集管，gata3⁺ecad⁺(在黃色中的綠點(diǎn))；遠(yuǎn)端小管，ecad⁺(黃色)；近端小管，ltl⁺(紅色)；腎小球nphs1(綠色圓圈)。比例尺＝100μm。f，類腎體與13個(gè)人胎兒組織的相對(duì)轉(zhuǎn)錄同一性的可視化熱圖(得分從0到1，使用keygene算法¹⁵確定)。對(duì)來自4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(聚集后第0、3、11、18天)的全類腎體x來自1個(gè)實(shí)驗(yàn)/時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)個(gè)體類器官進(jìn)行rna-seq(參見補(bǔ)充表2)。g，基于先前定義的85個(gè)關(guān)鍵基因(補(bǔ)充表3)，顯示了來自第一妊娠期和第二妊娠期的人胎兒器官與第0、3、11和18天類腎體的分層聚類的樹形圖¹⁵。這清楚地顯示了從第11天和第18天培養(yǎng)的第1妊娠期胎兒腎臟的緊密匹配。

圖9.類腎體含有分化的腎單位、基質(zhì)和血管系統(tǒng)，隨著時(shí)間的推移逐漸成熟。

a，示意圖說明了從im到腎的每種細(xì)胞組分的發(fā)育途徑。cd，收集管；dt，遠(yuǎn)端小管；loh，henle環(huán)；pt，近端小管；pod，足細(xì)胞；vasc，血管系統(tǒng)；strom，腎間質(zhì)。b-j，第11天或第18天類腎體的免疫熒光。b，由pax2、gata3和ecad標(biāo)志的收集管。比例尺＝50μm。c，d，第11天ltl⁺ecad^-的早期近端小管(空白箭頭)。ltl⁺ecad⁺成熟的近端小管出現(xiàn)在第18天(白色箭頭)。比例尺＝100μm。e，近端小管表達(dá)cubilin(cubn)。比例尺＝50μm。f，由umod和ecad標(biāo)志的henle環(huán)。比例尺＝50μm。g，具有由wt1和nphs1標(biāo)志的足細(xì)胞的發(fā)育中的腎小球。比例尺＝50μm。h，腎間質(zhì)內(nèi)的cd31⁺內(nèi)皮細(xì)胞。比例尺＝200μm。i，培養(yǎng)第18天內(nèi)皮侵入腎小球的證據(jù)。比例尺＝50μm。j，meis1標(biāo)志的腎間質(zhì)。比例尺＝100μm。k-m，類腎體的透射電子顯微鏡。k，具有相對(duì)稀疏的短微絨毛(m)和緊密連接(tj)的推定的遠(yuǎn)端小管。l，推定的近端小管，內(nèi)腔填充有廣泛密集的、刷狀緣(bb)特有的微絨毛。m，具有特征性大核和初級(jí)足突(pf)和次級(jí)足突(sf)的足細(xì)胞(p)。數(shù)據(jù)代表了至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖10.近端小管的功能成熟。

a，顯示ltl⁺小管的內(nèi)吞能力的葡聚糖攝取測(cè)定。比例尺＝50μm。b，用20μm順鉑處理類腎體，導(dǎo)致ltl⁺ecad⁺近端腎小管細(xì)胞凋亡。通過切割的半胱天冬酶3抗體染色(casp3)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。比例尺＝100μm。c，通過腎毒性劑順鉑定量顯示成熟的近端小管特異性細(xì)胞凋亡的凋亡小管數(shù)。響應(yīng)于5um和20um順鉑，ltl⁺ecad⁺成熟近端小管(pt)劑量依賴地進(jìn)行凋亡。相比之下，ltl⁺ecad^-未成熟pt對(duì)順鉑沒有反應(yīng)。通過獨(dú)立t檢驗(yàn)(平均值±s.e.，n＝5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn))計(jì)算p值。

圖11.類腎體中腎發(fā)生的調(diào)節(jié)。a，在聚集后立即用5μm的chir99021刺激類器官1h促進(jìn)腎發(fā)生(chir脈沖)，而沒有chir99021(無脈沖)下只有有限數(shù)量的腎發(fā)生事件發(fā)生。比例尺＝1mm。b，在該chir99021脈沖之后，不加入fgf9的情況下，類器官未引發(fā)腎發(fā)生(-fgf9)。比例尺＝200μm。

圖12.類腎體發(fā)育過程中基因表達(dá)的變化。a-c，顯示了類腎體培養(yǎng)物的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第0、3、11和18天)所選標(biāo)志基因的表達(dá)變化的圖。x軸表示rna測(cè)序分析中每個(gè)基因的檢測(cè)計(jì)數(shù)。腎單位祖細(xì)胞(cap間充質(zhì))和收集管祖細(xì)胞(輸尿管尖端)的標(biāo)志物在第3天達(dá)到頂峰，然后下降(a)。早期腎單位的標(biāo)志物在第3天增加，而成熟的腎單位組分(近端和遠(yuǎn)端小管和足細(xì)胞)的標(biāo)志物在第3天后開始。圖解顯示發(fā)育中的腎中每個(gè)選定基因的表達(dá)區(qū)域(藍(lán)色)(b)。

圖13.顯示d0、d3、d11、d18分化實(shí)驗(yàn)和來自第一和第二妊娠期的21個(gè)人胎兒器官(gse66302)的分層聚類的樹形圖¹⁵。樣品名稱由個(gè)體id后接器官名稱和孕周組成。例如，“dj1腎_9”代表來自個(gè)體id：dj1的第9周妊娠的腎臟。d0和d3類腎體帶有性腺，與中段中胚層的性腺和腎臟的共同起源一致。d11和d18類腎體顯示出與妊娠1期人腎最強(qiáng)的相似性。用于該分析的分類基因詳見表3。

圖14.類腎體中非上皮結(jié)構(gòu)的表征。所有圖像均取自第18天類腎體a，附著于kdr⁺血管的pdgfra⁺周細(xì)胞。比例尺＝50μm。b，一些腎小球含有可能代表早期腎小球系膜細(xì)胞的pdgfra⁺細(xì)胞¹⁹。比例尺＝50μm。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明至少部分地基于鑒定特定的體外培養(yǎng)條件，所述條件定制為促進(jìn)腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞從中段中胚層(im)的同步、同時(shí)分化以產(chǎn)生至少部分血管化的類腎體或其它腎細(xì)胞或組織聚集體。更具體地，fgf9加肝素單獨(dú)地、或者與包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bmp7)、視黃酸(ra)、ra拮抗劑；wnt激動(dòng)劑和/或fgf20加肝素；和/或fgf2加肝素的一種或多種試劑組合，能夠促進(jìn)中段中胚層分化為腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。此外，體外培養(yǎng)方法提供一種體系，其用于通過后原條、im和后腎間充質(zhì)階段分化人胚胎干細(xì)胞以產(chǎn)生腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。有利地，可以操縱某些分子如ra、ra拮抗劑和/或wnt激動(dòng)劑的存在或不存在以優(yōu)先促進(jìn)腎單位祖細(xì)胞與輸尿管上皮祖細(xì)胞的產(chǎn)生，反之亦然。更具體地，本發(fā)明還基于以下發(fā)現(xiàn)：人多能干細(xì)胞可以引導(dǎo)形成復(fù)合多細(xì)胞類腎體，所述復(fù)合多細(xì)胞類腎體包含由內(nèi)皮和腎間質(zhì)包圍的完全分段的腎單位并且與人胎腎轉(zhuǎn)錄相似?？梢酝ㄟ^促進(jìn)或引導(dǎo)血管內(nèi)皮從間充質(zhì)細(xì)胞或組織發(fā)育的條件來促進(jìn)血管形成。

腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞同時(shí)誘導(dǎo)，引導(dǎo)彼此在體內(nèi)分化，并且能夠發(fā)育成包括輸尿管樹和腎單位祖細(xì)胞間充質(zhì)在內(nèi)的不同管狀上皮結(jié)構(gòu)，期間上皮結(jié)構(gòu)代替輸尿管尖端以維持腎單位祖細(xì)胞。因此提出了根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的hesc來源的輸尿管上皮和/或腎單位祖細(xì)胞可以引導(dǎo)從輸尿管和間充質(zhì)區(qū)室二者分化成腎細(xì)胞。此外，可以進(jìn)而利用這些細(xì)胞“自組織”成為聚集的類器官結(jié)構(gòu)的能力來促進(jìn)腎臟修復(fù)，例如借助于腎臟生物工程。如上所述腎單位祖細(xì)胞、由其衍生的腎單位或“自組織”的類腎體也可適用于受到以前無法生產(chǎn)適合于試驗(yàn)的細(xì)胞阻礙的腎毒性試驗(yàn)。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述類似或等同的任何方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)施或試驗(yàn)中，但是描述了優(yōu)選的方法和材料。

如本文所使用的，除上下文另有要求外，術(shù)語“包括(comprise)”和該術(shù)語的變體如“comprising”、“comprises”和“comprised”，不意圖排除進(jìn)一步的添加劑、組分、整數(shù)或步驟。

將理解的是，不定冠詞“a”和“an”不能被視為單數(shù)的不定冠詞，或者不包括不止一個(gè)或多于一個(gè)不定冠詞所指的單個(gè)對(duì)象。例如，“一個(gè)”細(xì)胞包括一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞和多個(gè)細(xì)胞。

為了本發(fā)明的目的，“分離的”意指已經(jīng)從其天然狀態(tài)除去或以其他方式進(jìn)行人為操作的材料。分離的材料(例如，細(xì)胞)可以實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其天然狀態(tài)下通常伴隨的組分，或者可以操作成與在其天然狀態(tài)下通常伴隨的組分一起處于人造狀態(tài)。

“富集的”或“純化的”意指在特定狀態(tài)(例如富集或純化狀態(tài))下與富集或純化之前的先前狀態(tài)相比具有更高的發(fā)生率、表現(xiàn)或頻率。

術(shù)語“分化”(“differentiate”,“differentiating”和“differentiated”)涉及細(xì)胞從發(fā)育途徑的較早或初始階段到發(fā)育途徑的較晚或更成熟階段的進(jìn)展。將理解的是，在這種情況下，“分化(differentiated)”并不意味著或暗示細(xì)胞是完全分化的，并且已經(jīng)喪失沿著該發(fā)育途徑或沿著其它發(fā)育途徑進(jìn)一步進(jìn)展的多能性或能力。分化可伴隨細(xì)胞分裂。

“祖細(xì)胞”是能夠沿著一個(gè)或多個(gè)發(fā)育途徑分化，具有或不具有自我更新的細(xì)胞。通常，祖細(xì)胞是單能或寡能的并且能夠至少有限的自我更新。

如在本領(lǐng)域中將會(huì)很好理解的，細(xì)胞分化的階段或狀態(tài)可通過表達(dá)和/或不表達(dá)一種或多種標(biāo)志物表征。在此情況下，“標(biāo)志物”是指由細(xì)胞、細(xì)胞群、譜系、區(qū)室或子集的基因組編碼的核酸或蛋白質(zhì)，其表達(dá)或表達(dá)模式在整個(gè)發(fā)育過程中變化。核酸標(biāo)志物表達(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來檢測(cè)或測(cè)定，包括核酸序列擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和核酸雜交(例如微陣列、northern雜交、原位雜交)，但不限于此。蛋白質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)或測(cè)定，包括流式細(xì)胞術(shù)，免疫組織化學(xué)，免疫印跡，蛋白質(zhì)陣列，蛋白質(zhì)分析(例如2d凝膠電泳)，但不限于此。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供生產(chǎn)腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的方法，所述方法包括使中段中胚層(im)細(xì)胞與：bmp7；視黃酸(ra)；ra拮抗劑；wnt激動(dòng)劑；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或fgf20；和肝素接觸的步驟；從而由im細(xì)胞產(chǎn)生腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。

本文涉及的“視黃酸”或“ra”包括與ra具有相似生物學(xué)活性的所有形式的視黃酸(例如包括所有反式ra和9-順式ra)、類似物和/或視黃酸受體(rar)激動(dòng)劑。各種不同的ra類似物和rar激動(dòng)劑(包括對(duì)rarα、β或γ非選擇性和選擇性的激動(dòng)劑)是可從例如r&dsystems和tocrisbioscience商購(gòu)的。

具體涉及的“ra拮抗劑”包括視黃酸受體(rar)拮抗劑和通過rar抑制、阻斷或阻止ra信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何其它分子。rar拮抗劑的非限制性實(shí)例包括agn193109、le135、er50891、bms493、bms453和mm11253，但不限于此。該定義不排除ra拮抗劑也或可選地模擬由另一種配體的結(jié)合經(jīng)由rar的信號(hào)傳導(dǎo)阻斷的可能性。

如本文所用，“wnt激動(dòng)劑”是在典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的背景下、但優(yōu)選不在其他非典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的背景下抑制gsk3(例如gsk3-β)的分子。wnt激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例包括可從諸如santacruzbiotechnology和r&dsystems等商購(gòu)的chir99021、liclsb-216763、cas853220-52-7和其它wnt激動(dòng)劑。不應(yīng)將此定義視為絕對(duì)排除wnt激動(dòng)劑模擬一種或多種其他gsk3β活性抑制劑的可能性。

還將理解的是，盡管fgf9是優(yōu)選的，但成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如fgf2、fgf9和fgf20可以是可互換的。通常包括肝素以促進(jìn)或增強(qiáng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如fgf2、fgf9和/或fgf20的生物學(xué)活性。

下文將更詳細(xì)地描述fgf9、bmp7、視黃酸(ra)；ra拮抗劑；wnt激動(dòng)劑；fgf20和肝素各自優(yōu)選的濃度。還將提及控制或操縱某些分子如ra激動(dòng)劑或類似物、ra拮抗劑和/或wnt激動(dòng)劑的存在或不存在以優(yōu)先促進(jìn)腎單位祖細(xì)胞與輸尿管上皮祖細(xì)胞的產(chǎn)生，反之亦然。

如本文所用，“腎單位祖細(xì)胞”是衍生自后腎間充質(zhì)的祖細(xì)胞，其可以通過初始間充質(zhì)向上皮過渡來分化成所有腎單位節(jié)段(除收集管外)，其包括腎單位上皮細(xì)胞如連接段、遠(yuǎn)端小管曲部(dct)細(xì)胞、遠(yuǎn)端小管直部(dst)細(xì)胞、近端小管直部(pst)段1和2、pst細(xì)胞、足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、henle上升環(huán)和/或henle下降環(huán)，但不限于此。腎單位祖細(xì)胞也能夠自我更新。

后腎間充質(zhì)特有的或代表后腎間充質(zhì)的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括wt1，six1，six2，sall1，gdnf和/或hoxd11，但不限于此。腎單位祖細(xì)胞特有的或代表腎單位祖細(xì)胞的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括wt1，six1，six2，cited1，pax2，gdnf，sall1，osr1和hoxd11，但不限于此。

“輸尿管上皮祖細(xì)胞”意指衍生自、可得自或源自可以發(fā)育成腎組織和/或結(jié)構(gòu)如收集管的中腎管或其衍生物輸尿管芽的上皮祖細(xì)胞。

輸尿管上皮祖細(xì)胞特有的或代表輸尿管上皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括hoxb7，cret，gata3，calb1，e-cadherin和pax2，但不限于此。

如上所述，腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞在fgf9單獨(dú)或與包含bmp7、視黃酸(ra)、激動(dòng)劑或類似物、ra拮抗劑如agn193109和/或fgf20的一種或多種試劑、優(yōu)選肝素組合的存在下從中段中胚層(im)分化。

“中段中胚層(im)”細(xì)胞意指從定形中胚層產(chǎn)生的胚胎中胚層細(xì)胞，而定形中胚層來源于后原條并可最終發(fā)育成泌尿生殖系統(tǒng)，包括輸尿管和腎臟以及其他組織如性腺。中段中胚層特有的或代表中段中胚層的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括pax2，osr1和/或lhx1。

還將理解，im細(xì)胞的產(chǎn)生并不意味著im細(xì)胞是不存在其它細(xì)胞類型(例如定形中胚層)的純的或同質(zhì)的im細(xì)胞群。因此，提及“im細(xì)胞”或“im細(xì)胞群”是指包含im細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞群。

適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明，如下文將更詳細(xì)描述的，通過使后原條細(xì)胞與促進(jìn)將后原條細(xì)胞分化為im細(xì)胞的一種或多種試劑接觸來產(chǎn)生im細(xì)胞。

優(yōu)選地，im細(xì)胞通過使后原條細(xì)胞與促進(jìn)將后原條細(xì)胞分化成im細(xì)胞的一種或多種試劑接觸來產(chǎn)生。

通常，所述一種或多種試劑包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和任選的ra拮抗劑如agn193109和/或一種或多種其它fgf如fgf2和/或fgf20。

“后原條(posteriorprimitivestreak,pps)”細(xì)胞意指可從在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的早期階段在囊胚中形成的原條結(jié)構(gòu)的后端的細(xì)胞獲得的細(xì)胞、或者與所述細(xì)胞功能上和/或表型上對(duì)應(yīng)的細(xì)胞。后原條建立雙側(cè)對(duì)稱性，確定原腸胚形成的位置并啟動(dòng)胚層形成。通常，后原條是中胚層的祖細(xì)胞(即推定的中胚層)，前原條是內(nèi)胚層的祖細(xì)胞(即推定的內(nèi)胚層)。后原條特有的或代表后原條的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括brachyury(t)。前原條特有的或代表前原條的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例是sox17。mixl1可以由后原條和前原條表達(dá)。

還將理解，后原條細(xì)胞的產(chǎn)生并不意味著后原條細(xì)胞是沒有其它細(xì)胞類型存在的純的或同質(zhì)的后原條細(xì)胞群。因此，提及“后原條細(xì)胞”或“后原條細(xì)胞群”意指包含后原條細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞群。

適當(dāng)?shù)兀鶕?jù)本發(fā)明，如下文將更詳細(xì)描述的，后原條細(xì)胞通過使hpsc細(xì)胞與促進(jìn)hpsc細(xì)胞分化成后原條細(xì)胞的一種或多種試劑接觸來產(chǎn)生。

通常，所述一種或多種試劑包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)、活化素a和/或wnt激動(dòng)劑如chir99021。

術(shù)語“人多能干細(xì)胞”和“hpsc”是指衍生自、可得自或源自顯示多能性的人組織的細(xì)胞。hpsc可以是人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

人多能干細(xì)胞可來自內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，或使用來自許多胎兒或成體體細(xì)胞類型的山中因子(yamanakafactors)重新編程。使用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移可能可產(chǎn)生hpsc。

術(shù)語“人胚胎干細(xì)胞”，“hes細(xì)胞”和“hesc”是指衍生自、可得自或源自人胚胎或囊胚的細(xì)胞，其是自我更新和多能或全能的，具有產(chǎn)生成熟動(dòng)物中存在的所有細(xì)胞類型的能力。人胚胎干細(xì)胞(hesc)可以分離自例如從人體內(nèi)植入前胚胎，體外受精胚胎或擴(kuò)大到囊胚階段的單細(xì)胞人胚胎獲得的人囊胚。

術(shù)語“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”和“ipsc”是指衍生自、可得自或源自通過外源基因例如轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)重編程為多能狀態(tài)的任何類型的人成體體細(xì)胞的細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)錄因子包括oct4、sox2、klf4和c-myc的優(yōu)選組合。hipsc顯示相當(dāng)于hesc的多能性水平，但是可以衍生自進(jìn)行自體治療(在分化和細(xì)胞遞送之前有或沒有同時(shí)進(jìn)行基因校正)的患者。

更一般來說，本文公開的方法可以應(yīng)用于衍生自任何患者的任何多能干細(xì)胞，或隨后使用基因編輯修飾成產(chǎn)生突變體模型的hpsc，或使用基因編輯校正的突變體hpsc。基因編輯可以通過crispr、talen或zf核酸酶技術(shù)進(jìn)行。

從前文可以理解，本發(fā)明的優(yōu)選廣泛形式提供了一種包括以下順序步驟的方法：

(i)將hpsc與一種或多種促進(jìn)hpsc分化為后原條細(xì)胞的試劑接觸；

(ii)使后原條細(xì)胞與一種或多種促進(jìn)后原條細(xì)胞分化成中段中胚層細(xì)胞的試劑接觸；和

(iii)使中段中胚層細(xì)胞與fgf9和任選的以下中的一種或多種：bmp7；視黃酸；ra拮抗劑如agn193109；wnt激動(dòng)劑如chir99021；fgf20；和肝素接觸；從而從中段中胚層細(xì)胞產(chǎn)生后腎間充質(zhì)細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。

下文中將描述這些順序步驟如下。

(i)將hpsc分化為后原條

從上述可以理解，將hpsc在不含血清的合適的培養(yǎng)基例如apel分化培養(yǎng)基(ng等人，2008,nat.protoc.3:768)中與bmp4、活化素a和/或chir99021接觸，但不限于此，從而產(chǎn)生適當(dāng)?shù)匕笤瓧l細(xì)胞的后原條細(xì)胞。hpsc可以是hesc或ipsc。

適當(dāng)?shù)兀琤mp4的濃度為約5-40ng/ml，活化素a的濃度為約3-40ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，bmp4的濃度為約20-35ng/ml，或更優(yōu)選約30ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，活化素a的濃度為約5-30ng/ml，或更優(yōu)選為10ng/ml。適當(dāng)?shù)?，最佳相?duì)活性比在3:1至1:6的bmp4對(duì)活化素a的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，最佳相對(duì)活性比在3:1至1:1bmp4對(duì)活化素a的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，諸如chir99021的wnt激動(dòng)劑的濃度可以在約0.5至50μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選約4-30μm，更優(yōu)選約5-20μm或有利地約8μm。在某些實(shí)施方案中，在不存在bmp4和活化素a的情況下，chir99021單獨(dú)存在。

干細(xì)胞群可以在含有bmp4、活化素a和/或wnt激動(dòng)劑如chir99021的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36-120小時(shí)。

在一些非限制性實(shí)施方案中，細(xì)胞可以與bmp4、活化素a和/或chir99021接觸比hesc所需的時(shí)間更長(zhǎng)的時(shí)間。舉例來說，諸如ipsc等細(xì)胞可以與bmp4、活化素a和/或chir99021接觸多達(dá)96-120小時(shí)。

培養(yǎng)基可以每24-48小時(shí)更換一次。

雖然不希望受理論束縛，但如本文所公開的，使hpsc與bmp4、活化素a和/或wnt激動(dòng)劑如chir99021接觸導(dǎo)致包括后原條在內(nèi)的原條(ps)的形成。這是產(chǎn)生中胚層和內(nèi)胚層組織的初始步驟。通常，hpsc的分化是朝向包含表達(dá)后原條(即推定中胚層)特征性標(biāo)志物的細(xì)胞和表達(dá)前原條(即推定內(nèi)胚層)特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的混合細(xì)胞群。

后原條(推定中胚層)特征性標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括brachyury(t)。

前原條(推定內(nèi)胚層)特征性標(biāo)志物的非限制性實(shí)例是sox17。

(ii)將后原條細(xì)胞分化為中段中胚層(im)

適當(dāng)?shù)?，將后原條細(xì)胞或包含后原條細(xì)胞的混合原條群與至少包含fgf9和任選的fgf2和/或fgf20和/或視黃酸(ra)拮抗劑的一種或多種纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)在不存在血清的合適培養(yǎng)基如apel分化培養(yǎng)基中接觸。

通常，視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)拮抗劑是視黃酸受體(rar)抑制劑或拮抗劑，例如agn193109。

合適地，fgf2、fgf9和/或fgf20的濃度為約100至400ng/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，fgf2、fgf9和/或fgf20的濃度為約150至300ng/ml或有利地約200ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，ra拮抗劑(例如agn193109)的濃度為約0.1-10μm，更優(yōu)選為0.5-5μm。

將細(xì)胞與fgf9，單獨(dú)或與fgf9同fgf2和/或fgf20和/或ra拮抗劑(例如agn193109)一起，接觸至少約96小時(shí)但不超過約190-200小時(shí)。優(yōu)選地，細(xì)胞與fgf9單獨(dú)或與fgf9與fgf2和/或fgf20和/或ra拮抗劑(例如agn193109)接觸約96小時(shí)。

培養(yǎng)基可以每40-48小時(shí)更換一次。

在一個(gè)實(shí)施方案中，使后原條細(xì)胞(其通常表達(dá)后原條(推定中胚層)和前原條(推定內(nèi)胚層)的特征性標(biāo)志物)與fgf9單獨(dú)或與fgf9連同fgf2和/或fgf20一起接觸導(dǎo)致細(xì)胞向表達(dá)中段中胚層(im)的特征性標(biāo)志物的細(xì)胞群分化。中段中胚層的特征性標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括pax2、lhx1和osr1。

(iii)將中段中胚層(im)分化為腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞

適當(dāng)?shù)?，將后原條細(xì)胞與fgf2、fgf9和/或fgf20接觸后，將所得的im細(xì)胞在不含血清的合適培養(yǎng)基如apel分化培養(yǎng)基中與fgf9單獨(dú)或與fgf9同bmp7、ra、ra拮抗劑、fgf20、wnt激動(dòng)劑和/或肝素中的一種或多種的組合接觸。

適當(dāng)?shù)?，fgf9濃度為約20ng至1μg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，fgf9的濃度為約50-500ng/ml，更優(yōu)選為約100-300ng/ml或有利地為約200ng/ml。通常，以約0.1-10μg/ml，優(yōu)選約0.3-5μg/ml，0.5-2μg/ml或有利地約1μg/ml的濃度包含肝素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，fgf20濃度為約20ng至1μg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，fgf20的濃度為約50-500ng/ml，更優(yōu)選為約100-300ng/ml或有利地為約200ng/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，fgf2濃度為約20ng至1μg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，fgf2的濃度為約50-500ng/ml，更優(yōu)選為約100-300ng/ml或有利地為約200ng/ml。

應(yīng)當(dāng)理解，fgf20和fgf2可以替代或補(bǔ)充fgf9，因?yàn)檫@些試劑具有相似的生物學(xué)活性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，bmp7的濃度為約25至75ng/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，bmp7的濃度為約35-60ng/ml、45-55ng/ml或有利地約50ng/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，ra為約10pm至1μm的濃度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，ra的濃度為約30pm至0.5μm，更優(yōu)選約50pm至0.2μm或有利地約0.1μm。盡管對(duì)本發(fā)明沒有約束力，但是初步數(shù)據(jù)表明，較高濃度的ra促進(jìn)了輸尿管上皮祖細(xì)胞比例的相對(duì)增加，而較低濃度的ra促進(jìn)了輸尿管上皮祖細(xì)胞比例的相對(duì)降低。

在一個(gè)實(shí)施方案中，ra拮抗劑如agn193109的濃度為約50pm至10μm。在優(yōu)選實(shí)施方案中，agn193109的濃度為約0.01μm至5μm，更優(yōu)選約0.1μm至5μm或有利地約1μm。盡管對(duì)本發(fā)明沒有約束力，但初步數(shù)據(jù)表明，較高濃度的agn193109促進(jìn)了后腎間充質(zhì)細(xì)胞比例的相對(duì)增加。

在一個(gè)實(shí)施方案中，wnt激動(dòng)劑如chir99021以約0.1μm至10μm，優(yōu)選約0.2μm至5μm或更優(yōu)選約1-2μm的濃度存在。

雖然對(duì)本發(fā)明不具有約束力，但wnt激動(dòng)劑促進(jìn)了來自im細(xì)胞的腎單位祖細(xì)胞的產(chǎn)生的相對(duì)增加。優(yōu)選地，細(xì)胞與fgf9單獨(dú)或與fgf9同bmp7、ra、wnt激動(dòng)劑、ra拮抗劑和/或fgf20和/或fgf2加肝素中的一種或多種一起接觸至少72小時(shí)但不超過360小時(shí)。優(yōu)選地，細(xì)胞接觸約160-220小時(shí)，或更優(yōu)選約190-200小時(shí)。

培養(yǎng)基可以每48-72小時(shí)更換一次。

通常，如本文所公開的，使中段中胚層細(xì)胞與fgf9單獨(dú)或與fgf9同bmp7、ra、ra拮抗劑、wnt激動(dòng)劑和/或fgf20和/或fgf2中的一種或多種并優(yōu)選肝素一起接觸，將中段中胚層細(xì)胞分化為后腎間充質(zhì)和輸尿管上皮細(xì)胞譜系的細(xì)胞。后腎間充質(zhì)譜系包括在fgf9和肝素中培養(yǎng)約72小時(shí)后最佳產(chǎn)生的腎單位祖細(xì)胞。還提出可以選擇ra類似物或激動(dòng)劑和/或ra拮抗劑的存在、不存在和/或濃度來操縱由該方法產(chǎn)生的輸尿管上皮與由該方法產(chǎn)生的后腎間充質(zhì)相比的相對(duì)量。如前所述，ra以后腎間充質(zhì)為代價(jià)促進(jìn)輸尿管上皮的形成，而ra拮抗劑如agn193109則以輸尿管上皮為代價(jià)促進(jìn)后腎間充質(zhì)的形成。wnt激動(dòng)劑如chir99021也可以以輸尿管上皮為代價(jià)促進(jìn)后腎間充質(zhì)的生存和/或形成。

后腎間充質(zhì)譜系或其細(xì)胞的細(xì)胞特有的或代表其的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括wt1，six1，six2，sall1，gdnf和/或hoxd11，但不限于此。

腎單位祖細(xì)胞特有的或代表其的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括wt1，six2，cited1，pax2，gdnf，sall1和hoxd11，但不限于此。

輸尿管上皮譜系的細(xì)胞特有的或代表其的標(biāo)志物的非限制性實(shí)例包括hoxb7，gata3，calb1，e-cadherin，pax2和/或cret，但不限于此。

基于wt1，six2，cited1，pax2，gdnf，sall1和hoxd11的共表達(dá)，在從hpsc細(xì)胞培養(yǎng)開始的該方法開始之后11-15天或有利地14天(第11至15天的范圍)，腎單位祖細(xì)胞可最大程度地產(chǎn)生。

基于hoxb7，cret，e-cadherin和pax2的共表達(dá)，在從hpsc培養(yǎng)開始的該方法之后的至少10天后或有利地14天后，可以最大限度地產(chǎn)生輸尿管上皮祖細(xì)胞。

在該方法的優(yōu)選形式中，fgf9存在于本文所述的兩個(gè)步驟(ii)和(iii)的至少一部分或完全整個(gè)過程中。更優(yōu)選地，wnt激動(dòng)劑如chir99021存在于本文所述的步驟(i)的至少一部分。

其特別優(yōu)選的方法包括以下順序步驟：

(a)將人多能干(hpcs)細(xì)胞與chir99021接觸以促進(jìn)hpsc細(xì)胞分化成后原條細(xì)胞；

(b)將后原條細(xì)胞與fgf9(單獨(dú)或與ra拮抗劑如agn193109一起)接觸，以促進(jìn)將后原條細(xì)胞分化成im細(xì)胞；和

(c)使im細(xì)胞與fgf9和肝素(單獨(dú)或與ra拮抗劑如agn193109一起)接觸，從而從im細(xì)胞產(chǎn)生腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。

根據(jù)該優(yōu)選形式，可以在約18-20天的總培養(yǎng)期內(nèi)促進(jìn)從hes細(xì)胞的初始群體的腎分化。

從hpsc快速生成類腎體

本發(fā)明的相關(guān)方面提供產(chǎn)生定形中胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：將hpsc與wnt激動(dòng)劑接觸更長(zhǎng)時(shí)間(最佳3-5天)。適當(dāng)?shù)?，該方面的方法產(chǎn)生包含定形中胚層細(xì)胞和im細(xì)胞的一種或多種的中胚層細(xì)胞群，所述im細(xì)胞可以包括喙部和尾部im。通常，用wnt激動(dòng)劑培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，尾部im出現(xiàn)越多，喙部im存留得越少。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括使中胚層細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fgf20)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)接觸的后續(xù)步驟。適當(dāng)?shù)?，該步驟有助于尾部和喙部im的分化。適當(dāng)?shù)?，尾部和喙部im將依次分別分化為腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮細(xì)胞。如前所述，ra或類似物或激動(dòng)劑的包含可增加輸尿管上皮祖細(xì)胞的相對(duì)產(chǎn)生。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在使中段中胚層(im)細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(fgf9)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fgf20)和/或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)接觸后，該方法還包括解離和再聚集細(xì)胞的后續(xù)步驟。這可以在空氣-培養(yǎng)基界面處的浮動(dòng)過濾器上進(jìn)行培養(yǎng)。合適地，該步驟有助于形成含有腎單位、基質(zhì)和血管系統(tǒng)的類腎體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在形成用于培養(yǎng)的聚集體(例如在浮動(dòng)過濾器上)之后，該方法還包括隨后加入wnt激動(dòng)劑30-60分鐘。適當(dāng)?shù)?，該步驟有助于產(chǎn)生具有最大腎單位的聚集的類腎體。

應(yīng)當(dāng)理解，該方法的優(yōu)選目的是產(chǎn)生聚集的、分化的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞，它們形成類器官或其它至少部分有組織的腎結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，正常發(fā)育中的腎單位的所有區(qū)段的存在可以存在于包括收集管(表型為gata3⁺ecad⁺)，早期遠(yuǎn)端小管(表型為gata3^-ltl^-ecad⁺)，早期近端小管(表型為ltl⁺ecad^-)和腎小球(表型wt1⁺)的類器官中，提示正常的胚胎器官發(fā)生。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以如上所述在大約7天培養(yǎng)中形成用于培養(yǎng)為類器官的分化細(xì)胞的聚集體。

wnt激動(dòng)劑(例如chir99021)的優(yōu)選濃度為約1-50mm，優(yōu)選約1-20μm、5-15μm或有利地約8μm。優(yōu)選地，與wnt激動(dòng)劑接觸的持續(xù)時(shí)間為約4天。

適當(dāng)?shù)兀琭gf9濃度為約20ng至1μg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，fgf9濃度為約50-500ng/ml，更優(yōu)選約100-300ng/ml或有利地約200ng/ml。優(yōu)選地，隨后與fgf9/fgf20/fgf2接觸的持續(xù)時(shí)間包括肝素在內(nèi)約3天。

優(yōu)選地，在fgf9/fgf20/fgf2加肝素中培養(yǎng)后再聚集后立即隨后加入短脈沖的wnt激動(dòng)劑如chir99021。wnt激動(dòng)劑(例如chir99021)的優(yōu)選濃度為約1-15μm，優(yōu)選約2-10μm或有利地約5μm。短脈沖通常為0.5至2小時(shí)，例如約45分鐘或1小時(shí)。

可以通過維持或促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞之間的物理接觸來輔助聚集的、至少部分有組織的結(jié)構(gòu)如類腎體的形成。在這方面，在添加“短脈沖”的wnt激動(dòng)劑(例如chir99021)之前，細(xì)胞的成團(tuán)可有助于類器官形成。

任選地，培養(yǎng)物可以進(jìn)一步包括：視黃酸(ra)拮抗劑、ra或ra激動(dòng)劑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bmp7)和/或肝素中的一種或多種。視黃酸(ra)拮抗劑、ra激動(dòng)劑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bmp7)；和/或肝素的各自的濃度和作用可如上所述。

誘導(dǎo)血管形成

適當(dāng)?shù)?，類腎體或聚集體中至少部分血管化和/或血管祖細(xì)胞的存在通過促進(jìn)或引導(dǎo)血管內(nèi)皮或血管祖細(xì)胞從間充質(zhì)細(xì)胞或組織發(fā)育的條件而促進(jìn)。

適當(dāng)?shù)?，根?jù)前述方面產(chǎn)生的分化細(xì)胞和/或類器官的聚集體可以在促進(jìn)至少部分血管化、特別是腎小球結(jié)構(gòu)的血管形成、或至少產(chǎn)生血管內(nèi)皮或其它血管細(xì)胞或組織的祖細(xì)胞的條件下培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，通過促進(jìn)或引導(dǎo)血管內(nèi)皮從間充質(zhì)細(xì)胞或組織發(fā)育的條件來促進(jìn)血管形成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可以包括與如上所述的im細(xì)胞一起共培養(yǎng)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(例如從人多能干細(xì)胞分化的)，或加入到至少部分分化的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)物中，從而產(chǎn)生血管細(xì)胞或組織如血管內(nèi)皮。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可以包括在培養(yǎng)期間降低的氧分壓。通常，21％的o2是存在于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中的常見氧分壓。本發(fā)明考慮5至12％的o2，其可以更相當(dāng)于發(fā)育中的胚胎中經(jīng)受的氧分壓。這可以提高后腎間充質(zhì)產(chǎn)生vegfa的能力，從而誘導(dǎo)flk1⁺血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的形成和遷移。

鑒于上述內(nèi)容，所提及的蛋白質(zhì)試劑如bmp4、bmp7、活化素a、fgf2、fgf9和fgf20應(yīng)理解為包括任何哺乳動(dòng)物(包括人、小鼠和大鼠)來源的天然或重組或化學(xué)合成蛋白質(zhì)，但不限于此。此外，這些蛋白質(zhì)可包括本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾，糖基化，脂化，諸如生物素的標(biāo)記和附加的氨基酸序列如表位標(biāo)簽或融合伴侶。通常，上述蛋白質(zhì)可以商業(yè)獲得和/或通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或制造方法制備為重組或化學(xué)合成蛋白質(zhì)。

另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文公開的方法產(chǎn)生的分離或純化的腎單位祖細(xì)胞、輸尿管上皮祖細(xì)胞和/或類腎體。

類腎體優(yōu)選包括由內(nèi)皮和腎間質(zhì)包圍的分段的腎單位。

在特定的實(shí)施方案中，腎單位被分成四(4)個(gè)或更多個(gè)組成部分，包括收集管(表型為gata3⁺ecad⁺)，早期遠(yuǎn)端小管(表型為gata3^-ltl^-ecad⁺)，早期近端小管(表型為ltl⁺ecad^-)和腎小球(表型為wt1⁺)。適當(dāng)?shù)?，在類器官底部形成收集管樹，連接到中部的遠(yuǎn)端和近端小管，在類器官頂部具有腎小球。

應(yīng)當(dāng)理解，腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞可以在如上所述的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)期之后獲得，并且在一些任選的實(shí)施方案中可以根據(jù)表面標(biāo)志物的共表達(dá)來進(jìn)一步富集或純化。細(xì)胞富集或純化可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)或方法，包括流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分選(例如facs)，通過磁性免疫珠(例如dynabeads^tm)進(jìn)行陽性或陰性細(xì)胞選擇、淘選(panning)、密度分離或補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解等，但不限于此。

腎再生和移植

慢性腎病是一種嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)病癥，每年影響3100萬美國(guó)人和170萬澳大利亞人?；颊咴诔霈F(xiàn)癥狀前可能會(huì)損失其腎功能的90％，導(dǎo)致腎衰竭、透析或腎移植。2010年美國(guó)終末期腎病的醫(yī)療費(fèi)用估計(jì)為280億美元。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供生產(chǎn)腎或者腎細(xì)胞或組織的方法，所述方法包括將腎或者腎細(xì)胞或組織從分離或純化的腎單位和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞分化的步驟從而產(chǎn)生腎或者腎細(xì)胞或組織。此外，本發(fā)明的該方面在促進(jìn)或引導(dǎo)血管內(nèi)皮或血管祖細(xì)胞從間充質(zhì)細(xì)胞或組織發(fā)育的條件下提供至少部分血管形成和/或產(chǎn)生血管祖細(xì)胞。

本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生輸尿管上皮和后腎間充質(zhì)譜系或區(qū)室的細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，這些細(xì)胞被同時(shí)誘導(dǎo)并且在體內(nèi)引導(dǎo)彼此的分化。這些細(xì)胞能夠發(fā)育成不同的管狀上皮結(jié)構(gòu)，包括輸尿管樹和腎單位祖細(xì)胞間充質(zhì)。因此，提出根據(jù)本發(fā)明制備的hpsc細(xì)胞衍生的輸尿管上皮和/或腎單位祖細(xì)胞可以被引導(dǎo)從輸尿管和后腎間充質(zhì)區(qū)室分化成腎細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)臈l件下，腎單位祖細(xì)胞可以能夠分化成包括腎單位上皮細(xì)胞的任何腎單位節(jié)段(除收集管以外)，如連接段、遠(yuǎn)端小管曲部(dct)細(xì)胞、遠(yuǎn)端小管直部(dst)細(xì)胞、近端小管直部(pst)段1和2、pst細(xì)胞、足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、henle的上升環(huán)和/或henle的下降環(huán)，但不限于此。

此外，這些細(xì)胞“自組織”的能力可以因此用來促進(jìn)腎臟修復(fù)，例如通過腎組織或器官生物工程。

應(yīng)當(dāng)理解，該方面的方法的一個(gè)實(shí)施方案可以包括將分離或純化的腎單位和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移或移植到人中，從而產(chǎn)生腎或者腎細(xì)胞或組織。

根據(jù)該實(shí)施方案，分離或純化的腎單位和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞向腎或者腎細(xì)胞或組織的分化在體內(nèi)發(fā)生。

該方面的方法的另一個(gè)實(shí)施方案可以包括至少部分地將分離或純化的腎單位和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞體外分化為腎、或者腎細(xì)胞或組織、或者這些的祖細(xì)胞。適當(dāng)?shù)?，將至少部分體外分化的細(xì)胞腎、或者腎細(xì)胞或組織、或者這些的祖細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移或移植到人中。

根據(jù)任一個(gè)或兩個(gè)實(shí)施方案，腎、腎細(xì)胞或組織可以促進(jìn)或有助于腎、其細(xì)胞或組織的再生或修復(fù)。

一個(gè)實(shí)施方案提供類器官、由其獲得的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞產(chǎn)生工程化或人造腎的用途。例如，分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞可以并入支架內(nèi)，例如脫細(xì)胞的人腎或其細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)組分，聚酯絨毛或可生物降解的聚合物支架，從而產(chǎn)生再生的腎小管結(jié)構(gòu)。舉例來說，這樣的方法可以包括以下一個(gè)或多個(gè)：(a)從類器官中分離一種或多種分化的細(xì)胞類型和/或中間祖細(xì)胞類型；和(b)將一種或多種分化的細(xì)胞類型和/或中間祖細(xì)胞類型遞送到脫細(xì)胞的腎支架中。在一些實(shí)施方案中，來自腎支架的ecm可以用作基質(zhì)(例如從單獨(dú)的ecm或與水凝膠結(jié)合的ecm產(chǎn)生)，其中將一種或多種分化的細(xì)胞類型和/或中間祖細(xì)胞類型接種或生物打印從而使腎支架或基質(zhì)再細(xì)胞化。

另一實(shí)施方案可涉及修復(fù)受損或患病的腎臟。舉例來說，該方法可以包括以下中的一種或多種：(i)從類器官中分離一種或多種分化的細(xì)胞類型和/或中間祖細(xì)胞類型；(ii)將一種或多種分化的細(xì)胞類型和/或中間祖細(xì)胞類型遞送到受損或患病的腎臟中，從而促進(jìn)患病或受損腎的修復(fù)和/或再生。通過實(shí)質(zhì)注射或通過血管途徑直接遞送至受損或患病的腎臟中。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供在用于輔助或促進(jìn)腎透析的裝置中從分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞分化的腎細(xì)胞或組織的用途。例如，生物人造腎可以通過將腎細(xì)胞或其祖細(xì)胞接種到反應(yīng)器中以產(chǎn)生與透析并行使用的“腎臟輔助裝置”來制備。

還考慮使用由本文所述的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞分化或以其他方式獲得的腎細(xì)胞或組織的“生物打印”腎或其他含有腎單位的器官、類器官或器官樣結(jié)構(gòu)。

因此，本發(fā)明的一個(gè)特定方面提供一種生物打印腎結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括沉積本文公開的多個(gè)hpsc或其它祖細(xì)胞以形成腎結(jié)構(gòu)，其具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或者其能夠顯現(xiàn)腎或其組分的一種或多種功能特征。

適當(dāng)?shù)?，使hpsc或其它祖細(xì)胞經(jīng)受本文公開的用于在三維結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的方法。

該特定方面還提供一種生物打印的腎結(jié)構(gòu)，其具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或能夠顯現(xiàn)腎或其組分的一種或多種功能特征，由上述方法制備。

本發(fā)明的另一個(gè)特定方面提供一種生物打印腎結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括沉積本文公開的多個(gè)腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞以形成腎結(jié)構(gòu)，所述腎結(jié)構(gòu)具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或者其能夠顯現(xiàn)腎或其組分的一種或多種功能特征。

適當(dāng)?shù)?，腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞已通過本文公開的方法由hpsc產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生具有或能夠顯現(xiàn)至少部分血管形成和/或血管祖細(xì)胞的生物打印的腎結(jié)構(gòu)。

該特定方面還提供一種生物打印的腎結(jié)構(gòu)，其具有腎或其組分的一種或多種功能特征，或能夠顯現(xiàn)腎或其成分的一種或多種功能特征，由上述方法制備。在一些實(shí)施方案中，具有或能夠顯現(xiàn)至少部分血管形成和/或血管祖細(xì)胞的生物打印的腎結(jié)構(gòu)。

適當(dāng)?shù)兀锎蛴〉哪I結(jié)構(gòu)是三維腎結(jié)構(gòu)。

還將理解，如下文將更詳細(xì)地描述的，三維結(jié)構(gòu)可以由多個(gè)生物打印“層”或“陣列”構(gòu)造或形成。

生物打印的腎結(jié)構(gòu)組分可以是或包含腎的任何結(jié)構(gòu)和/或功能組分，例如腎小球、近腎小球器、間質(zhì)組織、收集管、鮑曼氏囊、近端和/或遠(yuǎn)端小管曲部、血管系統(tǒng)如小動(dòng)脈、動(dòng)脈、靜脈和/或毛細(xì)血管，但不限于此。

適當(dāng)?shù)?，生物打印的腎結(jié)構(gòu)至少部分血管化和/或包含血管祖細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，生物打印的腎或腎組分可以是可植入的或以其他方式過繼轉(zhuǎn)移到宿主中。

如本文所使用的，“生物打印”包括并涵蓋利用通過與自動(dòng)化或半自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)輔助三維原型設(shè)備(例如生物打印機(jī))兼容的方法三維、精確的細(xì)胞沉積(例如，細(xì)胞溶液、含細(xì)胞的凝膠、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體、類器官，多細(xì)胞體等)。在這方面，參考美國(guó)專利申請(qǐng)us20120116568，us20130164339和us20140012407，其通過引用并入本文，并提供潛在合適的生物打印技術(shù)的非限制性實(shí)例。

舉例來說，在一些實(shí)施方案中，工程化的、可植入的類腎體組織和/或器官的至少一種組分可以生物打印。在另外的實(shí)施方案中，工程化的、可植入的組織和/或器官完全生物打印。還在另外的實(shí)施方案中，使用利用基于三維、自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)輔助的沉積如本文所公開的腎細(xì)胞(包括細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液、含細(xì)胞的凝膠或糊狀物、細(xì)胞濃縮物，多細(xì)胞體(例如，圓柱體，球體，帶狀物等))以及將材料通過三維遞送裝置(如生物打印機(jī))限制在生物相容性表面(例如，由水凝膠和/或多孔膜組成)上的快速原型技術(shù)的方法制備生物打印構(gòu)建體。如本文所用，在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“工程化”是指腎組織和/或器官，意味著細(xì)胞、細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液、含細(xì)胞的凝膠或糊狀物、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體和其層根據(jù)計(jì)算機(jī)腳本通過計(jì)算機(jī)輔助裝置(例如，生物打印機(jī))定位形成三維結(jié)構(gòu)。在另外的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)腳本例如是一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序、計(jì)算機(jī)應(yīng)用或計(jì)算機(jī)模塊。還在另外的實(shí)施方案中，三維組織結(jié)構(gòu)通過類似于早期形態(tài)發(fā)生中的自組裝現(xiàn)象的細(xì)胞或多細(xì)胞體的打印后融合來形成。

盡管許多方法可用于在生物相容性表面上排列細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體和/或其層以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，然而包括手動(dòng)放置、通過自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)輔助機(jī)器(例如生物打漿機(jī))定位是有利的。使用該技術(shù)遞送細(xì)胞或多細(xì)胞體的優(yōu)點(diǎn)包括細(xì)胞或多細(xì)胞體的快速、準(zhǔn)確和可再現(xiàn)的放置，以產(chǎn)生展現(xiàn)具有各種組成的細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體和/或其層的計(jì)劃的或預(yù)定的取向或模式的構(gòu)建體。優(yōu)點(diǎn)還包括確保高細(xì)胞密度，同時(shí)最大限度地減少細(xì)胞損傷。在一些實(shí)施方案中，生物打印的方法是連續(xù)的和/或基本連續(xù)的。連續(xù)生物打印方法的非限制性實(shí)例是經(jīng)由連接到生物墨儲(chǔ)存器的分配尖端(例如，注射器、毛細(xì)管等)從生物打印機(jī)分配生物墨。在進(jìn)一步的非限制性實(shí)施方案中，連續(xù)生物打印方法是以功能單元的重復(fù)模式分配生物墨。在各種實(shí)施方案中，重復(fù)功能單元具有任何合適的幾何形狀，包括例如圓形，正方形，矩形，三角形，多邊形和不規(guī)則幾何形狀。在另外的實(shí)施方案中，生物打印功能單元的重復(fù)模式包括層或陣列，并且多個(gè)層或陣列相鄰地生物打印(例如，堆疊)以形成工程化組織或器官。在各種實(shí)施方案中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多層或陣列相鄰生物打印(例如，堆疊)以形成工程化的腎組織或器官。

在一些實(shí)施方案中，生物打印的功能單元以棋盤格模式重復(fù)。“棋盤格模式”是圖表平面，該平面無重疊也無間隙。連續(xù)和/或棋盤格生物打印的優(yōu)點(diǎn)包括(通過非限制性實(shí)例)提高生物打印組織的生產(chǎn)率。另一個(gè)非限制性的示例性優(yōu)點(diǎn)是消除了將生物打印機(jī)與先前沉積的生物墨元件對(duì)準(zhǔn)的需要。連續(xù)的生物打印還可以方便地從大的生物墨儲(chǔ)存器中打印更大的組織，任選地使用注射器機(jī)構(gòu)。

在各種實(shí)施方案中，用于連續(xù)生物打印的方法包括獨(dú)立地或相對(duì)于彼此優(yōu)化和/或平衡諸如打印高度、泵速度、機(jī)器人速度或其組合等參數(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，用于沉積的生物打印機(jī)頭速度為3mm/s，第一層的分配高度為0.5mm，并且每個(gè)后續(xù)層的分配高度增加0.4mm。在一些實(shí)施方案中，分配高度近似等于生物打印機(jī)分配尖端的直徑。無限定的，適當(dāng)?shù)暮?或最佳的分配距離不會(huì)導(dǎo)致材料壓扁或粘附到分配針上。在各種實(shí)施方案中，生物打印機(jī)分配尖端具有大約20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、650、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或以上的內(nèi)徑，包括其中的增量。在各種實(shí)施方案中，生物打印機(jī)的生物墨儲(chǔ)存器具有約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100cm³或以上的體積，包括其中的增量。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)系統(tǒng)中的殘余壓力積聚低時(shí)，泵速度是合適的和/或最佳的。在一些實(shí)施方案中，有利的泵速度取決于儲(chǔ)存器和分配針的截面積之間的比，其中比率越大需要的泵速度越低。在一些實(shí)施方案中，合適的和/或最佳的打印速度使得能夠沉積均勻的線而不影響材料的機(jī)械完整性。

僅舉例而言，organovo與invetech合作開發(fā)了一種器官打印機(jī)，其使用水凝膠支架以所需的取向放置人類細(xì)胞來重建人體器官。從本文所述的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞分化的或以其他方式獲得的腎細(xì)胞或組織可以與諸如上述organovo機(jī)一起使用以開發(fā)“生物打印”的人類腎體或腎臟。

本發(fā)明的另一方面提供具有平面幾何形狀的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管祖細(xì)胞陣列。

陣列可以包括多個(gè)堆疊陣列，優(yōu)選2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)或更多個(gè)堆疊陣列。

陣列可以以棋盤格模式堆疊。

本發(fā)明的有關(guān)方面提供通過使前述方面的陣列成熟獲得的類腎體。

適當(dāng)?shù)?，類腎體至少部分血管化和/或包含血管祖細(xì)胞。

還將理解，本文所述的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞、類器官和生物打印的腎結(jié)構(gòu)的定向分化可以是用于細(xì)胞療法的純化的、分化的腎細(xì)胞亞型、類器官和/或生物打印的腎結(jié)構(gòu)的潛在來源。

例如，本文所述的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞可用于在某些基因遺傳的腎臟病癥中在基因校正后產(chǎn)生腎細(xì)胞或組織。例如，可以通過在基因校正后從本文所述的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞再生腎組織來輔助或促進(jìn)包括alport綜合征(col4a3突變)和多囊腎病(pkd1，pkd2等)等單基因腎病的修復(fù)。

在特定的實(shí)施方案中，衍生自、得自或源自患有遺傳性腎病的患者的ipsc系可用于體外修復(fù)基因突變?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法使用這樣的細(xì)胞，然后將其給予患者用于自體細(xì)胞療法。

腎毒性篩查

還將理解，本文所述的分離的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞的定向分化可以提供純化的分化腎細(xì)胞、生物打印的腎結(jié)構(gòu)、類腎體、陣列或腎組織亞型的潛在來源用于腎毒性篩查。

由于缺乏用于體外藥物試驗(yàn)的原代人腎細(xì)胞的可用性，制定旨在預(yù)防疾病(包括藥物和基于細(xì)胞的療法)的干預(yù)的開發(fā)變得困難。

因此，本發(fā)明的另一方面提供確定一種或多種化合物的腎毒性的方法，所述方法包括使一種或多種化合物與本文所述的腎單位祖細(xì)胞和/或輸尿管上皮祖細(xì)胞(作為類器官或在分離和純化后、或由其分化的或以其它方式由其獲得的腎細(xì)胞或組織)接觸的步驟，從而確定一種或多種化合物是否為腎毒性。

優(yōu)選地，該方法使用類器官或由分離或純化的腎單位祖細(xì)胞、或衍生自腎單位祖細(xì)胞的腎細(xì)胞或組織進(jìn)行。

許多有用的藥物具有腎毒性副作用，例如通過直接腎小管效應(yīng)(例如氨基糖苷類抗生素、順鉑、放射性對(duì)照培養(yǎng)基、nsaids、ace抑制劑)，間質(zhì)性腎炎(例如β內(nèi)酰胺抗生素、鋰、csa、抗癲癇藥如苯妥英)或腎小球性腎炎。因此，使用由本文所述的分離或純化的腎單位祖細(xì)胞分化或以其他方式獲得的確定的、特定的腎細(xì)胞和組織類型來試驗(yàn)新的或現(xiàn)有的藥物是有利的。上述“生物打印”的腎或生物打印的類腎體也可應(yīng)用于腎毒性篩查。

腎毒性可以通過針對(duì)體外腎細(xì)胞功能的任何適合的試驗(yàn)來評(píng)估或測(cè)量，包括降低的肌酐清除率或生物標(biāo)志物表達(dá)，例如通過來自qiagen的humannephrotoxicityrt²profiler^tmpcrarray或來自eurofins的highcontentanalysis(hca)multiplexednephrotoxicityassay，但不限于此。

如實(shí)施例中更詳細(xì)描述的，順鉑是誘導(dǎo)腎臟中近端腎小管細(xì)胞的半胱天冬酶介導(dǎo)的急性凋亡的腎毒性物質(zhì)。類腎體的順鉑治療誘導(dǎo)成熟近端腎小管細(xì)胞的特異性急性凋亡，而未成熟細(xì)胞不發(fā)生凋亡。

為了使本發(fā)明可以容易地理解并付諸實(shí)踐，參考以下非限制性實(shí)施例。

實(shí)施例

導(dǎo)致本發(fā)明的研究確定了特定的體外培養(yǎng)條件，將其定制為促進(jìn)來自中段中胚層(im)的腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的同步、同時(shí)分化。更具體地，fgf9加肝素單獨(dú)、或與包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bmp7)、視黃酸(ra)、ra拮抗劑；wnt激動(dòng)劑和/或fgf20加肝素的一種或多種試劑組合，能夠促進(jìn)中段中胚層分化為腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞。此外，體外培養(yǎng)方法提供了通過后原條、im和后腎間充質(zhì)階段分化hpsc以產(chǎn)生腎單位祖細(xì)胞和輸尿管上皮祖細(xì)胞的系統(tǒng)?？梢圆倏v某些分子如ra、ra拮抗劑和/或wnt激動(dòng)劑的存在或不存在以優(yōu)先促進(jìn)腎單位祖細(xì)胞與輸尿管上皮祖細(xì)胞的產(chǎn)生，反之亦然。后部ps是用于中胚層如im的祖細(xì)胞群，并且使用wnt激動(dòng)劑(例如chir99021)從hpsc誘導(dǎo)。im分化為兩個(gè)關(guān)鍵的腎臟祖細(xì)胞群：輸尿管上皮(ue)，收集管的祖先；后腎間充質(zhì)(mm)，腎單位的祖先。當(dāng)前部im產(chǎn)生ue時(shí)，后部im發(fā)育成mm。在這里，我們提出了一種通過使用chir99021仔細(xì)確定的時(shí)間段同時(shí)誘導(dǎo)前部和后部im的方法。這種同時(shí)誘導(dǎo)導(dǎo)致成功生成含有所有預(yù)期的腎臟成分(包括腎單位、間質(zhì)和內(nèi)皮)的類腎體。我們還提出了添加ra信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，例如合成有效的泛視黃酸受體(rar)拮抗劑agn193109，將促進(jìn)后腎間充質(zhì)的形成。

實(shí)施例1

材料和方法

這些方法中提到的試劑的來源的非限制性實(shí)例在表1中提供。

培養(yǎng)基如下：

·明膠溶液：pbs中的0.1％明膠。然后將溶液高壓蒸汽處理。

·fdmem：89％dmem高葡萄糖，10％胎牛血清，1％glutamax補(bǔ)充劑，0.5％青霉素/鏈霉素。

·ksr培養(yǎng)基：77.8％dmem/f-12、20％knockout血清替代品，1％neaa，1％glutamax，0.5％青霉素/鏈霉素，0.2％2-巰基乙醇(55mm)。然后用stericup-gp過濾培養(yǎng)基。

·mef條件ksr培養(yǎng)基：在t175燒瓶中將40mlksr培養(yǎng)基加至1000萬個(gè)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞一天。第二天收集培養(yǎng)基，再加入40ml的ksr培養(yǎng)基。重復(fù)6次后，收集和合并的培養(yǎng)基通過stericup-gp過濾。

·apel：用0.5ml抗生素-抗真菌劑補(bǔ)充一瓶stemdiffapel(100ml)。

對(duì)于其他試劑、方法、pcr引物等，還參見國(guó)際公開wo2014/197934和takasato,m.等人，2014,.nat.cellbiol.16,118–26，這些文獻(xiàn)整體通過引用并入本文。

接種飼養(yǎng)層(倒數(shù)第8天)

在25cm²的組織培養(yǎng)瓶中涂3ml0.1％明膠溶液。

將冷凍的有絲分裂失活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)的小瓶通過在37℃下加熱小瓶來解凍，直至留下小冰丸。將溫?zé)岬?mlfdmem培養(yǎng)基以逐滴方式加入到小瓶中并輕輕混合。收集到15ml管中，并以1500rpm離心3分鐘。

去除上清液并將mef重懸在fdmem中。在fdmem中以12,000個(gè)細(xì)胞/cm²接種在燒瓶中，并在37℃的co2培養(yǎng)箱中孵育過夜。

解凍hesc/ipsc(倒數(shù)第7天)

將冷凍的ipsc/hesc的小瓶通過在37℃下加熱小瓶將其解凍至所準(zhǔn)備的含有有絲分裂失活的mef的25cm²組織培養(yǎng)瓶中，直至留下小冰丸。將溫?zé)岬?mlksr培養(yǎng)基(見附錄a)逐滴加入小瓶中并輕輕混合。收集到15ml管中，并以1,500rpm離心3分鐘。

每25cm²組織培養(yǎng)瓶中準(zhǔn)備5mlksr培養(yǎng)基。向ksr培養(yǎng)基中加入10ng/mlbfgf。

除去上清液并將ipsc/hesc在含有10ng/mlbfgf的ksr培養(yǎng)基中重懸。接種入燒瓶中并在37℃的co2培養(yǎng)箱中孵育3天。

每日吸出消耗的ksr培養(yǎng)基，并補(bǔ)充5ml含有10ng/mlbfgf的新鮮ksr培養(yǎng)基。

hesc/ipsc的解離和matrigel適應(yīng)(倒數(shù)第3天)

matrigel涂層：

將3ml冷dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基等分至15ml管中。

將25ul的hesc合格matrigel加入dmem/f12。混合均勻并轉(zhuǎn)移到25cm²的組織培養(yǎng)瓶中。(*加熱時(shí)將matrigel以固化形式在冰上處理。)

將燒瓶保持在室溫至少30分鐘，以使matrigel涂布在表面上。

準(zhǔn)備5mlmef條件ksr培養(yǎng)基(見附錄b)，并向培養(yǎng)基中加入10ng/mlbfgf。

解離細(xì)胞：

(*為獲得最佳效果，細(xì)胞應(yīng)約80-90％匯合。如果細(xì)胞不匯合，允許另外一天進(jìn)行孵育或進(jìn)行較低的分裂比率。)

用3mlpbs洗滌匯合的25cm²燒瓶?jī)纱巍?/p>

加入2mltrypleselect至細(xì)胞，并在37℃孵育3分鐘。

移取5mldmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基至細(xì)胞，混合并確保細(xì)胞已從塑料表面脫落。

在15ml管中以1:3分裂比率收集細(xì)胞懸浮液，并以1,500rpm離心3分鐘。

接種細(xì)胞到matrigel涂布的燒瓶上：

去除上清液，并將制備的5ml條件ksr培養(yǎng)基加入細(xì)胞。輕輕混合。

從制備的組織培養(yǎng)瓶中吸出含有matrigel的dmem/f12并接種細(xì)胞。

在37℃的co2培養(yǎng)箱中孵育過夜兩天。

每日吸出消耗的條件ksr培養(yǎng)基，并補(bǔ)充5ml含有10ng/mlbfgf的新鮮條件ksr培養(yǎng)基。

接種細(xì)胞用于分化(倒數(shù)第1天)

用3mlpbs洗滌25cm²燒瓶?jī)纱巍?/p>

加入2mltrypleselect至細(xì)胞，并在37℃孵育3分鐘。

移取5mldmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基至細(xì)胞，混合并確保細(xì)胞已從塑料表面脫落。

將細(xì)胞懸浮液收集到15ml管中。計(jì)數(shù)。

計(jì)算所需細(xì)胞數(shù)以達(dá)到每孔4000個(gè)細(xì)胞(12,500個(gè)細(xì)胞/cm²)。

將所需細(xì)胞數(shù)量等分至15ml管中。以1,500rpm離心3分鐘。

將細(xì)胞重懸在含有10ng/mlbfgf的條件ksr中，每孔50ul。將細(xì)胞接種到96孔玻璃底板中，并在37℃孵育過夜。

分化階段一(第0天)

對(duì)于新開的apel瓶，以1/100加入抗生素-抗真菌劑(100x)。

在apel中準(zhǔn)備8μm的chir。

從96孔板吸出條件ksr。

將100微升含有8μmchir的apel加入細(xì)胞。

在37℃孵育4天，每2天更新一次培養(yǎng)基。

分化階段二(第4天)

在apel中準(zhǔn)備200ng/mlfgf9+1μg/ml肝素。

從96孔板中吸取消耗的含有chir的apel。

將含有200ng/mlfgf9+1μg/ml肝素的100μlapel加入細(xì)胞。

在37℃下孵育2天，并在第6天用含有200ng/mlfgf9+1μg/ml肝素的新鮮apel更新培養(yǎng)基。

3d類器官培養(yǎng)(第7天)

在96孔板中獲得不同條件的培養(yǎng)的c32ips細(xì)胞。

吸取培養(yǎng)基并用無菌pbs快速洗滌。

吸取pbs。

向每個(gè)孔中加入50μl胰蛋白酶edta(0.25％)。

放置在37℃的培養(yǎng)箱中長(zhǎng)達(dá)3分鐘，使細(xì)胞從表面剝離。

在顯微鏡下觀察，以確保所有細(xì)胞都從玻璃(96孔)表面脫落。如果細(xì)胞仍附著在表面，則用胰蛋白酶輕輕抽吸細(xì)胞并放回培養(yǎng)箱中另外2分鐘。

用100μldmem+10％fbs+1％p/s中和胰蛋白酶。

將整個(gè)培養(yǎng)物等分至15mlfalcon管中。

以1500rpm的速度離心細(xì)胞5分鐘。

吸出培養(yǎng)基，直到僅剩下細(xì)胞沉淀物。

用3mlchir重懸細(xì)胞。

取出10μl的細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

每個(gè)3d類器官小球(pelletorganoid)將具有大約5×10⁵個(gè)細(xì)胞，將所需量的細(xì)胞懸液等分至15mlfalcon管中。

以2000rpm離心所述管2分鐘。

將1.2mlapel+5mlchir等分至6孔transwell聚酯膜細(xì)胞培養(yǎng)板中。

使用p1000移液管，緩慢地將沉淀物從含apel的溶液中移出。

通過使用p1000寬孔移液器槍頭來取沉淀物。

小心地將沉淀物置于transwell過濾器上，同時(shí)帶有最少的培養(yǎng)基。

置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中1小時(shí)。

將1.2mlapel+200ng/mlfgf9+1μg/ml肝素等分至corningcostar6孔板。

將在apel+5μmchir中培養(yǎng)1小時(shí)的過濾器移至apel+200ng/mlfgf9+1μg/ml肝素板并培養(yǎng)5天。(培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q一次)

5天后，取出過濾器，并放入新鮮制備的具有1.2ml新鮮的apel的corningcostar6孔板中。

在僅含apel的培養(yǎng)基中將類器官再培養(yǎng)6天。(培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q一次)

3d類器官免疫熒光(第18天)

在類器官培養(yǎng)6天后，用1％多聚甲醛在4℃下將沉淀物固定20分鐘。

取出多聚甲醛并用pbs洗滌三次。

一旦固定和洗滌，類器官可以在免疫熒光染色前在4℃下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)一周。

將約150ul的封閉緩沖液(10％驢血清/0.3％triton-x/pbs)等分到mattek玻璃底培養(yǎng)皿中。

小心地將類器官切出過濾器，并將過濾器浸沒在封閉緩沖液中。

封閉類器官2-3小時(shí)。

在封閉緩沖液中準(zhǔn)備選擇的一抗。

列出的大多數(shù)抗體的稀釋度為1:300。

將封閉緩沖液從mattek培養(yǎng)皿中吸出，并將150μl的封閉緩沖液+一抗等分至mattek培養(yǎng)皿中。

在4℃將類器官與一抗孵育過夜。

將一抗從培養(yǎng)皿中吸出并用pbtx洗滌6次，每次10分鐘。

在pbtx(0.1％triton-x/pbs)中準(zhǔn)備選擇的二抗(1:400diln)。

將類器官在二抗中孵育4小時(shí)。

去除二抗，并用pbs中的dapi(1:1000稀釋)孵育1小時(shí)。

用pbs洗3次，每次10分鐘。

準(zhǔn)備成像。

結(jié)果

如圖1所示，為了選擇收集管(ecad⁺，gata3⁺，pax2⁺)，較少天(2-3)的初始wnt激動(dòng)劑和/或隨后用fgf9培養(yǎng)并激活視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)是最佳的。為選擇形成腎單位的后腎間充質(zhì)(wt1⁺hoxd11⁺ecad^-)并產(chǎn)生表達(dá)早期腎單位標(biāo)志物的上皮結(jié)構(gòu))，更多天(3-5)的初始wnt激動(dòng)劑和/或隨后用fgf9培養(yǎng)并抑制視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)是最佳的。

我們現(xiàn)在已有證據(jù)表明通過使用本文公開的方法經(jīng)由人多能干細(xì)胞的聚集形成的類器官顯示了指示正常腎器官發(fā)生的以下特征。如圖2所示，meis1⁺基質(zhì)群的存在顯示存在于形成腎單位之間。已知這種群體是由后腎間充質(zhì)產(chǎn)生的，存在于胚胎腎的發(fā)育中的腎單位之間，并且已被證明有助于最終器官的血管周圍的形成。在圖3中存在cd31⁺血管祖細(xì)胞。我們看到了內(nèi)皮的證據(jù)，如通過cd31評(píng)估的，然而cd31是成熟內(nèi)皮的標(biāo)志物，我們還沒有看到顯示積極入侵腎小球以形成功能性過濾單位的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞。圖4和圖5顯示正常發(fā)育中的腎單位的所有區(qū)段的存在，包括收集管(gata3⁺pax2⁺ecad⁺)，遠(yuǎn)端小管(ecad⁺gata3^-ltl^-)，近端小管(ltl⁺aqp1⁺)和腎小球(wt1⁺nphs1⁺synpo⁺)，其相互連接，提示正常的胚胎器官發(fā)生。

許多參數(shù)的變化提高了由人多能干細(xì)胞形成的類器官內(nèi)存在的總體大小、復(fù)雜性、成熟度和腎單位數(shù)。

這些包括在誘導(dǎo)7天后形成用于培養(yǎng)為類器官的分化細(xì)胞的聚集體。最初，這些被證明能夠在14或18天的現(xiàn)有培養(yǎng)后形成。我們現(xiàn)在可以在7天后可靠地獲得類器官形成，這7天包括在8μmchir中培養(yǎng)4天，然后在具有或不具有agn(視黃酸抑制劑)、bmp7、低chir或ra的fgf9中培養(yǎng)3天，其濃度范圍如前所述。如圖6所示，通過在再聚集后立即加入高chir(5μm)的45分鐘脈沖，隨后在具有或不具有agn(視黃酸抑制劑)、bmp7、低chir或ra的fgf9中培養(yǎng)，濃度范圍如前所述，可增強(qiáng)聚集體的形成。

血管化腎小球的形成對(duì)腎功能至關(guān)重要。這種腎小球血管系統(tǒng)甚至可以在體外形成的證據(jù)將顯著提高類器官作為腎臟模型的可信度。

一種方法將分化為腎的人多能干細(xì)胞與分化為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的人多能干細(xì)胞結(jié)合使用，例如orlova³¹的方案。

另一種方法是將分化過程中的氧分壓從21％o2(標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)箱中常見的氧分壓)減少至5至12％的o2(更相當(dāng)于發(fā)育中的胚胎中經(jīng)受的氧分壓)。我們預(yù)計(jì)這可以很好地改善后腎間充質(zhì)產(chǎn)生vegfa并誘導(dǎo)flk1+內(nèi)皮祖細(xì)胞的形成和遷移的能力。

實(shí)施例2

細(xì)胞培養(yǎng)和分化

所有呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)都使用了以前描述的野生型人ipsc系crl1502(克隆#c32)，其使用附加型重編程²⁸產(chǎn)生。用人es細(xì)胞(hes)培養(yǎng)基將未分化的人ipsc保持在作為飼養(yǎng)層的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)(millipore)上，如前所述¹。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定并檢測(cè)支原體感染²⁸。將人ipsc鋪在matrigel涂布的(millipore)培養(yǎng)皿上并在mef條件hes培養(yǎng)基(mef-cm)中培養(yǎng)直到達(dá)到60-100％匯合。然后，將細(xì)胞再次以5000細(xì)胞/cm²鋪在matreigel涂覆的培養(yǎng)皿上并在mef-cm中培養(yǎng)。第二天，細(xì)胞達(dá)到40-50％的匯合，細(xì)胞在補(bǔ)充有抗生素-抗真菌劑(lifetechnologies)的apel基礎(chǔ)培養(yǎng)基(stemcelltechnologies)中用8μmchir99021處理2-5天，然后用fgf9(200ngml-1)和肝素(1μgml^-1)再處理5-2天，每隔一天更換培養(yǎng)基。在第7天，使用胰蛋白酶或trypleselect(lifetechnologies)收集細(xì)胞并將其解離成單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞(0.5×10⁶)以×400g離心2分鐘以形成沉淀物，然后轉(zhuǎn)移到transwell0.4μm孔聚酯膜(#cls3450corning)上。用5μmchir99021在apel中處理沉淀物1小時(shí)，然后用fgf9(200ngml^-1)和肝素(1μgml^-1)培養(yǎng)5天，然后在apel基礎(chǔ)培養(yǎng)基中再培養(yǎng)6-13天，每周更換3次培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不應(yīng)超過膜之上。對(duì)于單層培養(yǎng)物中的分化，chir99021誘導(dǎo)后的細(xì)胞用fgf9(200ngml^-1)和肝素(1μgml^-1)處理10天，然后用apel基礎(chǔ)培養(yǎng)基再處理6天。在一些實(shí)驗(yàn)中，將ra(0.1μm)或agn193109(5μm)加入到fgf9培養(yǎng)基中。在實(shí)施例1中提供了描述類腎體生成的逐步方案。

免疫組化

對(duì)于單層細(xì)胞，如前所述進(jìn)行抗體染色¹。對(duì)于類腎體，將類器官用pbs中的2％多聚甲醛在4℃下固定20分鐘，然后用pbs洗滌3次。然后用10％驢血清，0.3％tritonx/pbs在室溫下封閉類器官2-3小時(shí)，并在4℃下與一抗孵育過夜。用0.1％tritonx/pbs洗滌5次后，將二抗在室溫下孵育4小時(shí)。使用以下抗體和稀釋度：兔抗pax2(1:300，#71-6,000，zymedlaboratories)，山羊抗-six1(1:300，#sc-9709，santacruzbiotechnology)，兔抗six2(1:300，#11562-1-ap，proteintech)，小鼠抗ecad(1:300，#610181，bdbiosciences)，兔抗wt1(1:100，#sc-192，santacruzbiotechnology)，小鼠抗hoxd11(1:300，#sab1403944，sigma-aldrich)，山羊抗gata3(1:300，af2605，r&dsystems)，兔抗jag1(1:300，#ab7771，abcam)，山羊抗cubilin(1：150，#sc-20607，santacruzbiotechnology)，綿羊抗nphs1(1:300，af4269，r&dsystems)，ltl-生物素綴合物(1:300，b-1325，vectorlaboratories)，dba-生物素綴合物(1:300，b-1035，vectorlaboratories)，小鼠抗krt8(1:300，#troma，dshb)，小鼠抗cd31(1:300，#555444，bdpharmingen)，兔抗kdr(1:300，#2479，cellsignalingtechnology)，山羊抗sox17(1:300，#af1924，r&dsystems)，兔抗ng2(1:300，#ab5320，merckmillipore)，兔抗sma(1:300，#ab15267，abcam)，小鼠抗-pdgfra(1:200，#556001，bdpharmingen)，兔抗層粘蛋白(1:300，#l9393，sigma-aldrich)，兔抗umod(1:300，#bt-590，biomedicaltechnologies)，小鼠抗meis1(1:300，#atm39795，activemotif)，山羊抗foxd1(1:200，#sc-47585，santacruzbiotechnology)和兔抗切割的casp3(1:300，#9661，cellsignalingtechnology)。使用nikonti-u顯微鏡或zeisslsm780共焦顯微鏡拍攝圖像。所有免疫熒光分析成功重復(fù)超過三次，并顯示代表性的圖像。

電子顯微鏡

使用以下方法對(duì)類器官進(jìn)行處理以用于電子顯微鏡分析。將5％戊二醛在2×pbs中的溶液直接加入到與生長(zhǎng)培養(yǎng)基相等體積的類器官培養(yǎng)皿中并置于真空下5分鐘。通過切成小塊(～2×2mm)將類器官尺寸減小，并在80w功率的pelcobiowave(tedpellain，redding，ca)中再次在真空下在2.5％新鮮固定劑中照射6分鐘。然后將樣品在0.1m二甲胂酸鹽緩沖液中洗滌4×2分鐘。然后將樣品在室溫下浸入含有鐵氰化鉀(3％)和四氧化鋨(2％)在0.1m二甲胂酸鹽緩沖液中的溶液中30分鐘。在蒸餾水中洗滌6×3分鐘后，將組織塊在含有硫代對(duì)稱二氨基脲(1％)的過濾溶液中在室溫下孵育30分鐘。隨后在蒸餾水中洗滌(6×2分鐘)后，將樣品在四氧化鋨水溶液(2％)中孵育30分鐘，然后在蒸餾水(6×2分鐘)中，并在1％的乙酸鈾酰水溶液中在4℃孵育30分鐘。在進(jìn)一步蒸餾水洗滌(2×2分鐘)后，將新鮮制備的溫?zé)嶂?0℃的天冬氨酸(ph5.5)中的0.06％硝酸鉛過濾溶液加入到培養(yǎng)皿中，并在60℃下進(jìn)一步孵育20分鐘，然后室溫下在蒸餾水中沖洗(6×3分鐘)。在pelcobiowave中，將組織塊在30％、50％、70％、90％和無水乙醇的各乙醇溶液中在250瓦特下脫水兩次40秒。eponlx112樹脂用于在pelcobiowave中的25％、50％和75％樹脂:無水乙醇浸漬下在250瓦特真空下埋入組織3分鐘，并用100％樹脂(2次)完成，然后在60℃下最終埋入/封閉和固化12小時(shí)。

qrt-pcr分析

使用purelinkrna迷你試劑盒(lifetechnologies)從細(xì)胞中提取總rna，并使用superscriptiii逆轉(zhuǎn)錄酶(lifetechnologies)從>100ng總rna合成cdna。通過rochelightcycler96實(shí)時(shí)pcr機(jī)用gotaqqpcrmastermix(promega)進(jìn)行qrt-pcr分析。所有絕對(duì)數(shù)據(jù)首先相對(duì)于gapdh歸一化，然后相對(duì)于對(duì)照樣品歸一化(δ-δ-ct法)。用于qrt-pcr的引物序列如表2所示。

使用keygenes的下一代rna測(cè)序和比較分析

使用illuminanextseq500(nextseq控制軟件v1.2/realtimeanalysisv2.1)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。文庫(kù)池(librarypool)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)nextseq500方案進(jìn)行稀釋和變性，并使用75個(gè)循環(huán)的nextseq500高產(chǎn)量試劑盒(目錄號(hào)fc-404-1005)進(jìn)行測(cè)序以產(chǎn)生單末端76bp的讀段(read)。使用star²⁹將讀段與參考人類基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)，并使用htseqpython包中的htseq-count生成ucsc注釋中的每個(gè)基因的讀段計(jì)數(shù)((http://www-huber.embl.de/users/anders/htseq/doc/index.html)。唯一映射讀段的數(shù)量范圍為每個(gè)樣本18810634-36706805。使用deseq2包³⁰計(jì)算歸一化的讀段數(shù)。

keygenes已經(jīng)用于將d0、d3、d11、d18類腎體的特性分值(identityscore)生成不同的第一妊娠期人體器官，包括腎臟(gse66302)¹⁵。顯示了來自第一和第二妊娠期(gse66302)的d0、d3、d11、d18類腎體細(xì)胞和21個(gè)人胎兒器官的分級(jí)聚類的樹形圖(圖13)是基于由keygenes(www.keygenes.nl；表3)確定的85個(gè)分類基因的表達(dá)水平的pearson相關(guān)分析。通過keygenes使用人胎兒數(shù)據(jù)的前500個(gè)最差異表達(dá)的基因計(jì)算分類基因，而不包括來自該數(shù)據(jù)集的胚胎外組織。

近端小管的功能分析

對(duì)于葡聚糖攝取測(cè)定，將第17天的類器官用10μgml^-1的10,000mw的葡聚糖alexa488綴合物(d-22910，lifetechnologies)培養(yǎng)24小時(shí)。將類器官固定并用ltl染色，不透化。對(duì)于腎毒性測(cè)定，將第17天的類器官用0、5、20或100μm順鉑(sigma-aldrich)培養(yǎng)24小時(shí)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)2或3個(gè)代表性區(qū)域中，使用imagej手動(dòng)計(jì)數(shù)凋亡近端小管與總近端小管的比例?？傆?jì)n＝5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。使用zeisslsm780共焦顯微鏡拍攝圖像。

結(jié)果與討論

我們以前在體外證實(shí)了im的形成需要fgf9或fgf2¹。因此，在體內(nèi)，我們假設(shè)ue形成于在原條階段之后不久暴露于fgf9和ra的早期遷移性psm細(xì)胞，而細(xì)胞晚遷移，因此暴露于更長(zhǎng)的wnt信號(hào)傳導(dǎo)，應(yīng)該引起mm¹³(圖7a)。為了證實(shí)這一點(diǎn)以及繼實(shí)施例1中所示的數(shù)據(jù)，我們?cè)诩尤雈gf9之前改變了初始wnt信號(hào)傳導(dǎo)(chir99201)的持續(xù)時(shí)間(圖7b)，并通過qpcr監(jiān)測(cè)了ai和pi的標(biāo)志物。chir99021的較短時(shí)期誘導(dǎo)了ai標(biāo)志物lhx1和gata3，而chir99021的較長(zhǎng)天數(shù)則在第7天增加了pi標(biāo)志物hoxd11和eya1。如預(yù)期的那樣，在chir99021中較長(zhǎng)時(shí)間后，psm標(biāo)記物tbx6和t的長(zhǎng)期表達(dá)表明fgf9誘導(dǎo)的命運(yùn)承諾的延遲(圖7c)。免疫熒光分析顯示chir99021的較長(zhǎng)(或較短)持續(xù)時(shí)間分別誘導(dǎo)較少(較多)的ai但較多(較少)的pi，如在第7天分化分別由gata3和hoxd11所示(圖7d)。這些觀察在培養(yǎng)18天后持續(xù)存在，在chir99201中較少的天數(shù)之后，具有優(yōu)勢(shì)的ue誘導(dǎo)(gata3⁺pax2⁺ecad⁺)，在chir66201中較長(zhǎng)的天數(shù)下mm(pax2⁺ecad^-)及其衍生物(pax2⁺ecad⁺)優(yōu)先誘導(dǎo)。此外，我們研究了ra信號(hào)傳導(dǎo)是否也使用ra或rar拮抗劑agn193109與fgf9一起控制im的a-p命運(yùn)模式(圖7e，f)。ra促進(jìn)ue誘導(dǎo)，而agn193109抑制ue但增強(qiáng)mm譜系的誘導(dǎo)(圖7g，h)。

這些結(jié)果增加了我們對(duì)胚胎發(fā)生的理解，并且提供了一種通過其調(diào)節(jié)對(duì)腎形成必不可少的兩種im衍生的祖細(xì)胞群的相對(duì)誘導(dǎo)的方法。因此，我們修改了現(xiàn)有的腎臟分化過程，以增加mm形成的比例，增加3d培養(yǎng)時(shí)間，積極觸發(fā)腎單位形成。該優(yōu)化方法應(yīng)用于hesc或人ipsc，并且包含初始4天的chir99021，其導(dǎo)致在單層培養(yǎng)中ue和mm的誘導(dǎo)，隨后是3天的fgf9，然后轉(zhuǎn)移至類器官培養(yǎng)(圖8a)。將所得聚集體培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)20天，在此期間它們自發(fā)形成復(fù)合的類腎體(圖8b)。在正常腎臟發(fā)育期間，響應(yīng)于從ue分泌的wnt9b啟動(dòng)由mm的腎單位形成。在小鼠中，可以通過添加規(guī)范的wnt激動(dòng)劑來觸發(fā)異位腎單位形成¹⁴。事實(shí)上，每個(gè)類器官的最大腎單位數(shù)在形成沉淀物后需要chir99021的脈沖1小時(shí)(圖8a和圖11a)。此外，在chir99021脈沖后繼續(xù)存在fgf9對(duì)于腎發(fā)生是必需的，這表明在wnt介導(dǎo)的腎單位誘導(dǎo)后fgf信號(hào)傳導(dǎo)的附加作用(圖11b)。在每個(gè)類器官內(nèi)，腎單位適當(dāng)分為4個(gè)組分，包括收集管(gata3⁺ecad⁺)，早期遠(yuǎn)端小管(gata3^-ltl^-ecad⁺)，早期近端小管(ltl⁺ecad^-)和腎小球(wt1⁺)(圖8c，d)。此外，類腎體顯示復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生模式，收集管樹形成在類器官的底部，連接到中部的遠(yuǎn)端和近端小管，每個(gè)類器官的頂部有腎小球(圖8e'，e”，e”')。這種模式模擬在體內(nèi)觀察到的組織的結(jié)構(gòu)化，其中腎小球在皮質(zhì)中出現(xiàn)，而收集管從中間輻射狀穿過器官。在這里，單個(gè)類器官內(nèi)的收集管與腎單位的相對(duì)水平可以隨著初始chir99201-至-fgf9開關(guān)的時(shí)間安排而變化。接下來，我們?cè)诰奂?d培養(yǎng)后的第(d)0、3、11和18天對(duì)整個(gè)類腎體進(jìn)行rna測(cè)序。在這個(gè)時(shí)間段，我們觀察到腎單位祖細(xì)胞基因表達(dá)的暫時(shí)性損失，但是包括足細(xì)胞、近端和遠(yuǎn)端小管的多個(gè)腎單位段的標(biāo)志物增加(圖12)。進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析，并使用無偏倚方法與從懷孕第一和/或第二妊娠期的21個(gè)人胎兒器官/組織的人胎兒轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較。該分析在第一妊娠期人胎兒腎臟培養(yǎng)的d11和d18時(shí)聚集了類腎體(圖8f，g；圖13)。在稍早期的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(d0，d3)，類器官與胎兒性腺(衍生自im的與胚胎密切相關(guān)的組織)更緊密地匹配。

在腎臟中，上皮細(xì)胞類型(腎單位和收集管)由其中存在血管網(wǎng)絡(luò)的腎間質(zhì)(基質(zhì))包圍。除了形成mm之外，im產(chǎn)生基質(zhì)和血管祖細(xì)胞(圖9a)^16,17。我們檢查了類腎體以證明其他細(xì)胞類型和功能成熟?？梢曰趐ax2、gata3和ecad的共表達(dá)來區(qū)分收集管(圖9b)。在d11，腎單位上皮顯示近端(ltl⁺ecad^-)和遠(yuǎn)端(ltl^-ecad⁺)元件(圖9c)。到d18，近端小管成熟以共表達(dá)ecad與ltl，cubilin在頂端表面明顯(圖9d，e)。透射電子顯微鏡(tem)顯示不同的上皮亞型；收集管/遠(yuǎn)端小管特有的、有很少的短的微絨毛圍繞開放管腔的細(xì)胞(圖9k)和顯示具有緊密連接的頂端刷狀緣的典型的近端腎小管上皮細(xì)胞(圖9l)。到d18，henle環(huán)(umod⁺)開始形成(圖9f)。到d11，觀察到包含具有中心足細(xì)胞形成的鮑曼氏囊的wt1⁺nphs1⁺早期腎小球¹⁸連接到近端小管(圖9g)。類腎體還發(fā)育出有腔形成的cd31⁺kdr⁺sox17⁺內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)(圖9h)。tem顯示足細(xì)胞特有的初級(jí)足突和次級(jí)足突的存在(圖9m)。在發(fā)育中的腎臟中，腎間質(zhì)分化為周細(xì)胞和系膜細(xì)胞¹⁹。正如預(yù)期的那樣，如在人胎兒腎臟²⁰中觀察到的，類腎體含有沿著kdr⁺內(nèi)皮和pdgfra⁺早期腎小球系膜細(xì)胞侵襲腎小球的pdgfra⁺血管周圍細(xì)胞(圖14a，b)。早期無血管性腎小球包含基底膜，如層粘連蛋白染色和tem所示，并顯示足突附著在基底膜上。在一些情況下，腎小球顯示內(nèi)皮侵襲的證據(jù)(圖9i)，這是在移植的胚胎小鼠腎臟中未見的特征²¹。最后，腎單位被meis1⁺腎間質(zhì)細(xì)胞²²包圍，其中一些也是foxd1⁺(圖9j)，表明存在皮質(zhì)(foxd1⁺meis1⁺)和髓質(zhì)(foxd1^-meis1⁺)基質(zhì)。因此，所有預(yù)期的腎組分形成、構(gòu)型并開始在這些hpsc衍生的類腎體中成熟。與這些觀察結(jié)果一致的是培養(yǎng)中隨時(shí)間的轉(zhuǎn)錄變化，伴隨著腎原性間充質(zhì)和輸尿管尖端標(biāo)志物的逐漸減少，隨后是對(duì)足細(xì)胞、近端小管、遠(yuǎn)端小管和henle環(huán)的特異性基因的上調(diào)^23,24(圖11)。

干細(xì)胞來源的類腎體用于疾病建?；蛩幬锖Y選的效用將取決于這些類器官內(nèi)的腎單位的功能成熟。為了試驗(yàn)這一點(diǎn)，我們專注于近端小管，一個(gè)在溶質(zhì)、維生素、激素和氨基酸重吸收中起重要作用的腎單位段。通過在暴露24小時(shí)后ltl⁺小管從培養(yǎng)基中選擇性攝取葡聚糖-alexa488，證明了cubilin介導(dǎo)的近端小管特異性內(nèi)吞的能力(圖10a)。近端小管由于多藥耐藥性(如abcb1，abcg2)和陰離子和陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如slc22基因家族)^23,24的表達(dá)而代表腎毒性的特定靶標(biāo)。順鉑是誘導(dǎo)腎臟近端腎小管細(xì)胞的半胱天冬酶介導(dǎo)的急性細(xì)胞凋亡的腎毒劑之一^25,26。我們用0、5和20μm順鉑處理類腎體24小時(shí)，然后檢查切割的casp3抗體染色。雖然對(duì)照類器官有時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的間質(zhì)細(xì)胞，但5μm和20μm順鉑均誘導(dǎo)成熟近端小管細(xì)胞(ltl⁺ecad⁺)的特異性急性細(xì)胞凋亡，而未成熟細(xì)胞(ltl⁺ecad^-)未發(fā)生細(xì)胞凋亡(圖10b，c)。

總之，這項(xiàng)研究表明，通過仔細(xì)平衡im與小分子的a/p模式化，可以引導(dǎo)人多能干細(xì)胞形成復(fù)合多細(xì)胞類腎體，所述復(fù)合多細(xì)胞類腎體包含由內(nèi)皮和腎間質(zhì)包圍的完全分段的腎單位，并且與人胎腎轉(zhuǎn)錄相似。因此，這將提高我們對(duì)人腎臟發(fā)育的認(rèn)識(shí)。每個(gè)類腎體達(dá)到>500個(gè)腎單位/類器官的實(shí)質(zhì)大小，該數(shù)字相當(dāng)于14.5dpc下的小鼠腎臟²⁷。盡管關(guān)于管狀功能成熟度、腎小球血管形成和具有尿液?jiǎn)纬隹诼窂降倪B續(xù)收集管上皮還有進(jìn)一步改善的空間，但是觀察到的組織復(fù)雜性和類器官功能化程度支持其用于篩選藥物的毒性、建模遺傳性腎病或作為細(xì)胞療法的特定腎細(xì)胞類型的來源。

我們可以從單獨(dú)的分化hes細(xì)胞培養(yǎng)物形成類器官的事實(shí)打開了產(chǎn)生基于組織的腎毒性篩選、體外疾病模型或開發(fā)可移植類器官以補(bǔ)充腎功能的可能性。它還表明產(chǎn)生特異性成熟腎細(xì)胞類型以供以后純化的可行性。

使用此方法生成的細(xì)胞的特定用途可能包括：

·產(chǎn)生微型類腎體或純化的腎細(xì)胞用于腎毒性篩選；

·產(chǎn)生微型類腎體或純化的腎細(xì)胞用于疾病建模，無論是一般性地還是為每一名患者的；和/或

·產(chǎn)生微型類腎體或純化的腎細(xì)胞類型用于治療腎病的藥物篩選。

這些可以在微型生物反應(yīng)器中進(jìn)行，或者在生物打印成更大格式的屏幕之后進(jìn)行。對(duì)于疾病建?；蛩幬锖Y選，我們可能會(huì)以根據(jù)具體疾病提供有用信息的方式或格式來純化個(gè)體細(xì)胞類型并進(jìn)行培養(yǎng)。例如，我們可以分離ub并在matrigel培養(yǎng)物中生長(zhǎng)以評(píng)估包囊形成(例如用于疾病例如腎單位腎癆(nephronopthisis))或分離mm以產(chǎn)生足細(xì)胞(例如用于芬蘭腎病或alport綜合征等疾病)。

細(xì)胞療法和器官替代或修復(fù)的具體實(shí)例可包括：

·產(chǎn)生腎細(xì)胞類型用于細(xì)胞療法(急性腎損傷或慢性腎損傷)；

·產(chǎn)生腎細(xì)胞類型用于全器官替代生物工程，這可能需要將多個(gè)較小的腎連接在一起，形成替代“器官”；和/或

·產(chǎn)生腎細(xì)胞類型用于脫細(xì)胞支架的再細(xì)胞化。

·其他應(yīng)用包括：

·1)由這樣的人多能干細(xì)胞系產(chǎn)生類腎體，其被工程化以報(bào)告一種或多種熒光報(bào)告子作為分化為特定腎細(xì)胞類型的讀出。這將允許由單個(gè)起始細(xì)胞系產(chǎn)生類器官，其將報(bào)告分化的復(fù)雜程度，而不需要特異性抗體可視化，并且將促進(jìn)組合facs分選以從一種分化純化多種特異性腎細(xì)胞類型。這種分選的細(xì)胞可能在細(xì)胞療法中有用。

·2)由這樣的人多能干細(xì)胞系產(chǎn)生類腎體，其被工程化以報(bào)告一種或多種基于熒光或熒光素酶的報(bào)告子，作為細(xì)胞損傷的讀出(對(duì)腎毒性、細(xì)胞毒性或誘導(dǎo)凋亡/壞死的預(yù)測(cè)反應(yīng))。這將允許產(chǎn)生用于藥物或腎毒性篩選并具有可計(jì)量的反應(yīng)讀出的類器官。

·3)產(chǎn)生單獨(dú)的收集管或單獨(dú)的后腎間充質(zhì)以與其他生物打印結(jié)構(gòu)組合。例如，產(chǎn)生單獨(dú)的腎單位形成間充質(zhì)用于與分別分化但生物打印成輸尿管樹的收集管細(xì)胞組合。這里的優(yōu)點(diǎn)將是創(chuàng)建特定模式化的收集管網(wǎng)絡(luò)，圍繞該網(wǎng)絡(luò)腎單位可以分化，使得最終產(chǎn)物可以充當(dāng)能夠?qū)⒛蛞龑?dǎo)到單個(gè)出口的可移植器官。

在整個(gè)說明書中，目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不將本發(fā)明限制于任何一個(gè)實(shí)施方案或特定的特征集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)本公開，可以在所示的具體實(shí)施方案中進(jìn)行各種修改和改變，而不脫離本發(fā)明的范圍。

本文引用的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)都通過引用并入本文。

表1.試劑來源

表2:用于qrtpcr的引物序列

表3

參考文獻(xiàn)

1.takasato,m.etal.directinghumanembryonicstemcelldifferentiationtowardsarenallineagegeneratesaself-organizingkidney.nat.cellbiol.16,118–26(2014).

2.james,r.g.&schultheiss,t.m.patterningoftheavianintermediatemesodermbylateralplateandaxialtissues.dev.biol.253,109–124(2003).

3.mae,s.etal.monitoringandrobustinductionofnephrogenicintermediatemesodermfromhumanpluripotentstemcells.nat.commun.4,1367(2013).

4.xia,y.etal.directeddifferentiationofhumanpluripotentcellstouretericbudkidneyprogenitor-likecells.nat.cellbiol.15,1507–15(2013).

5.taguchi,a.etal.redefiningtheinvivooriginofmetanephricnephronprogenitorsenablesgenerationofcomplexkidneystructuresfrompluripotentstemcells.cellstemcell14,53–67(2014).

6.lam,a.q.etal.rapidandefficientdifferentiationofhumanpluripotentstemcellsintointermediatemesodermthatformstubulesexpressingkidneyproximaltubularmarkers.j.am.soc.nephrol.25,1211–1225(2014).

7.kang,m.&han,y.differentiationofhumanpluripotentstemcellsintonephronprogenitorcellsinaserumandfeederfreesystem.plosone9,e94888(2014).

8.xu,j.etal.eya1interactswithsix2andmyctoregulateexpansionofthenephronprogenitorpoolduringnephrogenesis.dev.cell31,434–47(2014).

9.duester,g.retinoicacidsynthesisandsignalingduringearlyorganogenesis.cell134,921–31(2008).

10.sakai,y.etal.theretinoicacid-inactivatingenzymecyp26isessentialforestablishinganunevendistributionofretinoicacidalongtheanterio-posterioraxiswithinthemouseembryo.genesdev.15,213–25(2001).

11.abu-abed,s.etal.theretinoicacid-metabolizingenzyme,cyp26a1,isessentialfornormalhindbrainpatterning,vertebralidentity,anddevelopmentofposteriorstructures.genesdev.15,226–40(2001).

12.sweetman,d.,wagstaff,l.,cooper,o.,weijer,c.&münsterberg,a.themigrationofparaxialandlateralplatemesodermcellsemergingfromthelateprimitivestreakiscontrolledbydifferentwntsignals.bmcdev.biol.8,63(2008).

13.takasato,m.&little,m.h.theoriginofthemammaliankidney:implicationsforrecreatingthekidneyinvitro.development142,1937–1947(2015).

14.park,j.etal.six2andwntregulateself-renewalandcommitmentofnephronprogenitorsthroughsharedgeneregulatorynetworks.dev.cell23,637–51(2012).

15.roost,m.s.etal.keygenes,atooltoprobetissuedifferentiationusingahumanfetaltranscriptionalatlas.stemcellreports4,1112–1124(2015).

16.mugford,j.w.,p.,mcmahon,j.a.&mcmahon,a.p.osr1expressiondemarcatesamulti-potentpopulationofintermediatemesodermthatundergoesprogressiverestrictiontoanosr1-dependentnephronprogenitorcompartmentwithinthemammaliankidney.dev.biol.324,88–98(2008).

17.sims-lucas,s.etal.endothelialprogenitorsexistwithinthekidneyandlungmesenchyme.plosone8,1–8(2013).

18.brunskill,e.w.,georgas,k.,rumballe,b.,little,m.h.&potter,s.s.definingthemolecularcharacterofthedevelopingandadultkidneypodocyte.plosone6,(2011).

19.kobayashi,a.etal.identificationofamultipotentself-renewingstromalprogenitorpopulationduringmammaliankidneyorganogenesis.stemcellreports3,650–662(2014).

20.floege,j.etal.localizationofpdgfalpha-receptorinthedevelopingandmaturehumankidney.kidneyint.51,1140–1150(1997).

21.loughna,s.,yuan,h.t.&woolf,a.s.effectsofoxygenonvascularpatterningintie1/laczmetanephrickidneysinvitro.biochem.biophys.res.commun.247,361–6(1998).

22.brunskill,e.w.etal.atlasofgeneexpressioninthedevelopingkidneyatmicroanatomicresolution.dev.cell15,781–91(2008).

23.thiagarajan,r.d.,etal.identificationofanchorgenesduringkidneydevelopmentdefinesontologicalrelationships,molecularsubcompartmentsandregulatorypathways.plosone.6(2):e17286(2011).

24.cheng,x.&klassen,c.d.tissuedistribution,ontogeny,andhormonalregulationofxenobiotictransportersinmousekidneys.drugmetab.dispos.37,2178-85(2009)

25.mese,h.,sasaki,a.,nakayama,s.,alcalde,r.e.&matsumura,t.theroleofcaspasefamilyprotease,caspase-3oncisplatin-inducedapoptosisincisplatin-resistanta431cellline.cancerchemother.pharmacol.46,241–245(2000).

26.cummings,b.s.&schnellmann,r.g.cisplatin-inducedrenalcellapoptosis:caspase3-dependentand-independentpathways.j.pharmacol.exp.ther.302,8–17(2002).

27.short,k.m.etal.globalquantificationoftissuedynamicsinthedevelopingmousekidney.dev.cell29,188–202(2014).

28.briggs,j.a.etal.integration-freeinducedpluripotentstemcellsmodelgeneticandneuraldevelopmentalfeaturesofdownsyndromeetiology.stemcells31,467–78(2013).

29.dobin,a.etal.star:ultrafastuniversalrna-seqaligner.bioinformatics29,15–21(2013).

30.love,m.i.,huber,w.&anders,s.moderatedestimationoffoldchangeanddispersionforrna-seqdatawithdeseq2.genomebiol.15,550(2014).

31.orlovavv,vandenhilfe,petrus-reurers,drabschy,tendijkep,mummerycl.generation,expansionandfunctionalanalysisofendothelialcellsandpericytesderivedfromhumanpluripotentstemcells.natprotoc.2014；9(6):1514-31.