本發(fā)明屬于發(fā)酵
技術領域：
，具體涉及一種提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及獲得酵母菌株，尤其是利用脯氨酸合成途徑中的關鍵基因pro1提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及獲得酵母菌株。
背景技術：
：人類社會對化石能源的依賴延伸到生活的方方面面。然而，由于化石燃料的不可再生性，石油逐漸成為困擾世界各國經(jīng)濟和社會發(fā)展的重大問題。為了應對日益嚴重的能源危機，以木質纖維素如農作物秸稈、城市固體垃圾等為原料，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)新的可替代能源-燃料乙醇成為各國研究者關注的熱點。然而木質纖維素原料預處理過程中的高溫高壓條件會導致一系列對微生物細胞有毒的物質產(chǎn)生，主要包括呋喃類、弱酸類和酚類等，其中糠醛、乙酸和苯酚是三類抑制劑的典型代表。釀酒酵母作為生產(chǎn)乙醇的傳統(tǒng)菌株，廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中。天然的釀酒酵母對預處理過程中產(chǎn)生的大量抑制劑具有較低的耐受能力，影響后續(xù)的發(fā)酵效率和乙醇得率。而傳統(tǒng)的脫毒步驟增加操作成本，降低纖維素乙醇的價格競爭優(yōu)勢。因此提高酵母菌株對抑制劑耐受性，尤其是對三種代表復合抑制劑的耐受能力，對推進纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及獲得酵母菌株。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種提高酵母細胞對復合抑制劑耐受能力的方法，構建含有表達pro1d154n,g220c突變體的重組質粒，轉化酵母細胞。。在一些實施方案中，所述重組質粒為prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t。其中，所述pro1d154n,g220c具有seqidno:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明提高酵母細胞對復合抑制劑耐受能力的方法中所述轉化酵母細胞為釀酒酵母宿主菌。在一些實施方案中，釀酒酵母宿主菌為釀酒酵母宿主菌by4742。本發(fā)明還提供了耐受復合抑制劑的酵母菌株，包含重組質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的酵母菌株。在一些實施方案中，所述酵母菌株為釀酒酵母宿主菌by4742。優(yōu)選的，所述pro1d154n,g220c具有seqidno:1所示的氨基酸序列。實驗表明，本發(fā)明所述酵母菌株能明顯增強對復合抑制劑的耐受性。因此，本發(fā)明還提供所述酵母菌株在復合抑制劑存在下發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇中的應用。本發(fā)明還提供一種在復合抑制劑存在下發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，將本發(fā)明所述酵母菌株接種纖維素水解液發(fā)酵。由上述技術方案可知，本發(fā)明提供了提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及獲得酵母菌株。本發(fā)明所述提高酵母細胞對復合抑制劑耐受能力的方法通過基因工程技術構建包含pro1d154n,g220c突變體的重組質粒，轉化酵母細胞，通過酵母菌株中的pro1基因上第154位(d154n)和第220位(g220c)的同時突變，實現(xiàn)對酵母細胞耐受纖維素水解抑制物能力的調控，提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本發(fā)明所述酵母菌株為包含重組質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株sybe_sc0150012。實驗結果表明本發(fā)明所述酵母菌株對復合抑制劑耐受性能顯著增強。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實 施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示實施例1所述prs416-hxt7p-pro1-tef1t質粒譜圖；圖2示實施例1所述prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t質粒譜圖；圖3示實施例1所述prs416-hxt7p-pro1g220c-tef1t質粒譜圖；圖4示實施例1所述prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t質粒譜圖；圖5示實施例1所述pro1突變體pro1d154n,g220c的表達對釀酒酵母在含有復合抑制劑的液體培養(yǎng)基中生長能力的影響圖；圖6示實施例2所述pro1突變體pro1d154n,g220c的表達對釀酒酵母在含有復合抑制劑的固體培養(yǎng)基中生長能力的影響圖，其中圖中每一列分別表示加入不同種子密度的菌液點，從左到右菌液點的種子密度od600依次為50、5、0.5、0.05、0.005。具體實施方式下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了如下技術方案。一種提高酵母細胞對復合抑制劑耐受能力的方法，構建含有表達pro1d154n,g220c突變體的重組質粒，轉化酵母細胞。本發(fā)明通過基因工程技術構建包含表達pro1d154n,g220c突變體的重組質粒，轉化酵母細胞，通過酵母菌株中的pro1基因上第154位(d154n)和第220位(g220c)的同時突變，實現(xiàn)對酵母細胞耐受纖維素水解抑制物能力的調控，提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受性。在一些實施方案中，所述重組質粒為prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t。其中，所述pro1d154n,g220c具有seqidno:1所示的氨基酸序列。本領域技術人員可以按照公知的方法構建本發(fā)明所述重組質粒。在一些實施方案中，本發(fā)明所述方法分別擴增啟動子hxt7p和終止子tef1t，酶切后依次將啟動子hxt7p和終止子tef1t連入質粒prs416中得到質粒prs416-hxt7p-tef1t；然后擴增pro1d154n,g220c，酶切后插入到質粒prs416-hxt7p-tef1t中啟動子hxt7p和終止子tef1t中間，得到質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t，質粒譜圖如圖1所示。所述pro1d154n,g220c中的突變位點為d154n、g220c。即pro1氨基酸序列中154位d突變?yōu)閚、220位g突變?yōu)閏。所述pro1d154n,g220c具有seqidno:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明提高酵母細胞對復合抑制劑耐受能力的方法中所述轉化酵母細胞為釀酒酵母宿主菌。在一些實施方案中，釀酒酵母宿主菌為釀酒酵母宿主菌by4742。本發(fā)明也提供了耐受復合抑制劑的酵母菌株。在一些實施方案中，所述酵母菌株為包含重組質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的酵母菌株。優(yōu)選的，所述酵母菌株為釀酒酵母宿主菌by4742。在一些具體實施例中，所述耐受復合抑制劑的酵母菌株為包含重組質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的釀酒酵母宿主菌by4742，命名為sybe_sc0150012。實驗表明，本發(fā)明所述酵母菌株能明顯增強對復合抑制劑的耐受性。因此，本發(fā)明還提供所述酵母菌株在復合抑制劑存在下發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇中的應用。其中，所述復合抑制劑為糠醛、乙酸和苯酚。本發(fā)明還提供一種在復合抑制劑存在下發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，將本發(fā)明所述酵母菌株接種纖維素水解液發(fā)酵。其中，纖維素水解液發(fā)酵含有糠醛、乙酸和苯酚。由上述技術方案可知，本發(fā)明提供了提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及獲得酵母菌株。本發(fā)明所述提高酵母細胞對復合抑制劑耐受能力的方法通過基因工程技術構建包含pro1d154n,g220c突變體的重組質粒，轉化酵母細胞，通過酵母菌株中的pro1基因上第154位 (d154n)和第220位(g220c)的同時突變，實現(xiàn)對酵母細胞耐受纖維素水解抑制物能力的調控，提高酵母細胞對復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本發(fā)明所述酵母菌株為包含重組質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株sybe_sc0150012。實驗結果表明本發(fā)明所述酵母菌株對復合抑制劑耐受性能顯著增強。為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1：pro1d154n,g220c的表達增強釀酒酵母在含有復合抑制劑的液體培養(yǎng)基中的生長能力1、培養(yǎng)基的配制sc-ura液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，氨基酸缺省混合物2g/l，20mg/l組氨酸，20mg/l亮氨酸，20mg/l色氨酸，115℃滅菌15min。sc-ura固體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，氨基酸缺省混合物2g/l，20mg/l組氨酸，20mg/l亮氨酸，20mg/l色氨酸，20g/l瓊脂粉，115℃滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基：sc-ura液體培養(yǎng)基，在接種前加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為0.78g/l，乙酸的含量為3.18g/l，苯酚的含量為0.3g/l。2、質粒構建與酵母轉化2.1、質粒構建以釀酒酵母s288c的基因組為模版，以表1中的hxt7p_f為上游引物，hxt7p_r為下游引物，擴增啟動子hxt7p；以下表中的tef1t_f為上游引物，tef1t_r為下游引物，擴增終止子tef1t。使用限制性內切酶bamhi和ecori酶切啟動子hxt7p片段，利用連接體系1將片段hxt7p連入質粒prs416，形成質粒prs416-hxt7p。使用限制性內切酶sali和xhoi酶切終止子tef1t片段和質粒prs416-hxt7p，利用連接體系2將片段tef1t同時連入質粒prs416-hxt7p中，得到質粒prs416-hxt7p-tef1t。以pro1_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以釀酒酵母s288c的基因組為模版，采用pcr體系1擴增pro1片段。之后使用限制性內切酶ecori和sali 酶切片段pro1和質粒prs416-hxt7p-tef1t，利用連接體系3將基因pro1插入到啟動子hxt7p和終止子tef1t中間，得到質粒prs416-hxt7p-pro1-tef1t，質粒譜圖如圖1所示。以pro1_f為上游引物，p154_r為下游引物，以釀酒酵母s288c的基因組為模版，采用pcr體系1擴增pro1d154n-1片段，以p154_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以釀酒酵母s288c的基因組為模版，采用pcr體系1擴增基因pro1d154n-2片段，以pro1_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以片段pro1d154n-1和pro1d154n-2為模版，采用pcr體系2進行重疊延伸pcr，得到片段pro1d154n。之后使用限制性內切酶ecori和sali酶切片段pro1d154n和質粒prs416-hxt7p-tef1t，利用連接體系4將基因pro1d154n插入到啟動子hxt7p和終止子tef1t中間，得到質粒prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t，質粒譜圖如圖2所示。以pro1_f為上游引物，p220_r為下游引物，以釀酒酵母s288c的基因組為模版，采用pcr體系1擴增pro1g220c-1片段，以p220_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以釀酒酵母s288c的基因組為模版，采用pcr體系1擴增基因pro1g220c-2片段，以pro1_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以片段pro1g220c-1和pro1g220c-2為模版，采用pcr體系2進行重疊延伸pcr，得到片段pro1g220c。之后使用限制性內切酶ecori和sali酶切片段pro1g220c和質粒prs416-hxt7p-tef1t，利用連接體系5將基因pro1g220c插入到啟動子hxt7p和終止子tef1t中間，得到質粒prs416-hxt7p-pro1g220c-tef1t，質粒譜圖如圖3所示。以pro1_f為上游引物，p220_r為下游引物，以質粒prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t為模版，采用pcr體系1擴增pro1d154n,g220c-1片段，以p220_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t為模版，采用pcr體系1擴增基因pro1d154n,g220c-2片段，以pro1_f為上游引物，pro1_r為下游引物，以片段pro1d154n,g220c-1和pro1d154n,g220c-2為模版，采用pcr體系2進行重疊延伸pcr，得到片段pro1d154n,g220c。之后使用限制性內切酶ecori和sali酶切片段 pro1d154n,g220c和質粒prs416-hxt7p-tef1t，利用連接體系6將基因pro1d154n,g220c插入到啟動子hxt7p和終止子tef1t中間，得到質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t，質粒譜圖如圖4所示。表1引物序列primeridsequence(5’-3’)hxt7p_fccccccgggagaaggttttgggacgctchxt7p_rcggaattctttttgattaaaattaaaaaaactttttgtef1p_fcgcggatccaatgtttctactccttttttactcttctef1p_rcggaattctttgtaattaaaacttagattagattgctattef1t_facgcgtcgacaaataaggagattgataagacttttctef1t_rccctcgagggctaactctcaacagacaacaacpro1_fcggaattcatgaaggatgctaatgagagtaaatpro1_racgcgtcgactcaacgaggtgggaatgccp154_ftggtaacaatgacactttatcagcaatp154_rattgctgataaagtgtcattgttaccap220_fcgttgggacctgtggtatggp220_rccataccacaggtcccaacg其中pcr擴增體系1為100μl：64.5μlddh2o，20μl5×buffer，1μldna聚合酶，2.5μl10mmdntp，4μldna模板，4μl上游引物，4μl下游引物。pcr反應條件為：95℃5min進行1輪；95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，進行30輪；72℃延伸10min進行1輪。pcr擴增體系2為100μl：48.5μlddh2o，20μl5×buffer，1μldna聚合酶，2.5μl10mmdntp，20μldna模版(片段1和片段2的摩爾比為1:1)，4μl上游引物，4μl下游引物。pcr反應條件為：95℃5min進行1輪；95℃30s，退火溫度為65℃-51℃，每個循環(huán)降0.5℃，退火時間為30s，72℃延伸50s，進行28輪；95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，進行8輪；72℃延伸10min進行1輪。柱回收pcr產(chǎn)物，50μl洗脫液溶解dna樣品。酶切反應體系50μl：40μldna片段，5μl10×buffer，2.5μl酶1，2.5μl酶2；37℃酶切反應30min-50min，之后柱回收酶切產(chǎn)物，30μl洗脫液溶解dna片段。連接體系1為10μl：hxt7p片段7μl，載體1.5μl，10×buffer1μl，連接酶1μl。連接體系2為10μl：tef1t片段7μl，載體1.5μl，10×buffer1μl，連接酶1μl。連接體系3為10μl：pro1片段7μl，載體1.5μl，10×buffer1μl，連接酶1μl。連接體系4為10μl：pro1d154n片段7μl，載體1.5μl，10×buffer1μl，連接酶1μl。連接體系5為10μl：pro1d220c片段7μl，載體1.5μl，10×buffer1μl，連接酶1μl。連接體系6為10μl：pro1d154n,d220c片段7μl，載體1.5μl，10×buffer1μl，連接酶1μl。反應條件：22℃，30min。每次的連接產(chǎn)物都需轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，獲得平板轉化子，利用m13f與m13r這兩個引物進行菌落pcr，篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接到lb-amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時，保存一份菌液，取少量樣品送交公司進行dna測序，將測序正確的質粒用于酵母轉化。2.2、酵母轉化將質粒prs416、prs416-hxt7p-pro1-tef1t、prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t、prs416-hxt7p-pro1g220c-tef1t和prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t轉化酵母菌株by4742，分別得到重組菌株sybe_sc0150011(by4742/prs416)、sybe_sc0150020(prs416-hxt7p-pro1-tef1t)、sybe_sc0150019(by4742/prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t)、sybe_sc0150031(by4742/prs416-hxt7p-pro1g220c-tef1t)和sybe_sc0150012(by4742/prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t)。酵母轉化采用傳統(tǒng)的醋酸鋰法：菌株by4742在液體ypd培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜，以初始od600＝0.1接種于5ml液體ypd中培養(yǎng)5～7h，1.5ml離心管5000rpm收集細胞，水洗一遍，離心棄水，之后向細胞中加入1ml0.1mol/l的liac離心棄廢液，重復兩遍，第二次盡量吸除liac，向殘余細胞中分別加入40μl水、10μl質粒dna、240μlpeg(50％m/v)、36ml1.0mol/lliac、25μlssdna，劇烈震蕩直至細胞完全混勻，30℃培養(yǎng)箱保溫30min，42℃水浴中熱激25min，4000rpm離心2min，棄上清，加入1ml無菌水，用小槍吹勻細胞，后4000rpm離心2min，棄上清，將細胞在無菌水中懸浮涂在sc-ura平板上，30℃培養(yǎng)箱上培養(yǎng)。酵母轉化子在sc-ura培養(yǎng)基上篩選。3、發(fā)酵分別將菌株sybe_sc0150011、sybe_sc0150012、sybe_sc0150019、sybe_sc0150020和sybe_sc0150031在含有sc-ura的固體培養(yǎng)基上活化，然后挑去單菌落接種于5ml的sc-ura液體培養(yǎng)基中，在30℃、150rpm條件下培養(yǎng)12h。將一級種子接種于100mlsc-ura液體培養(yǎng)基中，在30℃、150rpm條件下培養(yǎng)16h-20h。然后以od600＝0.2的初始菌體濃度接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、150rpm條件下培養(yǎng)，測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線，結果如圖5所示。圖5顯示，在含有復合抑制劑糠醛、乙酸和苯酚的培養(yǎng)條件下，對照菌株sybe_sc0150011經(jīng)過長達100h的延滯期進入指數(shù)生長期，并在125h左右完成發(fā)酵。而質粒prs416-hxt7p-pro1-tef1t、pro1的154位氨基酸突變的質粒prs416-hxt7p-pro1d154n-tef1t和pro1的220位氨基酸突變的pro1的prs416-hxt7p-pro1g220c-tef1t的表達，使得菌株sybe_sc0150020、sybe_sc0150019和sybe_sc0150031在復合抑制劑條件下的液體培養(yǎng)基中生長能力有所增強，發(fā)酵時間縮短到100h左右。而pro1154位和220位氨基酸的同時突變，使得表達質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的菌株sybe_sc0150012在含有復合抑制劑的液體培養(yǎng)基中的生長能力顯著增強，在33h左右就可進入生長穩(wěn)定期。結果表明在釀酒酵母細胞中表達突變基因pro1d154n,g220c，能夠增強酵母菌株對復合抑制劑的耐受性，pro1基因上第154位(d154n)和第220位(g220c)的同時突變，顯著增加酵母細胞的復合抑制劑耐受性。實施例2：pro1d154n,g220c的表達增強釀酒酵母在含有復合抑制劑的固體培養(yǎng)基上的生長能力1、培養(yǎng)基的配制sc-ura液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，氨基酸缺省混合物2g/l，20mg/l組氨酸，20mg/l亮氨酸，20mg/l色氨酸，115℃滅菌15min。sc-ura固體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，氨基酸缺省混合物2g/l，20mg/l組氨酸，20mg/l亮氨酸，20mg/l色氨酸，20g/l瓊脂粉，115℃滅菌15min。生長培養(yǎng)基：sc-ura固體培養(yǎng)基，加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為0.78g/l，乙酸的含量為3.18g/l，苯酚的含量為0.3g/l。2、發(fā)酵將實施例1所述菌株sybe_sc0150011、sybe_sc0150012、sybe_sc0150019、sybe_sc0150020和sybe_sc0150031在含有sc-ura固體培養(yǎng)基上活化，然后挑取單菌落接種于5ml的sc-ura液體培養(yǎng)基中，在30℃、150rpm條件下培養(yǎng)12h。將一級種子接種于100ml種子液體培養(yǎng)基中，在30℃、150rpm條件下培養(yǎng)16h-20h。然后將種子密度od600濃縮到50，10倍倍比稀釋至0.005，分別取5μl的菌液點到含有復合抑制劑的生長培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天觀察細胞生長，，結果如圖6所示。圖6顯示，在含有復合抑制的固體平板上，對照菌株sybe_sc0150011、sybe_sc0150020、sybe_sc0150019和sybe_sc0150031的第一個菌斑基本沒有生長，而表達質粒prs416-hxt7p-pro1d154n,g220c-tef1t的菌株sybe_sc0150012在含有復合抑制劑的固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢。結果表明在釀酒酵母細胞中表達突變基因pro1d154n,g220c，能夠增強酵母菌株對復合抑制劑的耐受性，pro1基因上第154位(d154n)和第220位(g220c)的同時突變，顯著增加酵母細胞的復合抑制劑耐受性。當前第1頁12