發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體的，提供了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)示蹤以及引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法，即一種能在培養(yǎng)細(xì)胞中定位顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。
背景技術(shù)：
：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有極強的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系。但仍然有很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。例如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、同型半胱氨酸等化學(xué)物質(zhì)處理、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過快以至于超過蛋白折疊能力、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂、卵磷脂合成障礙等多種物理、化學(xué)或遺傳因素等均可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細(xì)胞進(jìn)化出一套完整的機制來監(jiān)督和幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與修飾。而當(dāng)錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積時，細(xì)胞通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對其進(jìn)行應(yīng)答，包括增強蛋白質(zhì)折疊能力、停滯大多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯、加速蛋白質(zhì)的降解等。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂持續(xù)，細(xì)胞將最終啟動caspase12(天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶家族成員12)依賴的細(xì)胞凋亡程序。這些反應(yīng)被統(tǒng)稱為未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(unfoldedproteinresponse，upr)。因此了解研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)對于研究細(xì)胞對于環(huán)境耐受、藥物作用、抗病毒以及腫瘤發(fā)生等現(xiàn)象有重要的意義。例如，乙肝病毒為一基因組僅為3.2kb的不完全雙鏈dna病毒。作為嗜肝病毒，人hbv的感染宿主僅限人類和猩猩，尚無有效的細(xì)胞和動物感染模型，限制了人們的研究工作，人類對其感染復(fù)制過程的認(rèn)識仍非常有限。已知乙肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后，其基因組dna進(jìn)入細(xì)胞核，并在那里修復(fù)形成完全雙鏈dna(cccdna)，再轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組rna(pregenomerna)，首先在新合成的病毒核衣殼內(nèi)經(jīng)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成病毒負(fù)鏈dna(4)，并以其為模板合成出不完整地病毒正鏈，并裝配成完整病毒，出胞釋放形成新的感染。s基因區(qū)全長1167hp,由s基因、前s1、前s2基因組成.s甚因(678bp)編碼含226個氨基酸的多肽,稱為s蛋白、小表面抗原(shbsag)或主蛋白；前s2基因 (165bp)編碼含55個氨基酸的多肽,稱為前s2蛋白；前s1基因(324hp)編碼含109個氨基峻的多肽,稱為前s1蛋白.前s2基因和s基因連續(xù)編碼的多肽(含前s2蛋白和s蛋白)稱為中表面蛋白(mhbsag)或中蛋白；前s1基因、前s2基因和s基因連續(xù)編碼的多肽(含前s1蛋白、前s2蛋白和s蛋白)稱為大表面抗原(lhbsag)或大蛋白.鑒于主蛋白、中蛋白和大蛋白的稱呼不能反映其含義,又易相互混淆.故目前已傾向于以shbsag、mhbsag、lhbsag分別取代之.s基因區(qū)上述各段編碼產(chǎn)物均屬于hbv包膜蛋白(hbsag)的范疇。三種表面蛋白雖然使用同一個開放閱讀框，但是卻受兩個不同的啟動子調(diào)控，其中l(wèi)hbsag單獨使用一個啟動子，叫pres1啟動子；而mhbsag與shbsag共用另一個啟動子，叫s啟動子。研究表明，hbv入侵肝細(xì)胞之后，lhbsag表達(dá)會在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引起一系統(tǒng)分子伴侶上調(diào)表達(dá)并激活s啟動子，誘導(dǎo)mhbsag與shbsag的表達(dá)，從而形成病毒表面蛋白復(fù)合物以利于包裝成熟的hbv顆粒。因此了解研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)對于研究細(xì)胞抗乙肝病毒具有重要的意義。同樣，了解研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)對于研究細(xì)胞抗其他病毒也具有重要的意義。所以有必要提出有效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)示蹤以及引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提拱一種能在培養(yǎng)細(xì)胞中定位顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。本方法將乙肝病毒前s1基因(pres1)、前s2基因(pres2)或者前s1基因和前s2基因共同與熒光蛋白基因融合，構(gòu)建于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中，通過轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，導(dǎo)致熒光蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積而指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的位置，并同時引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，可伴隨分子伴侶蛋白grp78的高表達(dá)。同時本發(fā)明使提供的融合蛋白不僅僅適用于肝源細(xì)胞系，對于非肝源細(xì)胞系也有相似的作用。本發(fā)明通過pcr方式分別擴(kuò)增克隆pres1、pres2和pres1+pres2(指兩基因融合在一起)片段，通過設(shè)計合適的酶切位點插入含熒光蛋白基因(如gfp、rfp以及相關(guān)增強衍生物)融合表達(dá)載體(如egfp-n1等)中。構(gòu)建產(chǎn)物所表達(dá)的融合蛋白以pres1、pres2或pres1+pres2做為n端，熒光蛋白為c端。將構(gòu)建好的載體，通過化學(xué)轉(zhuǎn)染、電穿轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入目的細(xì)胞中并培養(yǎng)表 達(dá)8-72小時，可以觀察到熒光蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的聚積，培養(yǎng)24-48h可以檢測到分子伴侶蛋白grp78(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78)的表達(dá)升高。可見，本發(fā)明提出了一種有效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)示蹤以及引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方法。附圖說明圖1a是以hbv基因組為模板設(shè)計引物，pcr擴(kuò)增pres1、pres1+pres2和pres2片段示意圖(兩端分別引入ecori和bamhi酶切位點)。圖1b是電泳結(jié)果實測圖。圖2是pres-熒光蛋白基因的拼接示意圖。圖3是將圖2中所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝源細(xì)胞系hepg2(肝癌細(xì)胞系)和lo2(肝細(xì)胞系)示意圖。圖4是將圖2中所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非肝源細(xì)胞系hek293(人胚腎細(xì)胞系)示意圖。圖5是將步驟3和4中轉(zhuǎn)染24h后的各種細(xì)胞裂解液進(jìn)行western‐blot實驗測定grp78蛋白表達(dá)情況。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例步驟1：以hbv基因組為模板設(shè)計引物，pcr擴(kuò)增pres1、pres1+pres2和pres2片段。設(shè)計4條引物，如下表所示引物名pres1forwardatagaattcatgggaggttggtcttccaaaccpres1reverseataggatccggcctgaggatgagtgtcccttapres2forwardatagaattcatgcagtggaactccaccactttpres2reverseataggatccgttcggtacagggtccccagtct以乙肝病毒基因組為模板，分別用pres1forward+pres1revers，pres1forward+pres1forward和pres2forward+pres2reverse進(jìn)行三組pcr。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可清晰看到分子量為約360bp(pres1)、約520bp(pres1+pres2)和約170bp(pres2)的三條擴(kuò)增片段。見附圖1a、1b，其中圖1a是以hbv基因組為模板設(shè)計引物，pcr擴(kuò)增pres1、pres1+pres2和pres2片段(兩端分別引入ecori和bamhi酶切位點)圖1b是電泳結(jié)果。步驟2：pres-熒光蛋白基因的拼接如圖2所示，是pres-熒光蛋白基因的拼接示意圖。此處的pres指代pres1，pres2和pres1+pres2中的任一片段。將圖1中得到的pres片段用ecori和bamhi雙酶切后，插入下游融合表達(dá)熒光蛋白基因的表達(dá)載體pegfp-n1，構(gòu)建成為pegfp-n1-pres質(zhì)粒。步驟1中擴(kuò)增片段切膠回收后用ecori和bamhi雙酶切，再與同樣用ecori和bamhi雙酶切后的pegfp‐n1載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10株。用卡那霉素平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑取單克隆轉(zhuǎn)化子并在含卡那霉素的lb培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，收集菌體后提取質(zhì)粒。用ecori和bamhi雙酶切獲得的重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳判斷是否有插入片段，將含有插入片段的質(zhì)粒測序以確定重組質(zhì)粒序列符合構(gòu)建預(yù)期。通過以上步驟獲得了可以在哺乳動物細(xì)胞中分別融合表達(dá)pres1‐egfp、pres1+pres2‐efgp和pres2‐egfp蛋白的三種質(zhì)粒，分別命名為pegfp‐n1‐pres1、pegfp‐n1‐(pres1+pres2)和pegfp‐n1‐pres2。步驟3：將所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝源細(xì)胞系hepg2(肝癌細(xì)胞系)和lo2(肝細(xì)胞系)圖3是將圖2中所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝源細(xì)胞系hepg2(肝癌細(xì)胞系)和lo2(肝細(xì)胞系)示意圖。12h后，用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？梢娤鄬τ诳瞻讓φ眨躳egfp‐n1‐pres1或者pegfp‐n1‐(pres1+pres2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可見明顯的熒光聚集，呈點或團(tuán)狀分布，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的其余地方無明顯熒光；而pegfp‐n1‐pres2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞除了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處有明顯熒光積累，同時在細(xì)胞質(zhì)中也有均勻分布。將步驟2中所述的質(zhì)粒分別按以下方法轉(zhuǎn)染肝源細(xì)胞系hepg2和lo2：將hepg2和lo2細(xì)胞分別接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，12‐24h后，細(xì)胞融合生長到一定程度，優(yōu)選50‐80％，最優(yōu)選70％左右時可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用轉(zhuǎn)染試劑，優(yōu)選lifescience公司的lipofectamine3000試劑盒，將步驟2中所述的質(zhì)粒將一定量，優(yōu)選200‐1000ng/孔，最優(yōu)選800ng/孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用pegfp‐n1質(zhì)粒做為空白對照。轉(zhuǎn)染24h后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，結(jié)果見附圖說明3。觀察表明，相對于空白對照，受pegfp‐n1‐pres1或者pegfp‐n1‐(pres1+pres2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可見明顯的熒光聚集，呈點或團(tuán)狀分布，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的 其余地方無明顯熒光；而pegfp‐n1‐pres2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞除了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處有明顯熒光積累，同時在細(xì)胞質(zhì)中也有均勻分布。步驟4：將所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非肝源細(xì)胞系hek293圖4是將圖2中所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非肝源細(xì)胞系hek293(人胚腎細(xì)胞系)示意圖。12h后，倒置用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞。相對于空白對照，受pegfp‐n1‐pres1或者pegfp‐n1‐(pres1+pres2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可見明顯的熒光聚集，呈點或團(tuán)狀分布，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的其余地方無明顯熒光；而pegfp‐n1‐pres2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞除了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處有明顯熒光積累，同時在細(xì)胞質(zhì)中也有均勻分布。將步驟2中所述的質(zhì)粒分別按以下方法轉(zhuǎn)染非肝源細(xì)胞系hek29:將hek293細(xì)胞分別接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，12‐24h后，細(xì)胞融合生長到一定程度，優(yōu)選50‐80％，最優(yōu)選70％左右時可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用轉(zhuǎn)染試劑，優(yōu)選lifescience公司的lipofectamine2000試劑盒，將步驟2中所述的質(zhì)粒將一定量，優(yōu)選200‐1000ng/孔，最優(yōu)選500ng/孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用pegfp‐n1質(zhì)粒做為空白對照。轉(zhuǎn)染24h后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，結(jié)果見附圖說明4。觀察表明，相對于空白對照，受pegfp‐n1‐pres1或者pegfp‐n1‐(pres1+pres2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可見明顯的熒光聚集，呈點或團(tuán)狀分布，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的其余地方無明顯熒光；而pegfp‐n1‐pres2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞除了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處有明顯熒光積累，同時在細(xì)胞質(zhì)中也有均勻分布。步驟5：將步驟3和4中轉(zhuǎn)染24h后的各種細(xì)胞裂解液進(jìn)行western‐blot實驗測定grp78蛋白表達(dá)情況圖5是將步驟3和4中轉(zhuǎn)染24h后的各種細(xì)胞裂解液進(jìn)行western‐blot實驗測定grp78蛋白表達(dá)情況。，可見，相對于對照，所有被含pres基因質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的grp78均出現(xiàn)不同程度升高。將步驟3和4中轉(zhuǎn)染24h后的各種細(xì)胞使用含蛋白酶抑制劑的ripa緩沖液裂解，離心去掉細(xì)胞碎片后使用bca法測定各樣本中的蛋白濃度，加入sds‐page上樣緩沖液，沸水浴3min，按每個樣本30μg的上樣量進(jìn)行sds‐page電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行western‐blot實驗，測定各樣本中的grp78蛋白的變化情況，β‐actin做內(nèi)對照，結(jié)果如附圖說明5所示，結(jié)果表明，相對于空白pegfp‐n1質(zhì)粒，所有插 入pres基因(包括pres1、pres2和pres1+pres2)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，無論是否是肝源細(xì)胞，均可以造成grp78的表達(dá)上調(diào)。說明含有pres肽段的熒光蛋白都能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，造成分子伴侶grp78上調(diào)。需要指出的是，本發(fā)明給出的構(gòu)建融合蛋白的方法不是獲得該蛋白的唯一方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，如直接的dna序列合成法、重組酶拼接法均可以用于所述蛋白基因的構(gòu)建。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效裝置或等效方法變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12