本發(fā)明屬于天然藥物及化學(xué)藥物領(lǐng)域，特別涉及一種間苯三酚類新化合物及其在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)菌感染是常見病及多發(fā)病。目前，臨床上的耐藥菌感染日趨嚴(yán)重，細(xì)菌耐藥呈現(xiàn)出向多藥耐藥發(fā)展的趨勢，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)、耐氨芐西林肺炎鏈球菌(prsp)、以及多藥耐藥結(jié)核桿菌(mdr-tb)等正在迅速蔓延。耐藥菌感染日益增多且死亡率逐步升高，說明傳統(tǒng)抗菌藥物已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代臨床治療的需要。因此，研究開發(fā)新型抗菌藥物具有重要的臨床應(yīng)用價值。

香桃木(myrtuscommunislinn.)為桃金娘科(myrtaceae)香桃木屬植物，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，常被用作防腐劑和消毒劑等(journalofethnopharmacology,1984,11:275-281)。香桃木精油或其提取物具有較強(qiáng)的抗菌活性(phytochemistry,2006,67:1249-1255)。1974年，rotsteina等首次從香桃木中發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的?；g苯三酚類化合物myrtucommulonesa-b(antimicrobialagentsandchemotherapy,1974,6:539-542)。近年來，有文獻(xiàn)報道了香桃木中的間苯三酚類成分myrtucommulonesc-e具有良好的抗菌及降血糖活性(europeanjournaloforganicchemistry,2006,10:2371-2377)?？梢?，間苯三酚類化合物可能是香桃木的主要活性成分。然而，目前香桃木間苯三酚類化學(xué)成分的研究尚不深入，僅報道了不足20個化合物。因此，其抗菌活性成分有待深入發(fā)掘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種結(jié)構(gòu)新穎的間苯三酚類新化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的間苯三酚類新化合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種間苯三酚類新化合物，命名為 (+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b，結(jié)構(gòu)如式i所示：

式i中，(+)myrtucyclitonea的構(gòu)型為1s,9s,10s,17s,1'r,6's；(-)myrtucyclitonea的構(gòu)型為1r,9r,10r,17r,1's,6'r；(+)myrtucyclitoneb的構(gòu)型為1s,9s,10s,17r,1's,6'r；(-)myrtucyclitoneb的構(gòu)型為1r,9r,10r,17s,1'r,6's。

所述的間苯三酚類新化合物為從香桃木枝葉中提取分離得到，具體步驟如下：將香桃木枝葉粉碎，用95％(w/w)乙醇滲漉提取，提取物濃縮后通過硅膠柱層析、sephadexlh-20、十八烷基鍵合硅膠(ods)柱層析及制備型hplc分離純化，得到(±)myrtucyclitonesa–b，進(jìn)一步采用手性hplc拆分得到光學(xué)純的對映異構(gòu)體。

所述的間苯三酚類新化合物在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

所述的抗菌藥物包括有效量的作為活性成分的(+)myrtucyclitonea或(+)myrtucyclitoneb或(-)myrtucyclitonea或(-)myrtucyclitoneb和藥學(xué)上可以接受的載體。

所述的菌包括金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了香桃木中一類結(jié)構(gòu)新穎的間苯三酚類化合物，命名為(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b，這類化合物是由38個碳原子組成的環(huán)聚酮-間苯三酚-環(huán)聚酮三聚體，且其中一個環(huán)聚酮片段發(fā)生重排，是具有新穎骨架結(jié)構(gòu)的化學(xué)實(shí)體。

(2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b在較低濃度(2～4μg/ml)下即對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和萬古霉素中介耐藥金葡菌均具有顯著的抗菌活性，其活性強(qiáng)于陽性藥氨芐西林和頭孢他啶。

(3)本發(fā)明的(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對真核細(xì)胞毒性很低。

附圖說明

圖1是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitonea的¹hnmr譜圖。

圖2是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitonea的¹³cnmr譜圖。

圖3是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitonea的hsqc譜圖。

圖4是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitonea的hmbc譜圖。

圖5是間苯三酚類化合物(+)myrtucyclitonea的cd譜圖。

圖6是間苯三酚類化合物(-)myrtucyclitonea的cd譜圖。

圖7是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitoneb的¹hnmr譜圖。

圖8是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitoneb的¹³cnmr譜圖。

圖9是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitoneb的hsqc譜圖。

圖10是間苯三酚類化合物(±)myrtucyclitoneb的hmbc譜圖。

圖11是間苯三酚類化合物(+)myrtucyclitoneb的cd譜圖。

圖12是間苯三酚類化合物(-)myrtucyclitoneb的cd譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1化合物的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定

(1)稱取干燥香桃木枝葉8kg，粉碎機(jī)粉碎成粗粉，用95％(w/w)乙醇滲漉提取4次，每次25l，合并滲漉液并減壓濃縮至無醇味，得到的總浸膏約 1.2kg。浸膏加水混懸后用石油醚萃取，得到石油醚萃取部位389g。

(2)對步驟(1)制備得到的石油醚萃取部位進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，按照石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:100和0:100的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，經(jīng)薄層色譜(tlc)分析并合并相似流份，得到10個主流份fr.1～fr.10。其中流份fr.5(石油醚/乙酸乙酯100:7洗脫部分，70g)繼續(xù)經(jīng)硅膠柱層析，按照石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:100的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，得到9個亞流份fr.5a～fr.5i。

(3)①對步驟(2)中得到的亞流份fr.5b(石油醚/乙酸乙酯100:1洗脫部分，12.8g)，濃縮后上樣于sephadexlh-20色譜柱，以氯仿-甲醇(chcl3-meoh)按體積比1:1混合得到的混合溶劑為流動相，流速為0.5ml/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液(洗脫體積50-1000ml)，經(jīng)tlc分析并合并相似流份，得到4個流份fr.5b-1～fr.5b-4。

②將步驟(3)①得到的流份fr.5b-3(洗脫體積300-500ml)(0.8g)進(jìn)行反相ods柱層析，以甲醇-水(meoh-h2o)為洗脫劑，按照甲醇和水體積比為60:40、70:30、80:20、90:10、100:0的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，收集甲醇-水體積比為80:20的洗脫流份。

③將步驟(3)②得到的洗脫液濃縮后用甲醇溶解，然后用反相制備型hplc分離純化，以體積比為90:10的甲醇-水為洗脫劑，流速為3ml/min進(jìn)行洗脫，收集保留時間14.4min和18.4min的色譜峰，得到(±)myrtucyclitonea(46.8mg)和(±)myrtucyclitoneb(27.6mg)。

④將步驟(3)③得到的(±)myrtucyclitonea經(jīng)手性hplc柱(phenomenex,luxcellulose-1)分離純化，以體積比為65:35的乙腈-水為洗脫劑，流速為1ml/min進(jìn)行洗脫，收集保留時間14.8min和15.5min的色譜峰，得到(+)myrtucyclitonea(19.8mg)和(-)myrtucyclitonea(19.4mg)。

⑤將步驟(3)③得到的(±)myrtucyclitoneb經(jīng)手性hplc柱(phenomenex,luxcellulose-1)分離純化，以體積比為60:40的乙腈-水為洗脫劑，流速為1ml/min進(jìn)行洗脫，收集保留時間21.9min和22.9min的色譜峰，得到(+)myrtucyclitoneb(11.9mg)和(-)myrtucyclitoneb(12.6mg)。

(4)①(±)myrtucyclitonea的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色片狀晶體；香草醛-濃硫酸反應(yīng)(tlc)顯紫紅色；uv(chcl3)λmax(logε)242(3.43),294(5.39)nm；ir(kbr)νmax3477,2958,1703,1623,1462,1385, 1256,1117,1033,860cm^-1；hr-esi-msm/z653.3689[m+h]⁺(計算值c38h53o9,653.3684)。氫譜(¹hnmr)和碳譜(¹³cnmr)數(shù)據(jù)見表1。¹hnmr,¹³cnmr,hsqc和hmbc核磁共振圖譜見圖1～4。根據(jù)以上理化數(shù)據(jù)和nmr數(shù)據(jù)，鑒定(±)myrtucyclitonea的結(jié)構(gòu)如式ⅰ所示。其中(+)myrtucyclitonea：cd圖譜見圖5；(-)myrtucyclitonea：cd圖譜見圖6。

②(±)myrtucyclitoneb的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色片狀晶體；香草醛-濃硫酸反應(yīng)(tlc)顯紫紅色；uv(chcl3)λmax(logε)242(2.39),294(4.70)nm；ir(kbr)νmax3418,2931,1698,1616,1461,1387,1250,1160,1135,1092,923,863,757cm^-1；hr-esi-msm/z653.3687[m+h]⁺(計算值c38h53o9,653.3684)。氫譜(¹hnmr)和碳譜(¹³cnmr)數(shù)據(jù)見表2。¹hnmr,¹³cnmr,hsqc和hmbc核磁共振圖譜見圖7-10。根據(jù)以上理化數(shù)據(jù)和nmr數(shù)據(jù)，鑒定(±)myrtucyclitoneb的結(jié)構(gòu)如式ⅰ所示，其中(+)myrtucyclitoneb：cd圖譜見圖11；(-)myrtucyclitoneb：cd圖譜見圖12。

表1.(±)myrtucyclitonea的¹h(500mhz)和¹³c(125mhz)nmr數(shù)據(jù)

注：(溶劑為cdcl3，δ單位為ppm，j單位為hz)

表2.(±)myrtucyclitoneb的¹h(500mhz)和¹³c(125mhz)nmr數(shù)據(jù)

注：(溶劑為cdcl3，δ單位為ppm，j單位為hz)

實(shí)施例2(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對多種細(xì)菌的抑制作用

金黃色葡萄球菌s.aureusatcc29213、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌s.aureusatcc33591(mrsa)、萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌s.aureusmu50(visa)、表皮葡萄球菌s.epidermidisatcc12228、糞腸球菌e.faecalisatcc29212、屎腸球菌e.faecium13-01、大腸埃希菌e.coliatcc25922、銅綠假單胞菌ps.aeruginosa，均來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

采用肉湯微量二倍稀釋法，測定化合物體外抑菌作用的最小抑菌濃度(mic)，具體操作方法如下：

(1)細(xì)菌培養(yǎng)：以mueller-hinton(mh)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)菌，當(dāng)其生長8-12h至約0.5個mcfarland濃度(1×10⁸cfu)時備用。

(2)將測試樣品溶解在乙醇中，用培養(yǎng)液稀釋至1000μg/ml。繼續(xù)用培養(yǎng)液稀釋使樣品濃度范圍從256μg/ml到0.25μg/ml。另外，配制好一定濃度的氨 芐西林和頭孢他啶作為陽性對照。

(3)在96孔板上每孔加入100μl不同濃度的藥液和100μl菌液，使最終菌液濃度為5×10⁴cfu，以胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tsb)加菌液作為陰性對照(tsb培養(yǎng)基、菌液各100μl)，以不加菌液的tsb肉湯培養(yǎng)基空白對照(tsb培養(yǎng)基200μl)，將96孔板密封后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育20h。

(4)以陰性對照孔內(nèi)細(xì)菌明顯生長為前提條件，通過肉眼觀察，以加藥后孔內(nèi)細(xì)菌無明顯生長的藥物最低濃度為該藥物的mic(μg/ml)，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，化合物(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和萬古霉素中介耐藥金葡菌均具有顯著的抗菌活性，mic值為2～4μg/ml；對表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌具有較強(qiáng)抗菌活性，mic值為4～16μg/ml；對大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有一定的抗菌活性，mic值為64～128μg/ml。尤其是上述化合物對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金葡菌和萬古霉素中介耐藥金葡菌的抗菌活性優(yōu)于氨芐西林、頭孢他啶等臨床常用藥物，這對于研發(fā)抗耐藥菌的藥物具有重要意義。本發(fā)明的(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b作為分子結(jié)構(gòu)完全不同于已有抗菌藥物的新化學(xué)實(shí)體，對于耐藥菌具有良好的活性，極有可能作為新化學(xué)實(shí)體發(fā)展為新型抗菌藥物。

表3.(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對多種細(xì)菌的抑制作用

實(shí)施例3(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對正常細(xì)胞的影響

試驗(yàn)方法：人胚腎細(xì)胞hek293(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)于含有10％(v/v)胎牛血清及雙抗(青霉素和鏈霉素各100u/ml)的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)至 對數(shù)期，用pbs洗滌，0.25％(w/v)的胰蛋白酶消化，然后用新鮮dmem培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶個/ml，鋪96孔板，每孔200μl，待細(xì)胞貼壁后，加不同濃度的樣品，在37℃、5％co2條件下共培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用移液槍吸出孔中液體，每孔加入100μldmso，室溫下輕搖10分鐘，用酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測每個孔的吸光度od值。按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率，重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次以上。細(xì)胞生長抑制率計算公式：抑制率(％)＝(1-加藥組od值)/對照組od值×100％。結(jié)果見表4。

試驗(yàn)結(jié)果顯示：即使在200μg/ml的高濃度下，本發(fā)明的化合物(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對人正常細(xì)胞胚胎腎細(xì)胞hek293僅表現(xiàn)出很低的細(xì)胞毒作用，細(xì)胞生長抑制率為9.25-12.01％。

表4.(+)myrtucyclitonesa-b和(-)myrtucyclitonesa-b對hek293的細(xì)胞毒性

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。