本發(fā)明是關(guān)于一種勝肽，尤其是關(guān)于一種能應(yīng)用于促進(jìn)傷口愈合、膠原蛋白增生、血管新生、活化免疫細(xì)胞并降低傷口感染的勝肽。
背景技術(shù)：
：一般人受傷或經(jīng)手術(shù)之后，無論是傷口的復(fù)原以及氣力的恢復(fù)，都需要較長時(shí)間的靜養(yǎng)，并配合適當(dāng)?shù)娘嬍?，才能達(dá)到最好的恢復(fù)效果。若欲提早康復(fù)，最常見者就是食用能夠讓傷口快速愈合的食品、補(bǔ)品或藥品，例如鱸魚湯等鱸魚萃取物。2013年臺灣的鱸魚(Latescalcarifer)產(chǎn)量約為26,094噸，總產(chǎn)值高達(dá)21.8億元，除一般家庭、餐廳的直接食用外，有多數(shù)鱸魚被為加工制品，而其再制后產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其中魚皮與魚骨所占比例竟高達(dá)30％，若能妥善加以應(yīng)用，不但可增進(jìn)臺灣漁業(yè)的附加價(jià)值，更可有效解決鱸魚加工副產(chǎn)物的處理問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為獲悉鱸魚萃取物中具效果的成分，本發(fā)明確認(rèn)其中有效的勝肽成分，遂提供一種可促進(jìn)傷口愈合、膠原蛋白增生、血管新生、活化免疫細(xì)胞并降低傷口感染的勝肽，該勝肽包括選自SEQIDNO:1至SEQIDNO:11的序列，及其組合的勝肽所組成的群組。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，該鱸魚萃取物是萃取自鱸魚的魚皮、鱗片、魚骨或魚肉。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，該鱸魚萃取物是以角蛋白酶(Keratinase)、胰蛋白酶(Trypsin)、菠蘿蛋白酶(Bromelain)、木瓜蛋白酶(Papain)、胃蛋白酶(Pepsin)、堿性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)以及風(fēng)味 蛋白酶(Flavourzyme)所組成的群組萃取后而獲得。在本發(fā)明的一態(tài)樣中，提供一種勝肽用于促進(jìn)傷口愈合的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的另一態(tài)樣中，提供一種傷口愈合促進(jìn)劑，包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的一態(tài)樣中，提供一種勝肽用于促進(jìn)膠原蛋白增生的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的另一態(tài)樣中，提供一種膠原蛋白增生促進(jìn)劑，包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的一態(tài)樣中，提供一種勝肽用于促進(jìn)血管增生的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的另一態(tài)樣中，提供一種血管增生促進(jìn)劑，包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的一態(tài)樣中，提供一種勝肽用于活化免疫細(xì)胞的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發(fā)明的另一態(tài)樣中，提供一種免疫細(xì)胞活化劑，包括如前所述的勝肽。藉由本發(fā)明實(shí)施例的勝肽，可誘發(fā)TNF-α與IL-1β的表現(xiàn)量，因此可對抗病毒、細(xì)菌、降低傷口感染，并清理壞死組織、幫助傷口清瘡，促進(jìn)傷口的修復(fù)。此外，藉由本發(fā)明實(shí)施例的勝肽，亦可誘發(fā)IL-8與CXCL12的表現(xiàn)，使促進(jìn)傷口處能夠招集更多的免疫細(xì)胞，并活化更多的免疫細(xì)胞。再一方面，本發(fā)明實(shí)施例的勝肽，能夠抑制IL-10的表現(xiàn)，因而能有效促進(jìn)纖維組織分泌膠原蛋白，幫助傷口的修護(hù)與愈合。同時(shí)，藉由本發(fā)明實(shí)施例的勝肽，還可因?yàn)榛罨疶NF-α與IL-1β的表現(xiàn)，進(jìn)一步可活化纖維母細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞，而具有促進(jìn)血管新生的效用。由于本發(fā)明所提供的勝肽具有前述的功效，因此在本發(fā)明的一實(shí)施例中，可進(jìn)一步利用本發(fā)明的勝肽應(yīng)用于制備相關(guān)功效的組合物或試劑，例如傷口愈合促進(jìn)劑、膠原蛋白增生促進(jìn)劑、血管增生促進(jìn)劑或免疫細(xì)胞活化劑。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-1β其 mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞TNF-α其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-8其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞CXCL12其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-10其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-1β其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞TNF-α其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例勝肽的取得，首先須先處理鱸魚樣本，將其以酸處理后進(jìn)行萃取，萃取出的混合物再以復(fù)合型酵素進(jìn)行水解，然后將水解產(chǎn)物過濾純化后即可獲得。后續(xù)則針對該些勝肽進(jìn)行定序以及相關(guān)的功效試驗(yàn)，以下將進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1鱸魚萃取物的制備方法首先，將鱸魚以切片機(jī)剪切為約2至6cm大小作為原料，其中該鱸魚部位包含魚皮、鱗片、魚骨與魚肉；之后以2至5倍體積的RO逆滲透水進(jìn)行原料清洗，重復(fù)清洗鱸魚2至3次以去除血水與雜質(zhì)。之后，以1:5的鱸魚與酸液(w/v)比率進(jìn)行酸處理，其中酸的種類與濃度為質(zhì)量百分濃度為1～5％鹽酸、質(zhì)量百分濃度為1～5％硫酸或質(zhì)量百分濃度為1～5％磷酸。將鱸魚于15至20℃浸泡10至48小時(shí)后，以2至5倍體積RO逆滲透水清洗酸處理后的原料，重復(fù)清洗2至3次進(jìn)行去酸，最后并以碳酸鈣調(diào)整pH值 為4至8之間。鱸魚樣本備妥后，開始以55至100℃熱水進(jìn)行萃取1至6小時(shí)；之后以3000rpm離心10分鐘，進(jìn)行脫渣過濾；再以0.2-1％的碳酸鈣或石灰去雜質(zhì)并澄清化；然后以1-10μm的濾膜進(jìn)行過濾；之后再以離子交換樹脂管柱吸附過濾，去除雜質(zhì)與石灰，以進(jìn)一步將效性勝肽分離純化；純化后的效性勝肽經(jīng)由活性碳脫臭與脫色處理，置于50至60℃下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮其10至20倍。接著，添加復(fù)合型酵素并于40至60℃進(jìn)行水解1至5小時(shí)，其中該復(fù)合型酵素包含0.01wt％-0.1wt％的角蛋白酶(Keratinase)與菠蘿蛋白酶(Bromelain)；0.1-5wt％的木瓜蛋白酶(Papain)、胰蛋白酶(Trypsin)與胃蛋白酶(Pepsin)、0.1-5wt％堿性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)以及風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)。水解完成后，于85至95℃下反應(yīng)10至30分鐘進(jìn)行酵素失活；之后將其冷卻；冷卻后以硅藻土與活性碳進(jìn)行過濾，使勝肽萃取液澄清化與脫臭，之后再進(jìn)行一次過濾，將過濾后產(chǎn)物進(jìn)行超高溫滅菌(Ultra-hightemperature，UHT)，于135至140℃下進(jìn)行殺菌3至5秒；最后以0.2μm濾膜過濾除菌與去除細(xì)小雜質(zhì)后即可獲得本發(fā)明所需包含多種勝肽的鱸魚萃取物。實(shí)施例2鱸魚萃取物中勝肽的測序鱸魚勝肽萃取物經(jīng)適當(dāng)稀釋后，經(jīng)離心(13000rpm,2min)吸取200μl上清液，以C18-ZipTip(Millpore)去鹽濃縮，樣品回溶后取1/2體積，以下列條件進(jìn)行LC-MS/MS分析。MS/MS圖譜利用Mascot分析程序進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索分析以得到分析結(jié)果。反應(yīng)條件：質(zhì)譜儀:LTQXL(ThermoScientific)LC系統(tǒng):Agilent1200Series緩沖溶液A:ddH2O/0.1％甲酸緩沖溶液B:100％乙腈/0.1％甲酸分析管柱:C18反相柱梯度表:時(shí)間(min)B％0.00510.02510.05545.004050.008560.008563.00575.02575.05590.005經(jīng)氨基酸測序后，確認(rèn)其中11種勝肽，其氨基酸序列如表1所示的SEQIDNO:1～11。表1實(shí)施例3免疫細(xì)胞的基因表現(xiàn)量分析將人類THP-1細(xì)胞(人類單核球細(xì)胞株)分養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)盤(5*105cell/well)，并將其分組個(gè)別進(jìn)行脂多醣(Lipopolysaccharide，以下簡稱LPS)處理，處理方式如表2所示。表2將各組經(jīng)不同反應(yīng)物與時(shí)間處理后的細(xì)胞加以搜集后，以RNA分離套組(GeneMarkRNAisolationkit)分離細(xì)胞中的RNA，再經(jīng)由cDNA合成套組(RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthhesisKit)合成出cDNA，之后利用實(shí)時(shí)聚合酶連鎖反應(yīng)套組(SYBRGreenMasterMix,KAPA公司)測定目標(biāo)基因，并由ABIStepone軟件進(jìn)行基因表現(xiàn)的分析，以從基因表現(xiàn)層面探討鱸魚萃取物對免疫細(xì)胞的影響與功效，其結(jié)果如圖1至圖7所示。請先參閱圖1，該圖是本發(fā)明實(shí)施例鱸魚萃取物中的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-1β其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。由圖1顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的IL-1β表現(xiàn)量會上升，在LPS誘導(dǎo)6小時(shí)下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時(shí)的IL-1β表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_6hr)的4.8與7.9倍，而在LPS誘導(dǎo)9小時(shí)下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時(shí)的IL-1β表現(xiàn)量則分別為對照組(LPS_9hr)的4.3與8.7倍。請?jiān)賲㈤唸D2，該圖是本發(fā)明實(shí)施例鱸魚萃取物中的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞TNF-α其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。由圖2結(jié)果顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的TNF-α表現(xiàn)量會上升，在LPS誘導(dǎo)6小時(shí)下再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時(shí)的TNF-α表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_6hr)的3與3.5倍，而在LPS誘導(dǎo)9小時(shí)下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時(shí)的TNF-α表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_9hr)的2.3與4倍，而誘發(fā)TNF-α與IL-1β對于傷口修護(hù)扮演著重要角色，其表現(xiàn)量的增加可對抗病毒、細(xì)菌、降低傷口感染，并清理壞死組織、幫助傷口清瘡。請參閱圖3，該圖是本發(fā)明實(shí)施例鱸魚萃取物中的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-8其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。由圖3結(jié)果顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的IL-8表現(xiàn)量會上升，在LPS誘導(dǎo)6小時(shí)下再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時(shí)的IL-8表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_6hr)的7.6與6.3倍，而在LPS誘導(dǎo)9小時(shí)下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時(shí)的IL-8表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_9hr)的4.7與7.9倍。請參閱圖4，該圖是本發(fā)明實(shí)施例鱸魚萃取物中的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞CXCL12其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。由圖4結(jié)果顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的CXCL12表現(xiàn)量會上升，在LPS誘導(dǎo)6小時(shí)下再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時(shí)的CXCL12表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_6hr)的1.9與3倍，而在LPS誘導(dǎo)9小時(shí)下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時(shí)的CXCL12表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_9hr)的1.7與3.2倍，而誘發(fā)IL-8與CXCL12表現(xiàn)量可促進(jìn)免疫是統(tǒng)于傷口處招集更多免疫細(xì)胞，并同時(shí)活化更多免疫細(xì)胞。請參閱圖5，該圖是本發(fā)明實(shí)施例鱸魚萃取物中的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-10其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。由圖5結(jié)果顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的IL-10表現(xiàn)量會下降，在LPS誘導(dǎo)27小時(shí)下再以1％與2％鱸魚勝肽處理24小時(shí)的IL-10相較于對照組(LPS_27hr)分別減少了54％與30％的表現(xiàn)量，而抑制IL-10表現(xiàn)的效果，是能有效促進(jìn)纖維組織分泌膠原蛋白，因此能幫助傷口的修護(hù)與愈合。請同時(shí)參閱圖6、7，該二圖分別是本發(fā)明實(shí)施例鱸魚萃取物中的勝肽于細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎下，對細(xì)胞IL-1β與TNF-α其mRNA表現(xiàn)影響的結(jié)果圖。由圖6結(jié)果顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的IL-1β表現(xiàn)量會上升，在LPS誘導(dǎo)27小時(shí)下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理24小時(shí)的IL-1β表現(xiàn)量分別為對照組(LPS_27hr)的3.3與5.1倍，而由圖7結(jié)果顯示，以LPS處理THP-1細(xì)胞株的TNF-α表現(xiàn)量會上升，在LPS誘導(dǎo)27小時(shí)下再以2％鱸魚勝肽處理24小時(shí)的TNF-α表現(xiàn)量為對照組(LPS_27hr)的2.3倍，而活化TNF-α與IL-1β的表現(xiàn)量，亦可同時(shí)活化纖維母細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞，因而具有促進(jìn)血管新生的功效。因此，透過前述細(xì)胞模擬傷口發(fā)炎狀態(tài)下，IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10以及CXCL12表現(xiàn)量的變化影響，可確知本發(fā)明所提供的勝肽，能夠使傷口處能夠招集更多的免疫細(xì)胞，并活化更多的免疫細(xì)胞，具有對抗病毒、細(xì)菌、降低傷口感染，并清理壞死組織、幫助傷口清瘡，促進(jìn)傷口的修復(fù)的功效。同時(shí)因?yàn)榭捎行Т龠M(jìn)纖維組織分泌膠原蛋白，更加能夠幫助傷口的修護(hù)與愈合。此外，由于該勝肽可活化TNF-α與IL-1β的表現(xiàn)，而能進(jìn)一步活化纖維母細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞，因此亦具有促進(jìn)血管新生的效用。由于本發(fā)明所提供的勝肽具有前述的功效，因此可進(jìn)一步利用本發(fā)明的勝肽應(yīng)用于制備相關(guān)功效的組合物或試劑，例如傷口愈合促進(jìn)劑、膠原蛋白增生促進(jìn)劑、血管增生促進(jìn)劑或是免疫細(xì)胞活化劑。該些組合物或試劑可包括有效劑量的本發(fā)明勝肽以及賦形劑或載劑等，因此該組合物或試劑形式可為藥錠、膠囊、液狀、凝膠、漿液、懸浮液、粉包、敷料、乳液、噴劑、膜狀物，并未設(shè)有特別的限制。進(jìn)一步，前述組合物或試劑依其利用方式，亦可制備成飲食品應(yīng)用于保健相關(guān)食品，或是輔助用作外用品。當(dāng)前第1頁1 2 3