本發(fā)明涉及一種海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法

背景技術(shù)：

木聚糖酶在飼料工業(yè)中應(yīng)用廣泛。小麥、玉米等基礎(chǔ)飼料中含有大量的木聚糖，木聚糖具有較強(qiáng)的持水性、小分子吸附活性和表面活性，造成基礎(chǔ)飼料對單胃或無胃動物具有強(qiáng)烈的抗?fàn)I養(yǎng)作用。而木聚糖酶作為飼料添加劑使用，可有效消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。飼料中添加木聚糖酶可以降解植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，降低畜禽腸道內(nèi)容物黏度，提高內(nèi)源性消化酶活性，減少腸道有害微生物數(shù)量，從而改善動物對養(yǎng)分的消化吸收以及飼料轉(zhuǎn)化率，最終提高生長性能。

但游離態(tài)的木聚糖酶在實際應(yīng)用中也存在一些問題如穩(wěn)定性差、易失活等，導(dǎo)致利用率較低，成本較高。因此，可根據(jù)酶的固定化原理，利用生物技術(shù)以期解決上述問題。酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)并可回收重復(fù)使用的技術(shù)。與游離酶相比,固定化酶不但可保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性并且其貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點,不僅在化學(xué)、生物學(xué)及生物工程、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域得到迅速發(fā)展而且因為具有節(jié)省資源與能源、減少或防治污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。

近年來國內(nèi)外關(guān)于固定化木聚糖酶的載體選擇逐漸轉(zhuǎn)向于性能優(yōu)越的天然高分子材料和有機(jī)合成材料。其中天然高分子材料具有無毒,成本低廉,傳質(zhì)性能好等特點,主要有海藻酸鈉、殼聚糖等。目前如何改進(jìn)木聚糖酶的穩(wěn)定性,提高酶的活性回收率,找到應(yīng)用于不同領(lǐng)域的固定化載體及合適的和新的方法對木聚糖酶進(jìn)行固定化,是今后研究發(fā)展的方向和趨勢。而海藻酸鈉，殼聚糖是最為常見的天然高分子材料，因此，本方法選用海藻酸鈉為載體，通過與鈣離子和殼聚糖作用表面形成不溶于水的致密膜，以改進(jìn)木聚糖酶的穩(wěn)定性，同時優(yōu)化最佳條件，以提高酶活回收率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法，以解決游離木聚糖酶在實際應(yīng)用中存在的穩(wěn)定性差、易失活變性、利用率低等問題。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法，通過以下步驟完成：

(1)原料混合步驟

稱取一定量的海藻酸鈉充分溶解于蒸餾水中形成一膠體溶液，向該膠體溶液中加入適量的木聚糖酶液，調(diào)節(jié)ph至6.0～7.0，充分?jǐn)嚢杌靹颍玫交旌弦?；

分別稱取一定量的殼聚糖和氯化鈣溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph至3.0～6.0，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到混合?；

(2)微球成形及包覆步驟

采用帶有針頭的蠕動泵將步驟(1)所得混合液1，滴入至步驟(1)所得混合液2中，得到直徑2～3mm的光滑微球；

(3)低溫固化步驟

將步驟(2)中所得光滑微球置于3℃-10℃環(huán)境中進(jìn)行低溫固化得到固化微球，其中低溫固化時間為1～4h；

(4)洗脫過濾步驟

將步驟(3)制備的固化微球以蒸餾水沖洗去除表面殘留雜質(zhì)得到洗脫微球；

(5)低溫干燥步驟

將洗脫微球置于35～45℃的恒溫干燥箱內(nèi)進(jìn)行低溫干燥得到近似球型顆粒，干燥時間4～8h；

(6)顆粒成型

篩選步驟(5)得到的近似球型的固定化酶顆粒。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述步驟(1)中，所述海藻酸鈉質(zhì)量百分比濃度為1.0～3.0％，所述殼聚糖質(zhì)量百分比濃度為0.5～4.5％,氯化鈣質(zhì)量百分比濃度為0.5～2.5％。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述步驟(1)中，所述混合液1制備過程中的ph值采用質(zhì)量百分比濃度為5％的醋酸溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述步驟(1)中，所述混合液2制備過程中的ph值采用質(zhì)量百分比濃度為5％的醋酸溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述步驟(2)中，所述混合液1以3滴/秒的速度滴入至步驟(1)所得混合液2中。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述步驟(3)重復(fù)三次。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟(6)得到的近似球型顆粒的固定化木聚糖酶進(jìn)行包埋率、穩(wěn)定性及酶活回收率測定方法如下：

固定化酶的包埋率測定：固定化酶的包埋率(％)＝固定化酶量(g)/酶總添加量(g)×100％；

固定化酶活回收率測定：酶活回收率(％)＝固定化酶的總活力/游離酶的總活力×100％

固定化酶的穩(wěn)定性測定：分別取一定量的固定化酶與游離酶；(a)在18℃、28℃、38℃、48℃、58℃、68℃、78℃溫度下分別測定固定化酶與游離酶的活力；(b)在ph值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0值下測定固定化酶與游離酶的活力。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的一種海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法，根據(jù)固定化酶的包埋原理，以天然高分子材料海藻酸鈉及殼聚糖為載體，具有反應(yīng)條件溫和、保護(hù)酶分子結(jié)構(gòu)、酶活力損失小等優(yōu)點；該方法最終得到的固定化酶穩(wěn)定性和酶活回收率較高，在飼料等工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義。

附圖說明

圖1本發(fā)明實施例1不同溫度下游離酶與固定化酶的相對酶活比較曲線圖。

圖2本發(fā)明實施例1不同ph值條件下游離酶與固定化酶的相對酶活比較曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明，但并不限制本發(fā)明。

實施例1

一種海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法，具體步驟如下：

(1)原料混合

稱取4.0g的海藻酸鈉充分溶解于蒸餾水中，向該膠體溶液中加入適量的木聚糖酶液，調(diào)節(jié)ph至6.0～7.0(ph值由5％醋酸溶液調(diào)至，下同)，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到混合?a，其中海藻酸鈉質(zhì)量百分比濃度為2.0％。

分別稱取3.0g殼聚糖和4.0g氯化鈣溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph至5.5，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到混合?a，其中殼聚糖質(zhì)量百分比濃度為1.5％,氯化鈣質(zhì)量百分比濃度為2.0％。

(2)微球成形及包覆

采用帶有針頭的蠕動泵將(1)所得混合液1a，以3滴/秒的速度滴入至步驟(1)所得混合液2a中，得到直徑2～3mm的光滑微球。

(3)低溫固化

將步驟(2)中所得光滑微球置于4℃環(huán)境中進(jìn)行低溫固化，固化時間為1h。

(4)洗脫過濾

將步驟(3)固化后的微球以蒸餾水沖洗去除表面殘留雜質(zhì)，重復(fù)3次。

(5)低溫干燥

將洗脫后的微球置于40℃的恒溫干燥箱內(nèi)，干燥時間6h。

(6)顆粒成型

篩選收集干燥后的近似球型的固定化酶顆粒。

在該工藝條件下得到的固定化酶顆粒的包埋率為92％，酶活回收率為64.7％

固定化酶的穩(wěn)定性測定；

(a)結(jié)果如附圖1所示的不同溫度下游離酶與固定化酶的相對酶活比較，游離酶的最適溫度范圍為37～39℃，固定化酶的最適溫度范圍為47～48℃，由于海藻酸鈉-殼聚糖壁材的保護(hù)作用，固定化酶的耐熱穩(wěn)定性有明顯提高。

(b)結(jié)果如附圖2所示的不同ph值條件下游離酶與固定化酶的相對酶活比較，游離酶的最適ph范圍為4.5～5.5，固定化酶的最適ph范圍為5.5～6.5，固定化酶的最適ph范圍有所提高，同時由于海藻酸鈉-殼聚糖壁材在低ph(ph＝2.0～4.0)條件下有良好的穩(wěn)定性，避免了木聚糖酶在胃液中的損失。

實施例2

一種海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法，具體步驟如下：

(1)原料混合

稱取3.0g海藻酸鈉充分溶解于蒸餾水中，向該膠體溶液中加入適量的木聚糖酶液，調(diào)節(jié)ph至6.0～7.0(ph值由5％醋酸溶液調(diào)至，下同)，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到混合?b，其中海藻酸鈉質(zhì)量百分比濃度為1.5％。

分別稱取2.0g殼聚糖和5.0g氯化鈣溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph至5.5，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到混合?b，其中殼聚糖質(zhì)量百分比濃度為1.0％,氯化鈣質(zhì)量百分比濃度為2.5％；

(2)微球成形及包覆

采用帶有針頭的蠕動泵將(1)所得混合液1b，以3滴/秒的速度滴入至(1)所得混合液2b中，得到直徑2～3mm的光滑微球。

(3)低溫固化

將步驟(2)中所得光滑微球置于4℃環(huán)境中進(jìn)行低溫固化，固化時間為2h。

(4)洗脫過濾

將步驟(3)固化后的微球以蒸餾水沖洗去除表面殘留雜質(zhì)，重復(fù)3次。

(5)低溫干燥

將洗脫后的微球置于35℃的恒溫干燥箱內(nèi)，干燥時間8h。

(6)顆粒成型

篩選收集干燥后的近似球型顆粒。

在該工藝條件下得到的固定化酶顆粒的包埋率為90.8％，酶活回收率為48.5％；

固定化酶的穩(wěn)定性檢測方法參照實施例1。

實施例3

一種海藻酸鈉-殼聚糖固定木聚糖酶的方法，具體步驟如下：

(1)原料混合

稱取4.0g海藻酸鈉充分溶解于蒸餾水中，向該膠體溶液中加入適量的木聚糖酶液，調(diào)節(jié)ph至6.0～7.0(ph值由5％醋酸溶液調(diào)至，下同)，充分?jǐn)嚢杌靹颍玫交旌弦?c，其中海藻酸鈉濃度為2.0％。分別稱取4.0g殼聚糖和3.0g氯化鈣溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph至5.5，充分?jǐn)嚢杌靹?，得到混合?c，其中殼聚糖濃度為2.0％,氯化鈣濃度為1.5％。

(2)微球成形及包覆

采用帶有針頭的蠕動泵將(1)所得混合液1c，以3滴/秒的速度滴入至(1)所得混合液2c中，得到直徑2～3mm的光滑微球。

(3)低溫固化

將步驟(2)中所得微球置于4℃環(huán)境中固化時間為1.5h。

(4)洗脫過濾

將固化后的微球以蒸餾水沖洗去除表面殘留雜質(zhì)，重復(fù)3次。

(5)低溫干燥

將洗脫后的微球置于35℃的恒溫干燥箱內(nèi)，干燥時間8h。

(6)顆粒成型

篩選收集干燥后的近似球型顆粒。

在該工藝條件下得到的固定化酶顆粒的包埋率為94.1％，酶活回收率為51.6％，固定化酶的穩(wěn)定性檢測方法參照實施例1。

綜上所述，以上所述僅是本發(fā)明的實施方式的舉例，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)。