本發(fā)明涉及一種篩選herg鉀離子通道激動劑和毒性檢測方法。

背景技術(shù)：

長qt綜合癥(longqtsyndrome,lqts)是一類由心肌離子通道異常引起的心律失常疾病，表現(xiàn)為心肌復(fù)極化時程延長，體現(xiàn)在心電圖上是qt間期延長。lqts易誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsadesdepointes，tdp)，從而導(dǎo)致心悸、暈厥、甚至猝死。lqts可分為先天性和獲得性兩種。先天性lqts是由基因突變引起，突變主要發(fā)生在kcnq1、kcnh2(編碼herg鉀離子通道)和scn5a等離子通道基因上。herg通道基因突變導(dǎo)致ii型lqts(lqts2)，占總lqts發(fā)生率的45％左右。獲得性lqts主要指由藥物引起的可逆性qt間期延長，研究表明大多數(shù)藥物是通過抑制herg鉀離子通道從而誘發(fā)lqts。目前l(fā)qts病人的治療主要依賴于使用β阻斷劑，病情嚴重的需要植入心臟起搏器或進行左頸胸交感神經(jīng)節(jié)切除術(shù)。然而，β阻斷劑只對部分病人有效，而植入心臟起搏器和左頸胸交感神經(jīng)節(jié)切除術(shù)對病人造成創(chuàng)傷，影響病人生活質(zhì)量。鑒于lots主要是由于基因突變使離子通道功能異常導(dǎo)致的，小分子化合直接修復(fù)突變體通道的功能將會是一種非常有效和安全的治療手段。

herg鉀離子通道介導(dǎo)心臟快速延遲整流鉀電流(ikr)，調(diào)控心肌細胞的復(fù)極化過程〔warmke,j.w.&ganetzky,b.afamilyofpotassiumchannelgenesrelatedtoeagindrosophilaandmammals.procnatlacadsciusa91,3438-3442(1994)〕。先天性基因突變或者一些藥物可抑制herg鉀離子通道功能，導(dǎo)致ⅱ型lqts〔curran,m.e.etal.amolecularbasisforcardiacarrhythmia:hergmutationscauselongqtsyndrome.cell80,795-803(1995)；sanguinetti,m.c.,jiang,c.,curran,m.e.&keating,m.t.amechanisticlinkbetweenaninheritedandanacquiredcardiacarrhythmia:hergencodestheikrpotassiumchannel.cell81,299-307(1995)；trudeau,m.c.,warmke,j.w.,ganetzky,b.&robertson,g.a.herg,ahumaninwardrectifierinthevoltage-gatedpotassiumchannelfamily.science269,92-95(1995)；abbott,g.w.etal.mirp1formsikrpotassiumchannelswithhergandisassociatedwithcardiacarrhythmia.cell97,175-187(1999)；vandenberg,j.i.etal.hergk(+)channels:structure,function,andclinicalsignificance.physiolrev92, 1393-1478〕。lqts是一種心律失常類疾病，臨床表現(xiàn)為心慌、昏厥、抽搐甚至猝死。許多化合物都會影響herg通道功能進而導(dǎo)致lqts。這些化合物根據(jù)作用機制可以分為兩類：阻斷細胞膜上herg通道功能的阻斷劑和抑制herg胞內(nèi)運輸?shù)囊种苿?；從上世紀九十年代末至今，有若干臨床藥物因為其對herg通道的影響而被撤出市場；目前，新藥開發(fā)都需要進行herg藥理檢測以評估該化合物對心臟的副作用〔vandenberg,j.i.etal.hergk(+)channels:structure,function,andclinicalsignificance.physiolrev92,1393-1478〕。

最新研究表明，大多數(shù)ⅱ型lqts相關(guān)的基因突變造成herg蛋白運輸缺陷、滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而減少細胞膜上的通道數(shù)目，降低其功能〔anderson,c.l.etal.mostlqt2mutationsreducekv11.1(herg)currentbyaclass2(trafficking-deficient)mechanism.circulation113,365-373(2006)；anderson,c.l.etal.large-scalemutationalanalysisofkv11.1revealsmolecularinsightsintotype2longqtsyndrome.natcommun5,5535(2014)〕。一些herg突變體通道可以在阻斷劑或低溫環(huán)境處理后能夠重新被運輸?shù)郊毎|(zhì)膜〔anderson,c.l.etal.mostlqt2mutationsreducekv11.1(herg)currentbyaclass2(trafficking-deficient)mechanism.circulation113,365-373(2006)；ficker,e.,dennis,a.t.,wang,l.&brown,a.m.roleofthecytosolicchaperoneshsp70andhsp90inmaturationofthecardiacpotassiumchannelherg.circres92,e87-100(2003)〕，而且重新上膜的突變體通道能夠發(fā)揮出與野生型通道相應(yīng)的生理功能〔mehta,a.etal.re-traffickingofhergreverseslongqtsyndrome2phenotypeinhumanips-derivedcardiomyocytes.cardiovascres102,497-506(2014)〕。上述現(xiàn)象一方面說明herg突變體通道可以被矯正并重新被運輸?shù)郊毎|(zhì)膜，另一方面也暗示了具備上述特性的矯正化合物對lqts有著潛在的臨床治療效果。但是，herg通道的阻斷劑因其對細胞膜上herg通道的直接阻斷作用而不能用于治療lqts。因此，篩選非阻斷劑類的矯正化合物是開發(fā)治療lqts新型藥物的重要方向。

目前已經(jīng)有一些細胞水平的檢測體系應(yīng)用于評估藥物對herg功能的影響。這些方法包括放射性配體結(jié)合實驗〔finlayson,k.,turnbull,l.,january,c.t.,sharkey,j.&kelly,j.s.[3h]dofetilidebindingtohergtransfectedmembranes:apotentialhighthroughputpreclinicalscreen.eurjpharmacol430,147-148(2001)〕、離子流監(jiān)測〔tang,w.etal.developmentandevaluationofhighthroughputfunctionalassaymethodsforhergpotassiumchannel.jbiomolscreen6,325-331(2001)〕和自動化膜片鉗體系〔guo,l.&guthrie,h.automatedelectrophysiologyinthepreclinicalevaluationofdrugsforpotentialqtprolongation.jpharmacoltoxicolmethods52,123-135(2005)〕和herg-lite系統(tǒng)〔wible,b. a.etal.herg-lite:anovelcomprehensivehigh-throughputscreenfordrug-inducedhergrisk.jpharmacoltoxicolmethods52,136-145(2005)〕。但是這些監(jiān)測儀器比較昂貴，而且它們一般只能檢測作用于細胞膜上的、瞬時性的herg通道阻斷劑或激動劑，很難篩選到那些作用時程較長、調(diào)控herg通道胞內(nèi)運輸?shù)幕衔?。更重要的是，對于促進運輸缺陷型的突變herg通道重新上膜的矯正類化合物，目前尚未出現(xiàn)相關(guān)的篩選體系。

秀麗隱桿線蟲是生物學研究中重要的模式生物，也常用于解析藥物作用機制和尋找藥物作用靶點〔kwok,t.c.etal.asmall-moleculescreeninc.elegansyieldsanewcalciumchannelantagonist.nature441,91-95(2006)；kaletta,t.&hengartner,m.o.findingfunctioninnoveltargets:c.elegansasamodelorganism.natrevdrugdiscov5,387-398(2006)；burns,a.r.etal.apredictivemodelfordrugbioaccumulationandbioactivityincaenorhabditiselegans.natchembiol6,549-557(2010)〕。最近，一些基于線蟲行為的高通量篩選平臺被開發(fā)出來用于新藥篩選〔burns,a.r.etal.high-throughputscreeningofsmallmoleculesforbioactivityandtargetidentificationincaenorhabditiselegans.natprotoc1,1906-1914(2006)；leung,c.k.etal.anultrahigh-throughput,whole-animalscreenforsmallmoleculemodulatorsofaspecificgeneticpathwayincaenorhabditiselegans.plosone8,e62166(2013)〕。線蟲中有一個erg家族鉀離子通道unc-103，它在線蟲運動、產(chǎn)卵和雄性線蟲交配行為中發(fā)揮重要作用〔park,e.c.&horvitz,h.r.mutationswithdominanteffectsonthebehaviorandmorphologyofthenematodecaenorhabditiselegans.genetics113,821-852(1986)；garcia,l.r.&sternberg,p.w.caenorhabditiselegansunc-103erg-likepotassiumchannelregulatescontractilebehaviorsofsexmusclesinmalesbeforeandduringmating.jneurosci23,2696-2705(2003)〕。人的herg通道與線蟲的unc-103通道在氨基酸序列上高度保守。以前工作發(fā)現(xiàn)調(diào)控herg的基因也可以調(diào)控unc-103的功能〔petersen,c.i.etal.invivoidentificationofgenesthatmodifyether-a-go-go-relatedgeneactivityincaenorhabditiselegansmayalsoaffecthumancardiacarrhythmia.procnatlacadsciusa101,11773-11778(2004)〕，暗示erg家族鉀離子通道在細胞內(nèi)的調(diào)控機制也是高度保守的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文提供一種融合蛋白，所述融合蛋白含有：

作為該融合蛋白n端的來自線蟲erg家族鉀離子通道unc-103蛋白n端第1～85位氨基酸殘基之間，長75～85個、優(yōu)選78～82個氨基酸殘基的片段；

herg或其至少包含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域的片段；和

作為該融合蛋白c端的來自所述unc-103蛋白c端第590～829位氨基酸殘基之間，長220～240個、優(yōu)選225～235個氨基酸殘基的片段。

在一個或多個實施方案中，所述herg的氨基酸序列如seqidno:18所示。

在一個或多個實施方案中，所述unc-103蛋白的氨基酸序列如seqidno:19所示。

在一個或多個實施方案中，所述融合蛋白還含有報告基因編碼的可被檢測的蛋白質(zhì)或酶，如熒光蛋白。

在一個或多個實施方案中，所述unc-103蛋白n端長75～85個氨基酸殘基的片段由unc-103蛋白n端第1位到第70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85位氨基酸殘基組成。

在一個或多個實施方案中，所述unc-103蛋白n端長75～85個氨基酸殘基的片段由unc-103蛋白n端第1位到第77、78、79、80、81或82位氨基酸殘基組成。

在一個或多個實施方案中，所述unc-103蛋白n端長75～85個氨基酸殘基的片段至少包含第1～79位氨基酸殘基，或由第1～79位氨基酸殘基組成。

在一個或多個實施方案中，所述unc-103蛋白c端第590～829位氨基酸殘基之間長220～240個氨基酸殘基的片段由unc-103蛋白第590～605氨基酸殘基中的任一位起到第810～829位氨基酸中的任一位氨基酸殘基組成。

在一個或多個實施方案中，所述unc-103蛋白c端第590～829位氨基酸殘基之間長220～240個氨基酸殘基的片段至少含有第599～829位氨基酸殘基，或由第599～829位氨基酸殘基組成。

在一個或多個實施方案中，所述herg的含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域的片段至少包括herg第408～889位氨基酸殘基，優(yōu)選至少包括herg第369～889位氨基酸殘基。

在一個或多個實施方案中，所述herg的含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域的片段的長度為至少482個氨基酸殘基。

在一個或多個實施方案中，所述herg的含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域的片段是herg第360～900位氨基酸之間長510～530個氨基酸殘基的片段；

在一個或多個實施方案中，所述herg的含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域的片段由第369～889位氨基酸殘基或第1～889位氨基酸殘基組成。

在一個或多個實施方案中，所述融合蛋白為unc-103蛋白n端第1～79位氨基酸殘基、herg第369～889位氨基酸殘基或第1～889位氨基酸殘基與unc-103蛋白c端第599～829氨基酸殘基組成的融合蛋白。

在一個或多個實施方案中，所述herg或其至少包含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié) 合域的片段中存在通道功能獲得性的突變，其中，所述突變包括但不限于在536位和/653位上的突變，例如a536w和/或a653t。

在一個或多個實施方案中，所述herg或其至少包含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域的片段中存在通道功能獲得性的突變，其中，所述突變包括但不限于在536位和/653位上的突變，例如a536w和/或a653t；以及導(dǎo)致herg胞內(nèi)運輸障礙的突變，所述突變包括但不限于在第31、65、470、561、601和818中的一個或多個位置上的突變，例如i31s、t65p、n470d、a561v、g601s和s818l中的一個或多個。

本文還提供一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列選自：

(a)編碼本文所述融合蛋白的多核苷酸序列；和

(b)與(a)的多核苷酸序列互補的序列。

本文還提供一種表達載體，其包含本文所述的多核苷酸序列。

本文還提供一種基因工程細胞或轉(zhuǎn)基因線蟲，其包含本文所述的多核苷酸序列或轉(zhuǎn)入了本文所述的表達載體，優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因線蟲具有以下一項或多項特征：

(i)所述多核苷酸序列整合入所述轉(zhuǎn)基因線蟲的基因組中；

(ii)所述轉(zhuǎn)基因線蟲表達本文所述的herg中存在通道功能獲得性突變和優(yōu)選的導(dǎo)致其胞內(nèi)運輸障礙的突變的融合蛋白；和

(iii)所述轉(zhuǎn)基因線蟲為acs-20基因缺陷型線蟲。

本文還提供一種篩選herg通道抑制劑的方法，所述方法包括：使待篩選的化合物與表達權(quán)利要求3第(1)項所述的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲共同孵育，并觀察、比較共同孵育前和共同孵育后線蟲的行為表現(xiàn)，其中，與共同孵育前相比，共同孵育后使共同孵育前的線蟲的行為缺陷(如運動和/或產(chǎn)卵障礙)得以改善或恢復(fù)的化合物鑒別為herg通道的抑制劑。

本文還提供一種篩選lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑的方法，所述方法包括：使待篩選的化合物與表達權(quán)利要求3第(2)項所述的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲共同孵育，并觀察、比較共同孵育前和共同孵育后線蟲的行為表現(xiàn)，其中，與共同孵育前相比，共同孵育后使線蟲出現(xiàn)行為缺陷(如運動和/或產(chǎn)卵障礙)，且優(yōu)選地使融合蛋白運輸?shù)郊毎|(zhì)膜上的化合物鑒別為lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑。

本文還提供一種herg藥理作用檢測方法，所述方法包括：使待篩選的化合物與表達權(quán)利要求3第(1)項所述的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲共同孵育，并觀察、比較共同孵育前和共同孵育后線蟲的行為表現(xiàn)，其中，與共同孵育前相比，共同孵育后使共同孵育前的線蟲的行為缺陷(如運動和/或產(chǎn)卵障礙)得以改善或恢復(fù)的化合物鑒別為能夠抑制herg通道功能的化合物，具有潛在的導(dǎo)致lqts的副作用。

在一個或多個實施方案中，上述方法使用本文所述的轉(zhuǎn)基因線蟲進行篩選。

在一個或多個實施方案中，所述共同孵育包括：在優(yōu)選地含誘導(dǎo)劑(如iptg)和抗生素(如羧芐青霉素)的線蟲培養(yǎng)基(如ngm)中共同孵育待測混合物和轉(zhuǎn)基因線蟲，優(yōu)選為l4時期的線蟲；

在一個或多個實施方案中，在所述線蟲培養(yǎng)基中接種靶向ifd-2和c15c7.5基因的rnai菌數(shù)天后，將待測化合物加到該培養(yǎng)基中，數(shù)小時后將所述轉(zhuǎn)基因線蟲(優(yōu)選為l4時期的線蟲)接種到該培養(yǎng)基中。

本文還提供pkcε激動劑在制備用于矯正lqts相關(guān)的herg突變體通道功能的物質(zhì)或在制備治療lqts(尤其是ii型lqts)的藥物中的用途，優(yōu)選的是，所述pkc激動劑為prostratin和ingenol3,20-dibenzoate(idb)。

本文還提供本文所述的融合蛋白、多核苷酸、表達載體、基因工程細胞或轉(zhuǎn)基因線蟲的下述用途：

(1)用于篩選herg通道抑制劑；

(2)用于篩選lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑；和

(3)用于herg藥理作用檢測。

附圖說明

圖1：c端融合gfp蛋白的嵌合通道herg^{chimera/a536w}表達在野生型線蟲中會導(dǎo)致線蟲產(chǎn)生明顯的行為缺陷。a：herg嵌合通道herg^{chimera/a536w}示意圖，a536w突變點用箭頭標出；b：體式鏡下野生型n2線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲herg^{chimera/a536w}行為圖，箭頭指示線蟲卵；c：野生型n2線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲herg^{chimera/a536w}的頭部擺動行為統(tǒng)計圖，*p<0.001；d：野生型n2線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲herg^{chimera/a536w}的產(chǎn)卵能力統(tǒng)計圖，*p<0.001；e：熒光鏡下herg^{chimera/a536w}::gfp(綠色)和mcherry蛋白(紅色)在線蟲中的表達模式，箭頭所示為線蟲頭部神經(jīng)元，比例尺長度為10μm；f：在dmso或herg抑制劑處理條件下，表達在293t細胞中的herg通道全細胞電流示意圖，右上角顯示的是刺激膜電位，左面所示為虛線內(nèi)時程電流；g：體視鏡下dmso或herg抑制劑處理之后線蟲行為圖。

圖2：從小分子化合物庫中篩選出阻礙herg通道胞內(nèi)運輸?shù)囊种苿?。a：篩選策略工作流程示意圖；b：朦朧木酸(alphitolicacid)的化學結(jié)構(gòu)式；c：體視鏡下dmso或朦朧木酸處理之后線蟲行為圖，箭頭指示線蟲卵；d：朦朧木酸處理后對herg通道電流的瞬時效果，圖中給出了在dmso或朦朧木酸瞬時處理條件下，表達在293t細胞中的herg通道全細胞電流示意圖；e：朦朧木酸處理后對herg通道電流的長時程效果，圖 中給出了在dmso或朦朧木酸長時程處理條件下(加藥后24h)，表達在293t細胞中的herg通道全細胞電流示意圖；f：朦朧木酸處理后對herg通道電流電流-電壓曲線(i-vcurve)的影響；g：不同濃度朦朧木酸長時程處理條件下，herg鉀通道電流密度的變化；h：朦朧木酸長時程處理對herg通道胞內(nèi)運輸?shù)挠绊?。質(zhì)粒ha-herg轉(zhuǎn)染入293t細胞中，兩個箭頭分別指示高分子量(155kd，完全糖基化形式)和低分子量(135kd，核心糖基化形式)的herg條帶，ha抗體用于最后的顯影。

圖3：從小分子化合物庫中可以篩選促進突變通道herg^a561v重新上膜的矯正類化合物。a：herg嵌合通道herg^{chimera/a536w/a561v}示意圖，a536w和a561v兩個突變點分別用紅色箭頭和黑色箭頭標出；b：herg^{chimera/a536w}和herg^{chimera/a536w/a561v}蛋白在線蟲細胞中的定位，比例尺長度為10μm；c：篩選促進突變通道herg^a561v重新上膜的矯正類化合物的工作流程圖。

圖4：prostratin和idb修復(fù)herg^{chimera/w536a/a561v}線蟲中herg突變蛋白的運輸缺陷。prostratin和idb處理herg^{chimera/w536a/a561v}線蟲的顯微圖像和10μmprostratin和10μmidb處理后herg^{chimera/w536a/a561v}蛋白在線蟲神經(jīng)元細胞內(nèi)的定位。箭頭所示為線蟲頭部神經(jīng)元。標尺指示10μm。

圖5：prostratin和idb修復(fù)herga561v運輸缺陷。a：prostratin和idb化合物的結(jié)構(gòu)式；b：prostratin(3um)和idb(2um)對herg-herg^a561v(比例3:1)電流影響的示例電流圖；c：prostratin和idb處理提高herg-herg^a561v通道電流密度。herg和herg^a561v以3:1比例表達在hek293t細胞中；d：不同濃度prostratin和idb對herg-herg^a561v(比例3:1)通道電流密度的影響；e：prostratin和idb處理提高herg-herg^a561v(herg/herg^a561v比例為1:1)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)效率；f：prostratin和idb處理對其它運輸缺陷herg突變體電流的影響，herg和突變體以1:1比例表達在hek293t細胞中。

圖6：prostratin和idb不影響野生型herg功能。a和b：idb和prostratin瞬時處理后對野生型herg電流的影響(其中，上圖為處理前的影響，下圖為處理后的影響)；c和d：長時程(24h)idb和prostratin處理后對野生型herg電流的影響；e和f：westernblot分析idb和prostratin長時程處理對野生型herg蛋白的影響；化合物濃度idb為2um，prostratin為3um。

圖7：prostratin和idb對herg^a561v的調(diào)控依賴于pkcε的激活。a：pkcεsirna處理顯著降低hek293t細胞中pkcε的蛋白量；b：降低pkcε蛋白表達量可消除prostratin和idb對herg-herg^a561v(herg/herg^a561v比例為3:1)電流的影響；c：pkcεsirna處理后，prostratin和idb對herg/herg^a561v(比例1:1)蛋白量的影響。

圖8：prostratin和idb修復(fù)hipsc來源心肌細胞中herg^a561v的功能。a：表達 herg^a561v對hipsc來源心肌細胞內(nèi)源ikr電流(herg通道介導(dǎo))的影響，及prostratin和idb對表達有herg^a561v的hipsc來源心肌細胞中ikr電流的影響，ikr電流用cs⁺通道方法記錄；b：ikr電流密度分析；c：在hipsc來源心肌細胞中表達herg^a561v，以及之后prostratin和idb處理后心室類型和心房類型心肌細胞動作電位示意圖；d：hipsc來源心肌細胞不同處理條件下apd90統(tǒng)計結(jié)果圖，*p<0.001。

圖9：prostratin和idb可消除hipsc來源心肌細胞中由于表達herg^a561v引起的ead現(xiàn)象。a：hipsc來源心肌細胞表達herg^a561v可使心房和心室心肌細胞產(chǎn)生ead；b：hipsc來源心肌細胞不同處理條件下產(chǎn)生ead的比例統(tǒng)計結(jié)果圖。

圖10：prostratin和idb不影響hipsc來源野生型心肌細胞動作電位時程。prostratin和idb處理對野生型hipsc-cm心肌細胞動作電位apd90的影響統(tǒng)計圖。

圖11：unc-103和herg序列比對。

圖12：含herg第1～889位氨基酸殘基的融合蛋白表達在野生線蟲n2中的實驗結(jié)果。a：體式鏡下herg^{chimera/a536w}(herg1～889)轉(zhuǎn)基因線蟲行為圖；b：體式鏡下herg^{chimera/a536w/a561v}(herg1～889)轉(zhuǎn)基因線蟲行為圖；c：野生型n2線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲herg^{chimera/a536w}(herg1～889)的頭部擺動行為統(tǒng)計圖，*p<0.001(第二排左圖)；d：野生型n2線蟲和轉(zhuǎn)基因線蟲herg^{chimera/a536w}(herg1～889)的產(chǎn)卵能力統(tǒng)計圖，*p<0.001(第二排右圖)。

具體實施方式

在本文中，發(fā)明人構(gòu)建了線蟲轉(zhuǎn)基因動物模型，并用于篩選herg通道功能抑制劑和矯正lqts相關(guān)herg突變體通道功能的化合物(corrector)。發(fā)明人將存在通道功能獲得性突變的herg通道或和lqts相關(guān)的herg突變體通道表達在線蟲中。這些表達存在通道功能獲得性突變的herg通道線蟲呈現(xiàn)出非常明顯的運動和產(chǎn)卵障礙，通過抑制劑降低herg通道功能可以緩解該轉(zhuǎn)基因線蟲的上述行為缺陷。而表達herg突變體通道的線蟲，由于基因突變造成herg不能正常上膜，因而能夠正常運動和產(chǎn)卵，而促進該通道上膜的化合物則有可能導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因線蟲運動和產(chǎn)卵缺陷。通過在這些轉(zhuǎn)基因線蟲上進行小分子化合物篩選，本申請發(fā)現(xiàn)一些herg通道新的抑制劑和herg突變體通道的功能矯正化合物。因此，這是一種新的篩選調(diào)控herg離子通道功能小分子化合物的方法。

本文的線蟲可以是來自廣桿線蟲屬的線蟲，優(yōu)選為秀麗隱桿線蟲(caenorhabditiselegans)。本文所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因線蟲能表達線蟲erg家族鉀離子通道unc-103蛋白n端、herg或其含跨膜段氨基酸序列和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域(cnbd)的片段以及unc-103蛋白c端形成的融合蛋白。

“片段”在本文中指全長序列的一部分連續(xù)的序列。

具體而言，本文的融合蛋白包括作為融合蛋白的n端的unc-103蛋白n端長75～85個、優(yōu)選78～82個氨基酸殘基的片段，herg或其含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域(cnbd)的片段，以及作為融合蛋白的c端的unc-103蛋白c端第590～829位氨基酸殘基之間長220～240個、優(yōu)選225～235個氨基酸殘基的片段。

所述unc-103蛋白n端長75～85個氨基酸殘基的片段可以是例如unc-103蛋白n端第1位到第70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85位氨基酸殘基的片段，優(yōu)選為第1位到第77、78、79、80、81或82位氨基酸殘基，更優(yōu)選至少包含第1～79位氨基酸殘基，或由第1～79位氨基酸殘基組成。

所述unc-103蛋白c端第590～829位氨基酸殘基之間長220～240個氨基酸殘基的片段可以是例如unc-103蛋白第590～605氨基酸殘基中的任一位起到第810～829位氨基酸中的任一位所形成的片段，如第590～810位氨基酸殘基，第590～820位氨基酸殘基，第595～825位氨基酸殘基，第598～828位氨基酸殘基，或第599～829位氨基酸殘基；優(yōu)選地，所述片段至少含有第599～829位氨基酸殘基。

本文所述的herg的片段至少包含herg的s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域(cnbd)。所述s1～s6跨膜區(qū)和cnbd可如圖11所示。所述herg的含s1～s6跨膜區(qū)和環(huán)狀核苷酸結(jié)合域(cnbd)的片段至少包括herg第408～889位氨基酸殘基，優(yōu)選至少包括herg第369～889位氨基酸殘基，或由第369～889位氨基酸殘基組成。例如，該片段可以是herg第1～1000位氨基酸殘基中至少包括第408～889位氨基酸殘基的片段，或至少包括第369～889位氨基酸殘基的片段。又例如，該片段可以是herg第360～900位氨基酸之間至少包括第408～889位氨基酸殘基的片段。因此，herg的含跨膜段氨基酸序列和cnbd的片段的長度為至少482個氨基酸殘基，如至少500個、至少510個、至少520個、至少550個等。在某些實施方案中，該片段為herg第1～889位氨基酸殘基。

在某些實施方案中，herg的片段是第360～900位氨基酸之間長至少510～530個氨基酸殘基的片段，例如可以是第360～372位氨基酸殘基中的任一位起到第885～900位氨基酸中的任一位所形成的片段，如第360～885位氨基酸殘基，第365～895位氨基酸殘基，第368～890位氨基酸殘基，第369～889位氨基酸殘基等；優(yōu)選地，所述片段至少含第369～889位氨基酸殘基。

在優(yōu)選的實施方案中，該herg或其含跨膜氨基酸序列和cnbd的片段中存在通道功能獲得性的突變。這些突變包括但不限于在536位和/653位上的突變。優(yōu)選的突變?yōu)槿〈蛔儯鏰536w和/或a653t，這些通道功能獲得性突變能使離子通道的激活曲 線向更負的電壓偏移，使通道能在較低的膜電位條件下開放，可造成動物行為異常，有利于篩選調(diào)控herg離子通道功能的化合物。

更優(yōu)選的，所述herg或其含跨膜氨基酸序列和cnbd的片段還存在導(dǎo)致herg胞內(nèi)運輸障礙的突變。這些突變包括但不限于在第31、65、470、561、601和818中的一個或多個位置上的突變，已知這些位置上的突變導(dǎo)致herg胞內(nèi)運輸障礙(anderson,c.l.等，large-scalemutationalanalysisofkv11.1revealsmolecularinsightsintotype2longqtsyndrome，natcommun5，5535(2014))。優(yōu)選的突變?yōu)槿〈蛔?，包括但不限于為i31s、t65p、n470d、a561v、g601s和s818l中的一個或多個，但其它運輸缺陷型lqts相關(guān)突變體也可用于相應(yīng)的化合物篩選。

在某些實施方案中，本文的融合蛋白由unc-103蛋白n端第1～79位氨基酸殘基、herg第369～889位氨基酸殘基或第1～889位氨基酸殘基、和unc-103蛋白c端第599～829位氨基酸殘基組成。除此之外，應(yīng)理解的是，雖然本文沒有一一列出，但本文所述的任意unc-103蛋白n端片段可與本文所述的任意herg片段及任意unc-103蛋白c端片段組合，以形成本發(fā)明的融合蛋白。

適用于本文的unc-103的氨基酸序列可如seqidno:19所示；適用于本文的herg的氨基酸序列可如seqidno:18所示。文中所述的unc-103和herg全長序列或其片段的氨基酸位置/編號均以seqidno:18和19的氨基酸位置/編號為基準。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計合適的酶切位點，這勢必在所表達的蛋白末端引入了一個或多個不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進重組蛋白的表達、獲得自動分泌到宿主細胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的n-末端、c-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、麥芽糖e結(jié)合蛋白、蛋白a、如6his或flag的標簽，或xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點。應(yīng)理解，這些氨基酸序列的存在不會影響到所得蛋白的活性。因此，本發(fā)明也包括在本發(fā)明融合蛋白的c末端和/或n末端添加一個或數(shù)個氨基酸(例如前述接頭肽、信號肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、gst、麥芽糖e結(jié)合蛋白、蛋白a、如6his或flag的標簽，或xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點等)所得的融合蛋白，這些融合蛋白仍具有本文所述的生物學活性。

在某些實施方案中，本發(fā)明融合蛋白中所述unc-103蛋白n端片段、c端片段以及herg或其片段中可存在一個或多個(例如30個以內(nèi)、25個以內(nèi)、20個以內(nèi)、15個以內(nèi)、10個以內(nèi)、5個以內(nèi))氨基酸突變(包括取代、缺失和/或插入)。突變優(yōu)選是保守性突變。例如，用性能相近或相似的氨基酸進行保守性取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)或多肽的 功能?！靶阅芟嘟蛳嗨频陌被帷卑ɡ?，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優(yōu)選的是，突變所得的各片段或融合蛋白本身仍然保留本文所述的生物學活性。例如，突變所得的unc-103蛋白n端片段和c端片段保留野生型unc-103的n和c端在線蟲細胞中正常上膜所具有的生物學活性；突變所得的herg的片段保留了s1～s6以及cnbd的生物學功能，或保留了與本文所述的a536w或a653t突變體相同的生物學功能(通道功能獲得性)，或與i31s、t65p、n470d、a561v、g601s或s818l突變體相同的生物學功能(導(dǎo)致herg胞內(nèi)運輸障礙)。

除此之外，優(yōu)選的是，本文的融合蛋白可被檢測，例如通過報告基因編碼的蛋白質(zhì)或酶被檢測，用以檢測融合蛋白在細胞中所處的位置，如用于判斷該融合蛋白是否被運輸?shù)郊毎|(zhì)膜上。換言之，本文的融合蛋白還可在其n端和/或c端包括報告基因編碼的蛋白質(zhì)或酶。這類蛋白質(zhì)或酶包括但不限于本領(lǐng)域常用的各種熒光蛋白，如綠色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、橙色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等。綠色熒光蛋白還包括例如增強型gfp(egfp)和去穩(wěn)定egfp(destabilizedegfp)。這些蛋白質(zhì)或酶可經(jīng)由接頭序列與融合蛋白中unc-103的片段連接。接頭序列可以是本領(lǐng)域常規(guī)的接頭序列，例如含gs的接頭序列，只要其不影響到融合蛋白整體的生物學功能即可。

除此類蛋白質(zhì)或酶外，還可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法對本文的融合蛋白進行標記，以便于檢測融合蛋白在細胞中所處的位置，例如，用于判斷該融合蛋白是否被運輸?shù)郊毎|(zhì)膜上。

本文包括所述融合蛋白的編碼序列。例如，seqidno:1顯示了由unc-103n端第1～79位氨基酸殘基、herg第369～899位氨基酸殘基和unc-103n端第599～829位氨基酸殘基組成的融合蛋白的編碼序列；seqidno:2是存在a536w突變的前述融合蛋白的編碼序列；seqidno:3則顯示存在a536w和a561w突變的前述融合蛋白的編碼序列。本文包括seqidno:1、2和3的簡并異構(gòu)體，即編碼相同的氨基酸序列但核苷酸序列不同的序列。本文也包括本發(fā)明編碼序列的互補序列。如前述所述，當本文的融合蛋白中還包括用于檢測目的的蛋白質(zhì)或酶時，本文的編碼序列優(yōu)選還包括編碼該蛋白質(zhì)或酶的報告基因。

本文的編碼序列通?？梢杂胮cr擴增法或重組法獲得。對于pcr擴增法，可根據(jù) 本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次pcr擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。

本文包括含有本文所述編碼序列的核酸構(gòu)建物，如克隆載體或表達載體。核酸構(gòu)建物通常還含有與本文所述的編碼序列操作性連接的調(diào)控序列，用于指導(dǎo)所述編碼序列在合適的宿主細胞中表達。

調(diào)控序列可以是合適的啟動子。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合啟動子，并且可以從編碼與該宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。合適的啟動子可以是本領(lǐng)域周知的各種啟動子，包括但不限于大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體pl啟動子；真核啟動子包括cmv立即早期啟動子、hsv胸苷激酶啟動子、早期和晚期sv40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的ltrs和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。優(yōu)選的啟動子是線蟲unc-103的啟動子。作為一個例子，unc-103的啟動子序列如seqidno:4所示。

調(diào)控序列也可以是轉(zhuǎn)錄終止子，為宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列與編碼該多肽的核苷酸序列的3′末端可操作連接。在選擇的宿主細胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明，例如用于細菌宿主的優(yōu)選終止子可以是來自t7噬菌體的終止子。

表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。表達載體還可包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。表達載體中，本文的編碼序列和上述調(diào)控序列中的一種、多種或全部操作性連接在一起，用于在宿主細胞中表達本文的融合蛋白。重組表達載體可以是能夠方便地經(jīng)受重組dna方法并且可導(dǎo)致本文的編碼序列表達的任何載體，如質(zhì)?；虿《荆ǖ幌抻诩毦|(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。載體的選擇一般取決于載體與其中被導(dǎo)入該載體的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實體存在，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制。這類載體包括質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含用于保證自我復(fù)制的任何方式?；蛘撸d體可以是當被導(dǎo)入宿主細胞時整合到基因組中并且與其已經(jīng)被整合進入的染色體一起復(fù)制的載體。合適的標記基因的產(chǎn)物提供對抗生素或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營養(yǎng)缺陷型等。

可采用本領(lǐng)域已知的載體來構(gòu)建本發(fā)明的合適構(gòu)建物，如ppd95.75表達載體(序列如seqidno:17所示)。因此，在某些實施方案中，本文的合適構(gòu)建物以ppd95.75表 達載體為骨架，含有本文的編碼序列和與該編碼序列操作性連接的來自unc-103的啟動子序列。

可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含本文所述的編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。

可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法將本文的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入宿主細胞中。例如，當宿主為原核生物如大腸桿菌時，在指數(shù)生長期后收獲能吸收dna的感受態(tài)細胞，然后用cacl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

當宿主為線蟲時，可通過顯微注射的方式將本文的核酸構(gòu)建物，尤其是表達載體轉(zhuǎn)入線蟲體內(nèi)或細胞內(nèi)。然后通過本領(lǐng)域周知的方法使表達載體整合入染色體中，這類方法包括但不限于uv/tmp方法。由此可構(gòu)建獲得本文的轉(zhuǎn)基因線蟲。優(yōu)選的，獲得靶基因(即本文所述的融合蛋白的編碼基因)整合入染色體中的線蟲后，通過回交數(shù)次(例如2～5次)，可去除背景突變。此外，由于線蟲具備較厚的體壁，同時線蟲腸道又可以主動排除外源有毒物質(zhì)，這使得大多數(shù)化合物較難進入線蟲細胞，因此，進一步優(yōu)選的是，本文的線蟲是acs-20基因缺陷型的，例如其acs-20基因被敲除。例如，通過將靶基因整合入染色體中的線蟲或回交獲得的線蟲與acs-20基因缺陷型線蟲(如本領(lǐng)域周知的acs-20(tm3232))雜交，可獲得本文的acs-20基因缺陷型線蟲。

因此，在某些實施方案中，本文包括表達herg中存在通道功能獲得性突變的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲。具體而言，這類線蟲表達的本文的融合蛋白中，herg在第a536和/或a653位存在通道功能獲得性突變，優(yōu)選是a536w和/或a653t。這類線蟲通常存在行為缺陷。在進一步優(yōu)選的實施方案中，這類線蟲同時還是acs-20基因缺陷型線蟲。

在其它實施方案中，本文的轉(zhuǎn)基因線蟲表達herg中存在通道功能獲得性突變、并同時存在導(dǎo)致其胞內(nèi)運輸障礙的突變的融合蛋白。具體而言，這類線蟲表達的本文的融合蛋白中，herg在第a536和/或a653位存在通道功能獲得性突變，優(yōu)選是a536w和/或a653t；和在第31、65、470、561、601和818位的任一位置或多個位置上存在導(dǎo)致herg胞內(nèi)運輸障礙的突變，優(yōu)選是i31s、t65p、n470d、a561v、g601s和s818l中的任一個或多個。這類線蟲通常不存在行為缺陷。同樣地，優(yōu)選的是，這樣線蟲同時還是acs-20基因缺陷型線蟲。

本文中，線蟲的行為缺陷通常指運動和/或產(chǎn)卵障礙。在m9溶液中，野生型n2線蟲的頭部擺動運動平均可達到每分鐘114次。因此，當轉(zhuǎn)基因線蟲在m9溶液中頭部擺動 運動每分鐘低于80次時，可認為所述轉(zhuǎn)基因線蟲存在運動障礙。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因線蟲在m9溶液中頭部擺動運動每分鐘低于70次、60次、50次、40次、30次、20次、10次或更低。在產(chǎn)卵能力方面，l4晚期的野生型n2線蟲在30小時內(nèi)平均可產(chǎn)57枚卵。因此，當l4晚期的轉(zhuǎn)基因線蟲在30小時內(nèi)產(chǎn)卵數(shù)量低于35枚、優(yōu)選低于30枚、更優(yōu)選低于25枚、更優(yōu)選低于20枚、更優(yōu)選低于15枚、更優(yōu)選低于10枚、更優(yōu)選低于5枚時，可認為該轉(zhuǎn)基因線蟲存在產(chǎn)卵障礙。存在上述運動和/或產(chǎn)卵障礙的轉(zhuǎn)基因線蟲可用于化合物篩選。

可利用本文的轉(zhuǎn)基因線蟲篩選herg通道抑制劑和lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑。例如，使用本文所述的表達存在通道功能獲得性突變的融合蛋白的線蟲可篩選獲得herg通道的抑制劑。通常，表達存在a536w或a653t突變的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲存在行為缺陷(如運動和/或產(chǎn)卵障礙)，在與待篩選的物質(zhì)接觸后，若該轉(zhuǎn)基因線蟲的行為缺陷(如運動和/或產(chǎn)卵障礙)得以改善或恢復(fù)，則表明該待篩選物質(zhì)為herg通道的抑制劑。所述“改善”指在m9溶液中，轉(zhuǎn)基因線蟲每分鐘的頭部擺動運動次數(shù)高于未用待篩選物質(zhì)處理的轉(zhuǎn)基因線蟲對照每分鐘的頭部擺動運動次數(shù)(優(yōu)選高至少5次，更優(yōu)選高至少10次，更優(yōu)選高至少15次)，和/或轉(zhuǎn)基因線蟲在30小時內(nèi)的產(chǎn)卵數(shù)量多于未用待篩選物質(zhì)處理的轉(zhuǎn)基因線蟲在30小時內(nèi)的產(chǎn)卵數(shù)量(優(yōu)選至少多2枚，更優(yōu)選至少至少多5枚，更優(yōu)選至少多10枚)。

或者，使用本文所述的表達herg中存在通道功能獲得性突變和導(dǎo)致其胞內(nèi)運輸障礙的突變的融合蛋白的線蟲可篩選獲得lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑，其中，與未接觸待篩選化合物之前的線蟲相比，若與待篩選化合物接觸后線蟲出現(xiàn)行為缺陷(如運動和/或產(chǎn)卵障礙)，則可將該待篩選的化合物用作矯正劑。

通常，篩選可在常規(guī)的線蟲培養(yǎng)基ngm中進行，培養(yǎng)基中可加入誘導(dǎo)劑(如iptg)和抗生素(如羧芐青霉素)。誘導(dǎo)劑和抗生素的濃度可根據(jù)實際待測情況確定。可將待測化合物和本文的線蟲(優(yōu)選為l4時期的線蟲)加到該培養(yǎng)基中，共同孵育(即“處理”)一段時間(例如24～40小時)后可通過觀察線蟲表型來確定待篩選的化合物是否是抑制herg通道的抑制劑和lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑。優(yōu)選的，可將靶向ifd-2和c15c7.5基因的rnai菌接種于上述ngm培養(yǎng)基，以降低線蟲腸道排除外源藥物能力，增加待測化合物分子在線蟲體內(nèi)的累積。在此情況下，在將該rnai菌接種到上述ngm培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天(如1～3天)，然后先將待測化合物加到培養(yǎng)基中，數(shù)小時(如2～8小時)后再將本文的線蟲(優(yōu)選為l4時期的線蟲)接種到該培養(yǎng)基中，共同孵育一段時間(如24～40小時)后可通過觀察線蟲表型來確定待篩選的化合物是否是抑制herg通道的抑制劑和lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑。

可使用本文的線蟲和方法對本領(lǐng)域已知的各數(shù)據(jù)庫中的化合物進行篩選，例如這些化合物可來自prestwickchemicallibrary和thespectrumcollectionandsigmalopac等。在某些實施方案中，使用本文所述的線蟲和方法對蛋白激酶c(pkc)的各種激動劑(優(yōu)選為化學分子)，包括但不限于傳統(tǒng)型pkc(cpkc，α、βi、βii和γ)，新型pkc(npkc，δ，ε，η,θ)，和非典型pkc(apkc，ζ，ι，λ)的激動劑，尤其是pkcε的激動劑進行篩選，尋找lqts相關(guān)的herg突變體通道功能矯正劑和/或治療ii型lqts的藥物。

采用本文的線蟲和方法不僅能甄別抑制細胞膜上的herg通道功能的抑制劑，而且還能鑒定出阻礙herg通道胞內(nèi)運輸?shù)男》肿踊衔?。因此，本文也提供一種檢測化合物的herg藥理作用的方法，所述方法包括使用待篩選的化合物處理本文所述的線蟲(尤其是前文所述的表達herg中存在通道功能獲得性突變的融合蛋白的線蟲)的步驟，其中，用該化合物處理后所述線蟲的行為缺陷得以改善或恢復(fù)，則該化合物能夠抑制herg通道功能，具有潛在的導(dǎo)致lqts的副作用。

本文還包括pkc激動劑，尤其是pkcε激動劑，在矯正lqts相關(guān)的herg突變體通道功能中的用途，包括在制備用于矯正lqts相關(guān)的herg突變體通道功能的物質(zhì)中的用途。優(yōu)選的是，所述pkc激動劑為prostratin和idb。所述矯正lqts相關(guān)的herg突變體通道功能包括但不限于修復(fù)該突變體的運輸缺陷。所述herg突變體包括在第31、470、561、601、818和823位的任一位置或多個位置上存在突變的突變體，尤其是具有i31s、n470d、a561v、g601s、s818l和r823w中的任一個或多個突變的突變體。

進一步地，本文還包括pkc激動劑，尤其是pkcε激動劑，在治療lqts，尤其是ii型lqts中的用途，包括在制備治療lqts(尤其是ii型lqts)的藥物中的用途。

下文將以具體實施例的方式闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等，《分子克?。簩嶒炇抑改稀?美國紐約州：冷泉港實驗室出版社，1989)所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。對于試劑的用法和用量，除非另有說明，否則按照常規(guī)的用法和用量使用。

方法

線蟲品系

野生型線蟲品系n2是從美國線蟲遺傳中心獲得的，突變體線蟲acs-20(tm3232)是從日本線蟲資源庫中購得。線蟲飼養(yǎng)在20℃的ngm平板上。

分子生物學

用于轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒herg^{chimera/a536w}經(jīng)過三步pcr方法構(gòu)建而成。首先從基因組或cdna文庫中分別pcr出如下dna或cdna片段：unc-103基因上游啟動子序列(seqidno:4)，unc-103cdna5’端序列(核苷酸序列如seqidno:1的第1－237位所示，編碼的氨基酸序列如seqidno:19第1－79位氨基酸殘基所示)，hergcdna中間段序列(核苷酸序列如seqidno:1第238－1800位所示，編碼的氨基酸序列如seqidno:18第369－889位氨基酸殘基所示)，unc-103cdna3’端序列(核苷酸序列如seqidno:1第1801－2493位所示，編碼的氨基酸序列如seqidno:19第599－829位氨基酸殘基所示)。首先利用酶切連接方法將unc-103基因上游啟動子序列插入到ppd95.75(序列如seqidno:17所示)表達載體。其次將unc-103cdna5’端序列、hergcdna序列和unc-103cdna3’端序列的片段做融合pcr，得到嵌合的herg通道pcr片段，接著通過酶切連接方法把該片段插入到已包含unc-103基因上游啟動子序列的ppd95.75表達載體，從而得到herg^chimera質(zhì)粒；最后做點突變pcr將herg通道在536位氨基酸突變，從而得到質(zhì)粒herg^{chimera/a536w}(嵌合基因的序列如seqidno:2所示)。用于轉(zhuǎn)基因的herg^{chimera/a536w/a561v}質(zhì)粒(嵌合基因的序列如seqidno:3所示)是在herg^{chimera/a536w}的基礎(chǔ)上又經(jīng)過一次點突變將herg通道第561位氨基酸突變之后得到的。用于哺乳動物細胞中表達的ha-herg質(zhì)粒是將herg基因的cdna插入到ha-prk5表達載體中構(gòu)建得到的，相應(yīng)的herg突變體是通過點突變反應(yīng)得到的。上述所有質(zhì)粒都經(jīng)過測序反應(yīng)驗證保證序列的正確性。

采用與上述相同的方法構(gòu)建編碼unc-103第1－79位氨基酸殘基、herg片段為seqidno:1第1～889位氨基酸殘基和unc-103第599－829位氨基酸殘基的herg^chimera(1-899)轉(zhuǎn)基因序列(其核苷酸序列如seqidno:22所示)，不同的是，pcr擴增herg片段的正向引物和unc-103n端的反向引物分別使用seqidno:20和21所示的引物序列。然后將該轉(zhuǎn)基因序列插入ppd95.75表達載體中，得到herg^chimera(1-899)質(zhì)粒，再做點突變pcr，將herg通道在536位氨基酸突變，得到質(zhì)粒herg^{chimera/a536w}質(zhì)粒(稱為“herg^{chimera/a536w}(herg1～889)質(zhì)?！?，嵌合基因的核苷酸序列如seqidno:23所示)，進一步在561位氨基酸突變，得到herg^{chimera/a536w/a561v}(herg1～889)質(zhì)粒(嵌合基因的核苷酸序列如seqidno:24所示)。

上述構(gòu)建過程使用到的引物序列如下所示：

unc-103啟動子引物序列：

正向：atgcatgcaggtgttcacgagatacca(seqidno:5)

反向：cgggatccgattcgccacgcatt(seqidno:6)

unc-103n端引物序列：

正向-p1：cgggatccatgaagacggcggtatt(seqidno:7)

反向-r1：ggtgaccttctcagtgacatttagtcgacttgtccttctcgat(seqidno:8)

herg引物：

正向-p2:aatgtcactgagaaggtcacc(seqidno:9)

反向-r2:caacttgcgcttgcgttgc(seqidno:10)

unc-103c端引物：

正向-p3：ggcaacgcaagcgcaagttgtcatcatcaatgaacaaagat(seqidno:11)

反向-r3：ggggtacccttagaatagtatcagtttcttgtg(seqidno:12)

a536w點突變引物：

正向：ggctggtgcgcgtgtggcggaagctggatcg(seqidno:13)

反向：cgatccagcttccgccacacgcgcaccagcc(seqidno:14)

a561w點突變引物：

正向：cctttgcgctcatcgtgcactggctagcctg(seqidno:15)

反向：caggctagccagtgcacgatgagcgcaaagg(seqidno:16)

herg(1～889)引物：

正向-p2:atgccggtgcggaggggccacg(seqidno:20)

反向-r2:caacttgcgcttgcgttgc(seqidno:10)

unc-103n端引物序列：

正向-p1：cgggatccatgaagacggcggtatt(seqidno:7)

反向-r1：cgtggcccctccgcaccggcattagtcgacttgtccttctcgat(seqidno:21)

轉(zhuǎn)基因線蟲構(gòu)建

質(zhì)粒herg^{chimera/a536w}、herg^{chimera/a536w/a561v}、herg^{chimera/a536w}(herg1～889)質(zhì)粒和herg^{chimera/a536w/a561v}(herg1～889)質(zhì)粒分別顯微注射入野生型n2線蟲中，同時顯微注射punc-103::mcherry質(zhì)?？稍诰€蟲細胞質(zhì)中表達紅色mcherry熒光蛋白，可用于線蟲熒光挑選和標記線蟲細胞質(zhì)部分來反應(yīng)嵌合herg通道在線蟲中運輸狀況。瞬時傳代的線蟲用標準的uv/tmp方法〔jiangetal.(2014)longevitymanipulationsdifferentiallyaffectserotonin/dopaminelevelandbehavioraldeteriorationinagingcaenorhabditiselegans.thejournalofneuroscience34:3947-3958〕整合，之后反復(fù)回交四次以去除背景突變，得到herg^{chimera/a536w}、herg^{chimera/a536w/a561v}轉(zhuǎn)基因線蟲、herg^{chimera/a536w}(herg 1～889)轉(zhuǎn)基因線蟲和herg^{chimera/a536w/a561v}(herg1～889)轉(zhuǎn)基因線蟲。

線蟲行為檢測

線蟲的頭部擺動行為用于檢測線蟲的運動能力。具體而言，剛成年第一天的線蟲被放到線蟲生理鹽水m9緩沖液中，觀察并記錄線蟲在1分鐘內(nèi)的時間里身體的擺動次數(shù)。線蟲單位時間內(nèi)產(chǎn)生的后代數(shù)目用于檢測線蟲的產(chǎn)卵能力。l4晚期的線蟲被挑到一個空板上，30小時之后將線蟲挑走，盤子上的卵和已孵化出的小蟲數(shù)目總計為線蟲的后代個數(shù)。

蛋白免疫印跡

蛋白免疫印跡實驗參考已有的文獻報道進行。hek293t細胞按照標準的細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)在恒溫37℃的co2培養(yǎng)箱中。ha-herg質(zhì)粒由lipofetamine2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入細胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染30小時后細胞被收集下來，細胞裂解后的蛋白樣品在sds-page電泳中分離，蛋白印跡實驗。ha-herg蛋白是用ha抗體顯示出來。

小分子化合物篩選

結(jié)構(gòu)和功能多樣性的小分子化合物來源于多種化合物庫，如prestwickchemicallibrary，thespectrumcollectionandsigmalopac等。48孔板用于化合物處理線蟲篩選目標藥物。每個孔中含有500μlngm，培養(yǎng)基中含有1mmiptg(異丙基硫代半乳糖苷)，50μg/ml羧芐青霉素。靶向ifd-2和c15c7.5基因的rnai菌接種于ngm培養(yǎng)基，可以有效增加化合物分子在線蟲體內(nèi)的累積。2天后，把溶解在dmso中的待篩選小分子化合物加入ngm培養(yǎng)基上，化合物分子終濃度達到20μm。4小時后，將同步化得到的于接種op50細菌的正常ngm培養(yǎng)基上培養(yǎng)的l4時期線蟲接種到已加化合物分子的48孔板ngm上，每個孔線蟲約20只。36小時后于顯微鏡下觀察線蟲表型來初步確定目標化合物。

電生理實驗

采用全細胞記錄模式記錄herg電流。電極(borosilicateglass,sutterinstrument)電阻約4-6mω，膜片鉗放大器是axon200b。在hek293t細胞中，表達質(zhì)粒用lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染，sirna用lipofectamine或rnaimax試劑轉(zhuǎn)染。電極內(nèi)液成分為(mm)：135kcl,10egta,1mgcl2,5mg-atp，10hepes(用koh將ph調(diào)節(jié)為7.2)。細胞外液組分為(mm)：130nacl,5kcl,10hepes,1mgcl2,10葡萄糖，2cacl2(用naoh將ph調(diào)節(jié)為7.4)。herg電流于室溫(22±1℃)下記錄，采用刺激方式如下：即先給予 細胞+40mv刺激使herg通道失活，接著給予-140mv至+40mv梯度刺激(20mv遞增)，鉗制電壓設(shè)定為-80mv。

人誘導(dǎo)多能干細胞分化而成的心肌細胞來源于cellulardynamicsinternational公司，接種于0.1％geltain包被的24孔板玻上培養(yǎng)。4天后，用viafecttransfectionreagent試劑轉(zhuǎn)染心肌細胞表達herg-ires-gfp質(zhì)粒。12小時后轉(zhuǎn)染細胞給予藥物處理，動作電位和cs⁺介導(dǎo)的herg通道電流(ikr-cs⁺)于24小時后記錄，溫度控制在27℃。記錄動作電位的電極內(nèi)液成分為(mm)：120kcl,1mgcl2,3mg-atp,10hepes，10egta,ph7.2。細胞外液組分為(mm)：140nacl,5.4kcl,1.8cacl2,1mgcl2,10hepes，10葡萄糖,ph7.4。通過注入0-40pa電流引起動作電位的產(chǎn)生，數(shù)據(jù)采樣頻率為0.25hz。cs⁺介導(dǎo)的herg通道電流的記錄參照zhangs.(isolationandcharacterizationofi(kr)incardiacmyocytesbycs+permeation，amjphysiolheartcircphysiol.2006；290:h1038-49)進行。其電極內(nèi)液成分為(mm)：135cscl，10hepes，5mgatp，10egta，ph7.2。細胞外液組分為(mm)：135cscl，10hepes，10葡萄糖，1mgcl2,10μm硝苯吡啶，ph7.4。

結(jié)果

轉(zhuǎn)基因線蟲構(gòu)建

unc-103離子通道是線蟲中唯一一個erg家族的鉀離子通道，它調(diào)控線蟲運動、產(chǎn)卵和雄蟲交配等行為。unc-103通道與人的erg家族鉀通道herg同源性很高。在跨膜段和cnbd結(jié)構(gòu)域等重要的功能區(qū)段，兩者相同的氨基酸高達70％。為了構(gòu)建一個線蟲品系用于篩選調(diào)控herg通道功能的小分子藥物，本發(fā)明人首先將全長的人herg通道表達在線蟲中，卻發(fā)現(xiàn)herg通道在線蟲細胞中不能正常運輸?shù)郊毎|(zhì)膜。本發(fā)明人接著嘗試構(gòu)建了嵌合的herg通道蛋白。該嵌合的herg通道蛋白其n端和c端替換成了unc-103的序列，同時在這個嵌合herg通道的第五個跨膜區(qū)引入一個點突變a536w〔subbiah,r.n.等，同前〕(圖1，a)。之所以做出上述兩種改動，是基于如下考慮：一方面，unc-103通道的n端和c端對其在線蟲細胞中的正常上膜是至關(guān)重要的，所以herg的n端和c端替換成unc-103的n端和c端之后可能會使得herg在線蟲細胞中被正常轉(zhuǎn)運到細胞膜上；另一方面，a536w位突變的herg通道在更低的電壓下激活，使細胞的膜電位變得比較低，從而降低細胞的興奮性，導(dǎo)致線蟲行為缺陷。的確，在unc-103啟動子驅(qū)動下將這種嵌合herg通道表達在野生型線蟲中導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因線蟲出現(xiàn)非常明顯的運動和產(chǎn)卵障礙(圖1，b、c和d)。在m9溶液中，野生型n2線蟲的頭部擺動運動平均可達到每分鐘114次，而herg^{chimera/a536w}轉(zhuǎn)基因線蟲的頭擺動運動平均為每分鐘 接近6次；在產(chǎn)卵能力方面，l4晚期的野生型n2線蟲在30小時內(nèi)平均可產(chǎn)57枚卵，對應(yīng)的herg^{chimera/a536w}轉(zhuǎn)基因線蟲平均可產(chǎn)接近1枚卵。同時熒光結(jié)果顯示線蟲細胞中融合gfp的herg^{chimera/a536w}蛋白能夠被正確運輸?shù)郊毎|(zhì)膜(圖1，e)。herg^{chimera/a536w}(herg1～889)轉(zhuǎn)基因線蟲也出現(xiàn)了類似的行為缺陷(圖12，a、c和d)。herg^{chimera/a536w/a561v}(herg1～889)轉(zhuǎn)基因線蟲與herg^{chimera/a536w/a561v}轉(zhuǎn)基因線蟲相同，具有正常的運動和產(chǎn)卵行為(圖12，b)。

線蟲具備較厚的體壁，同時線蟲腸道又可以主動排除外源有毒物質(zhì)，這使得大多數(shù)化合物較難進入線蟲細胞〔subbiah,r.n.等，同前〕。acs-20蛋白是線蟲體壁一種重要組成成分〔kage-nakadai,e.etal.twoverylongchainfattyacidacyl-coasynthetasegenes,acs-20andacs-22,haverolesinthecuticlesurfacebarrierincaenorhabditiselegans.plosone5,e8857(2010)〕。acs-20基因敲除線蟲[acs-20(tm3232)]呈現(xiàn)出體壁保護功能的缺失〔kage-nakadai,e.等，同前〕。為了使小分子化合物能有效進入線蟲體內(nèi)，我們將herg^{chimera/a536w}和acs-20(tm3232)雜交得到acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w}品系。用已知的herg通道抑制劑clofilium，ibutilide或e-4031處理該線蟲，其運動和產(chǎn)卵行為缺陷可以得到明顯改善(圖1，f和g)。這一結(jié)果說明藥物小分子化合物可以有效地進入線蟲體內(nèi)，另一方面也表明本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因線蟲表型的確是由于嵌合herg通道能夠被正確運輸?shù)郊毎|(zhì)膜并成功發(fā)揮功能導(dǎo)致的。

小分子化合物篩選得到herg通道抑制劑

能夠抑制herg通道功能的小分子化合物具有潛在的導(dǎo)致lqts的副作用，故這類化合物在臨床前藥物研發(fā)過程中必須被剔除掉。為了檢驗本發(fā)明人構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因線蟲是否可以用于識別潛在的herg抑制劑，發(fā)明人通過檢查藥物處理后線蟲的行為，篩選了4000個小分子化合物(圖2，a)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這四千個化合物中有70個左右可以不同程度地緩解acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w}轉(zhuǎn)基因線蟲的行為缺陷。其中朦朧木酸(ala)，可以很大程度上減輕線蟲的行為缺陷(圖2，b和c)。通過全細胞記錄，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用1或10μm的ala進行的瞬時處理對表達在hek293細胞中的herg通道電流沒有影響(圖2，d)，而長時程ala處理(處理24-32小時)則導(dǎo)致herg通道電流密度顯著降低，并呈現(xiàn)出藥物濃度依賴特性，其半抑制濃度ic50為8.2μm(圖2，e-g)。

本發(fā)明人接著檢測了ala處理之后herg蛋白表達和運輸效率的變化。herg通道在sds變性膠電泳中呈現(xiàn)兩條帶：低分子量條帶是核心糖基化蛋白形式，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；高分子量的條帶是完全蛋白糖基化蛋白形式，已運輸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)〔ficker,e.等，2003，同前〕。ala處理之后herg高分子量條帶減少，而低分子量條帶不變(圖2，h)，表明ala 抑制了herg通道運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。以上數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明人構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因蟲acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w}可以有效地識別新的herg通道抑制劑。

prostratin和idb修復(fù)herg^a561v運輸缺陷

絕大多數(shù)和lqts相關(guān)的基因突變導(dǎo)致herg通道運輸缺陷，進而降低herg通道功能。為了構(gòu)建可以篩選運輸缺陷矯正化合物的動物模型，本發(fā)明人在嵌合通道herg^{chimera/a536w}中引入突變點a561v(圖3，a)，該突變點是herg通道561位丙氨酸突變成纈氨酸，從而導(dǎo)致herg胞內(nèi)運輸障礙，引起lqts〔kagan,a.,yu,z.,fishman,g.i.&mcdonald,t.v.thedominantnegativelqt2mutationa561vreduceswild-typehergexpression.jbiolchem275,11241-11248(2000)；ficker,e.etal.retentionintheendoplasmicreticulumasamechanismofdominant-negativecurrentsuppressioninhumanlongqtsyndrome.jmolcellcardiol32,2327-2337(2000)〕。本發(fā)明人將新的嵌合通道herg^{chimera/a536w/a561v}表達在野生型n2線蟲中，并通過該轉(zhuǎn)基因線蟲和acs-20(tm3232)交配，得到acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w/a561v}線蟲。在acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w/a561v}線蟲中，融合gfp的herg^{chimera/a536w/a561v}蛋白定位到細胞質(zhì)內(nèi)(圖3，b)。與之相應(yīng)的是，acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w/a561v}線蟲呈現(xiàn)和野生型線蟲類似的正常表型。

有報道顯示運輸缺陷的突變通道herg^a561v被糾正后到達細胞膜上就可以發(fā)揮正常通道的功能〔mehta,a.等，2014，同前〕。本發(fā)明人據(jù)此假設(shè)，如果某些化合物可以促進嵌合通道herg^{chimera/a536w/a561v}在轉(zhuǎn)基因線蟲中正常上膜，該嵌合通道將在細胞膜上發(fā)揮功能，從而重新導(dǎo)致運動和產(chǎn)卵缺陷。依據(jù)這一思路，本發(fā)明人從小分子化合物庫中篩選矯正herg^a561v通道功能的化合物。本發(fā)明人的篩選過程分為兩步：首先以行為指標去篩選可以導(dǎo)致acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w/a561v}線蟲運動和產(chǎn)卵行為缺陷的化合物；接著本發(fā)明人在這些化合物處理的轉(zhuǎn)基因蟲中通過gfp熒光觀察herg^{chimera/a536w/a561v}通道在細胞中的定位，以確認突變通道被運輸?shù)郊毎ど?圖3，c)。本發(fā)明人在10600個化合物中篩選到了包括prostratin和ingenol3,20-dibenzoate(idb)等6個化合物，它們都可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因線蟲運動和產(chǎn)卵行為缺陷和herg^{chimera/a536w/a561v}的細胞質(zhì)膜定位(圖4)。

herg^a561v和野生型herg在hek293t細胞中共表達時，成熟形式的155kd蛋白條帶明顯減少，表明herg^a561v具顯性負效應(yīng)，這與以前的研究相一致〔kagan,a.，2000，同前；ficker,e.，2000，同前〕。當以1：3比例在hek293細胞中共表達herg^a561v和野生型herg時，給予化合物prostratin或idb(其結(jié)構(gòu)式如圖5，a所示)處理24小時能夠顯著提高herg電流密度(圖5，b)。這兩種化合物的作用具有濃度梯度依賴性(圖5，c-d)， prostratin和idb的半最大效應(yīng)濃度(ec50)分別為0.95μm和0.042μm(圖5，d)。當在hek293t細胞中以1:1比例表達herg^a561v和野生型herg，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示prostratin和idb處理后，成熟形式的herg(155kd)蛋白量明顯增加，表明這兩個藥物能夠提高herg蛋白胞內(nèi)運輸效率(圖5，e)。進一步研究發(fā)現(xiàn)prostratin和idb也能提高其它herg突變體通道(如herg^i31s、hergg^601s、herg^s818l等)的電流密度(圖5，f)。此外，電生理和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示prostratin和idb處理對野生型herg通道功能影響不大(圖6，a-f)，表明這兩個pkc激動劑相對特異性的修復(fù)herg突變體通道功能。

prostratin和idb都是pkc的激動劑。prostratin是一種非致瘤性的佛波酯pkc激動劑，它可廣泛激活3大類型的pkc。idb是新型pkc的激動劑，主要激活pkcε。接著本發(fā)明人探究prostratin和idb對herg^a561v的調(diào)控是否依賴于它們的pkc激動劑功能?；趐rostratin和idb都可以激活pkcε，rnai敲低pkcε表達被用來檢測它們是否仍能修復(fù)herg^a561v的運輸缺陷。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示pkcεsirna能夠顯著降低pkcε的表達(圖7，a)。當sirna降低pkcε表達后，prostratin和idb對herg^a561v電流提高效果被消除(圖7，b)，同時蛋白免疫印跡結(jié)果顯示它們失去了對herg^a561v運輸缺陷的修復(fù)功能(圖7，c)。這些結(jié)果表明prostratin和idb對herg^a561v的調(diào)控依賴于pkcε的激活。

prostratin和idb提高hipsc來源心肌細胞中herg^a561v的功能

herg鉀離子通道主要在心肌細胞中發(fā)揮重要作用，它介導(dǎo)心肌細胞動作電位復(fù)極化過程中的ikr電流。在hipsc-cm心肌細胞中，表達herg^a561v蛋白能夠顯著降低內(nèi)源ikr電流(圖8，a-b)，這可能是由于herg^a561v具有顯性負效應(yīng)，和內(nèi)源herg形成四聚體，導(dǎo)致herg通道滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)致。ikr電流是根據(jù)文獻方法〔zhang,s.isolationandcharacterizationofi(kr)incardiacmyocytesbycs+permeation.amjphysiolheartcircphysiol290,h1038-1049(2006)〕利用herg通道能通透cs⁺離子特性記錄的。此外，表達herg^a561v的hipsc來源心肌細胞動作電位復(fù)極化過程變慢，動作電位時程延長(圖8，c-d)，并且在某些心房心肌細胞中引起早起后去極化(ead)現(xiàn)象，這和lqts2病人來源的hipsc心肌細胞動電生理特點類似。更為重要的是，3μmprostratin和2μmidb處理后，表達有herg^a561v的hipsc來源心肌細胞內(nèi)源ikr電流明顯增大(圖8a-8b)，其動作電位時程也恢復(fù)到正常hipsc來源心肌細胞水平(圖8，c-d)，而且心房心肌細胞早起后去極化(ead)現(xiàn)象也沒有再產(chǎn)生(圖9)。此外，這兩種化合物處理正常hipsc-cm心肌細胞對動作電位時程幾乎沒什么影響(圖10)。綜合來說，prostratin和idb能夠減緩心肌細胞由于表達herg^a561v而導(dǎo)致的lqts2相關(guān)電活動特性，而且這種提高效果很可能是通過修復(fù)herg^a561v運輸缺陷實現(xiàn)的。

以上實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明人構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因線蟲acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w}和acs-20(tm3232)；herg^{chimera/a536w/a561v}可以有效地篩選herg鉀離子通道抑制劑和lqts相關(guān)herg突變體通道功能矯正劑。pkc激動劑prostratin和idb是herg突變體通道的功能矯正劑，具有治療lqts前景。

討論

離子通道只有被運輸?shù)郊毎ど喜拍馨l(fā)揮功能。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)通道蛋白胞內(nèi)運輸?shù)恼系K是包括lqts、囊性纖維化、耳聾、癲癇等疾病的致病機制。利用小分子化合物去糾正這種運輸缺陷為疾病的治療提供了可能，但目前鮮有報道，主要是由于缺乏合適的高通量篩選體系。在本文中，本發(fā)明人將修飾過的herg通道表達在線蟲中，構(gòu)建了兩種轉(zhuǎn)基因線蟲，分別利用這兩種線蟲篩選體系，本發(fā)明人成功篩選到了抑制正常herg通道胞內(nèi)運輸?shù)幕衔锖瓦\輸缺陷型突變herg通道的矯正化合物。

在本研究中，本發(fā)明人首次構(gòu)建了一種在體的、可以識別影響herg胞內(nèi)運輸?shù)幕衔锓肿拥暮Y選方法。fda規(guī)定，先導(dǎo)化合物在進入一期臨床前必須經(jīng)過herg藥理作用檢測以評估該化合物對心臟的毒副作用。而目前已有的篩選方法只能甄別抑制細胞膜上的herg通道功能的抑制劑，無法鑒定出阻礙herg通道胞內(nèi)運輸?shù)男》肿踊衔铩１景l(fā)明人的方法為herg毒理檢測提供了新的途徑和方法。

基于線蟲行為的大規(guī)模篩選體系是第一個可以準確篩選運輸缺陷型herg突變體通道矯正化合物的體系。這一篩選體系有著獨特的優(yōu)勢，首先，herg通道的抑制劑會阻斷位于細胞膜上的herg通道功能，從而不會使線蟲產(chǎn)生行為缺陷，所以這種基于動物行為的在體篩選平臺篩選到的主要是非抑制劑類herg突變體通道矯正劑。另外，本文描述的篩選方法簡單、容易操作，線蟲的培養(yǎng)和維護費用很低。由于目前針對離子通道的高通量化合物篩選平臺一般價格昂貴、操作和維護費用很高，僅有少數(shù)實驗室和醫(yī)藥公司可以負擔起〔clare,j.j.targetingionchannelsfordrugdiscovery.discovmed9,253-260(2010)〕。本發(fā)明人提供的這種大眾化的篩選平臺可以讓更多的實驗室加入到離子通道類疾病藥物篩選之中。

蛋白激酶c(pkc)是一類ca²⁺和/或磷脂依賴性的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，發(fā)揮許多重要的生理功能，如調(diào)控細胞增殖，凋亡，遷移。pkc至少有10種亞型，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可分為3大類：傳統(tǒng)型pkc(cpkc，α、βi、βii和γ)，為ca²⁺依賴并可被甘油二酯(dag)、磷脂酰絲氨酸(ps)激活；新型pkc(npkc，δ，ε，η,θ)，為ca²⁺非依賴并可被dag和ps激活；非典型pkc(apkc，ζ，ι，λ)，不依賴ca²⁺而只能被ps激活。pkc存在許多廣譜性和亞型選擇性的抑制劑和激動劑。prostratin是一種非致瘤性的佛波酯 pkc激動劑，它可廣泛激活3大類型的pkc。idb是新型pkc的激動劑，主要激活pkcε。本發(fā)明人的研究表明prostratin和idb對herg^a561v的調(diào)控依賴于它們對蛋白激酶pkcε的激活，揭示了pkc信號參與對錯誤折疊運輸缺陷herg突變體的修復(fù)。之前研究表明pkc信號途徑可調(diào)控許多心肌細胞離子通道，如鈉通道(scn5a)、katp和kcnq1鉀離子通道等。激活pka和pkc能夠通過增強kcnq1和pip2相互作用而部分恢復(fù)lqts1突變通道功能〔matavel,a.,medei,e.&lopes,c.m.pkaandpkcpartiallyrescuelongqttype1phenotypebyrestoringchannel-pip2interactions.channels(austin)4,3-11(2010)〕。本發(fā)明人研究表明prostratin和idb能夠消除hipsc來源的心肌細胞中由于表達突變herg^a561v導(dǎo)致的動作電位時程的延長，它們的這種作用的發(fā)揮應(yīng)該是依賴于對herg^a561v運輸缺陷的修復(fù)，因為這兩個化合物對正常hipsc來源心肌細胞動作電位時程影響不大。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)了prostratin和idb區(qū)別于以前認識的新功能，即它們能促進lqts相關(guān)herg突變體通道的膜運輸，增大ikr電流，具有治療lqts前景。