本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞向間充質(zhì)干細(xì)胞分化的直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一種起源于中胚層的多能干細(xì)胞，可以從人的多種組織中分離，如骨髓和脂肪組織。mscs的特點(diǎn)之一是它們具有分化成多種間質(zhì)組織的能力，其中包括骨，軟骨，腱，肌肉，骨髓間質(zhì)和脂肪組織等，這一生物學(xué)特性使得mscs細(xì)胞在臨床治療和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
mscs可以方便的從多種成體組織中獲得，包括脂肪組織和骨髓組織，而且其分離和培養(yǎng)的方法在領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)十分成熟(例如，美國(guó)專(zhuān)利5,486,359)。然而，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的mscs體內(nèi)植入率低下并且分化能力十分有限，這成為使用成體來(lái)源的mscs進(jìn)行高效細(xì)胞治療的重要障礙。胚胎來(lái)源的mscs具有更長(zhǎng)的端粒，更好的增殖率，并且具有更高的體內(nèi)植入率和出色的分化能力。胚胎干細(xì)胞來(lái)源的mscs的獲取方法是已知的，例如，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)us2008/0219957描述的方法中，通過(guò)打散胚胎干細(xì)胞克隆并在無(wú)基質(zhì)細(xì)胞的條件下使用含有fgf2的無(wú)血清培養(yǎng)基能夠獲得胚胎來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，胚胎干細(xì)胞的使用本身就存在高度爭(zhēng)議。
臍帶血(umbilicalcordblood，ucb)在新生兒出生后十分容易獲得，分離和培養(yǎng)ucbmscs的方法已經(jīng)建立(例如，美國(guó)專(zhuān)利7704739)；然而，目前在ucb中獲得的mscs數(shù)量非常少。臍帶血取材方便，不存在醫(yī)學(xué)倫理爭(zhēng)議，其轉(zhuǎn)分化而來(lái)的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(inducedmesenchymalstemcells，imscs)增殖能力強(qiáng)且分化能力全面、體內(nèi)移植效率高于任何一種從成體組織分離獲得的mscs。臍帶血細(xì)胞誘導(dǎo)mscs的方法已被報(bào)道，但是一般具有非常低的效率。peters等報(bào)道了一種使用不依賴(lài)于滋養(yǎng)層細(xì)胞的雙重培養(yǎng)體系通過(guò)臍帶血細(xì)胞誘導(dǎo)mscs。另外，從其他胚胎組織，如胎盤(pán)，臍帶膠質(zhì)和羊水中獲取mscs的方法也被廣泛描述。不過(guò)，為了使mscs同種異體移植可廣泛用于臨床治療造福更多的患者，建立一個(gè)足夠規(guī)模的mscs儲(chǔ)備庫(kù)是十分必 要的。因此建立一個(gè)能夠高效率獲得高質(zhì)量的mscs的方法，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述臍帶血誘導(dǎo)mscs效率低下的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞分化成mscs的基因工程技術(shù)，以及使用此方法獲得的imscs進(jìn)行的臨床治療。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種可以使臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞直接從造血干細(xì)胞高效轉(zhuǎn)分化獲得imscs的基因工程技術(shù)，cd34分子選擇性地表達(dá)于人類(lèi)及其他哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞表面，并隨著細(xì)胞的成熟逐漸減弱至消失，是目前使用比較廣泛的人造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物。通過(guò)本發(fā)明提供的技術(shù)方法，使用病毒感染的方法使得相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，配合誘導(dǎo)mscs的培養(yǎng)基，能夠在2-3周的時(shí)間里，從1×106的臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)分化可獲得1×109的mscs，轉(zhuǎn)分化而來(lái)的imscs細(xì)胞表現(xiàn)為mscs的形態(tài)并表達(dá)mscs細(xì)胞表面標(biāo)志物，如cd29、cd44、cd73、cd90。
本發(fā)明所涉及的臍帶血造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化所使用的轉(zhuǎn)錄因子包括oct4、nanog、mycl1、snai1、snai2、twist1這6個(gè)基因的核昔酸序列組合中至少一種。oct4(pou5f1；accessionno.nm_001173531；aminoacidsequenceprovidedinseqidno：1)是眾所周知的一種重編程轉(zhuǎn)錄因子，能夠?qū)⒃煅杉?xì)胞轉(zhuǎn)化成中胚層干細(xì)胞，并能夠促進(jìn)中胚層干細(xì)胞的增殖。nanog(accessionno.aap49529；aminoacidsequenceprovidedinseqidno：2)是另一種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及mscs成克隆的能力。myc家族的基因，例如mycl1(accessionnos.np_001028253(isoform1)，np_005367(isoform2)，andnp_001028254(isoform3)；aminoacidsequencesprovidedinseqidno：3-5；respectively)，能夠長(zhǎng)期的促進(jìn)msc增殖。c-myc是原癌基因的一種，持續(xù)表達(dá)c-myc可能會(huì)引發(fā)腫瘤，但瞬時(shí)表達(dá)c-myc也是能夠安全的應(yīng)用于轉(zhuǎn)分化的，目前并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)mycl1與腫瘤有相關(guān)性。snai1(accessionno.nm_005985；aminoacidsequenceprovidedinseqidno：3)，snai2(accessionno.nm_003068xr_017857；aminoacidsequenceprovidedinseqidno：4)。snai是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，在胚胎發(fā)育過(guò)程中通過(guò)抑制粘附分子e-cadherin調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial.mesenchymaltransition，emt)。twist1 (accessionno.nm_000474；aminoacidsequenceprovidedinseqidno：3)是堿性螺旋一環(huán)一螺旋(basichelix-loop-helix，bhlh)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，進(jìn)化過(guò)程中非常保守，在不同種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守，在胚胎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外twist1被認(rèn)為是癌基因，影響腫瘤細(xì)胞凋亡，而且作為emt過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，twist1對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要影響。twist1可參與多種細(xì)胞的分化，包括肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞，并與心瓣膜的發(fā)育有關(guān)。
本發(fā)明所涉及的用于轉(zhuǎn)化臍帶血造血干細(xì)胞的表達(dá)載體包括，但不局限于慢病毒載體、非整合慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體和非整合型附加型載體。這些載體也可以加入適當(dāng)?shù)目刂圃约俺墒斓恼{(diào)控技術(shù)，例如tet-ontm系統(tǒng)(clontechlabs.，mountainview，ca；baron&bujard，methodsenzymol.2000，327：1-21)。本發(fā)明所涉及的表達(dá)載體的啟動(dòng)子可以是sffv、mscv、ef1-α和泛素啟動(dòng)子中的任何一種。
本發(fā)明所涉及的在轉(zhuǎn)分化過(guò)程中添加的細(xì)胞因子或者化合物可以是以下至少一種，所涉及的細(xì)胞因子包括但不局限于表皮生長(zhǎng)因子(egf)，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(如fgf-2)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(tgf-β1)，和骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(bmp-3)。所涉及的化合物包括但不局限于能夠增強(qiáng)mscs增殖能力的wnt3a或wnt5a或gsk-3的抑制劑和促進(jìn)mscs生長(zhǎng)的vegf和/或igf-1。
本發(fā)明提供了一種可以使臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞直接從造血干細(xì)胞高效轉(zhuǎn)分化獲得imscs的基因工程技術(shù)，將造血干細(xì)胞與一定組合物通過(guò)足夠時(shí)間的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)分化成為mscs，上述組合物包括oct4、nanog、mycl1、snai1、snai2、twist1中至少一種轉(zhuǎn)錄因子，還可以包括如上公開(kāi)的一種或多種細(xì)胞因子和其它化合物。
使用本發(fā)明提供的技術(shù)方法可以從臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到均勻的mscs，這種mscs基本上類(lèi)似或相同，具有相近的基因表達(dá)譜和細(xì)胞形態(tài)。例如使用本發(fā)明提供的技術(shù)方法制備的mscs表達(dá)公認(rèn)的鑒定mscs的細(xì)胞表面標(biāo)記cd73，cd105，cd166，cd90，cd271，cd29，cd44中的至少一種。
本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)方法除了可用于從cd34陽(yáng)性細(xì)胞制備mscs，也可用于使用cd133陽(yáng)性細(xì)胞或非純化的臍帶血細(xì)胞制備mscs。
本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容除了利用cd34陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為mscs的技術(shù)方法，還包括根據(jù)所公開(kāi)的技術(shù)方法獲得的mscs以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明所提供的技術(shù)方法可直接將已存在的臍帶血干細(xì)胞庫(kù)方便安全的轉(zhuǎn)化成為間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)，具有較深遠(yuǎn)的醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值。
附圖說(shuō)明
圖1為實(shí)施例1中采用的慢病毒載體構(gòu)建示意圖。
圖2為實(shí)施例2中采用的非整合型表達(dá)載體示意圖。
圖3為實(shí)施例3中來(lái)自實(shí)施例2的imscs長(zhǎng)期培養(yǎng)后的核型分析圖。
圖4為實(shí)施例4中來(lái)自實(shí)施例2的imscs向成脂細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞的分化圖。
圖5為實(shí)施例5中來(lái)自實(shí)施例2的imscs的細(xì)胞表型分析圖。
具體實(shí)施方式
為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說(shuō)明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明的可實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種使用慢病毒感染臍帶血來(lái)源cd34陽(yáng)性造血干細(xì)胞獲得mscs的方法，其包括以下步驟：
1.cd34陽(yáng)性細(xì)胞的富集和儲(chǔ)存：
1)臍帶血與羥乙基淀粉5∶1充分混勻，室溫靜置40分鐘沉淀紅細(xì)胞。
2)分裝15ml淋巴細(xì)胞分離液于50ml離心管中，置于室溫平衡。
3)吸取1)中的上清，緩慢加入已經(jīng)平衡到室溫的淋巴細(xì)胞分離液中，注意不要擾動(dòng)分離液的液面，總體積可達(dá)到50ml。離心機(jī)設(shè)置去閘，400g離心25分鐘。
4)吸取兩個(gè)液相之間的白膜層加入5倍體積pbs充分混勻。500g離心10分鐘。獲得單個(gè)核細(xì)胞。
5)按照美天旎人cd34陽(yáng)性細(xì)胞富集磁珠試劑盒的說(shuō)明書(shū)富集臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中的cd34陽(yáng)性細(xì)胞(miltenyibiotec，auburn，ca)。
2.cd34陽(yáng)性細(xì)胞預(yù)刺激：新鮮分離或者復(fù)蘇的臍帶血cd34陽(yáng)性細(xì)胞，在造血干細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)：iscove’smodifieddulbecco’smedium(imdm)+10％fbs+100ng/mltpo+100ng/mlscf+100ng/mlfl+100ng/mlg-csf+10ng/mlil3。細(xì)胞因子均購(gòu)自prospec(eastbrunswick，nj)。37℃，5％co2培養(yǎng)2天。
3.慢病毒感染：
1)24孔板使用纖維連接蛋白(retronectin)(ch-296；takarabio，inc.，shiga，japan)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)預(yù)處理。室溫放置2小時(shí)或者4度過(guò)夜后，pbs洗去殘留纖維連接蛋白，可以使用。
2)造血干細(xì)胞每孔1x104接種到包被好的24孔板中。然后加入moi為10的帶有轉(zhuǎn)分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒37℃，5％co2培養(yǎng)4-5小時(shí)，慢病毒載體構(gòu)建流程如圖1所示。
3)換去含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的造血干細(xì)胞培養(yǎng)基，并在24小時(shí)后進(jìn)行二次感染。
4.轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)：將第二次基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞培養(yǎng)在轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基組成如下：αmem+10％fbs+10-20ng/mlfgf2+10～20ng/mlegf2+10-20ng/mlpdgfb。37℃，5％co2培養(yǎng)4到5天后，大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為mscs樣imscs。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種使用非整合載體使臍帶血來(lái)源cd34陽(yáng)性造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化獲得imscs的方法，其包括以下步驟：
1.非整合載體的構(gòu)建
1)為了更好的符合臨床細(xì)胞治療的標(biāo)準(zhǔn)，我們開(kāi)發(fā)了使用非整合型載體進(jìn)行mscs的轉(zhuǎn)分化方法。我們首先測(cè)試了以ebna1為基礎(chǔ)的附加型載體。核轉(zhuǎn)染臍血cd34陽(yáng)性細(xì)胞一周之后，我們得到了msc樣細(xì)胞。
2)從invitrogen公司(卡爾斯巴德，ca)。潮霉素抗性基因元件和cmv啟動(dòng)子通過(guò)nrui和bamhi兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)被去除并將oct4，nanog，mycl1，snai1，snai2，twist1這6個(gè)基因的核苷酸序列組合中至少一種從慢病毒載體上切下并插入pcep4附加型載體。圖2是cd34陽(yáng)性細(xì)胞向imscs轉(zhuǎn)分化采用的非整合型表達(dá)載體的示意圖。
3)重編程基因被克隆到pcep4載體骨干上；基因的表達(dá)是sffv(spleenfocus-formingvirusu3promoter，脾焦點(diǎn)形成病毒u3啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)的。2a是一個(gè)來(lái)自馬鼻炎病毒的自體裂解位點(diǎn)序列。wpre，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件；sv40polya，sv40病毒多聚腺苷酸化信號(hào)；orip，epstein-barrvirus，ebv病毒起源的復(fù)制元件；ebna1，艾伯斯坦-巴爾抗原1，它對(duì)于感染細(xì)胞過(guò)程中的復(fù)制以及維持游離質(zhì)粒的持久性起著至關(guān)重要的作用。
2.附加型載體核轉(zhuǎn)染
1)新鮮或凍存后復(fù)蘇的臍血cd34陽(yáng)性細(xì)胞的培養(yǎng)在造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系中，既含有10％血清的imdm中加入tpo，scf，和fl，細(xì)胞因子終濃度均為100毫微克/毫升。
2)三天后，收獲細(xì)胞，使用cd34細(xì)胞
3)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞立即種于retronectin預(yù)處理板以利于造血干細(xì)胞恢復(fù)。
4)第二天使用前面所述的mscs的細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)。
使用非整合載體轉(zhuǎn)分化而來(lái)的imscs與慢病毒轉(zhuǎn)分化而來(lái)的imscs細(xì)胞生物學(xué)特性相同。轉(zhuǎn)分化3周之后99％細(xì)胞檢測(cè)不到oct4表達(dá)。
實(shí)施例3imscs的長(zhǎng)期培養(yǎng)及基因組穩(wěn)定性的鑒定
本實(shí)施例是對(duì)實(shí)施例2中得到的imscs進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，并進(jìn)行基因組穩(wěn)定性的鑒定，按照以下步驟進(jìn)行：
1.我們?cè)趍scs培養(yǎng)條件下將骨髓imscs培養(yǎng)40代以上，群體倍增時(shí)間為18-36小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)以及傳代具體方法：
1)24孔板使用纖維連接蛋白(retronectin)(ch-296；takarabio，inc.，shiga，japan)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)預(yù)處理。室溫放置2小時(shí)或者4度過(guò)夜后，pbs洗去殘留纖維連接蛋白，可以使用。
2)mscs培養(yǎng)在retronectin預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)板中，每2-3天，使用accutase或胰蛋白酶處理五分鐘消化imscs成單個(gè)細(xì)胞，并按4-6倍傳代。
2.經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，細(xì)胞保持典型的mscs形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面分子標(biāo)記的表達(dá)與早期轉(zhuǎn)分化的mscs細(xì)胞相同。
3.染色體核型分析結(jié)果如圖3所示，并沒(méi)有在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后的imscs中發(fā)現(xiàn)染色體異常。染色體g顯帶方法：使用dna標(biāo)準(zhǔn)光譜核型分析程序和hisky完全細(xì)胞遺傳學(xué)系統(tǒng)(appliedspectralimaging，inc.vista，ca)。每個(gè)克隆挑選10個(gè)處于細(xì)胞間期的細(xì)胞，進(jìn)行染色體核型分析。
實(shí)施例4imscs體外分化能力檢測(cè)
本實(shí)施例是對(duì)實(shí)施例2中得到的imscs進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，并進(jìn)行體外分化能力的鑒定，髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。使用上述方法獲 得的imsc在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3周，我們發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以很好的地分化成多個(gè)骨骼組織的譜系，證明了轉(zhuǎn)分化而來(lái)的mscs分化能力完整。具體按照以下步驟進(jìn)行：
1.脂肪細(xì)胞的分化：
1)imscs(4×103cells/cm2)接種。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：α-mem+10％/fbs+1μm地塞米松+10μg/ml胰島素，0.5mm異丁基黃嘌呤+10ng/mlfgf2。
2)培養(yǎng)基每三天換一次，三次后每隔2天換液，37℃，5％co2培養(yǎng)2周。
3)油紅染色法顯色油脂肪細(xì)胞中的顆粒：吸去培養(yǎng)液，用pbs洗2次。加入3.7％甲醛，室溫固定30min，再用蒸餾水洗2次。加入0.2％的油紅-o染液，在37℃染色30min，吸去染液，用蒸餾水洗2次。最后加入1ml蒸餾水，在顯微鏡下觀察并照像。
2.軟骨細(xì)胞分化：
1)imscs(4×103cells/cm2)接種。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，加入成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：α-mem+10％胎牛血清+0.1μm地塞米松+10ng/mltgf-β3+10ng/mltgf-β1+1％its+200μm抗壞血酸-2-磷酸。
2)培養(yǎng)基每三天換一次，三次后每隔2天換液，37℃，5％co2培養(yǎng)3周。
3)吸去培養(yǎng)液，輕輕加入4％的多聚甲醛進(jìn)行固定，然后取出細(xì)胞團(tuán)做石蠟切片。用阿爾新藍(lán)染色或用免疫組化檢測(cè)ii型膠原的表達(dá)。
4)阿爾新藍(lán)染色方法：首先將石蠟切片浸在1％的酸性阿爾新藍(lán)染液中染色30min，然后用0.1m的鹽酸洗滌5min。在顯微鏡下觀察并照相。
3.成骨分化：
1)imscs(4×103cells/cm2)接種。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：α-mem培養(yǎng)基+10％fbs+10mmβ-磷酸甘油+0.1μm地塞米松+10ng/mlbmp2+10ng/mlbmp4+10ng/mlfgf2+200μm的抗壞血酸。
2)培養(yǎng)基每三天換一次，三次后每隔2天換液，37℃，5％co2培養(yǎng)3周。
3)茜素紅染色：首先吸去6孔板中的培養(yǎng)液，用pbs洗2次，然后加入甲醇丙酮混合液(二者混合比例為1∶1)，室溫固定10min，再用pbs洗3次。最后加入0.5％茜素紅染液，在37℃染色30min，吸去茜素紅染液，用pbs洗3次后，在顯微鏡下觀察并照相。
三系分化結(jié)果如圖4所示，imscs可以分化成脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
實(shí)施例5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型
本實(shí)施例是對(duì)實(shí)施例2中得到的imscs進(jìn)行細(xì)胞表型檢測(cè)，按照以下步驟進(jìn)行：
1.收集imscs細(xì)胞成長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，使用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，400g離心5分鐘去除上清。細(xì)胞團(tuán)用100μlpbs+2％edta重懸。
2.標(biāo)記msc表面標(biāo)記相關(guān)的抗體，4度孵育30min，1mlpbs+2％edta洗第一次，細(xì)胞團(tuán)用300μlpbs+2％edta重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)抗原的表達(dá)。
3.流式抗體均購(gòu)自ebioscience公司(sandiego，ca，usa)
cd29：anti-humancd29(integrinbeta1)
cd44：anti-human/mousecd44(im7)
cd90：anti-humancd90(thy-1)
cd166：anti-humancd166(alcam)
cd73：anti-humancd73(ad2)
cd105：anti-humancd105(endoglin)
如圖5所示，培養(yǎng)3周后，所有的imsc表達(dá)msc標(biāo)志物：cd29、cd44、cd90和cd166，大部分的imscs同時(shí)表達(dá)cd73和cd105。