本發(fā)明屬中藥領域，涉及大別山五針松的樹皮提取物及其制備方法和在制藥中的用途，本發(fā)明從大別山五針松（pinusdabeshanensis）的樹皮中提取分離得到異海松烷型和松香烷型二萜化合物，經(jīng)生物活性測試表明該類化合物可顯著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b），可用于制備預防或治療ptp1b介導的疾病，特別是ii型糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥的藥物或該類藥物的先導化合物。本發(fā)明還涉及該類化合物的制備方法。
背景技術：
：現(xiàn)有技術公開了蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,ptp）是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白酪氨酸殘基磷酸化水平的酶家族，與細胞增殖和胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導過程密切相關（fischeretal,science1991,253:401-406）。蛋白酪氨酸磷酸酶1b（proteintyrosinephosphatase1b,ptp1b）廣泛分布于多種人體組織中，全長約50kda，是最早被純化和確定生物學特征的ptp家族成員之一（charbonneauetal,proc.natl.acad.sci.usa.1989,86:5252–5256）。ptp1b表達的改變與人類糖尿病、肥胖癥和癌癥等疾病相關。糖尿?。╠iabetesmellitus）和肥胖癥（obesity）是嚴重威脅人類身體健康的內(nèi)分泌紊亂性代謝類疾病，常伴隨著外周組織細胞對胰島素敏感性的降低（即胰島素抵抗），引起肌肉、肝臟及脂肪組織中的糖脂代謝平衡失調(diào)。根據(jù)糖尿病的發(fā)病機制，目前一般將糖尿病分為i型糖尿?。ㄒ葝u素依賴型，iddm）與ii型糖尿?。ǚ且葝u素依賴型，niddm）。其中ii型糖尿病占90%以上，胰島素抵抗是ii型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵因素。研究表明，ptp1b可使激活的胰島素受體和胰島素受體底物去磷酸化，在胰島素和瘦素的信號傳導過程中起著重要的負調(diào)控作用（kenndyetal,science1999,283:1544–1548）。ptp1b的過度表達將會導致胰島素和瘦素信號的變化，從而導致糖尿病和肥胖癥的發(fā)生。因此，ptp1b可視為治療糖尿病和肥胖癥等相關疾病的重要的藥物靶點（johnsonetal.,nat.rev.drug.discov.2002,1:696–709）。尋找ptp1b的特異性抑制劑，通過抑制ptp1b的活性來提高外周組織對胰島素的敏感性，對糖尿病和肥胖癥治療有著重要的應用前景。另有研究發(fā)現(xiàn)ptp1b在包括慢性髓細胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌在內(nèi)的若干癌細胞中都有過量表達和水平提高現(xiàn)象（liuetal.,j.biol.chem.1996,271,31290–31295;kennethetal.,mol.cell.biol.1998,18,2965–2975;weinerteal.,j.natl.cancerinst.1996,86,372–378），說明ptp1b在這些癌癥細胞中起著調(diào)控激酶活性的作用。因此，ptp1b的抑制劑可用于治療或預防癌癥或在癌癥發(fā)展時用于減緩其進展。還有研究表明ptp1b抑制劑可用于治療或預防神經(jīng)退行性疾病。ptp1b作為新的藥用靶點已成為近年來生物學及創(chuàng)新藥物研究的一個熱點。隨著高通量篩選技術的廣泛運用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較多種類的ptp1b抑制劑。然而迄今為止，尚未有任何ptp1b抑制劑得以成功上市成為藥物，限制其成藥的首要原因是ptp1b與ptp家族中其他的酶具有相同的催化中心，在抑制ptp1b活性的同時提高其針對ptp1b的選擇性極其重要。另外，目前發(fā)現(xiàn)的活性比較高的抑制劑多帶有磷酸、羧酸、磺酸等極性基團，具有較高的負電荷，不利于透過細胞膜，導致生物利用度差。因此尋找高效、高選擇性，同時兼具良好藥代動力學性質(zhì)的小分子ptp1b抑制劑具有重要意義，對于糖尿病和肥胖癥等疾病的治療有著廣闊的應用前景。天然產(chǎn)物具有結(jié)構復雜性和結(jié)構多樣性的特點，是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來源。天然產(chǎn)物及其衍生物獨特的化學結(jié)構，使其具有高藥效和對特定靶點高選擇性的優(yōu)點以及潛在的獨特的作用機制等優(yōu)點（newman,etal.,nat.prod.rep.2000,17:215–34;newmanetal.,j.nat.prod.2012,75:311–335）。因此從天然活性成分中尋找開發(fā)新型、高效的ptp1b抑制劑具有重要的研究價值。統(tǒng)計表明，瀕危植物次生代謝產(chǎn)物的成藥性較高，是發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構和獨特作用機制的新藥物的重要來源，在國際上正引起高度重視（ibrahimetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2013:110,16832–16837;zhuetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2011,108:12943–12948）。大別山五針松（pinusdabeshanensis）隸屬松科（pinaceae）松屬（pinus）植物，是一種常綠喬木，成年后高達30余米，直徑可達50cm，是我國特有的面臨瀕危滅絕的珍稀樹種之一，于1992年10月被列為國家珍稀樹種第一批二級保護樹種（fuetal.,chinaplantreddatabook,sciencepress:beijing;newyork,1992）；其天然分布于大別山地區(qū)海拔800-1350米的山脊懸?guī)r陡坡和溝谷兩側(cè)。分布范圍狹窄，結(jié)實母株罕見，授粉率極低，球果種子十粒九空，種子敗育率極高，發(fā)芽率極低，而且常因球果種子遭松鼠危害，故林下幼樹極少，自然更新十分困難，其化學成分尚未有任何報道。本申請的發(fā)明人基于保護性地采集少許大別山五針松植物樣品，積極促進利用這一瀕危珍稀資源為人類服務的宗旨，擬提供大別山五針松的樹皮提取物及其制備方法和在制藥中的用途。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供大別山五針松的樹皮提取物及其制備方法和在制藥中的用途，本發(fā)明從大別山五針松（pinusdabeshanensis）的樹皮中提取分離得到異海松烷型和松香烷型二萜化合物，經(jīng)生物活性測試表明該類化合物可顯著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b），可用于制備預防或治療ptp1b介導的疾病，特別是ii型糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥的藥物或該類藥物的先導化合物。本發(fā)明的所述的二萜類化合物具有如下化學結(jié)構式：其中化合物1和2為異海松烷型二萜，化合物3–5為松香烷型二萜，本發(fā)明中，所述的二萜類化合物，其中c-18位均氧化成羧基，同時異海松烷型二萜1和2的側(cè)鏈具有三元氧環(huán)；所述的松香烷型二萜化合物3–5結(jié)構中c環(huán)芳化。本發(fā)明的另一目的是提供所述的化合物的制備方法。本發(fā)明所述的化合物由大別山五針松樹皮經(jīng)由本領域所涉常規(guī)的提取分離方法制備而得，其包括步驟：晾干粉碎的大別山五針松樹皮用甲醇室溫浸泡提取，提取液減壓回收溶劑，合并后得浸膏。浸膏用水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分，乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠、sephadexlh-20及半制備hplc分離，得化合物1–5。本發(fā)明所述的化合物可通過從植物中分離純化得到；也可經(jīng)本領域技術人員熟知的化學方法合成獲得。本發(fā)明對所制得的二萜類化合物進行了蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b）抑制活性實驗，結(jié)果表明該類化合物均具有顯著的抑制活性，進一步，所述的化合物可作為蛋白酪氨酸磷酸酶ptp1b抑制劑，用于制成預防、延緩或治療由ptp1b介導的疾病，特別是ii型糖尿病和肥胖癥的藥物或是作為該類藥物的先導化合物。本發(fā)明所述的化合物可單獨應用或者合用，亦可與藥學上可接受的載體或賦形劑結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服或者非口服劑型。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：所述目標化合物1為新的異海松烷型二萜化合物，而化合物2為首次從自然界中分離得到；首次發(fā)現(xiàn)所述二萜類化合物具有顯著的ptp1b酶抑制活性，對現(xiàn)代人群中高發(fā)的糖尿病、肥胖癥等具有應用前景。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將落在權利要求書的范圍內(nèi)。具體實施方式下述制備例中，，比旋光測試通過jascop-1020旋光儀完成；紫外和紅外光譜數(shù)據(jù)分別通過shimadzuuv-2550紫外光譜儀和nicoletavatar360型紅外光譜儀獲得；nmr用brukeravanceii400型儀測定；lr-ms由agilent1100serieslc/msdg1946d型儀測定,hr-ms由absciextripletof5600型儀測定；所使用的硅膠和薄層板為煙臺康比諾公司生產(chǎn)，sephadexlh-20凝膠為瑞士gehealthcarebio-sciences公司生產(chǎn)；半制備hplc為waterse2695，配備2998pda和2424蒸發(fā)光散射雙檢測器以及sunfireods(5μm,250×10mm)半制備柱，日本島津lc-2010ahtshimadzunormal-phasechiralitycolumn(5μm,250×4.6mm,chiralpak,ad-h)；所有試劑均為上海國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。實施例1：二萜類化合物的制備取大別山五針松樹皮180g，粉碎后用90%甲醇室溫冷浸提取5次，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏50g。浸膏用水分散后依次用石油醚與乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部分40.0g。乙酸乙酯部分經(jīng)100-200目硅膠柱層析，以石油醚：乙酸乙酯30:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脫，得到8個組分（fr.a-fr.h），組分fr.b（1.9g）又經(jīng)200-300目硅膠柱層析（洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯10:1-2:1）得到3個亞組分（fr.b1-3），其中亞組分fr.b1(30.6mg)采用半制備型hplc進一步分離，以73%乙腈等度洗脫（流速：3ml/min），得到化合物3（8.0mg,tr=21.3min），組分fr.c（1.9g）經(jīng)200-300目硅膠柱層析（洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯7:1-3:1）得到2個亞組分（fr.c1-2），其中亞組分fr.c1經(jīng)過凝膠sephadexlh-20柱層析（洗脫劑為甲醇）得到化合物4（28.0mg），亞組分fr.c2經(jīng)過半制備型hplc進一步分離，以90%甲醇等度洗脫（流速：3ml/min），分別得到化合物1和2的混合物，該混合物又經(jīng)過手性柱（正己烷：異丙醇94:6，流速：1ml/min）進一步分離得到化合物1（2.2mg,tr=9.5min）和2（2.5mg,tr=12.5min），組分fr.f（0.5g）經(jīng)sephadexlh-20以純甲醇洗脫，得到化合物5（120.0mg）?；衔?–5的核磁及理化數(shù)據(jù)如下：化合物1(15(r*),16-epoxy-13-epi-pimara-7-en-18-oicacid):無色油狀,[α]d20+5.0°(c0.1,chcl3);uv(chcl3)λmax(logε)217(0.97)nm;ir(kbr)νmax2922,2857,1698,1452,1442,1386,1366,1024,786cm?1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.75(3h,s,me-17),0.90(3h,s,me-20),1.13(1h,m,h-1a),1.28(3h,s,h-19),1.36(1h,m,h-11a),1.39(1h,m,h-12a),1.45(1h,m,h-12b),1.56(2h,m,h-2),1.58(1h,m,h-11b),1.68(1h,m,h-3a),1.71(1h,m,h-6),1.76(1h,m,h-5),1.77(1h,m,h-3b),1.85(1h,d,j=13.6hz,h-14a),1.86(1h,m,h-1b),1.94(1h,d,j=13.6hz,h-14b),1.96(1h,m,h-9),1.99(1h,m,h-6b),2.64(2h,brd,j=3.6hz,h-16),2.72(1h,dd,j=3.6,3.2hz,h-15),5.34(1h,brd,j=5.2hz,h-7).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ38.8(c-1),17.9(c-2),36.9(c-3),46.3(c-4),52.0(c-5),25.2(c-6),121.3(c-7),134.7(c-8),44.9(c-9),35.0(c-10),19.4(c-11),33.3(c-12),33.9(c-13),42.0(c-14),60.6(c-15),43.4(c-16),18.1(c-17),184.7(c-18),17.1(c-19),15.3(c-20);(+)esimsm/z319[m+h]+,341[m+na]+;hresimsm/z341.2095[m+na]+(calcdforc20h30o3na,calcd341.2093,δ=－2.7ppm).化合物2(15(s*),16-epoxy-13-epi-pimara-7-en-18-oicacid):無色油狀,[α]d20+8.0°(c0.1,chcl3);uv(chcl3)λmax(logε)217(0.83)nm;ir(kbr)νmax2922,2857,1698,1452,1442,1386,1366,1024,786cm?1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.78(3h,s,me-17),0.90(3h,s,me-20),1.13(1h,m,h-1a),1.28(3h,s,h-19),1.36(1h,m,h-11a),1.37(1h,m,h-12a),1.45(1h,m,h-12b),1.56(2h,m,h2-2),1.58(1h,m,h-11b),1.68(1h,m,h-3a),1.71(1h,m,h-6),1.76(1h,m,h-5),1.77(1h,m,h-3b),1.85(1h,d,j=13.6hz,h-14a),1.86(1h,m,h-1b),1.94(1h,d,j=13.6hz,h-14b),1.96(1h,m,h-9),1.99(1h,m,h-6b),2.64(1h,dd,j=4.8,4.0hz,h-16),2.68(1h,dd,j=4.8,3.2hz,h-16),2.72(1h,dd,j=4.0,3.2hz,h-15),5.34(1h,brd,j=5.2hz,h-7).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ38.8(c-1),17.9(c-2),36.9(c-3),46.3(c-4),52.0(c-5),25.2(c-6),121.3(c-7),134.7(c-8),44.9(c-9),35.0(c-10),19.4(c-11),32.0(c-12),33.9(c-13),42.9(c-14),60.7(c-15),43.5(c-16),18.5(c-17),184.7(c-18),17.1(c-19),15.3(c-20);(+)esimsm/z319[m+h]+,341[m+na]+;hresimsm/z341.2095[m+na]+(calcdforc20h30o3na,calcd341.2093,δ=－2.5ppm).化合物3(abieta-8,11,13,15-tetraen-18-oicacid):白色無定形粉末,[α]d20+55.0(c0.1,meoh).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.25(3h,s,me-20),1.29(3h,s,me-19),1.50(1h,m,overlapped,h-6a),1.50(1h,dd,overlapped,h-1a),1.72(1h,m,h-3a),1.75(2h,m,h2-2),1.80(1h,m,h-3b),1.84(1h,m,h-6b),2.14(3h,brs,h-17),2.25(1h,dd,j=12.4,2.1hz,h-5),2.33(1h,brd,j=13.5hz,h-1b),2.94(2h,m,h2-7),5.04(1h,brs,h-16a),5.34(1h,brs,h-16b),7.16(1h,d,j=2.0hz,h-14),7.20(1h,d,j=8.0hz,h-11),7.26(1h,dd,j=8.0,2.0hz,h-12);(+)esimsm/z299[m+h]+,321[m+na]+.化合物4(12-hydroxydehydroabieticacid):淡黃色油狀,[α]d20+35.0°(c0.1,cdcl3).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.22(3h,s,me-20),1.25(3h,d,j=7.2hz,me-16),1.27(3h,d,j=7.2hz,me-17),1.29(3h,s,h-19),1.52(1h,m,overlapped,h-6a),1.52(1h,dd,overlapped,h-1a),1.70(1h,m,h-3a),1.74(2h,m,h2-2),1.79(1h,m,h-3b),1.82(1h,m,h-6b),2.22(1h,dd,j=12.5,2.2hz,h-5),2.25(1h,brd,j=13.5hz,h-1b),2.83(2h,m,h2-7),3.12(1h,sept.,j=7.2hz,h-15),6.64(1h,s,h-11),6.85(1h,s,h-14),13cnmr(100mhz,cdcl3):δ37.9(c-1),18.5(c-2),36.7(c-3),47.4(c-4),44.5(c-5),21.9(c-6),29.2(c-7),127.0(c-8),147.8(c-9),36.8(c-10),110.8(c-11),150.7(c-12),131.8(c-13),126.7(c-14),26.8(c-15),22.7(c-16),22.5(c-17),184.5(c-18),16.2(c-19),25.0(c-20);(+)esimsm/z317[m+h]+,339[m+na]+.化合物5(15-hydroxy-7-oxo-8,11,13-abietatrien-18-oicacid):淡黃色粉末,[α]d20+16.5(c0.1,meoh).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.27(3h,s,me-20),1.29(3h,s,me-19),1.58(6h,s,me-16,17),1.68(1h,m,h-1a),1.80(5h,m,h-1b,h2-2,h2-3),2.42(1h,dd,j=17.0,3.2hz,h-6a),2.68(1h,dd,j=13.5,3.2hz,h-5),2.86(1h,dd,j=17.0,13.5hz,h-6b),7.38(1h,d,j=8.4hz,h-11),7.76(1h,d,j=8.4,2.1hz,h-12),8.06(1h,d,j=2.1hz,h-12),13cnmr(100mhz,cdcl3):δ37.7(c-1),18.1(c-2),37.0(c-3),46.3(c-4),43.5(c-5),36.4(c-6),198.8(c-7),130.4(c-8),153.8(c-9),37.3(c-10),123.6(c-11),130.7(c-12),147.3(c-13),123.3(c-14),72.4(c-15),31.7(c-16),31.5(c-17),182.5(c-18),16.1(c-19),23.6(c-20);(+)esimsm/z331[m+h]+,353[m+na]+.。實施例2：蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制活性測定實驗方法：采用分子生物學的方法，構建基因重組的hgst-ptp1b-bl21e.coli人類ptp1b工程菌，經(jīng)純化后的hgst-ptp1b重組蛋白能水解底物para-nitrophenylphosphate(pnpp)的磷脂鍵，得到的脫磷酸產(chǎn)物pnp在波長405nm處有很強的光吸收，因此可通過直接檢測405nm處光吸收的變化以觀察酶活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況；初篩選擇所述化合物濃度為20μg/ml時對ptp1b酶活性的百分抑制率進行考察，試驗結(jié)果表明化合物4和5抑制率高于95%，化合物1-3抑制率高于60%。進一步測定ic50值：樣品臨用前溶于dmso配成合適濃度，3倍稀釋，7個稀釋度，三復孔，取2μl樣品溶液加入到標準的測活體系（30nmgst-hptp1b,2mmpnpp,50mm3-嗎啉丙磺酸(mops)，ph6.5,2mmdtt,1mmedta,2%dmso）。反應溫度為30oc，在versamax上動態(tài)測量405nm處的光吸收，時間為3min，其動力學曲線一級反應的斜率作為酶的活性指標。以相對活性對化合物濃度作圖，經(jīng)公式v/v0＝100/(1+b*[i]/ic50)擬合得到ic50值。實驗重復三次，結(jié)果取三次的平均值，陽性對照齊墩果酸（oleanolicacid）ic50值為1.45μg/ml；表1.測試化合物抑制ptp1b活性數(shù)據(jù)化合物ic50(μg/ml)113.04±1.21211.17±3.09316.10±1.4441.61±0.2653.42±0.28化合物1–5抑制ptp1b的ic50值如表1所示，測試結(jié)果表明，所述5個化合物均表現(xiàn)出顯著的抑制活性，尤其化合物4和5的作用強度與陽性對照齊墩果酸基本相當，表明本發(fā)明所述化合物可用于制備治療糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥的藥物或是作為該類藥物的先導化合物。當前第1頁12