本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成生物學(xué)與疾病基因或細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，集傳統(tǒng)藥物治療和基于合成生物學(xué)的細(xì)胞治療的聯(lián)合，具體涉及一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)及調(diào)控方法和在治療肝病合并糖尿病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
合成生物學(xué)旨在以工程學(xué)思想作為指導(dǎo)，對(duì)生物分子系統(tǒng)進(jìn)行遺傳學(xué)改造、對(duì)生命過程或生物體進(jìn)行有目標(biāo)的設(shè)計(jì)、改造、乃至重新合成，使細(xì)胞和生物體具備某些特定新功能的新興學(xué)科。利用合成生物學(xué)的方法和理論可以創(chuàng)造針對(duì)生物醫(yī)藥、環(huán)境能源、生物材料等問題的新“生命體系”。經(jīng)過近十年的飛速發(fā)展，合成生物學(xué)從起步到現(xiàn)在，已經(jīng)在多個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域取得重大進(jìn)展。尤其是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成生物學(xué)領(lǐng)域，人們?cè)O(shè)計(jì)、構(gòu)建了多種可控的基因遺傳電路用于診斷、治療代謝疾病、癌癥、免疫等相關(guān)疾病。
糖尿病是當(dāng)前威脅全球人類健康的最重要的慢性流行性疾病之一。全球糖尿病患者超過3.6億。僅我國(guó)糖尿病患者已超過1億，成為全球糖尿病患者最多的國(guó)家。相關(guān)調(diào)查資料顯示，糖尿病并發(fā)癥是糖尿病對(duì)機(jī)體的危害最重要的原因之一，其中糖尿病與肝臟疾病的并發(fā)概率非常高，比如糖尿病酮癥酸中毒時(shí)肝損害程度會(huì)明顯加重。還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，肝損傷也會(huì)引起血糖升高等糖尿病癥狀，慢性丙型肝炎患者的糖尿病并發(fā)率為21％～50％。一般糖尿病會(huì)引起肝組織結(jié)構(gòu)損傷，而肝損傷會(huì)嚴(yán)重影響糖代謝而導(dǎo)致糖尿病，因此兩者之間形成惡性循環(huán)。臨床研究顯示，8.4％的2型糖尿病及2.1％的i型糖尿病患者為hcv陽性，50％～80％的慢性肝病患者存在糖耐量異常的情況。目前，傳統(tǒng)的糖尿病和肝病治療方式依賴于改變生活方式以及一些傳統(tǒng)的藥物治療，而這些治療方案對(duì)大多數(shù)病人并無顯著療效。甚至一些治療糖尿病的化學(xué)藥物會(huì)一定程度改變代謝途徑導(dǎo)致肝毒性或肝損傷，并不能讓肝損傷等并發(fā)癥得到有效改善，所以說糖尿病的治療往往顧此失彼。同時(shí)新型藥物的研發(fā)大多都有成本高，周期長(zhǎng)的問題，即使能上市，其價(jià)格也很昂貴。
齊墩果酸(oa)是一種三萜類小分子，它廣泛地分布于幾乎整個(gè)植物界。oa和它的衍生物具有眾多潛在的藥理學(xué)活性，如保肝效應(yīng)和抗炎、抗氧化、抗癌活性。而且oa已經(jīng)成為當(dāng)下有效治療肝損傷等疾病的上市非處方類保肝藥物，價(jià)格便宜，可謂物美價(jià)廉。但是當(dāng)前還沒有關(guān)于oa可以用于調(diào)控胰島素或胰高血糖素樣肽并且治療糖尿病的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明利用合成生物學(xué)設(shè)計(jì)理念，公開了一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(例如，以齊墩果酸和強(qiáng)力霉素(doxycycline)共同調(diào)控)，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)治療一種或多種疾病(例如，糖尿病和/或肝臟疾病)的目的。
本發(fā)明提出了一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控方法，所述方法由基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控，所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)包括信號(hào)感受裝置、信號(hào)處理裝置、信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置；當(dāng)所述信號(hào)感受裝置感知外界信號(hào)，所述信號(hào)感受裝置被激活，通過所述信號(hào)處理裝置將所述外界信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)，并激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，磷酸化所述信號(hào)處理裝置中的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置中的啟動(dòng)子表達(dá)目的基因。
所述方法進(jìn)一步包括：利用啟動(dòng)裝置提供用于被所述信號(hào)感受裝置識(shí)別的外界信號(hào)。
所述方法進(jìn)一步包括：利用關(guān)閉裝置解除所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置中的重組轉(zhuǎn)錄因子與其特異識(shí)別的操縱子之間的結(jié)合，從而終止目的基因的表達(dá)。
其中，所述啟動(dòng)裝置含有能識(shí)別所述信號(hào)感受裝置的小分子化合物。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)裝置含有的小分子化合物包括齊墩果酸、熊果酸、或膽汁酸衍生物。
其中，所述信號(hào)感受裝置含有能識(shí)別所述啟動(dòng)裝置的小分子化合物的受體，所述受體能使細(xì)胞感知外界信號(hào)，并激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。優(yōu)選地，所述信號(hào)感受裝置含有的受體包括齊墩果酸受體、熊果酸受體、或膽汁酸受體gpbar1。
其中，所述信號(hào)處理裝置含有轉(zhuǎn)錄激活因子。優(yōu)選地，所述信號(hào)處理裝置的含有的轉(zhuǎn)錄激活因子包括tetr、pmer、vanr、cabr或ttgr。
其中，所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置含有單一報(bào)告或含有兩種報(bào)告，所述單一報(bào)告是用于檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)或蛋白表達(dá)，所述兩種報(bào)告是用于同時(shí)檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置用于檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)seap、egfp、胰島素、glp-1其中任意一種表達(dá)，或用于同時(shí)檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，包括seap-2a-insulin、seap-2a-glp-1、egfp-2a-glp-1。
其中，所述關(guān)閉裝置含有能解除信號(hào)處理裝置含有的轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動(dòng)子之間結(jié)合的小分子化合物。
其中，優(yōu)選地，所述關(guān)閉裝置含有的能解除信號(hào)處理裝置含有的轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動(dòng)子之間的結(jié)合的小分子化合物，包括強(qiáng)力霉素、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、苯甲酸或皮根素。
本發(fā)明首先提出了一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括信號(hào)感受裝置、信號(hào)處理裝置、信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置。
其中，所述信號(hào)感受裝置含有能識(shí)別所述啟動(dòng)裝置的小分子化合物的受體，所述受體能使細(xì)胞感知外界信號(hào)，并激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。所述信號(hào)感受裝置可以是一種膽汁酸受體gpbar1(g蛋白偶聯(lián)受體)，該受體可以是哺乳動(dòng)物來源的，例如人源或鼠源的，該受體可以被齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)或者其它膽汁酸衍生物小分子激活，該受體可激活細(xì)胞內(nèi)下游camp-pka信號(hào)通路。所述外界信號(hào)包括所述信號(hào)感受裝置能感知識(shí)別的外界信號(hào)分子如齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)或其它膽汁酸衍生物等。
優(yōu)選地，所述信號(hào)感受裝置是人源的膽汁酸感受器(gpbar1)。優(yōu)選地，所述膽汁酸受體gpbar1的表達(dá)可以通過不同活性的啟動(dòng)子來表達(dá)，主要包括phcmv、psv40、pteto7、puc57、phcre、phcre-tight、pnf-κb、pnfat、pare。其用于能使細(xì)胞感知外界信號(hào)分子如齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)等。
其中，所述信號(hào)處理裝置能使細(xì)胞將其感知到的所述外界信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)。所述信號(hào)處理裝置可以是一種人工合成的轉(zhuǎn)錄激活因子tetr-creb1，該處理器中的tetr蛋白可被其它多種能與特定dna序列結(jié)合的蛋白所替代，例如pmer、vanr、cabr、ttgr等。而creb1蛋白則不變，可以是人源或其它哺乳動(dòng)物來源的creb1全長(zhǎng)或核心序列。tetr與creb1之間可以由連接肽融合，連接肽長(zhǎng)度從0-30個(gè)氨基酸不等。同時(shí)tetr與creb1之間前后位置可以互換，即tetr可以連接到creb1的c端，也可以連接到n端，并且都有活性。所述信號(hào)處理裝置可在細(xì)胞中合成tetr-creb1重組轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其用于能使細(xì)胞將外界刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)，及激活細(xì)胞內(nèi)camp信號(hào)通路。
所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置含有單一報(bào)告或含有兩種報(bào)告，所述單一報(bào)告是用于檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)或蛋白表達(dá)；所述兩種報(bào)告是用于同時(shí)檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。
其中，所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置能使細(xì)胞在所述信號(hào)感受裝置和所述信號(hào)處理裝置的協(xié)同下，將外界信號(hào)以報(bào)告基因表達(dá)的方式體現(xiàn)出來。所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置可以是一種人工合成的啟動(dòng)子與報(bào)告基因系統(tǒng)(phcmvmin*-reporter)、(phcmvmin*＝teto7-phcmvmin)等，能使細(xì)胞在感受和處理裝置的協(xié)同下，將外界信號(hào)以報(bào)告基因表達(dá)的方式體現(xiàn)出來(例如：seap、egfp等)，也可用于表達(dá)藥物蛋白胰島素、glp-1、脂聯(lián)素等用于疾病治療。報(bào)告基因可以是seap、gfp以及具有疾病治療效果的功能蛋白glp-1、胰島素、脂聯(lián)素等。
本發(fā)明還提出一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括啟動(dòng)裝置。所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)包括啟動(dòng)裝置、所述信號(hào)感受裝置、所述信號(hào)處理裝置、所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置。其中，所述啟動(dòng)裝置提供或含有外界信號(hào)，能識(shí)別所述信號(hào)感受裝置。
其中，所述啟動(dòng)裝置含有外界信號(hào)即能識(shí)別所述信號(hào)感受裝置的小分子化合物。優(yōu)選地，所述外界信號(hào)即能識(shí)別所述信號(hào)感受裝置的小分子化合物包括齊墩果酸(oa)或熊果酸(ua)或者其它膽汁酸衍生物小分子。所述信號(hào)感受裝置能被小分子化合物包括齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)或者其它膽汁酸衍生物小分子激活。
本發(fā)明還提出一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括關(guān)閉裝置。所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)包括所述啟動(dòng)裝置、所述信號(hào)感受裝置、所述信號(hào)處理裝置、所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置、所述關(guān)閉裝置。其中，所述關(guān)閉裝置用于解除所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置中重組轉(zhuǎn)錄因子與其特異識(shí)別的操縱子之間的結(jié)合，如tetr與啟動(dòng)子之間的結(jié)合。
在一具體實(shí)施方案中，所述能解除tetr與phcmvmin*啟動(dòng)子之間的結(jié)合的小分子化合物是強(qiáng)力霉素(doxcycline)等。在另一具體實(shí)施方案中，所述信號(hào)處理裝置tetr-creb1的tetr蛋白可以被pmer、vanr、cabr、ttgr等替代，相應(yīng)地，關(guān)閉裝置可以被能分別解離pmer、vanr、cabr、ttgr與他們相對(duì)應(yīng)的dna結(jié)合序列的小分子化合物所關(guān)閉，即所述關(guān)閉裝置含有能分別解離pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1與其相對(duì)應(yīng)的dna結(jié)合序列(opmer、ovanr、ocabr、ottgr)的小分子化合物，例如：對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、苯甲酸、皮根素等。
本發(fā)明基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(基因開關(guān))中，所述信號(hào)感受裝置、所述信號(hào)處理裝置、所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置，分別由人工設(shè)計(jì)、合成的三個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)裝載并同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)源信號(hào)通路偶聯(lián)后執(zhí)行生物功能。本發(fā)明所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)如圖1所示，所述系統(tǒng)中涉及的序列詳見附表。
本發(fā)明中，所述啟動(dòng)裝置可以是通過齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)、膽汁酸及其衍生物等打開基因環(huán)路系統(tǒng)進(jìn)行基因調(diào)控表達(dá)。其都有相似的分子結(jié)構(gòu)，可以作為配體從而活化gpbar1，然后激活細(xì)胞下游camp信號(hào)通路。camp信號(hào)通路可進(jìn)一步活化creb1，從而起始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)報(bào)告基因。其中活化的creb1可以有以下幾種形式存在：tetr-creb1、pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1等。本發(fā)明也可以通過齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)、膽汁酸及其衍生物等調(diào)控報(bào)告基因的精確表達(dá)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，oa作用于膽汁酸受體gpbar1(一種g蛋白偶聯(lián)受體)激活下游camp-pka信號(hào)通路，并通過磷酸化合成的轉(zhuǎn)錄激活因子tetr-creb1的creb1活性位點(diǎn)，從而激活其靶標(biāo)啟動(dòng)子phcmvmin*表達(dá)目的基因。
在另一具體實(shí)施方案中，通過oa來精準(zhǔn)調(diào)控降血糖藥物胰島素和glp-1表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)治療一型或二型糖尿病的目的。同時(shí)結(jié)合其自身修復(fù)肝損傷的作用，最終實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療肝病合并糖尿病的目的。
本發(fā)明中，所述信號(hào)感受裝置含有膽汁酸受體gpbar1，可以選自以下：
pxs16(mcs-gpbar1-pa)、pxs20(pnfat-gpbar1-pa)、pxs21(pare-gpbar1-pa)、pxs22(pcre-gpbar1-pa)、pxs23(pcre-tight-gpbar1-pa)、pxs24(phcmv*-1-gpbar1-pa)、pxs26(psv40-gpbar1-pa)、pxs25(phcmv-gpbar1-pa)、pxs43(pnfkb-gpbar1-pa)。
在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)gpbar1，用來識(shí)別特殊小分子(例如，齊墩果酸(oa)、熊果酸(ua)等)的存在與否，并感應(yīng)其劑量大小。所述信號(hào)感受裝置pxs22(pcre-gpbar1-pa)特點(diǎn)之一是相對(duì)低劑量表達(dá)gpbar1，受oa的激活，引起camp信號(hào)通路的活化，并且活化程度在一定范圍內(nèi)與oa的劑量呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)自身可以被自身的信號(hào)通路所激活放大，產(chǎn)生自我放大效果。本發(fā)明中，也可采用pxs25(pcmv-gpbar1-pa)作為信號(hào)感受裝置質(zhì)粒，避免在特殊細(xì)胞中各種信號(hào)通路的交叉干擾。
本發(fā)明中，所述信號(hào)處理裝置含有轉(zhuǎn)錄激活因子，可以選自以下：
pxs13(pcmv-tetr-creb1-pa)、psv40-tetr-creb1-pa、pcmv-pmer-creb1-pa、pcmv-cabr-creb1-pa、pcmv-vanr-creb1-pa、pttgr-tetr-creb1-pa等。
在細(xì)胞中高表達(dá)融合蛋白tetr-creb1，融合蛋白的兩部分序列分別是它們?nèi)鞍仔蛄械囊徊糠?，tetr作為反式作用元件用來識(shí)別并結(jié)合在其特定的dna順式作用元件teto7，將后半部分融合蛋白creb1拉近到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，當(dāng)感受裝置被oa激活之后，引起的camp信號(hào)通路活化creb1，從而起始轉(zhuǎn)錄。此外，tetr在doxcycline存在時(shí)，可與其順式作用元件脫離，并攜帶creb1遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這樣即使creb1被磷酸化激活，也不能起始轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(基因開關(guān))的關(guān)閉。
本發(fā)明中，當(dāng)改變信號(hào)處理裝置中的tetr蛋白時(shí)，報(bào)告系統(tǒng)中的啟動(dòng)子phcmvmin*則需相應(yīng)改變。啟動(dòng)子中tetr的dna結(jié)合區(qū)域則需相應(yīng)替換成pmer、vanr、cabr、ttgr等蛋白的dna結(jié)合序列，而其下游的最小啟動(dòng)子序列hcmvmin部分可不做改動(dòng)。tetr蛋白可被其它多種能與特定dna序列結(jié)合的蛋白所替代，例如pmer、vanr、cabr、ttgr等。而creb1蛋白則不變，可以是人源或嚙齒動(dòng)物來源的creb1全長(zhǎng)或核心序列。
本發(fā)明中，所述信號(hào)處理裝置(如，tetr-hcreb1)中，tetr-hcreb1分別是它們?nèi)鞍仔蛄械囊徊糠秩诤隙?。tetr與hcreb1可通過接頭肽相連。
本發(fā)明中，所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置為含有單一報(bào)告，用于單一的報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)檢測(cè)，包括seap、egfp，或僅表達(dá)單一蛋白藥物用于疾病治療，包括胰島素、glp-1；或所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置為含有兩種報(bào)告，用于同時(shí)檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)和表達(dá)用于疾病治療的蛋白藥物，包括seap-2a-insulin、seap-2a-glp-1、egfp-2a-glp-1等。
即，所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置主要分為兩種，其一含有單一報(bào)告基因，用于單一的報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)檢測(cè)(如：seap、egfp等報(bào)告基因)或僅表達(dá)單一蛋白藥物用于疾病治療(如：胰島素、glp-1等降血糖蛋白)；其二含有兩種報(bào)告基因，用于同時(shí)檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)基因表達(dá)和表達(dá)用于疾病治療的蛋白藥物(如：seap-2a-insulin、seap-2a-glp-1、egfp-2a-glp-1等)；所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置可以選自以下：
pmf111強(qiáng)力霉素相應(yīng)的seap報(bào)告基因表達(dá)載體(phcmv*-1-seap-pa)；
phy79phcmv*-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的egfp報(bào)告基因表達(dá)載體(phcmv*-1-egfp-pa)；
phy73phcmv*-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的glp-1報(bào)告基因表達(dá)載體(phcmv*-1-glp-1-fc-pa)；由于天然的glp-1活性區(qū)域在其n端，并且在體內(nèi)極易降解，半衰期只有2-5分鐘。本發(fā)明中用phy73(phcmv*-1-glp-1-fc-pa)作為信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置，通過在glp-1的c端偶聯(lián)fc片段，既不影響其活性，又明顯提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，同時(shí)還可以通過檢測(cè)fc來定量glp-1。
pxs36(pteto7-seap-2a-insulin-pa)；直接調(diào)控表達(dá)胰島素難度較大，而且不容易定量檢測(cè)。
本發(fā)明還提出了一種含有兩種或多種報(bào)告基因的信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置。本發(fā)明首次提出利用兩種報(bào)告基因見實(shí)施例20-25，通過2a系統(tǒng)使seap與胰島素(insulin)同時(shí)并等量或正相關(guān)量表達(dá)，前者可以在體外實(shí)驗(yàn)中間接定量后者，同時(shí)后者在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用不受前者影響，二者在體內(nèi)共同受齊墩果酸(oa)調(diào)控表達(dá)。本發(fā)明有效解決了胰島素表達(dá)難和定量難的問題。
本發(fā)明中，所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置(如，phcmvmin*-reporter)中，phcmvmin*為tetr蛋白特異結(jié)合的最小啟動(dòng)子。phcmvmin*最小啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)表達(dá)任何蛋白基因，例如堿性磷酸酶seap、綠色熒光蛋白egfp、胰島素、人胰高血糖素樣肽(glp-1)等。將需要表達(dá)的多種功能多肽或蛋白，可以通過2a序列在同一個(gè)表達(dá)載體上同時(shí)表達(dá)，例如seap-2a-insulin、gfp-2a-insulin等，這樣不僅解決了啟動(dòng)子直接表達(dá)insulin表達(dá)量低的問題，同時(shí)也解決了insulin定量檢測(cè)的問題。
本發(fā)明中，所述關(guān)閉裝置可通過加入強(qiáng)力霉素(doxycycline，dox)來實(shí)現(xiàn)基因開關(guān)的關(guān)閉。強(qiáng)力霉素(doxcycline)可強(qiáng)制解離tetr與phcmvmin*啟動(dòng)子之間的相互結(jié)合。因此，可通過添加強(qiáng)力霉素關(guān)閉基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)安全閥的目的。所述強(qiáng)力霉素可以與tetr競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使tetr不能與其特異性dna序列結(jié)合，從而關(guān)閉下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)dox在體內(nèi)半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，而且與tetr的結(jié)合性強(qiáng)，高效而快速。具體實(shí)施方案中，用dox作為關(guān)閉裝置，可以做到更安全，更可靠。另一具體實(shí)施方案中，所述關(guān)閉裝置可以用對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、苯甲酸、皮根素等小分子化合物代替dox，解離pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1與其相對(duì)應(yīng)dna結(jié)合序列，從而來關(guān)閉所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，相對(duì)應(yīng)地，所述信號(hào)信號(hào)處理裝置為pmer-creb1、vanr-creb1、cabr-creb1、ttgr-creb1等。
本發(fā)明還提出一種細(xì)胞，其含有所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。所述細(xì)胞可以是各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括hek-293、hek-293t、hmsc、hana3a等細(xì)胞系。
本發(fā)明中，所述細(xì)胞包括以下實(shí)施例中涉及到的細(xì)胞系有hela，cho-k1，hek-293t，hana3a，hmsc-tert等，分別共轉(zhuǎn)由pxs25、pxs13和報(bào)告(如，pmf111)三質(zhì)粒組成的完整系統(tǒng)，通過合適的比例優(yōu)化，得到具有良好調(diào)控性能的配方，例如，在hek-293t細(xì)胞系中三種質(zhì)粒的質(zhì)量配比是1:20:20。考慮到不同的細(xì)胞系對(duì)不同的啟動(dòng)子有偏好，優(yōu)選地，本發(fā)明具體實(shí)施方案在hek-293t細(xì)胞系中進(jìn)行，其優(yōu)點(diǎn)包括：該細(xì)胞系在本發(fā)明微膠囊中有極好的生存狀態(tài)，例如，其對(duì)比與hmsc-tert細(xì)胞系，極易存活；可以利用其表達(dá)多種有功能的效應(yīng)蛋白或多肽，例如seap、insulin、glp-1等。
本發(fā)明還提出一種包裹細(xì)胞的微膠囊，其含有所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)或含有所述細(xì)胞。所述微膠囊中包裹的細(xì)胞中含有所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。
本發(fā)明中，采用海藻酸-多聚賴氨酸-海藻酸(alginate-polylysine-alginate-membrane)微膠囊包裹系統(tǒng)，采用現(xiàn)有的細(xì)胞包裝方法，對(duì)轉(zhuǎn)載有質(zhì)粒pxs25、pxs13、pmf111的hek-293t、hmsc-tert等細(xì)胞進(jìn)行包裹，然后進(jìn)行體內(nèi)腹腔或皮下移植。本發(fā)明根據(jù)實(shí)際情況對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得出最適合的微膠囊，包括微膠囊的大小、微膠囊膜的厚度、以及微膠囊膜分子篩孔徑大小等等，詳見實(shí)施例15，其中微膠囊的制定參數(shù)包括：噴頭裝配(200μm)，注射速度(20ml/min)，超聲震動(dòng)斷流(1300hz)的和靜電分散(1100v)等。
本發(fā)明微膠囊具有以下特征：所述微膠囊是一種半透膜，該半透膜能讓55kd以下的蛋白分子自由通透，而大于75kd的大蛋白不能自由通透。且，所述微膠囊內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)代謝所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均可透過半透膜自由交換。所述微膠囊保證啟動(dòng)系統(tǒng)的小分子化合物oa、ua等可以順利通過微膠囊半透膜，并激活細(xì)胞。所述微膠囊保證產(chǎn)生的效應(yīng)分子(包括各種可分泌的蛋白seap、insulin、glp-1等)可以分泌到微膠囊外，從而釋放到血液中并產(chǎn)生功能。所述微膠囊保證被包裹的工程化細(xì)胞在體內(nèi)不被宿主的免疫系統(tǒng)所攻擊；所述微膠囊保證整套系統(tǒng)在體內(nèi)穩(wěn)定保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。所述微膠囊系統(tǒng)可以保護(hù)宿主對(duì)含有基因環(huán)路系統(tǒng)細(xì)胞的免疫攻擊，且微膠囊內(nèi)細(xì)胞釋放的基因表達(dá)產(chǎn)物可以自由釋放到體外進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。
本發(fā)明中，所述調(diào)控系統(tǒng)可以被上載到不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(例如hek-293、hmsc、hana3a等)，通過微膠囊包裹技術(shù)，將微膠囊移植到肝病合并糖尿病模型小鼠體內(nèi)，當(dāng)通過注射或口服給予小鼠oa時(shí)，達(dá)到協(xié)同治療肝病和糖尿病的目的。
本發(fā)明首次提出了一種基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控方法，當(dāng)信號(hào)感受裝置感知外界信號(hào)，所述信號(hào)感受裝置被激活，通過所述信號(hào)處理裝置將所述外界信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)，并激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，磷酸化所述信號(hào)處理裝置中的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置中的啟動(dòng)子表達(dá)目的基因。
進(jìn)一步地，本發(fā)明基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控方法包括：利用啟動(dòng)裝置提供用于被所述信號(hào)感受裝置識(shí)別的外界信號(hào)。所述系統(tǒng)中的各裝置(包括啟動(dòng)裝置、信號(hào)感受裝置、信號(hào)處理裝置、信號(hào)效應(yīng)報(bào)告裝置等)協(xié)同有序配合行使功能，實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。
在具體實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)裝置中的外界信號(hào)(例如，齊墩果酸(oa)等)刺激作用于所述信號(hào)感受裝置中的受體(例如，膽汁酸受體gpbar1等)，膽汁酸受體gpbar1)被齊墩果酸(oa)激活，從而激活細(xì)胞內(nèi)下游camp-pka信號(hào)通路，進(jìn)一步磷酸化所述處理器中的轉(zhuǎn)錄激活因子(例如，tetr-creb1)的creb1活性位點(diǎn)，從而激活所述信號(hào)效應(yīng)報(bào)告裝置中的啟動(dòng)子(例如，phcmvmin*)表達(dá)目的基因。
本發(fā)明首次提出在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入本發(fā)明所述整套調(diào)控系統(tǒng)裝置。本發(fā)明利用常用保肝類藥物oa、ua等，同時(shí)將其作為配體識(shí)別并活化膽汁酸受體gpbar1，配體與其結(jié)合之后可激活下游camp-pka信號(hào)通路，且該信號(hào)通路中的成分是細(xì)胞自身所有，不需要額外加入。所述信號(hào)處理裝置中的轉(zhuǎn)錄激活因子tetr-creb1在感知camp-pka信號(hào)后被磷酸化激活，從而激活報(bào)告器中的啟動(dòng)子phcmvmin*，表達(dá)目的基因。
進(jìn)一步地，本發(fā)明基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控方法包括：利用關(guān)閉裝置解除所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置中的重組轉(zhuǎn)錄因子與其特異識(shí)別的操縱子之間的結(jié)合，從而終止目的基因的表達(dá)。本發(fā)明方法中，調(diào)控所述系統(tǒng)中的各裝置(包括啟動(dòng)裝置、信號(hào)感受裝置、信號(hào)處理裝置、信號(hào)效應(yīng)報(bào)告裝置、關(guān)閉裝置等)協(xié)同有序配合行使功能，不僅可以調(diào)控實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)，還可以調(diào)控終止目的基因的表達(dá)。
本發(fā)明方法中，所述信號(hào)感受裝置(膽汁酸受體gpbar1)被所述啟動(dòng)裝置中的齊墩果酸(oa)激活，從而激活下游camp-pka信號(hào)通路，進(jìn)一步磷酸化所述信號(hào)處理裝置中的轉(zhuǎn)錄激活因子tetr-creb1的creb1活性位點(diǎn)，激活報(bào)告器中的啟動(dòng)子phcmvmin*表達(dá)目的基因，實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。進(jìn)一步地，通過所述關(guān)閉裝置解除tetr與phcmvmin*啟動(dòng)子之間的結(jié)合，從而終止所述啟動(dòng)子的表達(dá)。例如，在所述調(diào)控系統(tǒng)中加入強(qiáng)力霉素(dox)，使tetr與phcmvmin*啟動(dòng)子之間的結(jié)合被強(qiáng)制解離，從而終止所述啟動(dòng)子phcmvmin*表達(dá)目的基因。本發(fā)明中，終止信號(hào)是直接作用于轉(zhuǎn)錄因子，即使轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被激活，也不能激活下游基因表達(dá)。例如，強(qiáng)力霉素(doxycycline，dox)可以與tetr競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使tetr不能與其特異性dna序列結(jié)合，從而關(guān)閉下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
本發(fā)明提出的基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)及調(diào)控方法，整個(gè)過程快速高效，例如，dox在體內(nèi)的穩(wěn)定性相對(duì)較高，與tetr的結(jié)合能力高，直接作用于激活區(qū)域，終止作用快速高效。本發(fā)明調(diào)控高效且適宜于廣泛應(yīng)用，例如，oa對(duì)gpbar1的激活效率可以跟其天然最適配體石膽酸相媲美，而oa在自然界的豐度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過石膽酸，更易于人們得到利用。
本發(fā)明中，整個(gè)激活過程具有相對(duì)嚴(yán)格的計(jì)量效應(yīng)，即，報(bào)告基因的表達(dá)嚴(yán)格反映了藥物的添加劑量。例如，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著oa劑量的增加，報(bào)告基因seap的表達(dá)量顯示明顯的正相關(guān)效應(yīng)。
本發(fā)明中，整個(gè)調(diào)控過程可逆轉(zhuǎn)，例如，可以通過控制oa、dox的存在與否，對(duì)所述系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)打開啟動(dòng)和/或關(guān)閉。而且，正常體內(nèi)濃度的膽汁酸不會(huì)激活所述調(diào)控系統(tǒng)中的調(diào)控元件(裝置)，只有施加特定的所述啟動(dòng)裝置之后，所述調(diào)控系統(tǒng)才被激活。因此當(dāng)含有該調(diào)控元件的微膠囊細(xì)胞移植到體內(nèi)后，正常情況下不會(huì)被激活表達(dá)基因。
本發(fā)明中，在野生型小鼠中，將含有本發(fā)明調(diào)控系統(tǒng)的微膠囊細(xì)胞移植到小鼠腹腔后，當(dāng)小鼠給予腹腔注射齊墩果酸和不同劑量dox后，可以實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)不同程度地關(guān)閉報(bào)告基因seap的表達(dá)。如，當(dāng)小鼠給予腹腔注射或口服齊墩果酸后，可實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)調(diào)控報(bào)告基因seap的表達(dá)。如，所述關(guān)閉裝置如同安全閥裝置。當(dāng)目的基因表達(dá)過多或想隨時(shí)停止目的基因的表達(dá)時(shí)，則可以通過在所述系統(tǒng)中加入dox立即停止目的基因表達(dá)，從而使本發(fā)明應(yīng)用更為安全可靠。
本發(fā)明可應(yīng)用于一種或多種疾病的治療。如，在肝病合并糖尿病模型鼠體內(nèi)，含有該調(diào)控元件的微膠囊細(xì)胞移植到小鼠腹腔后，當(dāng)小鼠給予口服齊墩果酸藥片后，小鼠體內(nèi)的微膠囊細(xì)胞被激活表達(dá)glp-1，從而能快速起到降血糖治療糖尿病的效果，而齊墩果酸同時(shí)起到了肝臟保護(hù)功能，最終實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療肝病合并糖尿病的目的。本發(fā)明調(diào)控系統(tǒng)及方法可用于同時(shí)治療不同類型的多種疾病。本發(fā)明通過表達(dá)不同治療功能的目的基因蛋白即可實(shí)現(xiàn)治療不同疾病。
本發(fā)明提出了所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)和/或所述細(xì)胞和/或所述微膠囊和/或所述齊墩果酸(oa)或熊果酸(ua)或其他膽汁酸及其衍生物等分別在制備調(diào)控胰島素表達(dá)、調(diào)控glp-1表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明中，所述調(diào)控系統(tǒng)中的所述信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置(phcmvmin*-reporter)，phcmvmin*為tetr蛋白特異結(jié)合的最小啟動(dòng)子。phcmvmin*最小啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)表達(dá)胰島素、人胰高血糖素樣肽(glp-1)等具有疾病治療價(jià)值的藥物蛋白。將需要表達(dá)的多種功能多肽或蛋白，可以通過2a序列在同一個(gè)表達(dá)載體上同時(shí)表達(dá)，例如seap-2a-insulin、gfp-2a-insulin等，這樣不僅解決了啟動(dòng)子直接表達(dá)insulin表達(dá)量低的問題，同時(shí)也解決了insulin定量檢測(cè)的問題。
本發(fā)明還提出了所述基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)和/或所述細(xì)胞和/或所述微膠囊和/或所述齊墩果酸(oa)或熊果酸(ua)或其他膽汁酸及其衍生物等在同時(shí)治療肝病和糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述調(diào)控系統(tǒng)可以被上載到不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(例如hek-293、hmsc、hana3a等)，通過微膠囊包裹技術(shù)，將微膠囊移植到肝病合并糖尿病模型小鼠體內(nèi)，當(dāng)通過注射或口服給予小鼠oa時(shí)，從而達(dá)到協(xié)同治療肝病和糖尿病的目的。本發(fā)明策略是把小分子肝保護(hù)藥物的功能進(jìn)一步放大：oa自身既能起到治療肝病保護(hù)肝臟的效果，同時(shí)能激發(fā)該基因環(huán)路系統(tǒng)表達(dá)glp-1從而治療糖尿病的目的。本發(fā)明通過利用具有良好肝保護(hù)功能的oa或ua精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)，同時(shí)也可通過加入強(qiáng)力霉素來關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)。本發(fā)明治療方式是協(xié)同治療肝源性糖尿病的新思路、新方法。
本發(fā)明有益效果包括：首次提出并成功設(shè)計(jì)合成了一種oa調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)基因環(huán)路系統(tǒng)。本發(fā)明可以通過oa精準(zhǔn)定量調(diào)控基因表達(dá)；可以通過dox關(guān)閉基因環(huán)路中的基因表達(dá)，而現(xiàn)有基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中均沒有關(guān)閉裝置功能；所使用基因表達(dá)調(diào)控開關(guān)激發(fā)分子oa是一種價(jià)格低廉極易獲得的肝保護(hù)藥，在臨床廣泛使用，而目前現(xiàn)有技術(shù)中的基因開關(guān)激發(fā)分子都是些抗生素或防腐劑等。本發(fā)明首次提出可通過oa來調(diào)控glp-1的表達(dá)，起到同時(shí)降血糖、緩和胰島素抵抗、降血脂以及降低肝臟相關(guān)酶指標(biāo)，達(dá)到協(xié)同治療肝病合并糖尿病的目的。而目前傳統(tǒng)的單一療法只能單一針對(duì)其中癥狀之一進(jìn)行治療，往往會(huì)顧此失彼。本發(fā)明為多因素疾病治療提供了新思路和新策略。
進(jìn)一步地，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在治療肝病及糖尿病時(shí)存在顧此失彼的不足，本發(fā)明綜合考究糖尿病的特點(diǎn)和當(dāng)前的治療方案，結(jié)合合成生物學(xué)中基因開關(guān)的設(shè)計(jì)思路，將糖尿病治療和肝損傷治療進(jìn)行有機(jī)對(duì)接，進(jìn)行協(xié)同治療，基于藥物和細(xì)胞治療的聯(lián)合療法來實(shí)現(xiàn)同時(shí)治療多因素的復(fù)雜疾病。本發(fā)明通過非處方類保肝藥物齊墩果酸(oa)來調(diào)控以精準(zhǔn)表達(dá)治療糖尿病藥物胰高血糖素樣肽(glp-1)或胰島素。利用oa等小分子對(duì)我們所設(shè)計(jì)的基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)降血糖蛋白藥物和其自身保肝護(hù)肝的多種生理學(xué)活性，首次實(shí)現(xiàn)同時(shí)治療糖尿病兼并肝損傷，從而達(dá)到一藥治多病的治療目的。且，本發(fā)明利用細(xì)胞微膠囊包裹技術(shù)，可以把含有該基因電路控制系統(tǒng)的工程化細(xì)胞移植到肝病合并糖尿病小鼠體內(nèi)，當(dāng)小鼠口服oa后，可以激活基因開關(guān)表達(dá)glp-1或胰島素，從而達(dá)到治療脂肪肝、急性肝損傷和糖尿病等諸多疾病的功效。本發(fā)明使用的激發(fā)分子oa為公認(rèn)的肝保健藥，通過合成生物學(xué)的方法，oa的生物學(xué)功能被進(jìn)一步放大從而去調(diào)控降血糖蛋白藥物的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)一藥治多病的協(xié)同治療功效。該發(fā)明為肝病合并糖尿病的治療提供了新方法和新策略，將有良好的臨床應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1是本發(fā)明基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)及調(diào)控方法的原理示意圖。
圖2是驗(yàn)證oa激活gpbar1受體，從而激活camp信號(hào)通路。
圖3是驗(yàn)證oa激活gpbar1行使camp信號(hào)通路的唯一性。
圖4是oa特異性激活gpbar1。
圖5是模擬健康野生型小鼠體內(nèi)總膽汁酸的含量及濃度激活gpbar1與oa激活作用對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
圖6是在hek-293細(xì)胞中調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)化研究，利用不同啟動(dòng)子的gpbar1表達(dá)載體，對(duì)基因環(huán)路的優(yōu)化。
圖7是本發(fā)明的基因環(huán)路輸出信號(hào)在不同細(xì)胞系中工作情況。
圖8是本發(fā)明的基因環(huán)路輸出信號(hào)在一定濃度范圍條件下的對(duì)oa劑量依賴性，即oa標(biāo)準(zhǔn)品精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖9是本發(fā)明的基因環(huán)路輸出信號(hào)在對(duì)oa藥片萃取物也有劑量依賴性，即oa藥片萃取物精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖10是oa精準(zhǔn)調(diào)控報(bào)告基因egfp的表達(dá)。
圖11是系統(tǒng)的可逆性檢測(cè)。
圖12是oa的不同刺激時(shí)間對(duì)基因環(huán)路輸出的影響。
圖13是dox關(guān)閉基因環(huán)路輸出的劑量依賴性，即dox精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖14是oa與dox同時(shí)調(diào)控基因環(huán)路輸出。
圖15是本發(fā)明基因環(huán)路工程化細(xì)胞的微膠囊制備。
圖16是oa誘導(dǎo)微膠囊化細(xì)胞精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖17是oa標(biāo)準(zhǔn)品在野生型小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)本發(fā)明基因環(huán)路，精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖18是oa藥片在野生型小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)本發(fā)明基因環(huán)路，精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖19是dox關(guān)閉本發(fā)明基因環(huán)路在野生型小鼠中的精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
圖20是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，顯著降低總膽汁酸(t-bas)水平。
圖21是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，顯著降低ast水平。
圖22是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，顯著降低alt水平。
圖23是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，糖耐受實(shí)驗(yàn)，表明系統(tǒng)可以有效改善高血糖癥狀。
圖24是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，系統(tǒng)可以有效改善過度飲食癥狀。
圖25是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，系統(tǒng)可以有效改善過度飲水癥狀。
圖26是db/db小鼠的肝功能異常鑒定。
圖27是在體外，驗(yàn)證本發(fā)明的基因環(huán)路經(jīng)oa誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)glp-1。
圖28是在野生型小鼠體內(nèi)，驗(yàn)證本發(fā)明的基因環(huán)路經(jīng)oa誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)glp-1。
圖29是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，顯著降低ast水平。
圖30是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，顯著降低alt水平。
圖31是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，顯著降低ast/alt水平，改善肝功能異常。
圖32是在db/db糖尿病兼肝功能異常的小鼠模型體內(nèi)，驗(yàn)證本發(fā)明的基因環(huán)路經(jīng)oa誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)glp-1。
圖33是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，糖耐受實(shí)驗(yàn)。
圖34是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，胰島素耐受實(shí)驗(yàn)。
圖35是oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，胰島素耐受指數(shù)計(jì)算。
圖36是齊墩果酸的異構(gòu)體熊果酸(ua)，同樣也可以激活齊墩果酸基因環(huán)路控制系統(tǒng)，并調(diào)控報(bào)告基因的精確表達(dá)。
具體實(shí)施方式
結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
實(shí)施例1，基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(基因開關(guān))的構(gòu)建
本發(fā)明基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)及調(diào)控方法，如圖1所示。主要質(zhì)粒的構(gòu)建以及來源見表1。具體地，所述系統(tǒng)包括：?jiǎn)?dòng)裝置(齊墩果酸(oa)或熊果酸(ua))、信號(hào)感受裝置(gpbar1)、信號(hào)處理裝置(tetr-hcreb1)、信號(hào)報(bào)告效應(yīng)裝置(phcmvmin*-reporter)、關(guān)閉裝置(dox)。
本發(fā)明基因環(huán)路誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(基因開關(guān))可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)和體外的有效實(shí)施及調(diào)控，具體如下：
(一)體外實(shí)驗(yàn)方案，具體步驟如下：
第一步，種細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞，以每孔3x104-5x104個(gè)細(xì)胞，種在24孔板中，加500μl/well含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第二步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后的12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)粒總量0.3μg/well的情況下，將質(zhì)粒以最優(yōu)質(zhì)量配比與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積50μl/well，室溫靜置15min后滴加到培養(yǎng)板中。
第三步，加藥，轉(zhuǎn)染6h后換液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中事先混合了一定濃度的oa。
第四步，選24h，48h，72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)報(bào)告基因(如seap，insulin，glp-1等)的表達(dá)情況。
第五步，利用數(shù)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
(二)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方案，具體步驟如下：
第一步，模型鼠的建立。例如，糖尿病合并肝損傷模型。
第二步，種細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞，以每孔3x106-5x106個(gè)細(xì)胞，種在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第三步，轉(zhuǎn)染,在種細(xì)胞。12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)粒總量30μg/dish的情況下，將質(zhì)粒以最優(yōu)配比與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積2.5ml/dish，室溫靜置15min后滴加到培養(yǎng)皿中
第四步，收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后換液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，孵育6h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。
第五步，微膠囊制備。
利用微膠囊制備儀inotechencapsulatorresearchunitie-50r(buchilabortechnikag,flawil,switzerland)和海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(alginate-polylysine-alginate-membrane)微膠囊包裹系統(tǒng)，主要參照limf.和suna.m，1980發(fā)表在《科學(xué)》雜志(第210期：頁碼：908-910)上的“microencapsulatedisletsasbioartificialpancreas”。
成功對(duì)轉(zhuǎn)載有基因開關(guān)的工程細(xì)胞進(jìn)行微膠囊化。其中，微膠囊形成的重要參數(shù)如下：裝配200μm噴頭，以20-40ml/min注射速度，加以1000-1300hz的超聲震動(dòng)斷流和900-1100v的靜電分散，可以形成微膠囊400-500units/s，微囊大小250-350μm；200-250cells/capsule。
第六步，小鼠體內(nèi)微膠囊移植
將制備好的微膠囊利用10mmmops((n-嗎啉)-丙烷磺酸)，0.85％nacl，在25℃時(shí)，ph＝7.2緩沖液，或者無血清培養(yǎng)基，或者pbs重懸至每1ml約含5x104個(gè)微囊，然后按照2x106capsules/kg小鼠體重腹腔注射，注意每次注射都要混勻，確保每只小鼠攜帶有的微膠囊數(shù)量是均衡的，從而保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。
第七步，給藥，藥物調(diào)控
給藥方式采用灌胃或者腹腔注射，標(biāo)準(zhǔn)品或者oa藥片研磨粉，標(biāo)準(zhǔn)品事先需要用dmso溶解，再利用生理鹽水重懸制得的均一懸液給小鼠灌胃，劑量為0-100mg/kg/d，每天給藥兩次，對(duì)照組以同樣方式給予相同的溶劑。基因環(huán)路關(guān)閉系統(tǒng)的調(diào)控給藥方式是腹腔注射強(qiáng)力霉素(doxycycline)(20μl,0–20mg/kg/d)。
實(shí)施例2，驗(yàn)證oa激活gpbar1受體，從而激活camp信號(hào)通路
第一步，種細(xì)胞。將收集好的hek-293t細(xì)胞，以每孔5x104個(gè)細(xì)胞，種在24孔板中，
加500μl/well含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第二步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)?？偭?.3μg/well的情況下，將質(zhì)粒pxs25(pcmv-gpbar1-pa)、pxs13(pcmv-tetr-linker-hcreb1-pa)、pmf111(pteto7-seap-pa)以最優(yōu)配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積50μl/well，室溫靜置15min后均勻滴加到培養(yǎng)板中。
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別更換事先已經(jīng)配制的不同濃度梯度的oa(含有10％fbs的dmem)刺激30min后消化裂解細(xì)胞利用campassayelisa試劑盒(r&dsynstems,inc.,minneapolis,mn,usa,cat.no.skge002b,lot.no.316451)，檢測(cè)camp的含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖2。
本實(shí)施例結(jié)果表明oa確實(shí)激活gpbar1受體，并且確實(shí)激活camp信號(hào)通路，同時(shí)表現(xiàn)出良好的oa劑量性效應(yīng)，說明本發(fā)明的環(huán)路設(shè)計(jì)是正確的。
實(shí)施例3，驗(yàn)證oa激活gpbar1行使camp信號(hào)通路的唯一性
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例2中第一，第二步，
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中預(yù)先混合了一定濃度的oa(20μm)以及不同濃度的pka抑制劑h89
第四步，檢測(cè)。48h后檢測(cè)報(bào)告基因seap。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明oa激活gpbar1后，相對(duì)唯一性地激活camp信號(hào)通路的，其他通路相對(duì)絕緣，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的基因環(huán)路特異性高。
實(shí)施例4，oa特異性激活gpbar1
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例2中第一，第二步。同樣的轉(zhuǎn)染方法pegfp-n1(或者pkzy73:psv40-ctaar1-pasv40,phir-wt)，pxs13和pmf111以配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)轉(zhuǎn)染，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入500μl/well含有20μm的oa以及10％fbs的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)報(bào)告基因seap，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明oa激活gpbar1具有嚴(yán)格的選擇特異性，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的基因環(huán)路特異性高。
實(shí)施例5，模擬健康野生型小鼠體內(nèi)總膽汁酸的含量及濃度激活gpbar1與oa激活作用對(duì)比實(shí)驗(yàn)
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例2中第一，第二步，
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中預(yù)先混合了一定濃度的oa(10μm)以及不同濃度的bas(五種主要成分的混合物)，具體劑量參照文獻(xiàn)rebeccaa.haeusler，diabetes62:4184–4191,2013
第四步，檢測(cè)。48h后檢測(cè)報(bào)告基因seap。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明正常健康個(gè)體的血液膽汁酸水平不足以激活gpbar1，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的基因環(huán)路具有嚴(yán)格的可控制性，在正常生理狀況該基因環(huán)路不會(huì)被激活。
實(shí)施例6，在hek-293細(xì)胞中調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)化研究，利用不同啟動(dòng)子的gpbar1表達(dá)載體，對(duì)基因環(huán)路的優(yōu)化
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例4，其中涉及到的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)情況pxs16(puc57::gpbar1)，pxs20(pnfat-gpbar1-pa)，pxs21(pare-gpbar1-pa)，pxs22(phcre-gpbar1-pa)，pxs23(phcrem-gpbar1-pa)，pxs24(pteto7-gpbar1-pa)，pxs25(pcmv-gpbar1-pa)，pxs26(psv40-gpbar1-pa)，pxs43(pnf-κb-gpbar1-pa)和pxs13，pmf111以不同質(zhì)量配比的同時(shí)給予oa(20μm)刺激，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明用不同啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)gpbar1受體，所產(chǎn)生的效果不同，其中在hek-293細(xì)胞中以pxs25(pcmv-gpbar1-pa)最佳，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的基因環(huán)路適用性廣。
實(shí)施例7，本發(fā)明的基因環(huán)路輸出信號(hào)在不同細(xì)胞系中工作情況
本實(shí)施例中涉及到的細(xì)胞系有hela，cho-k1，hek-293t，hana3a，hmsc-tert等，分別共轉(zhuǎn)pxs25、pxs13和pmf111，步驟參照實(shí)施例4。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明不同細(xì)胞系中基因環(huán)路的表達(dá)情況有所差異，在不同的細(xì)胞系中可以選擇特定的基因環(huán)路配置，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的基因環(huán)路選擇性好，細(xì)胞系適用面廣。
實(shí)施例8，本發(fā)明的基因環(huán)路輸出信號(hào)在一定濃度范圍條件下的對(duì)oa劑量依賴性，即oa標(biāo)準(zhǔn)品精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明oa激活gpbar1具有嚴(yán)格的劑量依賴性，說明本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因環(huán)路的精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
實(shí)施例9，本發(fā)明的基因環(huán)路輸出信號(hào)在對(duì)oa藥片萃取物也有劑量依賴性，即oa藥片萃取物精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例4，藥片經(jīng)過乙醇萃取，根據(jù)oa在乙醇中室溫下的飽和溶解度，配置不同濃度的藥物培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明oa激活gpbar1具有嚴(yán)格的劑量效應(yīng)，說明本發(fā)明可以通過簡(jiǎn)單易得的oa藥片來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因環(huán)路的精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
實(shí)施例10，oa精準(zhǔn)調(diào)控報(bào)告基因egfp的表達(dá)
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例4，其中將報(bào)告基因換成egfp，可直觀顯示報(bào)告基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明利用egfp報(bào)告可以直觀顯示報(bào)告基因表達(dá)情況，說明本發(fā)明可控制性好。
實(shí)施例11，系統(tǒng)的可逆性檢測(cè)
第一步，種細(xì)胞。將收集好的hek-293t細(xì)胞，以每孔2x105個(gè)細(xì)胞，種在6孔板中，加2ml/well含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第二步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后12h到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)?？偭?.5μg/well的情況下，將質(zhì)粒pxs25、pxs13、pmf111以最優(yōu)配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積200μl/well，室溫靜置15min后滴加到培養(yǎng)板中。
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，其中“on-off-on組”加入2ml/well含有20μm的oa以及10％fbs的dmem培養(yǎng)基，6h后更換培養(yǎng)基(不含oa)，及去除oa，分別在12h，24h檢測(cè)seap；24h處更換培養(yǎng)基(不含oa)繼續(xù)培養(yǎng)分別在36h，48h檢測(cè)seap；48h處更換培養(yǎng)基(不含oa)繼續(xù)培養(yǎng)分別在60h，72h檢測(cè)seap。
“off-on-off組”加入2ml/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，6h后更換培養(yǎng)基(不含oa)，及去除oa，分別在12h，24h檢測(cè)seap；24h處更換培養(yǎng)基(含oa20μm)繼續(xù)培養(yǎng)分別在36h，48h檢測(cè)seap；48h處更換培養(yǎng)基(不含oa)繼續(xù)培養(yǎng)分別在60h，72h檢測(cè)seap
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明可以通過控制oa的存在與否，來實(shí)現(xiàn)基因環(huán)路從開到關(guān)再到開，以及從關(guān)到開再到關(guān)等復(fù)雜調(diào)控過程，說明本發(fā)明的基因環(huán)路可逆性極好。
實(shí)施例12，oa的不同刺激時(shí)間對(duì)基因環(huán)路輸出的影響
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例4，通過控制oa在體系中的時(shí)間，從而控制刺激時(shí)間，反映出oa在不同刺激時(shí)間下基因環(huán)路的工作情況，體現(xiàn)出系統(tǒng)對(duì)oa誘導(dǎo)刺激時(shí)間的正相關(guān)依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖12。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明的可控制性良好。
實(shí)施例13，dox關(guān)閉基因環(huán)路輸出的劑量依賴性，即dox精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例8中第一，第二步。
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入500μl/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中預(yù)先混合了一定濃度的oa(20μm)以及不同濃度的dox。
第四步，檢測(cè)。分別在加藥后24h，48h，72h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)報(bào)告基因seap。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖13。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明dox對(duì)系統(tǒng)的控制具有嚴(yán)格的劑量依賴性，說明本發(fā)明可以通過dox劑量關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因環(huán)路的精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
實(shí)施例14，oa與dox同時(shí)調(diào)控基因環(huán)路輸出
本實(shí)施例步驟參照實(shí)施例11中第一，第二步。
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入2ml/well含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中預(yù)先混合了一定濃度的oa(20μm)以及5ng/ml濃度的dox
第四步，檢測(cè)。分別在加藥后6h，12h，24h，36h，48h等時(shí)間點(diǎn)撤去dox，同時(shí)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)報(bào)告基因seap。本實(shí)施例表明系統(tǒng)可以在oa與dox的作用下實(shí)現(xiàn)“關(guān)”和“開”的切換。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖14。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明oa與dox的配合使用可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因環(huán)路的精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
實(shí)施例15，本發(fā)明基因環(huán)路工程化細(xì)胞的微膠囊制備
第一步，種細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞，以每孔5x106個(gè)細(xì)胞，種在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第二步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)?？偭?0μg/dish的情況下，將質(zhì)粒pxs25、pxs13、pmf111以最佳優(yōu)化配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積2.5ml/dish，室溫靜置15min后滴加到培養(yǎng)皿中。
第三步，微膠囊化。收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后換液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，再繼續(xù)孵育6h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。微膠囊制備，利用微膠囊制備儀inotechencapsulatorresearchunitie-50r和alginate-polylysine-alginate-membrane微膠囊包裹系統(tǒng)，對(duì)轉(zhuǎn)載有質(zhì)粒pxs25、pxs13、pmf111的hek-293t細(xì)胞進(jìn)行包裝。本實(shí)施例具體的微膠囊形成的重要參數(shù)如下：裝配200μm噴頭，以20ml/min注射速度，加以1300hz的超聲震動(dòng)斷流和1100v的靜電分散，可以形成微膠囊500units/s，微囊大小300-350μm；200-250cells/capsule。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖15。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明所使用的微膠囊包裹技術(shù)參數(shù)，可以滿足本發(fā)明基本要求。說明本發(fā)明中工程化細(xì)胞可以被良好地微膠囊化。
實(shí)施例16，oa誘導(dǎo)微膠囊化細(xì)胞，精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例15操作方法，制得的微膠囊在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加以不同濃度的oa刺激，體現(xiàn)系統(tǒng)在微膠囊中的工作情況良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖16。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明微膠囊化后系統(tǒng)可以保持良好的工作狀態(tài)，說明本發(fā)明已經(jīng)具備初步體內(nèi)應(yīng)用的基本條件。
實(shí)施例17，oa標(biāo)準(zhǔn)品在野生型小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)本發(fā)明基因環(huán)路，精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例15操作方法，將制得的微膠囊移植到野生型小鼠腹腔，腹腔注射給予不同濃度oa標(biāo)準(zhǔn)品溶液，oa劑量在0、1、10、100mg/kg/d，控制劑量每天注射兩次，對(duì)照組生理鹽水。在治療48h后，檢測(cè)seap在小鼠血液中的豐度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖17。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明已經(jīng)可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的精準(zhǔn)調(diào)控。
實(shí)施例18，oa藥片在野生型小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)本發(fā)明基因環(huán)路，精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例15操作方法，將制得的微膠囊移植到野生型小鼠腹腔oa藥片研磨呈粉狀，再利用生理鹽水重懸制得的均一懸液給小鼠灌胃，oa劑量在0、1、10、100mg/kg/d，控制劑量每天灌胃兩次，對(duì)照組生理鹽水。在治療48h后，檢測(cè)seap在小鼠血液中的豐度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖18。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明中，安全簡(jiǎn)單易得的oa藥片可以作為調(diào)控因子，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的精準(zhǔn)調(diào)控。
實(shí)施例19，dox關(guān)閉本發(fā)明基因環(huán)路在野生型小鼠中的精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)
本實(shí)施例根據(jù)實(shí)施例15操作方法，將制得的微膠囊移植到野生型小鼠腹腔，腹腔注射給予oa標(biāo)準(zhǔn)品溶液，oa劑量在100mg/kg/d，同時(shí)給予不同濃度dox，控制劑量每天注射兩次，對(duì)照組生理鹽水。在治療48h后，檢測(cè)seap在小鼠血液中的豐度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖19。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明中dox可以作為調(diào)控因子并關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的精準(zhǔn)調(diào)控。
實(shí)施例20，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，顯著降低總膽汁酸(t-bas)水平
第一步，i型糖尿病小鼠模型的構(gòu)建，我們采用多次低劑量鏈脲霉素(streptozocin，stz，購自sigma公司s0130，18883-66-4)給藥法誘導(dǎo)模型。c57bl/6j小鼠50只(來自中國(guó)科學(xué)院)，8周齡，雄性，按照體重隨機(jī)分成7組，每組5到10只，其中陰性對(duì)照組(5只)、正常對(duì)照組(5只)。連續(xù)5d腹腔注射溶解有stz的檸檬酸鈉緩沖液，小鼠stz給藥劑量在40-50mg/kg，注射前禁食12-16h(理論上禁食時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)胰島細(xì)胞的破壞就越大，但同時(shí)要防止小鼠低血糖死亡)，不禁水。注射時(shí)將stz溶于新鮮的檸檬酸緩沖液中(0.1mol/l，ph4.5)，避光冰上配制，溶解后盡量在30min內(nèi)完成注射。陰性對(duì)照組腹腔注射檸檬酸緩沖液，正常對(duì)照組不作處理。
第二步，在i型糖尿病小鼠成模的基礎(chǔ)上繼續(xù)造肝損傷模型，利用ccl4造模，ccl4導(dǎo)致肝損傷的主要機(jī)制目前認(rèn)為與其自身和自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。
ccl4橄欖油溶液的配置，用微量移液器分別取10μlccl4加入5ml橄欖油，混合均勻，配置體積分?jǐn)?shù)為0.2％的ccl4橄欖油溶液，于通風(fēng)櫥操作，現(xiàn)用現(xiàn)配采用不同濃度的ccl4橄欖油溶液，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行單次腹腔注射(10ml/kg)，正常對(duì)照組給予等體積的橄欖油作為對(duì)照。具體實(shí)施見下表2。
表2
本發(fā)明中利用上述方案造模成功率100％，實(shí)驗(yàn)期間沒有小鼠死亡，小鼠糖尿病血糖指標(biāo)，以及肝損傷相關(guān)的alt、ast和總膽汁酸等生理指標(biāo)較陰性對(duì)照有極顯著差異。
第三步，種細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞，以每孔5x106個(gè)細(xì)胞，種在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第四步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)?？偭?0μg/dish的情況下，將質(zhì)粒pxs25(pcmv-gpbar1-pa)、pxs13(pcmv-tetr-linker-hcreb1-pa)、pxs36(pteto7-seap-2a-proinsulin-pa)以最佳優(yōu)化配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積2.5ml/dish，室溫靜置15min后滴加到培養(yǎng)皿中。
第五步，收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，再繼續(xù)孵育6h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。
第六步，微膠囊化。同實(shí)施例15制備微膠囊，將制備好的微膠囊利用者無血清培養(yǎng)基重懸至每ml約含5x104個(gè)微囊，然后按照2x106capsules/kg小鼠體重腹腔注射，每次注射都要盡量輕柔地混勻重懸，以確保每只小鼠攜帶有的微膠囊的數(shù)量一定。按照實(shí)施例18中的給藥方法，給小鼠灌胃oa劑量在50mg/kg/d。
第七步，在48h時(shí)間點(diǎn)通過眼球內(nèi)眥取血，檢測(cè)小鼠肝損傷指標(biāo)，seap表達(dá)，insulin表達(dá)，以及糖耐受試驗(yàn)。
結(jié)果表明本發(fā)明的基因環(huán)路系統(tǒng)可以很好的通過oa調(diào)控表達(dá)胰島素，治療i型糖尿病，同時(shí)可以有效減緩肝損傷。總膽汁酸(t-bas)(t-baskit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0300)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖20(t-bas)。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善i型糖尿病的應(yīng)用中，oa部分的肝保護(hù)作用顯著有效。
實(shí)施例21，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，顯著降低ast水平。
本實(shí)施例具體步驟同實(shí)施例20，ast檢測(cè)(astkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0020)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖21(ast)。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善i型糖尿病的應(yīng)用中，oa部分的肝保護(hù)作用顯著有效。
實(shí)施例22，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，顯著降低alt水平
本實(shí)施例具體步驟同實(shí)施例20，alt檢測(cè)(altkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0010)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖22(alt)。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善i型糖尿病的應(yīng)用中，oa部分的肝保護(hù)作用顯著有效。
實(shí)施例23，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，糖耐受實(shí)驗(yàn)，表明系統(tǒng)可以有效改善高血糖癥狀
本實(shí)施例具體步驟同實(shí)施例20，糖耐受實(shí)驗(yàn)方法具體如下：
第一步，給小鼠禁食16小時(shí)
第二步，根據(jù)每只小鼠的體重，計(jì)算葡糖劑量1.25g/kg體重，配制葡萄糖水溶液125mg/ml
第三步，測(cè)量每只小鼠的0點(diǎn)血糖，注射葡萄糖溶液，腹腔注注射體積＝bw(g)x10ul,125mg/ml的葡萄糖溶液
第四步，測(cè)量每只小鼠30，60，90，120min的血糖值，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖23(糖耐受試驗(yàn))。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善i型糖尿病的應(yīng)用中，oa誘導(dǎo)基因環(huán)路表達(dá)的功能蛋白胰島素，有顯著的改善i型糖尿病癥狀效果。
實(shí)施例24，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，系統(tǒng)可以有效改善過度飲食癥狀
本實(shí)施例具體步驟同實(shí)施例20，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖24(控制飲食)。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善i型糖尿病的應(yīng)用中，oa誘導(dǎo)基因環(huán)路表達(dá)的功能蛋白胰島素，有顯著的改善i型糖尿病癥狀效果。
實(shí)施例25，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的胰島素表達(dá)治療i型糖尿病兼肝損傷疾病模型的治療，系統(tǒng)可以有效改善過度飲水癥狀
本實(shí)施例具體步驟同實(shí)施例20，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖25(控制飲水)。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善i型糖尿病的應(yīng)用中，oa誘導(dǎo)基因環(huán)路表達(dá)的功能蛋白胰島素，有顯著的改善i型糖尿病癥狀效果。
實(shí)施例26，db/db小鼠的肝功能異常鑒定
本實(shí)施例中，我們對(duì)天然的糖尿病兼并肝功能異常的小鼠模型，db/db小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證鑒定，具體ast和alt檢測(cè)方法及步驟同實(shí)施例21和實(shí)施例22，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見圖26(ast，alt)。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明本發(fā)明所利用的db/db小鼠模型，是兼有肝臟病變和ii型糖尿病的天然模型。
實(shí)施例27，在體外，驗(yàn)證本發(fā)明的基因環(huán)路經(jīng)oa誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)glp-1
第一步，種細(xì)胞。將收集好的hek-293t細(xì)胞，以每孔5x104個(gè)細(xì)胞，種在24孔板中，加500μl/well含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第二步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)粒總量0.3μg/well的情況下，將質(zhì)粒pxs25(pcmv-gpbar1-pa)、pxs13(pcmv-tetr-linker-hcreb1-pa)、phy73(pteto7-glp-1-iggfc-pa)以最優(yōu)配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積50μl/well，室溫靜置15min后均勻滴加到培養(yǎng)板中。
第三步，加藥。轉(zhuǎn)染6h后換液，分別更換事先已經(jīng)配制的不同濃度梯度的oa(含有10％fbs)的dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用glp-1(7-36)activieelisa試劑盒(milliporecorporation,billerica,ma01821usa,cat.no.eglp-35k,lot.no.2639195)，檢測(cè)培養(yǎng)基上清glp-1(activie)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖27。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明在體外，本發(fā)明所利用的功能蛋白分子glp-1可以通過oa精準(zhǔn)調(diào)控表達(dá)。
實(shí)施例28，在野生型小鼠體內(nèi)，驗(yàn)證本發(fā)明的基因環(huán)路經(jīng)oa誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)glp-1
第一步，種細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞，以每皿5x106個(gè)細(xì)胞，種在15cmdish中，加25ml/dish含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。
第二步，轉(zhuǎn)染。在種細(xì)胞后12到24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(確保細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)狀況良好)，在保證質(zhì)?？偭?0μg/dish的情況下，將質(zhì)粒pxs25、pxs13、phy73以最佳優(yōu)化配比(1:20:20)與pei轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒與pei質(zhì)量比1:3)加無血清的dmem混勻，總體積2.5ml/dish，室溫靜置15min后滴加到培養(yǎng)皿中。
第三步，收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后換液，加入20ml/dish含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，再繼續(xù)孵育6h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。
第四步，微膠囊化。同實(shí)施例15制備微膠囊，將制備好的微膠囊利用者無血清培養(yǎng)基重懸至每ml約含5x104個(gè)微囊，然后按照2x106capsules/kg小鼠體重腹腔注射，每次注射都要盡量輕柔地混勻重懸，以確保每只小鼠攜帶有的微膠囊的數(shù)量一定。按照實(shí)施例18中的給藥方法，給小鼠灌胃oa劑量分別在0、10、100mg/kg/d。
第五步，檢測(cè)。在48h時(shí)間點(diǎn)通過眼球內(nèi)眥取血，用glp-1(7-36)activieelisa試劑盒(milliporecorporation,billerica,ma01821usa,cat.no.eglp-35k,lot.no.2639195)，檢測(cè)培養(yǎng)基上清glp-1(activie)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖28。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明在體內(nèi)，本發(fā)明所利用的功能蛋白分子glp-1可以通過oa精準(zhǔn)調(diào)控表達(dá)。
實(shí)施例29，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，顯著降低ast水平
本實(shí)施例中，工程化細(xì)胞的微膠囊制備具體操作，同實(shí)施例28。
然后將微膠囊按照2x106capsules/kg小鼠體重腹腔注射，每次注射都要盡量輕柔地混勻重懸，以確保每只db/db小鼠攜帶有的微膠囊的數(shù)量一定。按照實(shí)施例18中的給藥方法，給小鼠灌胃oa劑量分別在0、100mg/kg/d,。在48h時(shí)間點(diǎn)通過眼球內(nèi)眥取血，用ast試劑盒檢測(cè)(astkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0020)ast含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖29。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，oa與glp-1的聯(lián)合肝保護(hù)作用顯著有效。
實(shí)施例30，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，顯著降低alt水平
本實(shí)施例中具體操作同實(shí)施例29
alt檢測(cè)(altkit；biosino&biotechnologyscienceinc.,beijing,china,cat.no.0010)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖30。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，oa與glp-1的聯(lián)合肝保護(hù)作用顯著有效。
實(shí)施例31，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，顯著降低ast/alt水平，改善肝功能異常
本實(shí)施例綜合實(shí)施例29和實(shí)施例30數(shù)據(jù)，計(jì)算ast/alt的值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖31。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，oa與glp-1的聯(lián)合肝保護(hù)作用顯著有效。
實(shí)施例32，在db/db糖尿病兼肝功能異常的小鼠模型體內(nèi)，驗(yàn)證本發(fā)明的基因環(huán)路經(jīng)oa誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)glp-1
本實(shí)施例中具體操作同實(shí)施例29
在48h時(shí)間點(diǎn)通過眼球內(nèi)眥取血，用glp-1(7-36)activieelisa試劑盒(milliporecorporation,billerica,ma01821usa,cat.no.eglp-35k,lot.no.2639195)，檢測(cè)培養(yǎng)基上清glp-1(activie)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖32。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，所調(diào)控表達(dá)的功能因子glp-1的糖尿病治療作用顯著有效。
實(shí)施例33，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，糖耐受實(shí)驗(yàn)
本實(shí)施例中具體操作同實(shí)施例23。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖33。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，所調(diào)控表達(dá)的功能因子glp-1的糖尿病治療作用顯著有效，即對(duì)ii型糖尿病的高血糖癥狀具有良好的改善控制作用。
實(shí)施例34，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，胰島素耐受實(shí)驗(yàn)
第一步，給小鼠禁食4小時(shí)
第二步，根據(jù)每只小鼠的體重，計(jì)算胰島素劑量1.1u/kg體重，胰島素溶液配制方法，0.1u/ml(將16.6ul濃度為10mg/ml的胰島素溶液加入到40ml的pbs中配制)
第三步，測(cè)量每只小鼠的0點(diǎn)血糖，注射葡萄糖溶液，腹腔注注射體積＝bw(g)x11ul,0.1u/ml胰島素溶液
第四步，測(cè)量每只小鼠30，60，90，120min的血糖值，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖34。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，所調(diào)控表達(dá)的功能因子glp-1的糖尿病治療作用顯著有效，即對(duì)ii型糖尿病的胰島素抵抗癥狀具有良好的改善作用。
實(shí)施例35，oa誘導(dǎo)調(diào)控基因環(huán)路的glp-1表達(dá)治療ii型糖尿病兼肝功能異常疾病模型的治療，胰島素耐受指數(shù)計(jì)算
計(jì)算公式為：空腹血糖水平(fpg，mmol/l)×空腹胰島素水平(fins，miu/l)/22.5。參考turnerrc等人在1985年發(fā)表在metabolism題目為“insulindeficiencyandinsulinresistanceinteractionindiabetes:estimationoftheirrelativecontributionbyfeedbackanalysisfrombasalplasmainsulinandglucoseconcentrations.”的文獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖35。
表明本發(fā)明同時(shí)治療肝損傷和改善ii型糖尿病的應(yīng)用中，所調(diào)控表達(dá)的功能因子glp-1的糖尿病治療作用顯著有效，即對(duì)ii型糖尿病的胰島素抵抗癥狀具有良好的改善作用。
實(shí)施例36，齊墩果酸的異構(gòu)體熊果酸(ua)，同樣也可以激活齊墩果酸基因電路控制系統(tǒng)。因此也可通過ua調(diào)控報(bào)告基因的精確表達(dá)。
本實(shí)施例具體步驟參照實(shí)施例8，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見圖36。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖，表明齊墩果酸的異構(gòu)體熊果酸(ua)，同樣也可以激活齊墩果酸基因電路控制系統(tǒng)，即也可通過ua調(diào)控報(bào)告基因的精確表達(dá)。
注釋：限制性酶切位點(diǎn)由下劃線標(biāo)出，退火組裝所用的黏性末端由小寫字母區(qū)分
英文縮寫：pcr,polymerasechainreaction(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；mcs,multiplecloningsite(多克隆位點(diǎn))；egfp,enhancedgreenfluorescentprotein(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)；pa,polyadenylationsignal(多聚腺嘌呤信號(hào))；phcmv,humancytomegalovirusimmediateearlypromoter(人源巨細(xì)胞病素早期啟動(dòng)子)；pcre,syntheticmammalianpromotercontainingacamp-responseelement(cre-phcmvmin)(合成的響應(yīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞camp信號(hào)的啟動(dòng)子)；pmcre,modifiedpcrevariant(pcre突變優(yōu)化后可減少基因泄露的啟動(dòng)子)；cre,camp-responseelement(camp信號(hào)響應(yīng)的順式作用元件)；mcre,modifiedcamp-responseelement(camp信號(hào)響應(yīng)的順式作用元件突變型)；phcmvmin,minimalversionofphcmv(phcmv啟動(dòng)子的緊縮突變型)；phcmv*-1,tetracycline-responsivepromoter(teto7-phcmvmin)(四環(huán)素響應(yīng)的啟動(dòng)子)；psv40,simianvirus40promoter(猿猴病毒40啟動(dòng)子)；pnfat,nuclearfactorofactivatedtcellsresponsepromoter(t細(xì)胞激活響應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子)；tetr,escherichiacolitn10-derivedtetracycline-dependentrepressorofthetetracyclineresistencegene(大腸桿菌tn10系列衍生的四環(huán)素抗性基因的依賴性響應(yīng)因子)；teto7,tetr-specificheptamericoperatorsequence(tetr特異識(shí)別的7重復(fù)操縱序列)；krab,thekrueppel-associatedbox(克呂佩爾相關(guān)性蛋白結(jié)合域)；creb1,cyclicamp-responsiveelementbindingprotein1(camp應(yīng)答原件結(jié)合蛋白1)；tetr-creb1,tetr-creb1fusionprotein(tetr和creb1融合的重組轉(zhuǎn)錄因子)；seap,humanplacentalsecretedalkalinephosphatase(人類胎盤可分泌性堿性磷酸酶)；ctaar,chimerictrace-amine-associatedreceptor1(嵌合型胺關(guān)聯(lián)性受體1)；glp-1,glucagon-likepeptide1(胰高血糖素樣肽1)；glp-1-r,glucagon-likepeptide1receptor(胰高血糖素樣肽1受體)；gpbar1,humangprotein-coupledbileacidreceptor1(genbank:bc033625)(人源膽汁酸g蛋白偶聯(lián)受體)；are,antioxidantresponseelement(抗氧化反應(yīng)原件)；2a,2aoligopeptidesareautonomouselementscontainingad(v/i)exnpgpmotifatthecterminus(源自口蹄疫病毒的多順反子表達(dá)過程中的功能性多肽，能在其c末端介導(dǎo)多聚蛋白的剪切)；preproinsulin,ahumanproinsulinmoleculewithasignalpeptideattachedtoitsn-terminus(人胰島素前體蛋白原)；pnf-κb,operatorsequencefornuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedbcells(活化b細(xì)胞中的一種調(diào)控因子復(fù)合體，所識(shí)別的操縱子序列)。