本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種用微生物酶法合成芐基異硫氰酸酯的方法。
背景技術(shù)：
：硫苷是一種含硫的陰離子親水性植物次生代謝產(chǎn)物，幾乎存在于所有的十字花科植物中。硫苷晶體的x射線分析證明:所有的硫苷都具有相同的基本結(jié)構(gòu)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通常由一個β-d-硫葡萄糖基、一個硫化肟基團(tuán)以及一個來源于蛋氨酸、色氨酸或苯丙氨酸等8種氨基酸的可變側(cè)鏈構(gòu)成。然而硫苷自身并不具有生物活性，當(dāng)植物受到外界刺激時硫苷-硫苷酶二元系統(tǒng)會被激活，硫苷在硫苷酶的作用下水解并經(jīng)過一系列的分子重排形成異硫氰酸酯。異硫氰酸酯的生物活性主要體現(xiàn)在抑菌、抗蟲害，近年來研究證明蘿卜硫素(sfn)、芐基異硫氰酸酯(bitc)、苯乙基異硫氰酸酯(peitc)等具有很好的抗癌防癌作用。異硫氰酸酯的前體物質(zhì)-硫苷合成途徑比較復(fù)雜，主要分為3部分：前體氨基酸側(cè)鏈延伸；核心結(jié)構(gòu)形成，次級側(cè)鏈的修飾。其中核心結(jié)構(gòu)形成是所有硫苷合成的共有步驟。由于芐基異硫氰酸酯的合成以苯丙氨酸為底物只經(jīng)過核心結(jié)構(gòu)形成這一模塊，途徑相對簡單，可以為其他途徑復(fù)雜的異硫氰酸酯在微生物中的合成奠定基礎(chǔ)。植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯合成途徑具體如下：苯丙氨酸由細(xì)胞色素p450家族蛋白cyp79a2催化生成芐基醛肟；再由該家族另外一個蛋白cyp83b1催化生成腈類氧化物，該產(chǎn)物為強(qiáng)親電子產(chǎn)物立刻和谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)生成s-烷基磺肟酸共軛物；c-s裂解酶(sur1)進(jìn)一步催化反應(yīng)生成芐基硫肟酸、丙酮酸、nh3；葡糖轉(zhuǎn)移酶(ugt74b1)將尿苷二磷酸葡萄糖苷(udpg)上的葡萄糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到硫肟酸上形成芐基脫硫硫苷；脫硫硫苷硫酸化酶(sot16)在3-氧-磷酸腺苷-5-磷硫酸(paps)參與下催化脫硫硫苷生成芐基硫苷。芐基硫苷在硫苷酶(myr)的作用下生成芐基異硫氰酸酯(bitc)。目前有實驗推測在植物體內(nèi)第二步反應(yīng)產(chǎn)物腈類氧化物在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(gstf)的作用和谷胱甘肽反應(yīng)生成谷胱甘肽共軛物，在由γ-谷?；鞍酌?ggp1)作用下生成半胱氨酸-甘氨酸共軛物，該產(chǎn)物在被sur1催化反應(yīng)進(jìn)入后續(xù)步驟。植物次生代謝產(chǎn)物通常產(chǎn)量較低，分離純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)品純度低，且純化過程使用有機(jī)試劑會造成環(huán)境污染；植物生長周期長，成本高等弊端同樣限制了異硫氰酸酯的規(guī)?；a(chǎn)。微生物的生長周期短，成本低等，而且在微生物體內(nèi)搭建單一植物次生代謝途徑可以避免植物本身存在的其他次生代謝途徑的競爭問題，實現(xiàn)單一產(chǎn)物的快速、大量表達(dá)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用微生物酶法合成芐基異硫氰酸酯的方法。本發(fā)明所提供的用微生物酶法合成芐基異硫氰酸酯的方法，為體外合成法，具體可包括如下步驟：將7種反應(yīng)底物和6種蛋白配制成反應(yīng)體系，反應(yīng)后獲得所述芐基異硫氰酸酯；所述7種反應(yīng)底物分別為苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(atp)、還原型輔酶ⅱ(nadph)、尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(paps)和磷酸吡哆醛(plp)；所述6種蛋白分別為ma2r2蛋白、mb1r2蛋白、metc蛋白、ugt74b1蛋白、sot18蛋白和bmyr蛋白；所述ma2r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述mb1r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述metc蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5 所示；所述ugt74b1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述sot18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述bmyr蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。在所述方法中，所述ma2r2蛋白具體可按照包括如下步驟的方法制備獲得：將序列表中序列2所示的ma2r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述ma2r2蛋白。所述mb1r2蛋白具體可按照包括如下步驟的方法制備獲得：將序列表中序列4所示的mb1r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述mb1r2蛋白。所述metc蛋白具體可按照包括如下步驟的方法制備獲得：將序列表中序列6所示的metc基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述metc蛋白。所述ugt74b1蛋白具體可按照包括如下步驟的方法制備獲得：將序列表中序列8所示的ugt74b1基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述ugt74b1蛋白。所述sot18蛋白具體可按照包括如下步驟的方法制備獲得的：將序列表中序列10所示的sot18基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述sot18蛋白。所述bmyr蛋白具體可按照包括如下步驟的方法制備獲得：將序列表中序列12所示的bmyr基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述bmyr蛋白。在所述方法中，具體是按照圖1所示的合成途徑完成所述芐基異硫氰酸酯的體外合成的。所述反應(yīng)的條件為：37℃反應(yīng)0.5-1h(如1h)，加入有機(jī)溶劑(如乙酸乙酯或乙醇)后再60℃反應(yīng)1h。所述反應(yīng)體系中的溶劑為0.1mph7.0pbs。本發(fā)明還保護(hù)一種用于體外制備芐基異硫氰酸酯的成套蛋白質(zhì)或成套基因或產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的用于體外制備芐基異硫氰酸酯的成套蛋白質(zhì)，具體由6種蛋白組成；所述6種蛋白分別為ma2r2蛋白、mb1r2蛋白、metc蛋白、ugt74b1蛋白、sot18蛋白和bmyr蛋白；所述ma2r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述mb1r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述metc蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述ugt74b1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述sot18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述bmyr蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。本發(fā)明所提供的用于體外制備芐基異硫氰酸酯的成套基因，具體由6種基因組成；所述6種基因分別為ma2r2基因、mb1r2基因、metc基因、ugt74b1基因、sot18基因和bmyr基因；所述ma2r2基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述mb1r2基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；所述metc基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示；所述ugt74b1基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；所述sot18基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示；所述bmyr基因的氨基酸序列如序列表中序列12所示。本發(fā)明所提供的用于體外制備芐基異硫氰酸酯的產(chǎn)品，具體可為如下(a)或(b)：(a)含有所述成套蛋白質(zhì)以及7種反應(yīng)底物；所述7種反應(yīng)底物分別為苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(atp)、還原型輔酶ⅱ(nadph)、尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(paps)和磷酸吡哆醛(plp)；(b)含有所述成套基因、大腸桿菌以及7種反應(yīng)底物；所述7種反應(yīng)底物分別為苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(atp)、還原型輔酶ⅱ(nadph)、尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(paps)和磷酸吡哆醛(plp)。所述成套蛋白或所述成套基因或所述產(chǎn)品在體外制備芐基異硫氰酸酯中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明也保護(hù)如下蛋白質(zhì)組或蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)組，具體由ma2r2蛋白和mb1r2蛋白組成；所述ma2r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述mb1r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，具體為ma2r2蛋白或mb1r2蛋白；所述ma2r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述mb1r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。如下任一方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a1)所述成套蛋白的制備方法，包括如下步驟：將序列表中序列2所示的ma2r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述ma2r2蛋白；將序列表中序列4所示的mb1r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述mb1r2蛋白；將序列表中序列6所示的metc基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述metc蛋白；將序列表中序列8所示的ugt74b1基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述ugt74b1蛋白；將序列表中序列10所示的sot18基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述sot18蛋白；將序列表中序列12所示的bmyr基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述bmyr蛋白；(a2)所述蛋白質(zhì)組的制備方法，包括如下步驟：將序列表中序列2所示的ma2r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述ma2r2蛋白；將序列表中序列4所示的mb1r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述mb1r2蛋白；(a3)所述蛋白質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：將序列表中序列2所示的ma2r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述ma2r2蛋白；或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的mb1r2基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得所述mb1r2蛋白。在本發(fā)明中，將各基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行原核表達(dá)時采用的原核表達(dá)載體均具體為pet-28a(+)載體。本發(fā)明所提供的用微生物酶法合成芐基異硫氰酸酯的方法，是在現(xiàn)有的植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯合成途徑的基礎(chǔ)上，進(jìn)行改造后獲得的。實驗證明，該方法可以體外合成出芐基異硫氰酸酯。本發(fā)明為其他途徑復(fù)雜的異硫氰酸酯在微生物中的合成奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1為植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯合成途徑以及本發(fā)明微生物酶法體外合成芐基異硫氰酸酯的合成途徑示意圖。其中，a為植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯合成途徑示意圖；b為本發(fā)明微生物酶法體外合成芐基異硫氰酸酯的合成途徑示意圖。圖2為ma2r2蛋白和mb1r2蛋白經(jīng)iptg誘導(dǎo)前后的sds-page結(jié)果。其中，1為ma2r2蛋白誘導(dǎo)后；2為ma2r2蛋白誘導(dǎo)前；3為蛋白marker；4為mb1r2蛋白誘導(dǎo)前；5為mb1r2蛋白誘導(dǎo)后。圖3為metc蛋白的純化后sds-page結(jié)果。圖4為ugt74b1蛋白的純化后sds-page結(jié)果。圖5為sot18蛋白的純化后sds-page結(jié)果。圖6為bmyr蛋白的純化后sds-page結(jié)果。圖7為芐基異硫氰酸酯的gc-ms結(jié)果。其中，bitc-std為芐基異硫氰酸酯標(biāo)準(zhǔn)品。圖8為ma2r2蛋白中不同長度連接肽的sds-page結(jié)果。其中，連接肽(g4s)n,n＝0,1,2,3。泳道1,2為n＝0時誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)前樣品；泳道3,4為n＝1時誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)前樣品；泳道5,6為n＝2時誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)前樣品；泳道7,8為n＝3時誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)前樣品。圖9為mb1r2蛋白中連接肽后連接不同的還原酶的sds-page結(jié)果。其中，泳道1為b1r1未誘導(dǎo)；泳道2為b1r1誘導(dǎo)；泳道3為b1r2未誘導(dǎo)；泳道4為b1r2誘導(dǎo)；b1r1表示連接肽后連接的去掉跨膜區(qū)的還原酶為atr1；b1r2表示連接肽后連接的去掉跨膜區(qū)的還原酶為atr2。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、用微生物酶法體外合成芐基異硫氰酸酯的合成途徑的設(shè)計一、植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯合成途徑植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯合成途徑示意圖參見圖1中a所示。大致過程如下：苯丙氨酸由細(xì)胞色素p450家族蛋白cyp79a2催化生成芐基醛肟；再由該家族另外一個蛋白cyp83b1催化生成腈類氧化物，該產(chǎn)物為強(qiáng)親電子產(chǎn)物立刻和谷胱甘肽或者半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)生成s-烷基磺肟酸共軛物；c-s裂解酶(sur1)進(jìn)一步催化反應(yīng)生成芐基硫肟酸、丙酮酸、nh3；葡糖轉(zhuǎn)移酶(ugt74b1)將尿苷二磷酸葡萄糖苷(udpg)上的葡糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到硫肟酸上形成芐基脫硫硫苷；脫硫硫苷硫酸化酶(sot16)在3-氧-磷酸腺苷-5-磷硫酸(paps)參與下催化脫硫硫苷生成芐基硫苷。芐基硫苷在硫苷酶(myr)的作用下生成芐基異硫氰酸酯(bitc)。目前有實驗推測在植物體內(nèi)第二步反應(yīng)產(chǎn)物腈類氧化物在谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(gstf)的作用和谷胱甘肽反應(yīng)生成谷胱甘肽共軛物，在由γ-谷?；鞍酌?ggp1)作用下生成半胱氨酸-甘氨酸共軛物，該產(chǎn)物在被sur1催化反應(yīng)進(jìn)入后續(xù)步驟。二、設(shè)計本發(fā)明微生物酶法體外合成芐基異硫氰酸酯的合成途徑由于植物體內(nèi)芐基異硫氰酸酯代謝途徑比較復(fù)雜，同時涉及兩個推測的功能基因。因此發(fā)明人根據(jù)文獻(xiàn)報道中關(guān)于cyp83b1酶活測定過程中使用半胱氨酸作為底物而非植物體內(nèi)途徑中的底物谷胱甘肽，人工設(shè)計芐基異硫氰酸酯代謝途徑，從而避免表達(dá)上述推測的功能基因，簡化該代謝途徑。圖1中b中的方框內(nèi)部分即為人工設(shè)計的途徑，圖中ma2r2、mb1r2、metc、ugt74b1、sot18和bmyr蛋白都是經(jīng)過改造/篩選的，經(jīng)改造篩選蛋白的獲得過程參見實施例2。實施例2、本發(fā)明微生物酶法體外合成芐基異硫氰酸酯的合成途徑中六種蛋白的改造及表達(dá)純化一、cyp79a2蛋白在大腸桿菌中的改造及表達(dá)載體的構(gòu)建1、cyp79a2蛋白在大腸桿菌中的改造首先，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對cyp79a2基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化以及基因合成。cyp79a2屬于細(xì)胞色素p450家族蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)存在一定的問題，主要體現(xiàn)在一下兩個方面：1)膜信號元件不相容性；2)缺少相應(yīng)的電子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。使用在線分析軟件tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)對cyp79a2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其無跨膜序列。cyp79a2蛋白第40-518個氨基酸為功能結(jié)構(gòu)域(http://pfam.xfam.org/protein/q9flc8)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，發(fā)明人選擇了cyp79a1蛋白中的25-74個氨基酸代替cyp79a2中的前39個氨基酸，并且在n端起始位置加上來自哺乳動物的cyp17α蛋白中n端前8個氨基酸即肽段ε。經(jīng)過改造后可以解決在大腸桿菌中表達(dá)中出現(xiàn)的膜信號不相容的問題。對于問題2)主要解決方案在于表達(dá)其對應(yīng)的還原酶。在擬南芥中存在atr1，atr2兩 種nadph依賴的細(xì)胞色素p450還原酶，文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)分析得出這兩種酶活力基本一致，其區(qū)別在于植物體內(nèi)的atr2需要在外界刺激下表達(dá)。使用在線分析軟件tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)分析atr2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其第73氨基酸以后的序列是膜外序列。因此選擇這段序列，并且通過常用連接肽(g4s)3與修飾后的cyp79a2融合表達(dá)。即最終得到17α(1-8)79a1(25-74)79a2△(1-39)-atr2△(1-72)(其中“-”代表連接肽(g4s)3)，將該組合后的蛋白命名為ma2r2。最終獲得的ma2r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。其中，序列1的第541-555位為連接肽(g4s)3的氨基酸序列。2、ma2r2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)載體的構(gòu)建將序列表中序列2所示的ma2r2基因插入到pet-28a(+)載體的酶切位點sali和xhoi之間，所得重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后命名為pet-28a-ma2r2。所得重組表達(dá)載體pet-28a-ma2r2用于在大腸桿菌中表達(dá)ma2r2蛋白。二、cyp83b1蛋白在大腸桿菌中的改造及表達(dá)載體的構(gòu)建1、cyp83b1蛋白在大腸桿菌中的改造cyp83b1同樣屬于細(xì)胞色素p450系列蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)同樣面臨步驟一1)中所述兩個問題。發(fā)明人根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對cyp83b1基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化以及基因合成。cyp83b1蛋白第30-494個氨基酸為其功能結(jié)構(gòu)域(http://pfam.xfam.org/protein/o65782)。細(xì)胞色素p450系列蛋白在n端一般分為4個部分：1)短的極性端，通常是1-2個帶負(fù)電的氨基酸；2)12-32個疏水性氨基酸；3)少量帶正電的氨基酸序列；4)脯氨酸富集區(qū)。其中脯氨酸富集區(qū)高度保守，對于蛋白正確構(gòu)型具有重要作用，不可以進(jìn)行刪減；文獻(xiàn)證明n端的疏水序列至少需要保留12個氨基酸。因此，發(fā)明人對cyp83b1蛋白的n端氨基酸序列分析后，去掉前6個氨基酸并將7-15個氨基酸替換為cyp17α蛋白中的肽段ε。對于問題2)，發(fā)明人同樣使用atr2蛋白，連接肽選擇(g4s)2，最終得到17α(1-8)83b1△(1-15)-atr2△(1-72)(其中“-”代表連接肽(g4s)2)，該組合命名為mb1r2。最終獲得的mb1r2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。其中，序列3的第502-511位為連接肽(g4s)2的氨基酸序列；第512-1150位為atr2△(1-72)的氨基酸序列。2、mb1r2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)載體的構(gòu)建將序列表中序列4所示的mb1r2基因插入到pet-28a(+)載體的酶切位點sali和xhoi之間，所得重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后命名為pet-28a-mb1r2。所得重組表達(dá)載體pet-28a-mb1r2用于在大腸桿菌中表達(dá)mb1r2蛋白。三、c-s裂解酶的選擇及表達(dá)載體的構(gòu)建1、c-s裂解酶的選擇由于除了芐基異硫氰酸酯合成途徑中cyp79a2底物特異性強(qiáng)之外，其他的蛋白均表現(xiàn)為支鏈官能團(tuán)特異性，因此嘗試選擇其他途徑來源的c-s裂解酶來代替催化該步反應(yīng)。發(fā)明人選擇了大腸桿菌甲硫氨酸合成途徑中可以催化類似反應(yīng)的metc。metc蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。2、metc蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)載體的構(gòu)建將序列表中序列6所示的metc基因插入到pet-28a(+)載體的酶切位點bamhi和xhoi之間，所得重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后命名為pet-28a-metc。所得重組表達(dá)載體pet-28a-metc用于在大腸桿菌中表達(dá)metc蛋白。四、葡糖轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的改造及表達(dá)載體的構(gòu)建1、葡糖轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的改造選擇西蘭花來源的ugt74b1，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化及基因合成。ugt74b1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示，所得其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示。2、ugt74b1蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)載體的構(gòu)建將序列表中序列8所示的ugt74b1基因插入到pet-28a(+)載體的酶切位點ecori和hindiii之間，所得重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后命名為pet-28a-ugt74b1。所得重組表達(dá)載體pet-28a-ugt74b1用于在大腸桿菌中表達(dá)ugt74b1蛋白。五、脫硫硫苷硫酸化酶的選擇及表達(dá)載體的構(gòu)建1、脫硫硫苷硫酸化酶的選擇擬南芥中的sot18可以催化苯丙氨酸來源的硫苷合成。本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)擬南芥不同種屬中sot18酶活活性報道，最終選擇了來自哥倫比亞生態(tài)型的sot18。sot18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。2、sot18蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)載體的構(gòu)建將序列表中序列10所示的sot18基因插入到pet-28a(+)載體的酶切位點ecori和hindiii之間，所得重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后命名為pet-28a-sot18。所得重組表達(dá)載體pet-28a-sot18用于在大腸桿菌中表達(dá)sot18蛋白。六、硫苷酶(黑芥子酶)在大腸桿菌中的改造及表達(dá)載體的構(gòu)建1、硫苷酶(黑芥子酶)在大腸桿菌中的改造根據(jù)文獻(xiàn)報道，以產(chǎn)硫苷植物為食的動物中存在硫苷酶，發(fā)明人選擇了來自甘藍(lán)蚜蟲中的硫苷酶基因，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并合成基因。為與西蘭花來源的硫苷酶區(qū)別，將該蛋白命名為bmyr。最終所得的bmyr蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列12所示。2、硫苷酶(黑芥子酶)在大腸桿菌中的表達(dá)載體的構(gòu)建將序列表中序列12所示的bmyr基因插入到pet-28a(+)載體的酶切位點ncoi和hindiii之間，所得重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證正確后命名為pet-28a-bmyr。所得重組表達(dá)載體pet-28a-bmyr用于在大腸桿菌中表達(dá)bmyr蛋白。七、六種蛋白在大腸桿菌中的原核表達(dá)及純化將步驟一至六所得的6種重組表達(dá)載體分別導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)(天根生化科技有限公司，cb105-02)中，挑陽性克隆單菌落于含40μ/ml卡那霉素10mllb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h后，1％(體積百分含量)接種量接種于含40μ/ml卡那霉素200mllb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600為0.6-0.8，添加誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為0.1mm，除mb1r2蛋白在37℃誘導(dǎo)5h外，其他蛋白均在16℃誘導(dǎo)12h后收集菌體，并用0.1mph7.0pbs將菌體洗1遍去 除菌體表面培養(yǎng)基，保存于-20℃。ma2r2，mb1r2均為膜蛋白，分離純化過程較為復(fù)雜，因此本發(fā)明對這兩個蛋白采用粗酶液進(jìn)行后續(xù)實驗。具體步驟：1)將凍存的菌體用10ml0.1mph7.0pbs重懸起來，并加入200μl20mg/ml溶菌酶，冰上放置30min；2)超聲破碎，10％功率，10min，工作3s，間歇5s，破碎后12000rpm離心10min后取上清溶液0.22μm過膜得到粗酶液，使用100kd超濾管，6000g離心10min，超濾管內(nèi)的即為濃縮后的粗酶液。ma2r2蛋白和mb1r2蛋白經(jīng)iptg誘導(dǎo)前后的菌體經(jīng)上述提取所得粗酶液分別進(jìn)行sds-page，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的ma2r2蛋白粗酶液樣品出現(xiàn)大小約為131.5kd的目的條帶，與預(yù)期大小一致；與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的mb1r2蛋白粗酶液樣品出現(xiàn)大小約為126.6kd的目的條帶，與預(yù)期大小一致?？梢?，步驟一和二改造后的ma2r2和mb1r2成功實現(xiàn)了在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。其他4個蛋白均按照常規(guī)ni-agarosehis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，cw0894a)將重組蛋白進(jìn)行純化。冷凍離心收集菌體12小時以上，用結(jié)合液(氯化鈉：500mm，咪唑：10mm，tris-hcl：20mm)將菌體重懸，用溶菌酶在冰上處理半小時，超聲破碎，10％功率，10min，工作3s，間歇5s，破碎后12000rpm離心10min后取上清溶液0.22μm過膜得到粗酶液。然后將所得粗酶液進(jìn)行純化，步驟如下：1)將填料(his鎳柱)混勻后加入到層析柱(鎳柱)中，用5倍床柱體積的去離子水沖洗裝填好的柱子；2)用2.5個床體積的結(jié)合緩沖液(配方：氯化鈉500mm，咪唑10mm，tris-hcl20mm)平衡柱子；3)將離心得到的上清(即粗酶液)加入到層析柱里，在冰上結(jié)合1.5h；4)用分別含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液(配方：氯化鈉500mm，咪唑80mm或300mm，tris-hcl20mm)進(jìn)行階段洗脫(先用咪唑濃度為80mm的洗脫緩沖液洗脫5min，接著用咪唑濃度為300mm的洗脫緩沖液洗脫3min)，收集各階段洗脫峰，用sds-page檢測融合蛋白的分子量大小和純度；5)用結(jié)合緩沖液和純水分別流洗5個柱床體積，再用20％(體積百分含量)的乙醇流洗3個柱床體積，柱子置于4-8℃環(huán)境中保存。重組蛋白的大小和純度檢測使用sds-page電泳。將得到的蛋白大小與文獻(xiàn)中報道的大小比較，檢測純化蛋白的準(zhǔn)確性。sds-page結(jié)果如圖3-圖6所示。圖中所示目標(biāo)蛋白的大小與文獻(xiàn)報道一致?？梢姡?jīng)上述步驟三至六篩選的metc蛋白、ugt74b1蛋白、sot18蛋白和bmyr蛋白在大腸桿菌中均成功實現(xiàn)了可溶性表達(dá)。實施例3、體外合成芐基異硫氰酸酯一、體外合成芐基異硫氰酸酯的反應(yīng)按照表1加入7種反應(yīng)底物，按照表2加入6種蛋白(反應(yīng)體系中的溶劑為0.1mph7.0pbs)。37℃反應(yīng)1h，加入等體積的乙酸乙酯60℃反應(yīng)1h，芐基異硫氰酸酯溶解到乙酸乙酯中，離心后用移液器吸取乙酸乙酯層作為待檢測樣品。表17種反應(yīng)底物及在反應(yīng)體系中的濃度注：atp——腺嘌呤核苷三磷酸、nadph——還原型輔酶ⅱ、udpg——尿苷二磷酸葡萄糖、paps——3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸、plp——磷酸吡哆醛。表26種蛋白及在反應(yīng)體系中的濃度蛋白濃度(g/l)ma2r21mb1r21metc0.1ugt74b10.1sot180.1bmyr0.1注：表中各蛋白的濃度指的是經(jīng)實施例2純化后的各蛋白在反應(yīng)體系中的濃度，其中ma2r2和mb1r2為粗酶液濃度。二、gc-ms鑒定芐基異硫氰酸酯使用gc-ms對步驟一獲得的乙酸乙酯層樣品進(jìn)行檢測，條件如下：色譜柱hp-5，氣化室溫度300℃，柱升溫程序50℃保持2min，以10℃/min的速率升至190℃，再以20℃/min的速率升至300℃保持5min，接口溫度280℃，ei源70ev，200℃，檢測器電壓350v。將芐基異硫氰酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(acrossorganics公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為402130050)以及步驟一獲得的乙酸乙酯層樣品分別按照如上條件進(jìn)行g(shù)c-ms檢測。gc-ms結(jié)果如圖7所示，在步驟一獲得的乙酸乙酯層樣品中檢測到了產(chǎn)物，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對確定該產(chǎn)物為本實驗的最終目的產(chǎn)物-芐基異硫氰酸酯。對比例1、ma2r2蛋白相關(guān)對照本發(fā)明的發(fā)明人在完成本發(fā)明的過程中，對ma2r2蛋白中的連接肽的長度進(jìn)行了大量的摸索，摸索了當(dāng)連接肽為(g4s)n,n＝0,1,2,3時，蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況。具體操作參照實施例2步驟一及步驟七進(jìn)行。其中，當(dāng)“(g4s)n,n＝0”時，目標(biāo)蛋白的序列為序列表中序列1刪除第541-555位后得到的氨基酸序列；當(dāng)“(g4s)n,n＝1”時，目標(biāo)蛋白的序列為將序列表中序列1的第541-555位替換為“ggggs(此處以大寫單字母表示氨基酸)”后得到的氨基酸序列；當(dāng)“(g4s)n,n＝2”時，目標(biāo)蛋白的序列為將序列表中序列1的第541-555位替換為“ggggsggggs(此處以大寫單字母表示氨基酸)”后得到的氨基酸序列；當(dāng)“(g4s)n,n＝3”時，目標(biāo)蛋白的序列即為將序列表中序列1所示的氨基酸序列。對應(yīng)于每個(g4s)的編碼基因均為ggtggtggtggtagt。結(jié)果顯示：只在當(dāng)“(g4s)n,n＝3”時，才能實現(xiàn)蛋白融合表達(dá)。具體見圖8。對比例2、mb1r2蛋白相關(guān)對照本發(fā)明的發(fā)明人在完成本發(fā)明的過程中，對mb1r2蛋白中連接肽(g4s)2后去掉跨膜序列的還原酶進(jìn)行了摸索，摸索了為去掉跨膜序列的還原酶atr1和atr2時，融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況。具體操作參照實施例2步驟二及步驟七進(jìn)行。其中，當(dāng)連接肽(g4s)2后為去掉跨膜序列的還原酶atr2時，要表達(dá)的目標(biāo)融合蛋白的序列即為序列表中序列3所示的mb1r2蛋白；當(dāng)連接肽(g4s)2后為去掉跨膜序列的還原酶atr1時，要表達(dá)的目標(biāo)融合蛋白的序列為將序列表中序列3的第512-1150位替換為 genbank：aee84919.1的第47-692位后所得的氨基酸序列。相應(yīng)的，對應(yīng)于genbank：aee84919.1的第47-692位的編碼基因為genbank：nm_118585.3的第139-2079位。結(jié)果顯示：在連接肽為(g4s)2時與去掉跨膜序列的還原酶atr2融合表達(dá)成功，而與去掉跨膜序列的還原酶atr1未能實現(xiàn)融合表達(dá)。具體見圖9。對比例3、metc蛋白相關(guān)對照1、在植物體內(nèi)只存在單一c-s裂解酶sur1，并不存在其他同工酶。因此，實驗過程中，發(fā)明人首先選擇了來自西蘭花的sur1，通過大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后基因合成(序列13)。將該基因連接至pet-28a(+)載體的酶切位點bamhi和xhoi之間，得到重組表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)(參見實施例2步驟七)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白為包涵體，改變誘導(dǎo)條件也均未得到可溶性蛋白。2、以擬南芥cdna為模板pcr擴(kuò)增擬南芥來源的sur1(genbank：nm_201760.2)，同樣連接至pet-28a(+)載體的酶切位點ncoi和hindiii之間，得到重組表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)(參見實施例2步驟七)。結(jié)果顯示，同樣未得到可溶性蛋白。3、將真菌中麥角硫因合成途徑中可以催化類似反應(yīng)的egt2基因，通過大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后基因合成(序列16)連接至pet-28a(+)載體的酶切位點ecori和hindiii之間，得到重組表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)(參見實施例2步驟七)。結(jié)果顯示：egt2在大腸桿菌中可得到可溶性蛋白。但經(jīng)酶活測定后發(fā)現(xiàn)egt2的酶活低于本發(fā)明實施例2中選擇的metc的酶活，因此，本發(fā)明選擇大腸桿菌自身同源表達(dá)的蛋白metc。對比例4、sot18蛋白相關(guān)對照擬南芥中的sot16、sot18都可以催化苯丙氨酸來源的硫苷合成。實驗過程中，發(fā)明人首先對擬南芥sot16進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏好性密碼子優(yōu)化及基因合成(序列14)，連接至pet-28a(+)載體的酶切位點bamhi和hindiii之間，得到重組表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)(參見實施例2步驟七)。結(jié)果顯示，沒有獲得可溶性蛋白。對比例5、bmyr蛋白相關(guān)對照在植物體內(nèi)存在多種硫苷酶的同工酶，但所有的硫苷酶都是需要高度糖基化修飾。大腸桿菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較簡單，不能對蛋白質(zhì)進(jìn)行次級修飾，因此在大腸桿菌中有活性表達(dá)植物來源的硫苷酶是不可能的。本發(fā)明的發(fā)明人對西蘭花來源的硫苷酶基因myr進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏愛性密碼子優(yōu)化及基因合成(序列15)，連接至pet-28a(+)載體的酶切位點ncoi和xhoi之間，得到重組表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)(參見實施例2步驟七)。并采用硫苷酶的通用測定方法測定酶活，具體操作如下：采用20mm的磷酸鹽緩沖液(ph4.0)，體系添加5mm的2-丙烯基芥子油苷作為底物，同時添加10nm的純化后的myr蛋白，在37℃反應(yīng)20min，然后95℃加熱7min終止反應(yīng)，依據(jù)水解2-丙烯基芥子油苷后釋放的葡萄糖來測定酶活。結(jié)果顯示：采用硫苷酶的通用測定方法沒有檢測到硫苷酶酶活。當(dāng)前第1頁12