本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種吡咯并[3,2-d]嘧啶類化合物的制備方法及其中間體。
背景技術(shù)：
：toll樣受體表達于多種免疫細胞。toll樣受體識別高度保守結(jié)構(gòu)基序：由微生物病原體表達的病原體相關(guān)的微生物模式(pamp)或由壞死細胞釋放的損傷相關(guān)分子模式(damp)。通過相應(yīng)的病原體相關(guān)的微生物模式(pamp)或損傷相關(guān)分子模式(damp)刺激toll樣受體引發(fā)信號級聯(lián)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子如ap-1，nf-κb和干擾素調(diào)節(jié)因子(脈沖響應(yīng)函數(shù))的激活。這導(dǎo)致多種細胞反應(yīng)，包括生產(chǎn)干擾素，促炎性細胞因子和效應(yīng)細胞因子，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。迄今為止，哺乳動物中有13種toll樣受體已被發(fā)現(xiàn)。toll樣受體1，2，4，5和6主要表達在細胞表面上，toll樣受體3，7，8和9表達在內(nèi)體中。不同的toll樣受體識別不同病原體衍生的配體。對于toll樣受體7(tlr7)，它主要是由漿細胞樣樹突細胞(pdc)表達和配體識別而誘導(dǎo)干擾素α(ifn-α)的分泌。toll樣受體7(tlr7)和toll樣受體8(tlr8)高度同源。因此，tlr7配體在大多數(shù)情況下也是tlr8配體。tlr8刺激主要誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子如腫瘤壞死因子α(tnf-α)和趨化因子。干擾素α是治療慢性乙型肝炎或丙型肝炎的主要藥物之一，而tnf-α是一種促炎細胞因子，過多分泌可能導(dǎo)致嚴重的副作用。所以，對tlr7和tlr8的選擇性對于開發(fā)tlr7激動劑用于治療病毒感染性疾病至關(guān)重要。幾個tlr7激動劑已有報道，如咪喹莫特、瑞喹莫德、gs-9620。但具備更好的選擇性、活性和安全性的新的tlr7激動劑仍然有很大需求。我們發(fā)現(xiàn)了一系列的新穎的吡咯并嘧啶衍生物是tlr7的激動劑。背景研發(fā)資料參照如下的期刊文章：hoffmann,j.a.,nature,2003,426,p33-38；akira,s.,takeda,k.,andkaisho,t.,annual.rev.immunology,2003,21,335-376；ulevitch,r.j.,naturereviews:immunology,2004,4,512-520；coffman,r.l.,nat.med.2007,13,552-559；paula.roethle,j.med.chem.2013,56(18),7324-7333。中國專利申請201410405136.0報道了多個作為tlr7激動劑的吡咯并嘧啶化合物，在此作為參考全部引入本文中。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個方面在于提供式ⅰ化合物的制備方法，所述方法包括式ⅵ化合物通過脫羥基得式ⅰ化合物的步驟，其中，r1和r2獨立地選自c1～c4的烷基，或者，r1、r2與所連n原子一起形成4～8元雜環(huán)烷基，所述雜環(huán)烷基任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自羥基、鹵素、c1～c4的烷基或c1～c4的烷氧基。具體實施方式作為優(yōu)選的實施方式，式ⅰ化合物的制備方法是以式ⅱ化合物為原料，包括如下步驟：(a)式ⅱ化合物和式ⅲ化合物在堿的存在下反應(yīng)得式ⅳ化合物，(b)式ⅳ化合物和式ⅴ化合物在還原劑存在下反應(yīng)得式ⅵ化合物，(c)式ⅵ化合物通過脫羥基得式ⅰ化合物，其中，r1和r2獨立地選自c1～c4的烷基，或者，r1、r2與所連n原子一起形成4～8元雜環(huán)烷基，所述雜環(huán)烷基任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自羥基、鹵素、c1～c4的烷基或c1～c4的烷氧基。作為另一優(yōu)選的實施方式，式ⅰ化合物的制備方法是以式ⅱ化合物為原料，包括如下步驟：(a’)式ⅱ化合物和式?！衔镌趬A的存在下反應(yīng)得式ⅵ化合物，(b’)式ⅵ化合物通過脫羥基得式ⅰ化合物，其中，r1和r2獨立地選自c1～c4的烷基，或者，r1、r2與所連n原子一起形成4～8元雜環(huán)烷基，所述雜環(huán)烷基任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自羥基、鹵素、c1～c4的烷基或c1～c4的烷氧基。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、磷酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫、氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋇、甲醇鈉、乙醇鈉、叔丁醇鈉、叔丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶、n,n-二甲氨基吡啶、哌啶、n-甲基哌啶、嗎琳或n-甲基嗎琳，優(yōu)選碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀，更優(yōu)選碳酸鉀。作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅱ化合物與式?；衔锘蚺c式?！衔锏哪柋葹?.0：1.0～3.0，優(yōu)選1.0：1.0～1.5，更優(yōu)選1.0：1.2～1.5。作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅱ化合物與堿的摩爾比為1.0：1.0～3.0，優(yōu)選1.0：1.0～1.5，更優(yōu)選1.0：1.2。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述還原劑選自bh3、nabh4、nabh3cn或nabh(aco)3，優(yōu)選nabh(aco)3。作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅳ化合物與所述還原劑的摩爾比選自1.0：1.0～3.0，優(yōu)選1.0：1.2～2.0，更優(yōu)選1.0：1.5。作為本發(fā)明的一種實施方式，步驟(b)在酸的存在下進行，所述酸選自鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、甲酸、醋酸、丙酸、檸檬酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸、水楊酸、馬來酸或三氟乙酸，優(yōu)選醋酸。作為本發(fā)明的一種實施方式，步驟(b)中，式ⅳ化合物與酸的摩爾比選自1.0：1.0～3.0，優(yōu)選1.0：1.2～2.0，更優(yōu)選1.0：1.5。作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述的脫羥基是通過式ⅵ化合物在三乙基硅烷和三氟乙酸的作用下完成的。作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅵ化合物與三乙基硅烷的摩爾比選自1：1～10，優(yōu)選1：2～8，更優(yōu)選1：5。作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅵ化合物與三氟乙酸的摩爾比選自1：2～20，優(yōu)選1：5～15，更優(yōu)選1：10～12。作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅴ化合物選自：優(yōu)選作為本發(fā)明的一種實施方式，式ⅰ化合物選自如下編號所示的化合物：本發(fā)明另一方面提供作為中間體的式ⅱ和式ⅵ化合物：其中，r1、r2定義同上所述。在本發(fā)明的部分實施方式中，所述式ⅵ化合物選自：本發(fā)明所述的式ⅱ化合物可以采用如下路線制備：式ⅶ化合物與sem-cl反應(yīng)得式ⅷ化合物；式ⅷ化合物與氨水反應(yīng)得式ⅸ化合物；式ⅸ化合物溶于正丁醇，在金屬鈉的作用下，正丁醇與鈉形成正丁醇鈉后發(fā)生取代反應(yīng)生成式ⅹ化合物；式ⅹ化合物在tfa作用下脫除sem得式ⅱ化合物。本發(fā)明采用下述縮略詞：sem代表2-(三甲硅烷基)乙氧基甲基；dipea代表二異丙基乙基胺；tfa代表三氟乙酸；dmf代表n,n-二甲基甲酰胺；n-buoh代表正丁醇。本發(fā)明所述的制備方法，反應(yīng)條件溫和，避免使用價格昂貴和危險性高的試劑，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)。實施例為了更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例來做進一步的說明，但具體的實施方式并不是對本發(fā)明的內(nèi)容所做的限制。制備實施例1式ⅰ化合物的制備實施例2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)芐基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(編號為1的式ⅰ化合物)的制備1-1.4-((4-氨基-2-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-羥基甲基)苯甲醛(式ⅳ化合物)的制備將對苯二甲醛(790.64mg，5.82mmol)和異丙醇(10ml)投入至三口瓶中，攪拌下加入2-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(1.00g，4.85mmol)，降溫至0℃，之后繼續(xù)攪拌10min，加入純化水(10ml)和碳酸鉀(804.17mg，5.82mmol)，25℃反應(yīng)16hr，lcms監(jiān)控至原料反應(yīng)完全，反應(yīng)完全后，有固體析出。過濾，所得固體用20ml純化水打漿，然后用30ml(乙酸乙酯/正庚烷＝1/20)打漿，過濾，干燥，得到標題化合物黃色固體(1.50g，4.41mmol，收率：90.9％)。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ9.94(s,1h),7.86(d,j＝8.16hz,2h),7.72(d,j＝8.16hz,2h),7.12-7.17(m,1h),6.19(s,1h),4.28(t,j＝6.53hz,2h),1.68-1.77(m,2h),1.44-1.54(m,2h),0.97(t,j＝7.34hz,3h)。1-2.1(4-氨基-2-丁氧基-5h–吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(式ⅵ-1化合物)的制備將實施例1獲得的式ⅳ化合物4-((4-氨基-2-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-羥基甲基)苯甲醛(450.0g，1.32mol)和異丙醇(4.5l)投入至30l反應(yīng)釜中，攪拌5min，之后加入冰醋酸(119.0g，1.98mol)，攪拌降溫至0-10℃，滴加吡咯烷(112.4g，1.58mol)，在滴加中保持溫度低于10℃，滴畢，分批次加入三乙酰氧基硼氫化鈉(nabh(aco)3)(420.0g，1.98mol)，10-20℃反應(yīng)3hr，液相監(jiān)控至原料完全消失，反應(yīng)完全后，加入純化水5l，將溶液溫度降至-10℃左右，加入15％氨水12l，加入過程中溶液溫度低于0℃，攪拌有固體析出，過濾，所得濾餅2l水打漿，然后使用2l×2乙酸乙酯打漿，過濾，40℃減壓烘干12hr，得到標題化合物黃色固體465.0g，1.18mol，收率89.4％，水分0.9％。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.46(d,j＝7.91hz,1h),7.29(d,j＝8.03hz,1h),7.09(s,1h),6.12(s,1h),4.29(t,j＝6.53hz,2h),3.60(s,2h),2.52(br.s.,4h),1.66-1.83(m,6h),1.49(d,j＝7.53hz,2h),0.98(t,j＝7.40hz,3h)?；蛘撸龅氖舰?1化合物按照如下方法制備：1-2.2(4-氨基-2-丁氧基-5h–吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(式ⅵ-1化合物)的制備向2-丁氧基-5h并吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(3.00g，14.55mmol)，4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲醛(4.13g，21.82mmol)，甲醇(30ml)和水(30ml)的混合物在25℃攪拌下加入碳酸鉀(2.41g，17.46mmol)，然后在25℃繼續(xù)攪拌12小時，薄層色譜監(jiān)控至原料反應(yīng)完全，反應(yīng)完全后，有固體析出。加入30ml水，固體通過過濾，干燥，得到標題化合物白色固體(3.50g，8.85mmol，收率：60.82％)。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.46(d,j＝7.91hz,1h),7.29(d,j＝8.03hz,1h),7.09(s,1h),6.12(s,1h),4.29(t,j＝6.53hz,2h),3.60(s,2h),2.52(br.s.,4h),1.66-1.83(m,6h),1.49(d,j＝7.53hz,2h),0.98(t,j＝7.40hz,3h)。1-32-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)芐基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(編號為1的式ⅰ化合物)的制備將式ⅵ-1化合物(4-氨基-2-丁氧基-5h–吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(440.0g，1.11mol)和二氯甲烷(7.0l)投入20l反應(yīng)釜中，攪拌降溫至-15℃以下，滴加三乙基硅烷(880ml，5.55mol)后，繼續(xù)滴加三氟乙酸(880ml)，在滴加中保持溫度低于-10℃，滴加完畢后，0℃反應(yīng)2hr，液相監(jiān)控至原料點消失，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液濃縮至干，加入乙酸乙酯2.2l，攪拌降溫至0℃以下，之后加入飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph＝9-10，此過程中溫度小于10℃，過濾，所得濾餅用2.2l水打漿后過濾，減壓烘干，得到2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)芐基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺白色固體550g(標題化合物的三氟乙酸鹽)。所得白色固體用本領(lǐng)域公知技術(shù)手段，在堿性條件下脫鹽得到標題化合物。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.46(d,j＝7.91hz,1h),7.29(d,j＝8.03hz,1h),7.09(s,1h),6.12(s,1h),4.29(t,j＝6.53hz,2h),3.60(s,2h),2.52(br.s.,4h),1.66-1.83(m,6h),1.49(d,j＝7.53hz,2h),0.98(t,j＝7.40hz,3h)。制備實施例2式ⅱ化合物的制備實施例2-12,4-二氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶2,4-二氯-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶(4.00kg，21.28mol)溶解于dmf(20.00l)；室溫(25℃)下分批加入dipea(2.58kg，20.00mol)，隨后攪拌30min，反應(yīng)液用冰浴降溫至0℃，然后在5小時內(nèi)，以1～2滴/秒的滴速，緩慢滴加sem-cl(4.00kg，24.00mol)，滴完后，反應(yīng)液在0℃下攪拌反應(yīng)4小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)完全，反應(yīng)液用70l水淬滅稀釋后，用乙酸乙酯(15l×3)萃取，合并的有機相依次用1m的鹽酸水溶液(5l×2)和飽和食鹽水(7l×2)洗滌，減壓蒸餾除去溶劑后得標題化合物(6.40kg，20.11mol，產(chǎn)率94.50％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24-8.35(m,1h)，6.70-6.85(m,1h)，5.77(s,2h)，3.45-3.57(m,2h)，0.74-0.86(m,2h)，0.00(s,9h)。2-22-氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺10l高壓釜中，2,4-二氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶(1.60kg,5.03mol)溶于異丙醇(1.60l)，室溫(25℃)下一次性加入氨水(4l)，反應(yīng)混合物在95攝氏度下攪拌7小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)完畢，反應(yīng)液自然冷卻到室溫，經(jīng)布氏漏斗過濾后得到黑褐色固體，該固體依次用乙酸乙酯/正庚烷(1/1,5l×2)中打漿，乙酸乙酯(4l)打漿，得到標題化合物棕色固體(1.25kg,4.18mol，產(chǎn)率83.1％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.61-7.77(m,1h)，6.97-7.19(m,2h)，6.28-6.38(m,1h)，5.54-5.67(m,2h)，3.43-3.53(m,2h)，0.76-0.91(m,2h)，0.07(s,9h)。2-32-丁氧基-5-((2-(三甲基硅)基乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺氮氣保護下，金屬鈉(525.05g，22.84mol)緩慢分批加入到n-buoh(17.0l)中；加入完畢后，體系升溫至60℃，并在該溫度下持續(xù)攪拌，直至金屬鈉全部溶解，隨后，體系冷卻至25℃，將2-氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(1.95kg，6.53mol)分批加入，攪拌混合均勻后，反應(yīng)物在90℃下持續(xù)攪拌8小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)完全，反應(yīng)混合物自然降溫至25℃后，緩慢倒入30l飽和氯化銨水溶液中，隨后用乙酸乙酯(15l×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(20l×2)洗滌，經(jīng)無水na2so4干燥、過濾后，減壓蒸餾除去溶劑后，殘余物在正庚烷(4l)中打漿，過濾分離得到固體，再在乙酸乙酯(5l)中打漿，得到標題化合物黃白色固體(1.53kg，4.55mol，69.7％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.49-7.54(m,1h)，6.54-6.62(m,2h)，6.15-6.20(m,1h)，5.54(s,2h)，4.10-4.22(m,2h)，3.42-3.55(m,2h)，1.58-1.73(m,2h)，1.35-1.47(m,2h)，0.90-0.96(m,3h)，0.83-0.89(m,2h)，0.05(s,9h)。2-42-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺2-丁氧基-5-((2-(三甲基硅)基乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(1.10kg,3.27mol)溶于tfa(5.50l)，反應(yīng)液在25℃下持續(xù)攪拌16小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)完全，減壓蒸餾除去tfa，剩余物溶解在甲醇(1.2l)和冰水(1.2l)中，均勻攪拌下，用濃氨水調(diào)節(jié)體系ph至12，然后攪拌2小時，溶液中不斷有沉淀析出，過濾后，濾餅為白色固體，依次用15％的氨水(1.2l×3)和乙酸乙酯(4l)打漿，得到標題化合物白色固體(550.00g，2.67mol，81.7％)。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.37(d,j＝2.89hz,1h)，6.29(d,j＝3.01hz,1h)，4.27(t,j＝6.53hz,2h)，1.75(d,j＝7.91hz,2h)，1.44-1.61(m,2h)，1.00(t,j＝7.40hz,3h)。藥物活性效果實施例toll樣受體7和toll樣受體8體外受體結(jié)合活性篩選試驗試劑hek-bluehtlr7細胞和hek-bluehtlr8細胞(來源于invivogen公司)dmem培養(yǎng)基熱滅活胎牛血清抗支原體試劑normocintm博來霉素殺稻瘟菌素方案1.96孔化合物板的準備：利用液體工作站pod將化合物從10毫摩爾/升濃度起始，用dmso做3倍梯度稀釋，共稀釋10個點(從第2列到第11列，每個點2個重復(fù))。在第12列加入1微升5毫克/毫升的陽性化合物r848作為陽性對照，在第1列加入1微升dmso作為陰性對照。每孔中含有的dmso體積都是1微升。2.收取細胞培養(yǎng)瓶中的細胞，將細胞密度稀釋成250,000個細胞/毫升。3.加入200微升(50,000個細胞/孔)細胞懸液至準備好的化合物板中。每孔中dmso終濃度為0.5％。4.將含有細胞和化合物的培養(yǎng)板放入co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)條件為37℃，5％co2濃度。5.培養(yǎng)24小時后，從細胞培養(yǎng)板中每孔取出20微升上清液轉(zhuǎn)移到一塊96孔透明檢測板中。然后向檢測板中每孔加入180微升quanti-blue試劑，并置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱孵育1小時。6.1小時后，用酶標儀od650讀板檢測20微升上清液中堿性磷酸酶的含量。7.利用prism軟件分析數(shù)據(jù)，得出各化合物的ec50。實驗結(jié)果如表1所示：表1化合物tlr7ec50化合物tlr7ec50化合物1b化合物9b化合物2c化合物10b化合物3b化合物11b化合物4b化合物12b化合物5b化合物13b化合物6c化合物14b化合物7c化合物15b化合物8b化合物16b注：1nm≤a≤100nm；100nm＜b≤1000nm；1000nm＜c≤50μm。化合物1與對照品toll樣受體7激動劑gs-9620頭對頭測試實驗結(jié)果如表2所示：表2結(jié)論本發(fā)明的化合物1展現(xiàn)出比對照品toll樣受體7激動劑gs-9620更高的與toll樣受體7體外受體結(jié)合活性、比對照品toll樣受體7激動劑gs-9620更低的與toll樣受體8體外受體結(jié)合活性。當前第1頁12