本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒的融合蛋白、含該融合蛋白的納米顆粒、含該納米顆粒的疫苗組合物及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬流行性腹瀉（porcineepidemicdiarrhoea,ped）是由豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,pedv）引起豬腹瀉的一種重要急性、接觸性、病毒性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為特征。該病可發(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率越高，特別地，7日齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3-4天，呈現(xiàn)嚴(yán)重脫水而死亡，死亡率高達(dá)50%，最高的死亡率達(dá)100%。該病最早于上世紀(jì)70年代發(fā)生在英國(guó)和比利時(shí)，1973年先后在我國(guó)上海、遼寧、吉林等地分離到pedv。pedv可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡段的豬均易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，尤以哺乳仔豬嚴(yán)重，病死率達(dá)100%。目前，還沒(méi)有特效藥物可抵抗pedv，由于該病發(fā)病急，流行快，豬群一旦感染，就會(huì)給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
中國(guó)于1980年首次分離到pedv，以后許多地區(qū)相繼報(bào)道有本病發(fā)生，并主要在冬春季節(jié)散發(fā)，造成的危害巨大。自2010年至今，在我國(guó)華南、華北部分省份暴發(fā)了嚴(yán)重的傳染性腹瀉疾病，已超過(guò)100萬(wàn)只的豬死亡（sunrq,cairj,chenyq,etal.outbreakofporcineepidemicdiarrheainsucklingpiglets,china.emerginginfectiousdiseases,2012,18(1):161-162）。該疾病發(fā)病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時(shí)間長(zhǎng)，應(yīng)用各種抗生素防治均無(wú)效，其發(fā)病率與死亡率很高，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)研究表明：該疾病的罪魁禍?zhǔn)妆闶秦i流行性腹瀉病毒變異株（chenjf,liuxz,shid,etal.completegenomesequenceofaporcineepidemicdiarrheavirusvariant.journalofvirology,2012,86:3408）。
目前，對(duì)于該疾病的防控主要采取傳統(tǒng)工藝以制備滅活疫苗免疫接種，但pedv全病毒難以分離、培養(yǎng)。因此，如何解決防控pedv變異株所帶來(lái)的疾病的問(wèn)題是豬流行性腹瀉這一領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，制備了一種融合蛋白，含該融合蛋白的納米顆粒，以及含該納米顆粒的疫苗組合物與應(yīng)用。該疫苗組合物可有效預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉病毒所導(dǎo)致的疾病。
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，所述融合蛋白包括與豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白連接的單體鐵蛋白亞基蛋白；其中，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白包括豬流行性腹瀉病毒s蛋白和/或其片段，還可進(jìn)一步包括s1蛋白、m蛋白、n蛋白和/或其片段；其中，所述單體鐵蛋白亞基蛋白包括細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲(chóng)鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白；其中，所述單體鐵蛋白亞基蛋白為幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白；其中，所述單體鐵蛋白亞基蛋白為優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白；其中，所述優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白核苷酸序列編碼seqidno.2氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及一種包含所述融合蛋白的納米顆粒，其中，所述融合蛋白包含與所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白連接的單體鐵蛋白亞基蛋白，使得所述納米顆粒在其表面上包含24個(gè)豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白單體。
本發(fā)明還涉及一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括所述納米顆粒和/或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體；其中，所述疫苗組合物種所述納米顆粒的含量為0.5-200μg/ml，優(yōu)選為5-100μg/ml。
本發(fā)明還涉及所述疫苗組合物的制備方法，其中，所述制備方法包括：步驟（1）克隆表達(dá)所述融合蛋白，融合蛋白自身裝配成納米顆粒，以及步驟（2）按比例混合所述納米顆粒和載體；其中，所述制備方法中的所述步驟（1）中克隆表達(dá)所述融合蛋白為分別克隆所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白、所述單體鐵蛋白亞基蛋白，再用基因工程手段將兩種蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。
本發(fā)明還涉及所述疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白，其中，所述優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白核苷酸序列編碼seqidno.2氨基酸序列。
本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：
（1）所述納米顆粒制備的疫苗組合物，避免了用豬流行性腹瀉病毒普通株和變異株全病毒制備傳統(tǒng)滅活疫苗過(guò)程中全病毒難以分離、培養(yǎng)的技術(shù)難題，并且優(yōu)于現(xiàn)有亞單位疫苗的免疫效果。
（2）所述疫苗組合物可通過(guò)基因工程手段對(duì)疫苗組合物的組分即所述融合蛋白進(jìn)行大量重組表達(dá)，不僅耗時(shí)短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
術(shù)語(yǔ)“豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白”是指將具有免疫原性的豬流行性腹瀉病毒蛋白或其片段，包括但不限于豬流行性腹瀉病毒s蛋白、s1蛋白、m蛋白、n蛋白，和/或其片段，優(yōu)選為s蛋白和/或其片段。其中s蛋白是豬流行性腹瀉病毒中的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白之一，為纖突蛋白（spike蛋白），位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過(guò)膜融合侵入宿主細(xì)胞和在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，被劃分為2個(gè)功能區(qū)即s1和s2；s1蛋白為豬流行性腹瀉病毒s蛋白的功能區(qū)之一，一般由789個(gè)氨基酸組成；m蛋白為膜蛋白（membrane蛋白），是pedv中含量最多的包膜蛋白，由226個(gè)氨基酸編碼而成，有三方面的生物學(xué)作用：參與病毒粒子的組裝和出芽、刺激機(jī)體產(chǎn)生α-干擾素、其產(chǎn)生的抗體在不提存在時(shí)具有中和病毒的能力；n蛋白為核衣殼蛋白（nucleocapsid蛋白），是pedv在感染細(xì)胞中產(chǎn)生最多的病毒蛋白，結(jié)構(gòu)十分保守。優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒變異株。
術(shù)語(yǔ)“豬流行性腹瀉病毒變異株”又稱高致病性豬流行性腹瀉病毒，包括但不限于其s蛋白具有與seqidno.3基本相同的核苷酸序列的pedv；優(yōu)選地，豬流行性腹瀉病毒變異株其s蛋白具有與seqidno.3基本相同的核苷酸序列的pedv。與seqidno.3基本相同是指pedv的核苷酸序列優(yōu)選包含與seqidno.3有85%-100%相同的序列，優(yōu)選在豬流行性腹瀉病毒變異株并非本文所述pedv的條件下，例如與作為參考病毒分離物的ch/ynkm/2012相比，其s蛋白的核苷酸同源性低于91%，優(yōu)選低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。豬流行性腹瀉病毒變異株核苷酸序列優(yōu)選有超過(guò)80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，與seqidno.3相同，同樣優(yōu)選在豬流行性腹瀉病毒變異株并非本文所述pedv的條件下，例如與作為參考病毒分離物的ch/ynkm/2012相比，其s蛋白的核苷酸同源性低于91%，優(yōu)選低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
術(shù)語(yǔ)“同源性”是指兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?jì)算得到，例如，可以將目標(biāo)氨基酸（或核苷酸）序列與參比氨基酸（或核苷酸）序列進(jìn)行序列比對(duì)，必要時(shí)可以引入空缺，使得兩條比對(duì)的序列間相同的氨基酸（或核苷酸）數(shù)目達(dá)到最優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算兩條氨基酸（或核苷酸）序列之間相同氨基酸（或核苷酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比對(duì)和同源性的計(jì)算可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的軟件實(shí)現(xiàn)，例如，但不限于，blast軟件（在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心ncbi的網(wǎng)址上可獲得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，或者見(jiàn)，例如，altschuls.f.etal，j.mol.biol.，215：403-410(1990)；stephenf.etal，nucleicacidsres.，25：3389-3402(1997)），clustalw2軟件（在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得：http://www.eji.ac.uk/toolsa/clustalw2/，另見(jiàn)，例如，higginsd.g.etal,methodsinenzymology,266:383-402(1996);larkinm.a.etal,bioinformatics(oxford，england),23(21):2947-8(2007)）；和tcoffee軟件等（在瑞典生物信息學(xué)研究所的網(wǎng)站上可以獲得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另見(jiàn)，例如，poiroto.etal，nucleicacidsres.,31(13):3503-6(2003)；notredamec.etal,j.mol.boil.,302(1):205-17(2000)）。使用軟件進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，可以使用軟件提供的默認(rèn)參數(shù)，或者也可以根據(jù)實(shí)際情況對(duì)軟件提供的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“納米顆?！笨梢孕纬砂嗣骟w，所述八面體可以由24個(gè)具有432對(duì)稱的單體鐵蛋白亞基蛋白組成。
術(shù)語(yǔ)“單體鐵蛋白亞基蛋白”為ferritin蛋白（簡(jiǎn)稱ferri蛋白），是鐵蛋白蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)、單一多肽，或者能夠指導(dǎo)單體鐵蛋白亞基自身裝配成蛋白質(zhì)的球狀形式的其任何部分，來(lái)自任何已知鐵蛋白蛋白質(zhì)的單體鐵蛋白亞基蛋白的氨基酸序列可以用于生成本發(fā)明的融合蛋白，只要單體鐵蛋白亞基蛋白能夠自身裝配成在其表面上展示豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白的納米顆粒，或單體鐵蛋白亞基蛋白可以包含容許融合蛋白自身裝配成納米顆粒的域。本發(fā)明中的融合蛋白不需要包含單體鐵蛋白亞基蛋白多肽的全長(zhǎng)序列，可以利用單體鐵蛋白亞基蛋白的部分或區(qū)域，只要該部分包含指導(dǎo)單體鐵蛋白亞基蛋白自身裝配成蛋白質(zhì)球狀形式（如所述八面體）的氨基酸序列。此類(lèi)區(qū)域的一個(gè)例子位于幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白第5-167位氨基酸之間，另一個(gè)例子記載于zhangy.self-assemblyintheferritinnano-cageproteinsuperfamily.int.j.mol.sci.,2011(12):5406-5421。在一個(gè)實(shí)施方案中，單體鐵蛋白亞基蛋白可選自細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲(chóng)鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，單體鐵蛋白亞基蛋白來(lái)自幽門(mén)螺桿菌（helicobacterpylori）鐵蛋白。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白(fusionprotein)”有兩種不同的含義，一種是通過(guò)dna重組技術(shù)得到的兩個(gè)基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物，將兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)連成一個(gè)大分子；另一種可以通過(guò)化學(xué)方法連接，也可通過(guò)基因的融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。并且，融合蛋白能夠自身裝配成納米顆粒。
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，所述融合蛋白包括與豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白連接的單體鐵蛋白亞基蛋白。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白包括豬流行性腹瀉病毒s蛋白和/或其片段。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白還可進(jìn)一步包括豬流行性腹瀉病毒s1蛋白、m蛋白、n蛋白和/或其片段。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單體鐵蛋白亞基蛋白包括細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲(chóng)鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單體鐵蛋白亞基蛋白為幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白；其中，所述單體鐵蛋白亞基蛋白為優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白；其中，所述優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白核苷酸序列編碼seqidno.2氨基酸序列。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單體鐵蛋白亞基蛋白包含容許所述融合蛋白自身裝配成納米顆粒的域。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述融合蛋白能夠自身裝配成納米顆粒。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述融合蛋白中所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白與所述單體鐵蛋白亞基蛋白中間連接有柔性蛋白；其中，所述柔性蛋白為氨基酸序列g(shù)gsgg、ggsggggsgg、ggsggggsggggsgg、ggsg、ggsgggsg、ggsgggsgggsg、sgg、gsg、gg或ngtggsg編碼的蛋白。
本發(fā)明還涉及一種包含所述融合蛋白的納米顆粒，其中，所述融合蛋白包含與所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白連接的至少25個(gè)來(lái)自單體鐵蛋白亞基蛋白的連續(xù)氨基酸，使得所述納米顆粒在其表面上包含24個(gè)豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白單體。
術(shù)語(yǔ)“佐劑”可包括鋁膠佐劑；皂苷（saponin），如quila、qs-21（cambridgebiotechincorporation,cambridgema）、gpi-0100（galenicapharmaceuticalsincorporation，birminghamal）；油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水乳劑；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl）衍生物的共聚物選出的化合物。術(shù)語(yǔ)“乳劑”可尤其基于輕液體石蠟油（europeanpharmacopea類(lèi)型）；因烯烴寡聚產(chǎn)生的類(lèi)異戊二烯油（isoprenoidoil），如角鯊?fù)椋╯qualane）或角鯊烯油（squaleneoil），尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-（辛酸酯/葵酸酯）、甘油三-（辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優(yōu)選非離子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide）的酯（如無(wú)水甘露醇油酸酯）、脂肪族二元醇（glycol）的酯、聚甘油（polyglycerol）的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其pluronic產(chǎn)品，特別是l121。參見(jiàn)hunter等編寫(xiě)的《thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants》（ed.bydesstewart-tull,johnwileyandsons,newyork,1995:51-94）和todd等編寫(xiě)的《vaccine》（1997,15:564-570）。例如，可使用powellm和newmanm編寫(xiě)的《vaccinedesign,thesubunitandadiuvantapproach》（plenumpress,1995）第147頁(yè)描述的spt乳劑及第183頁(yè)描述的mf59乳劑。術(shù)語(yǔ)“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”優(yōu)選為交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是與糖（sugar）的聚鏈烯基醚或聚醇交聯(lián)，這些化合物已知被稱為卡波姆（carbomer，商品名carbopol）（phameuropa,1996,8(2)）。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利us2909462，其描述了這類(lèi)丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯(lián)，所述化合物具有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選不超過(guò)8個(gè)，其中至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和脂烴基（aliphaticradical）取代。優(yōu)選的基團(tuán)是那些含有2-4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團(tuán)（ethylenicallyunsaturatedgroup）。所述不飽和基團(tuán)自身可包含其它取代基，如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出售，（bfgoodrich,ohio,usa）特別合適。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇（allylpentaerythritol）交聯(lián)。這其中可提及卡波普974p、934p和971p，最優(yōu)選使用卡波普971p。術(shù)語(yǔ)“順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物”也可考慮順丁烯二酸酐與乙烯的共聚物ema（monsanto），這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，經(jīng)中和，優(yōu)選中和至生理ph，以便產(chǎn)生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。術(shù)語(yǔ)“佐劑”還包括，但不限于，ribi佐劑系統(tǒng)（ribiincorporation）、blockco-polymer（cytrx,atlantaga）、saf-m（chiron,emeryvilleca）、單磷酰脂質(zhì)a（monophosphoryllipida）、avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其它）、霍亂毒素、ims1314、胞壁酰二肽、gel佐劑等。
本發(fā)明還涉及一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括所述納米顆粒和/或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，其中，所述疫苗組合物種所述納米顆粒的含量為0.5-200μg/ml，優(yōu)選為5-100μg/ml。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述載體包括佐劑；其中，所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl）衍生物的共聚物、ribi佐劑系統(tǒng)、blockco-polymer、saf-m、單磷酰脂質(zhì)a、avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、ims1314、胞壁酰二肽或gel佐劑中的一種或幾種；其中，所述佐劑為鋁膠佐劑。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物中所述佐劑的體積比為5%-30%，優(yōu)選為20%。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所述其他抗原包括豬傳染性胃腸炎病毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬細(xì)小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；優(yōu)選地，所述其他抗原為豬傳染性胃腸炎病毒抗原。
本發(fā)明還涉及所述疫苗組合物的制備方法，其中，所述制備方法包括：步驟（1）克隆表達(dá)所述融合蛋白，融合蛋白自身裝配成納米顆粒，以及步驟（2）按比例混合所述納米顆粒和載體。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述制備方法中的所述步驟（1）中克隆表達(dá)所述融合蛋白為分別克隆所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白、所述單體鐵蛋白亞基蛋白，再用基因工程手段將兩種蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白是豬流行性腹瀉病毒s蛋白和/或其片段，還可進(jìn)一步包括s1蛋白、m蛋白、n蛋白和/或其片段；其中，所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白包括豬流行性腹瀉病毒s蛋白和/或其片段。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單體鐵蛋白亞基蛋白包括細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲(chóng)鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白；其中，所述單體鐵蛋白亞基蛋白為幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白；其中，所述單體鐵蛋白亞基蛋白為優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白；其中，所述優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白核苷酸序列編碼seqidno.2氨基酸序列。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述融合蛋白中所述豬流行性腹瀉病毒抗原性蛋白與所述單體鐵蛋白亞基蛋白中間連接有柔性蛋白；其中，所述柔性蛋白為氨基酸序列g(shù)gsgg、ggsggggsgg、ggsggggsggggsgg、ggsg、ggsgggsg、ggsgggsgggsg、sgg、gsg、gg或ngtggsg編碼的蛋白。
術(shù)語(yǔ)“預(yù)防和/或治療”在涉及豬流行性腹瀉病毒變異株感染時(shí)是指抑制豬流行性腹瀉病毒的復(fù)制、抑制豬流行性腹瀉病毒的傳播或防止豬流行性腹瀉病毒普通株和變異株在其宿主體內(nèi)定居，以及減輕豬流行性腹瀉病毒感染的疾病或病癥的癥狀。若病毒荷載量減少、病癥減輕和/或攝食量和/或生長(zhǎng)增加，那么就可以認(rèn)為所述治療達(dá)到了治療效果。
本發(fā)明還涉及所述疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“豬”是指任何屬于豬科（suidae）成員的動(dòng)物，如豬。
本發(fā)明還涉及優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白，其中，所述優(yōu)化的幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白核苷酸序列編碼seqidno.2氨基酸序列。
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明實(shí)施例中所采用豬流行性腹瀉攻毒毒株為滬毒株或hn1301株（porcineepidemicdiarrheavirus,strainhn1301），其中，滬毒株已在中國(guó)專(zhuān)利cn101117627a中公開(kāi)，農(nóng)業(yè)部公告270號(hào)文件中將該毒株作為豬流行性腹瀉普通株cv777株的效檢用強(qiáng)毒株；hn1301株的保藏號(hào)為cctccno.v201341，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2013年9月16日，參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利cn104513827a，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
本發(fā)明實(shí)施例中所用的磷酸鹽緩沖液為ph7.4pbs溶液，其配方為：1000ml蒸餾水中加入nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、kh2po40.24g，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
本發(fā)明實(shí)施例以體積比為20%的鋁膠佐劑制備豬流行性腹瀉疫苗組合物為例進(jìn)行闡述，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
本實(shí)施例中豬流行性腹瀉發(fā)病的判定標(biāo)準(zhǔn)為：厭食、通常黃色或淺黃色水樣腹瀉，部分仔豬伴有嘔吐、寒顫、脫水等癥狀，在臨床觀察的5-6日之內(nèi)可能有部分仔豬脫水后死亡。發(fā)病程度可能輕重不同，但判定發(fā)病最基本的、也是不可少的條件是腹瀉。
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1融合蛋白及含融合蛋白的納米顆粒的制備
1.1ferritin蛋白的制備
由蘇州金唯智生物科技有限公司直接按照seqidno.1直接合成ferritin蛋白。
1.2pcdna-ferri質(zhì)粒的構(gòu)建
合成ferritin蛋白的上游引物ferrifp：5'acgaattcggtggttc
tggtggtgagtctcaggtc3'、下游引物ferrirp：5'gctctagat
cagctcttcctgctcttggc3'。
用合成ferritin蛋白的上、下游引物將實(shí)施例1.1制備的ferritin蛋白做為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃2min-（變性94℃30s-退火56℃30s-延伸72℃1min）30個(gè)循環(huán)--延伸72℃7min。獲得的pcr產(chǎn)物包含了ferritin蛋白基因并融合了一段ggsgg（基因序列為ggtggttctggtggt）柔性蛋白linker。
與pcdna4.0質(zhì)粒（購(gòu)自invitrogen公司）通過(guò)柔性蛋白ggsgg構(gòu)建成pcdna-ferri質(zhì)粒。將含有柔性蛋白linker的pcr產(chǎn)物與pcdna4.0質(zhì)粒連接，具體步驟如下：用dna膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）將pcr產(chǎn)物回收，使用ecori和xbali酶切；pcdna4.0同時(shí)使用ecori和xbali酶切；用dna膠回收試劑盒回收酶切后片段；在10μl連接體系中加入載體2μl、pcr回收片段7μl和t4連接酶（thermo）1μl和t410×buffer1μl，室溫連接30min；將連接產(chǎn)物加入到1支dh5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上孵育30min，42℃熱激90s，然后冰上孵育5min，加入500μl的lb培養(yǎng)基37℃200rpm1h，離心去掉300μl培養(yǎng)基，剩余的涂lb平板；培養(yǎng)過(guò)夜挑取菌落于氨芐抗性lb培養(yǎng)。用質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒，即可獲得pcdna-ferri質(zhì)粒。
提取出的質(zhì)粒使用ecori和xbali酶切，酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結(jié)果：顯示為兩條條帶，被酶切下的目的dna片段條帶大小約為2500bp，與預(yù)期理論值相符，表明pcdna-ferri質(zhì)粒構(gòu)建正確。
1.3pedvs-ferri融合蛋白及含融合蛋白納米顆粒的制備及鑒定
表1pedv融合蛋白及對(duì)應(yīng)納米顆粒所用pedvs蛋白序列及引物序列
1.3.1融合蛋白sa-ferri及對(duì)應(yīng)納米顆粒的制備及鑒定
（1）融合蛋白sa-ferri表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
按照表1設(shè)計(jì)的上游引物saf、下游引物sar，以及豬流行性腹瀉病毒s蛋白基因序列（詳情seqidno.3）第1-1914位基因序列用pcr方法擴(kuò)增s蛋白片段（命名為sa蛋白）。其中，pcr的反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃2min-（變性94℃30s-退火56℃30s-延伸72℃1min）30個(gè)循環(huán)-延伸72℃7min。
將pcr產(chǎn)物回收，使用kpni與ecori酶切。同時(shí)用kpni與ecori酶切實(shí)施例1.2制備的質(zhì)粒pcdna-ferri，之后回收線性化載體。在10μl連接體系中加入線性化載體2μl、pcr回收片段7μl和t4連接酶（thermo）1μl和10×buffer1μl，室溫連接30min。按照實(shí)施例1.2中的方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞，并提取質(zhì)粒pcdna-sa-ferri。
使用kpni與ecori酶切鑒定，顯示為兩條條帶，被酶切下的目的dna片段條帶大小約為2500bp，與預(yù)期理論值相符，表明質(zhì)粒已正確插入片段。
按照實(shí)施例1.2的方法將質(zhì)粒pcdna-sa-ferri轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞。過(guò)夜長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落，接種至200mllb培養(yǎng)。使用大提質(zhì)粒試劑盒（天根生化科技有限公司）提取，獲得質(zhì)粒pcdna-sa-ferri。
（2）重組納米顆粒sa-nano的制備
用含10%v/v胎牛血清的dmem培養(yǎng)基將293t細(xì)胞以8×105細(xì)胞/cm2的密度平鋪細(xì)胞于60mm組織培養(yǎng)皿上，在5%co2的37℃溫箱中孵育24小時(shí),當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前換入預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與融合蛋白自組裝：準(zhǔn)備兩支1.5ml離心管，一管加入240μlhbs溶液（將8.76gnacl溶解于900ml超純水，加入20ml1m的hepes，調(diào)ph值到7.4，定容至1l，用0.2μm濾膜過(guò)濾后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆茫┖?μgpcdna-sa-ferri混勻；另一管中則將18μl100μm的pei加入162μl的hbs溶液中，終濃度10μm。將兩管1.5ml離心管內(nèi)液體混合，室溫孵育20min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。之后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，在5%co2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，融合蛋白在表達(dá)的過(guò)程中自身組裝成為重組納米顆粒sa-nano。
（3）納米顆粒sa-nano的純化與鑒定
收集293t細(xì)胞培養(yǎng)基上清，8000×g離心1小時(shí)后用0.45μm孔徑濾膜過(guò)濾。上清用超濾濃縮換液，換成凝集素層析的buffera。用cona凝集素親和層析柱（ge）純化293t細(xì)胞培養(yǎng)上清，然后使用陰離子交換層析進(jìn)行純化（ge），并繼續(xù)使用分子篩hiloadsuperdex20016/600gl純化，獲得純度>80%的納米顆粒sa-nano。
納米顆粒sa-nano用碳酸鹽緩沖液稀釋后終濃度1μg/ml，在elisa板每孔加入100μl，4℃包被過(guò)夜后棄掉包被液，用pbst洗3次；接著按100μl/孔加入含10%m/v脫脂奶的pbst溶液進(jìn)行封閉，37℃封閉1小時(shí)；封閉后用pbst洗3次，3min/次；按100μl/孔加入用pbs稀釋并使其終濃度含1:5000v/v的抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體8a3a10（參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利cn104694480a），室溫孵育1小時(shí)。pbst洗3次以去非特異結(jié)合，3min/次；用羊抗鼠二抗體積比1:5000稀釋?zhuān)靠准尤?00μl，室溫孵育40min；pbst洗5次以去非特異結(jié)合，3min/次；用elisa顯色液顯色；加入50μl的2mh2so4以終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定elisa鑒定的結(jié)果，詳情見(jiàn)表2。結(jié)果：包被的納米顆粒能夠與特異性單克隆抗體反應(yīng)，表明純化獲得的重組納米顆粒sa-nano含有pedv抗原成分。
表2不同納米顆粒包被后的elisa檢測(cè)結(jié)果
透射電鏡負(fù)染對(duì)0.01mg納米顆粒sa-nano，將納米顆粒sa-nano樣品在銅網(wǎng)孵育1min，用1%醋酸鈾染色45s，用透射電子顯微鏡進(jìn)行樣品觀測(cè)。結(jié)果顯示：電鏡觀察到為大量的直徑45nm左右的顆粒，表明融合蛋白sa-ferri自組裝成納米顆粒sa-nano。
（4）納米顆粒sa-nano含量的測(cè)定
用bca蛋白定量試劑盒（購(gòu)自pierce公司）按照說(shuō)明書(shū)對(duì)純化濃縮后納米顆粒sa-nano進(jìn)行定量分析，測(cè)定結(jié)果表明：納米顆粒sa-ferri的含量為2.3mg/ml。
1.4融合蛋白sb-ferri及對(duì)應(yīng)納米顆粒的制備及鑒定
按照表1所示的上游引物sbf、下游引物sbr及豬流行性腹瀉病毒s蛋白基因序列（詳情seqidno.3）第1-2370位基因序列，以及實(shí)施例1.3所示的方法制備融合蛋白sb-ferri，以及含融合蛋白sb-ferri的納米顆粒sb-nano，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符；然后對(duì)其進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的納米顆粒sb-nano進(jìn)行elisa鑒定，鑒定結(jié)果表明：純化獲得的重組納米顆粒sb-nano含有pedv抗原成分。
用bca蛋白定量試劑盒（購(gòu)自pierce公司）按照說(shuō)明書(shū)對(duì)純化后納米顆粒sb-nano進(jìn)行定量分析，測(cè)定結(jié)果表明：納米顆粒sb-nano的含量為3.1mg/ml。
1.5融合蛋白sc-ferri及對(duì)應(yīng)納米顆粒的制備及鑒定
先使用用實(shí)施例1.2所構(gòu)建的質(zhì)粒pcdna-ferri，進(jìn)行改造構(gòu)建質(zhì)粒pcdna-sp-ferri。構(gòu)建帶有pedv信號(hào)肽的融合蛋白ferri表達(dá)質(zhì)粒。合成一段帶有kpni與bamhi酶切位點(diǎn)的pedv信號(hào)肽序列：5'aaggtaccatgaagtctttaacctacttctggttgttcttaccagtactttcaacacttagcctaccacaagatgtcaccaggggatccaa3'。用kpni與bamhi進(jìn)行酶切，并用dna膠回收試劑盒回收酶切后的信號(hào)肽片段。同時(shí)酶切實(shí)施例1.2所構(gòu)建的質(zhì)粒pcdna-ferri，然后用dna膠回收試劑盒回收線性化載體。按照實(shí)施例1.3所述的方法進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和提取質(zhì)粒。并使用kpni與bamh酶切鑒定。
按照表1所示的上游引物scf、下游引物scr及豬流行性腹瀉病毒s蛋白基因序列（詳情seqidno.3）第1381-1914位基因序列，以及實(shí)施例1.3所示的方法（所用的質(zhì)粒為pcdna-sp-ferri）制備融合蛋白sc-ferri，以及含融合蛋白sc-ferri的納米顆粒sc-nano，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符；然后對(duì)其進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的納米顆粒sc-nano進(jìn)行elisa鑒定，鑒定結(jié)果（見(jiàn)表2）表明：純化獲得的重組納米顆粒sc-nano含有pedv抗原成分。
用bca蛋白定量試劑盒（購(gòu)自pierce公司）按照說(shuō)明書(shū)對(duì)純化后納米顆粒sc-nano進(jìn)行定量分析，測(cè)定結(jié)果表明：納米顆粒sc-nano的含量為2.5mg/ml。
1.6融合蛋白sd-ferri及對(duì)應(yīng)納米顆粒的制備及鑒定
按照表1所示的上游引物scf、下游引物scr及豬流行性腹瀉病毒s蛋白基因序列（詳情seqidno.3）第1381-2370位基因序列，以及實(shí)施例1.5所示的方法（所用的質(zhì)粒為pcdna-sp-ferri）制備融合蛋白sd-ferri，以及含融合蛋白sd-ferri的納米顆粒sd-nano，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符；然后對(duì)其進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的納米顆粒sc-nano進(jìn)行elisa鑒定，鑒定結(jié)果（見(jiàn)表2）表明：純化獲得的重組納米顆粒sc-nano含有pedv抗原成分。
用bca蛋白定量試劑盒（購(gòu)自pierce公司）按照說(shuō)明書(shū)對(duì)純化后納米顆粒sd-nano進(jìn)行定量分析，測(cè)定結(jié)果表明：納米顆粒sd-nano的含量為3.3mg/ml。
1.7融合蛋白se-ferri及對(duì)應(yīng)納米顆粒的制備及鑒定
按照表1所示的上游引物sef、下游引物ser及豬流行性腹瀉病毒s蛋白基因序列（詳情seqidno.3）第1-3978位基因序列，以及實(shí)施例1.3所示的方法制備融合蛋白se-ferri以及含融合蛋白se-ferri的納米顆粒se-nano，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，未純化出蛋白，表明蛋白未成功表達(dá)。
實(shí)施例2疫苗組合物的制備
使用ph7.4pbs將實(shí)施例1制備的納米顆粒sa-nano、sb-nano、sc-nano、sd-nano分別進(jìn)行稀釋?zhuān)⒓尤脘X膠佐劑充分混勻，使疫苗組合物中所含納米顆粒的含量如表3所示，同時(shí)保證鋁膠佐劑與疫苗組合物的體積比為1:5。將制備好的疫苗組合物作為免疫原，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
表3豬流行性腹瀉疫苗組合物所含組分
實(shí)施例3豬流行性腹瀉疫苗組合物免疫效力評(píng)價(jià)
3.1主動(dòng)免疫試驗(yàn)
選取3日齡pedv抗體、抗原陰性仔豬88頭，隨機(jī)分成11組（詳情見(jiàn)表2），8頭/組。第1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g組分別按表2肌肉注射實(shí)施例2所制備的疫苗1-6，2ml/頭；第1h、1i組均為按照中國(guó)專(zhuān)利cn103301476a方法制備的現(xiàn)有疫苗對(duì)照組，免疫2ml/頭；第1j、1k組均為空白對(duì)照組免疫注射相同劑量的ph7.4的pbs溶液。免疫后14日，采集免疫組和對(duì)照組豬血清，分別檢測(cè)各組血清中和抗體效價(jià)。使用spss15.0軟件對(duì)各仔豬平均抗體效價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)，免疫組除第1g、1h組和空白對(duì)照組第1j組豬每頭口服1ml滬毒株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）進(jìn)行攻毒外，其余免疫組第1a、1b、1c、1d、1f、1i組和空白對(duì)照組第1k組豬每頭口服1mlhn1301株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）進(jìn)行攻毒。攻毒后觀察7天，統(tǒng)計(jì)各組發(fā)病情況，并根據(jù)發(fā)病判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)判。
主動(dòng)免疫效力試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4主動(dòng)免疫效力試驗(yàn)結(jié)果
由表4可知：
（1）仔豬主動(dòng)免疫后測(cè)定的中和抗體效價(jià)，免疫豬流行性腹瀉疫苗組合物（第1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g組）仔豬的幾何平均抗體效價(jià)分別為1:60、1:62.5、1:63、1:65、1:58、1:75、1:67，發(fā)現(xiàn)抗原含量相同時(shí)抗體效價(jià)相當(dāng)，隨抗原含量的升高而抗體效價(jià)略有升高，并且顯著高于現(xiàn)有疫苗免疫組（第2h、2i組）的（p<0.05），顯著高于空白對(duì)照組的（p<0.05）。
（2）攻毒后，免疫豬流行性腹瀉疫苗組合物（第1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g組）的仔豬，除免疫當(dāng)日食欲有所下降外，在觀察期未見(jiàn)腹瀉，精神、飲食均正常，保護(hù)率均為100%；而現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組（第1h、1i組）分別有3、2頭仔豬出現(xiàn)腹瀉等癥狀，精神、食欲均下降，保護(hù)率僅為62.5%、75%；空白對(duì)照組（第1j、1k組）仔豬分別先后于攻毒后第2、3天發(fā)病，至觀察期結(jié)束，發(fā)病率為100%，其中3頭仔豬因腹瀉脫水而死亡。
3.2被動(dòng)免疫試驗(yàn)
選取22頭外觀正常、同期配種，pedv、tgev等抗原、抗體檢測(cè)均呈陰性的妊娠后期母豬，隨機(jī)分為11組（詳情見(jiàn)表3），2頭/組。第2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g組母豬分別在分娩前5-7周按表3肌肉注射免疫實(shí)施例3制備的疫苗1-6，2ml/頭，3周后，以同樣免疫方式及劑量進(jìn)行二免。
免疫母豬分娩后，同時(shí)采集母豬血液，分別處理后，測(cè)定中和抗體效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表3，表明：免疫疫苗1-6的試驗(yàn)組第2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g組母豬血清幾何平均抗體效價(jià)分別為1:46、1:50、1:52、1:56、1:48、1:64、1:54，發(fā)現(xiàn)抗原含量相同時(shí)抗體效價(jià)相當(dāng)，隨抗原含量的升高而抗體效價(jià)略有升高，并且顯著高于現(xiàn)有疫苗免疫組（第2h、2i組）的（p<0.05），顯著高于空白對(duì)照組的（p<0.05）。
從各免疫組及對(duì)照母豬所產(chǎn)仔豬，隨機(jī)挑選8頭3日齡仔豬，其中免疫組除第2g、2h組和空白對(duì)照組第2j組每頭豬口服1ml滬毒株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）進(jìn)行攻毒外，其余免疫組第2a、2b、2c、2d、2e、2f組和空白對(duì)照組第2k組每頭豬口服1mlhn1301株病毒液（病毒液tcid50不低于107.0/ml）進(jìn)行攻毒。攻毒后，觀察7天，統(tǒng)計(jì)各組發(fā)病情況，并根據(jù)發(fā)病判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)判。
被動(dòng)免疫效力試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5被動(dòng)免疫效力試驗(yàn)結(jié)果
由表5可知：
使用分離的豬流行性腹瀉病毒滬毒株或hn1301株攻毒后，免疫豬流行性腹瀉疫苗組合物的免疫組（第2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g組）母豬所產(chǎn)仔豬，均未出現(xiàn)腹瀉等典型癥狀，精神、食欲正常，保護(hù)率均為100%；而現(xiàn)有免疫對(duì)照組（第2h、2i組）分別有4、3頭仔豬出現(xiàn)腹瀉等癥狀，精神、食欲均下降，保護(hù)率僅為50%、62.5%；空白對(duì)照組（第2j、2k組）未免疫的母豬所產(chǎn)仔豬攻毒后，均于第3天出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀，至第7天觀察期結(jié)束，全部仔豬出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀，其中4頭仔豬因脫水發(fā)生死亡。
綜上所述，不論是主動(dòng)免疫還是被動(dòng)免疫，所用納米顆粒制備的豬流行性腹瀉疫苗組合物免疫后均能獲得較好的免疫效果，能獲得完全保護(hù)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
<110>普萊柯生物工程股份有限公司
<120>一種融合蛋白及其應(yīng)用
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<170>patentinversion3.5
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<213>人工序列
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