本發(fā)明屬于核酸提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及核酸提取方法，特別涉及組織不研磨直接提取核酸的方法。

背景技術(shù)：

核酸研究是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。核酸作為遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)，除了在生物體正常的生長、發(fā)育、和繁殖等生命活動中具有十分重要的作用外，它與生命的異常情況，如腫瘤發(fā)生、放射損傷、遺傳疾病等也有密切關(guān)系。隨著近年來分子生學(xué)技術(shù)的告訴發(fā)汗，以核酸雜交、核酸擴增和核酸序列分析為代表的分子診斷和檢測技術(shù)在諸多領(lǐng)域中日益凸顯出至關(guān)重要的作用。新型的分子生物學(xué)檢測技術(shù)包括聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)、微芯片、高通量測序等，然而，所有現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)首先面臨的問題就是如何從復(fù)雜多樣的生物樣本中迅速有效地分離和提取所需要的基因組核酸，而且抽提后的核酸質(zhì)量和其完整性都會直接影響到隨后的實驗結(jié)果。目前，全世界的研究者在核酸分離提取的技術(shù)方法上也缺德了許多突破性的進展。自1869年被人類首次發(fā)現(xiàn)以來，許多研究正在核酸的提取方法上進行了不懈的探索，對核酸提取的各種材料和試劑進行了改進，十二烷基磺酸鈉、酚、脲、鹽酸胍等各種各樣的化學(xué)試劑紛紛應(yīng)用到核酸提取實驗中。這期間具有里程碑意義的研究發(fā)現(xiàn)包括：1948年，chargaff鞥人使用檸檬酸鈉和rnase獲得了具有天壤形狀的dna，1957年kirby運用酚法抽提dna，即向細胞裂解液中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1體積)混合液，離心后收集上層水相并以異丙醇沉淀其中的核酸，經(jīng)乙醇漂洗掉鹽分后，使用te等緩沖液或蒸餾水溶解制備dna。1961年mamur創(chuàng)建了十二烷基磺酸鈉(sds)法，最早用于提取細菌質(zhì)粒dna，該法的原理是基于共價閉合環(huán)狀dna保持雙鏈的同時對高相對分子質(zhì)量的細菌染色體dna進行選擇性的堿變性，使之與細菌蛋白以及破碎的細胞壁形成表面覆蓋有十二烷基磺酸鹽的復(fù)合物，離心后變性物質(zhì)被去除，質(zhì)粒dna便可從上清中回收。1979年chirgwin對前人的研究進行了系統(tǒng)的總結(jié)，創(chuàng)立了硫氰酸胍法提取rna，異硫氰酸胍時一種強的蛋白變性劑，既可破裂細胞，也可以抑制核酸酶的作用，但該方法的操作較為繁瑣，因此1987年chomczynski和sacchi在此基礎(chǔ)上開創(chuàng)了一步法提取rna，提高了rna提取的速度并因此得到了廣泛的應(yīng)用。伺候，有關(guān)核酸的提取方法仍在在不斷地研究改進。自20世紀90年開起，為了適應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測試驗高通量、高靈敏度、自動化操作的需要，運用磁珠提取核酸的方法應(yīng)運而生了，該方法是納米科技與生物技術(shù)的完美結(jié)合，具有其他核酸提取方法無法比擬的優(yōu)勢，具有高通量操作、操作簡單用時短、安全無毒和純度高濃度大等優(yōu)點。

核酸抽提是下游核酸檢測、研究或產(chǎn)品開發(fā)的起點，所分離的核酸的質(zhì)量和完整性直接影響研究或診斷結(jié)果，因此核酸抽提時分子生物學(xué)最關(guān)鍵的方法之一。通常，成功的核酸分離純化需要四個重要的步驟：組織或細胞的破碎和裂解，和蛋白的復(fù)合體的變形，核酸酶的滅活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以獲取高質(zhì)量的靶核酸，同時沒有蛋白、糖、脂和其他核酸污染。目前已有很多專業(yè)化的核酸抽提方法可以從各種生物樣品中抽提出dna、rna或者總核酸。這些方法大多數(shù)已開成商業(yè)化的試劑盒，有的可以與儀器結(jié)合實現(xiàn)自動化抽提，從而使抽提過程大為簡化。

核酸抽提方法主要包括：堿抽提法、酚氯法、高鹽沉淀法、ctab抽提法、硅介質(zhì)柱法、離子交換法、磁性分離法等。

堿裂解法用于分離質(zhì)粒dna和大腸桿菌，在十二烷基磺酸鈉存在情況下，該法可有效處理所有的大腸桿菌菌株和體積在1ml至500ml以上的細菌培養(yǎng)物。該法的原理是基于共價閉合環(huán)狀dna保持雙鏈的同時對高分子量染色體dna進行選擇性的堿變性；細菌蛋白、破碎的細胞壁以及變性的染色體dna形成表面覆蓋有十二烷基磺酸鹽的大的復(fù)合物；經(jīng)離心，這些變性的物質(zhì)背去除，質(zhì)粒dna便可從上清中回收。

酚-氯仿抽提法是核酸分離的一個經(jīng)典方法。細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1體積)混合液，離心后收集上層水相并以異丙醇沉淀其中的dna，乙醇漂洗掉鹽分后棄去，te緩沖液或蒸餾水溶解靶dna。

異硫氰酸胍是一種強的蛋白變性劑，既可以破裂細胞，也可以抑制核酸酶的作用。異硫氰酸胍用于rna抽提由ulrich等(1977)首次提出。該法比較繁瑣，已被chomczynski和sacchi(1987)發(fā)明的異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法所代替。一步法是用包含異硫氰酸胍、乙酸鹽、酚和氯仿的酸性溶液抽提實現(xiàn)rna與dna的分離，最后以異丙醇沉淀回收水相中的總rna。

利用rna和dna在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1m氯化納提取,得到的dnp粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而dna位于上層水相中,用2倍體積95％乙醇可將dna鈉鹽沉淀出來.。

ctab是一種非離子去污劑，可從低離子強度溶液中沉淀核酸和酸性多糖，而蛋白質(zhì)和中性多糖仍留在溶液中。在高離子強度溶液中，ctab則不會沉淀核酸，而是和蛋白形成復(fù)合物。因此，ctab常用于從可產(chǎn)生大量多糖的有機體中純化核酸，如植物和某些革蘭氏陰性菌。該方法的后續(xù)步驟也是通過使用有機溶劑、乙醇沉淀等去除蛋白質(zhì)、污染的鹽和其他物質(zhì)來純化核酸。

硅介質(zhì)柱法可用于手工提取，也可用于自動化提取。其原理如圖8所示。

磁性分離法一般用于自動化提取，生物磁珠是一種新型的功能化固體載體，其表面包被有活性基團，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動性和固體磁性材料等特點，在外磁場的作用下可以定向移動和集中，當(dāng)撤去外磁場后，稍加振蕩或抽吸又可均勻分散于液體中，從而使固液相的分離變的十分快捷方便，通過簡單的洗脫可以得到純度很高的靶向物質(zhì)。

許多知名的生物試劑公司已經(jīng)以這些傳統(tǒng)的核酸提取方法為基礎(chǔ)研發(fā)出了各種各樣的核酸提取試劑盒，用于從各種各種不同的組織樣本中分離和提取dna以及rna，不同核酸提取方法對比見圖9。然而，傳統(tǒng)的核酸提取技術(shù)中所包含的沉淀和離心等操作需要用到大量的生物樣本，而且傳統(tǒng)提取技術(shù)步驟較為繁雜，費時長，收率低，很難實現(xiàn)自動化操作，大部分方法還需要操作人員直接接觸有毒的化學(xué)試劑。而離心柱型方法樣品需求量大，耗費樣品較多，對于某些珍稀樣本其應(yīng)用受到很大的局限，同時離心柱法提取核算需要反復(fù)離心，不便于高通量、自動化操作，特別是在基因診斷、突發(fā)疫情的監(jiān)測和控制等領(lǐng)域，使用離心柱法提取核酸需要大量的操作人員及儀器設(shè)備才能滿足需求。而新型的核酸提取技術(shù)雖然能夠滿足高通量和自動化操作，但對某些動植物組織，依舊無法擺脫傳統(tǒng)核酸提取過程中手動研磨裂解過程，無法實現(xiàn)組織樣本全自動核酸提取，使得核酸提取變得繁瑣，周期拉長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要克服傳統(tǒng)核酸提取過程中的缺陷：

1、步驟繁雜，費時長，得率低，很難實現(xiàn)自動化操作，需接觸有毒化學(xué)試劑；

2、離心柱型方法樣品需求量大，對于珍稀樣本受到局限，需要反復(fù)離心，無法實現(xiàn)高通量和自動化；

3、新型的核酸提取技術(shù)對某些動植物組織，依舊無法擺脫傳統(tǒng)核酸提取過程中手動研磨裂解過程，無法實現(xiàn)組織樣本全自動核酸提取，使得核酸提取變得繁瑣，周期拉長；

本發(fā)明采用磁珠法提取核酸，通過優(yōu)化裂解液和配套96通道全自動核酸提取儀來解決上述問題，實現(xiàn)組織不研磨直接提取核酸。

裂解液的具體技術(shù)方案是，基本裂解液的成分為鹽酸胍、異硫氰酸胍、tris和曲拉通，其中鹽酸胍和異硫氰酸胍為強蛋白變性劑，用于破裂組織、細胞壁的蛋白成分，幫助細胞內(nèi)的核酸釋放，同時提供高離液鹽環(huán)境，改變?nèi)芤褐兴肿拥呐帕蟹绞?，使被大量水分子包裹的核酸裸露出來，磁珠外包裹有硅化處理的薄膜，在裂解液環(huán)境下，裸露核酸的五碳糖上的羥基可以與磁珠外的硅化材料吸附，形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物從而結(jié)合在磁珠上。根據(jù)不同的樣本，在基本的裂解液的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整基本裂解液各成分濃度配比，并且增加其他輔助劑，包括sls、sds、尿素、乙醇、ctab和pvpp等。在提取樣本過程中，根據(jù)樣品細胞壁或外壁的成分組成和結(jié)構(gòu)的不同，在裂解過程中加入溶菌酶、蛋白酶k等來幫助裂解，其中溶菌酶可以特異的裂解革蘭氏陽性菌細胞壁的肽聚糖之間的β-1,4糖苷鍵，加速革蘭氏陽性菌的裂解。蛋白酶k是一種是切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，能夠充分降解組織或細胞中蛋白質(zhì)分子，使樣本中的核酸得到充分釋放，同時針對沉降系數(shù)較小樣品可加入核酸助沉劑來幫助核酸沉降。

96通道核酸提取儀的具體技術(shù)方案是，96通道核酸提取儀采用磁珠分離技術(shù)，其原理是硅化處理的納米級磁珠，可在高離液鹽條件下特異的吸附核酸，在低鹽條件下洗脫核酸，磁珠本身可被帶有磁性的磁棒吸附，因此樣本在裂解后釋放的核酸經(jīng)磁珠吸附后，由磁棒完成核酸轉(zhuǎn)移操作，分別在不同的液體中完成漂洗去雜質(zhì)和洗脫核酸的過程。在裂解不同樣本時，根據(jù)樣本裂解的難易程度，程序編輯時在參數(shù)設(shè)置中設(shè)置磁棒和磁棒套上下震動的速度以及裂解步驟的時間，同時96核酸提取儀安裝有半導(dǎo)體加熱制冷模塊，裂解過程可以加熱裂解液，提供蛋白酶k等酶類發(fā)揮活性的適宜溫度，以適應(yīng)不同組織樣本的裂解。

96通道核酸提取儀是采用先進磁珠分離技術(shù)的高科技產(chǎn)品，具有自動化程度高，提取速度快，結(jié)果穩(wěn)定，操作簡便的優(yōu)點。96通道核酸提取儀所有的分離純化步驟都是在96深孔板中完成，完全擺脫了常規(guī)提取、純化中必需的離心、過濾等步驟。該系統(tǒng)可在30-60分鐘內(nèi)同時完成1-96個原始檢材(包括血液、組織、細胞、分泌物、細菌、植物、法醫(yī)檢材及擴增產(chǎn)物等標(biāo)本)的快速提取純化。所提取出的高質(zhì)量核酸(dna/rna)可用于高靈敏的下游分析，如定量pcr、臨床分子診斷、基因表達分析、基因分析、法醫(yī)及傳染性疾病研究等；純化后的核酸可直接應(yīng)用于下一步的酶切、鑒定以及疾病診斷、治療等。配套其他專業(yè)的磁珠法試劑盒，可以實現(xiàn)自動化完成蛋白質(zhì)或多肽片段的提純，特定的細菌、細胞和各種腫瘤標(biāo)志物等的分離富集。廠家試劑盒配套齊全，非抗凝血(凝固血)可以直接提取基因組dna，不需要任何預(yù)處理；動物組織不需預(yù)先研磨消化、組織塊可以直接上機提取dna。

本發(fā)明的優(yōu)點有以下幾個方面：

1、能夠?qū)崿F(xiàn)高通量操作和自動化，用一個樣品的提取時間即可實現(xiàn)對96個樣品的處理，效率直接提高96倍，符合生物學(xué)高通量的操作要求，使得傳染性疾病爆發(fā)時能夠得到快速及時有效的應(yīng)對；

2、全自動，操作簡單、用時短，整個提取流程只有四步，尤其是動物組織，不用手動研磨裂解離心，使得整個提取過程基本上可以在30-60分鐘完成；

3、安全無毒，不適用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒溶劑，對實驗操作人員的傷害少，符合現(xiàn)代以人為本，安全至上的理念；

4、磁珠與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高、濃度大；

5、采用智能化軟件操作系統(tǒng)，技能控制孔間污染，又能避免批次間的污染；同時保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，避免人工操作引起的差異及錯誤；

6、試劑、儀器、耗材一體化，針對不同的樣本材料，有的放矢，優(yōu)化提取條件，便于獲得高純度、高質(zhì)量的核酸。

附圖說明

圖1是艙門開啟的96通道全自動核酸提取儀正面圖。

圖2是鼠肝不研磨直接提取dna電泳結(jié)果。

圖3是植物樣品dna提取電泳結(jié)果。

圖4是鼠肝不研磨直接提取rna電泳結(jié)果。

圖5是魚鰭樣品dna提取電泳結(jié)果。

圖6是糞便樣品dna提取電泳結(jié)果。

圖7是水貂組織dna提取電泳結(jié)果。

圖8是硅介質(zhì)柱法提取核酸原理示意圖。

圖9是核酸提取方法對比表。

具體實施方式

為了更易理解本發(fā)明提供的技術(shù)方案，下文將本發(fā)明的較佳的實施例，做詳細說明如下：

實施例1：

1、小鼠肝臟dna提取

手工加試劑操作步驟(如果是封好的試劑盒，在第1個96深孔板的每個孔分別加入125μl裂解液tr，加入小鼠肝臟越20-60mg，20μl蛋白酶k，4μlrnase，然后直接上機操作)：

1)加250μl磁珠結(jié)合液cb、125μl裂解液tl和125μl裂解液tr、20μl蛋白酶k，4μlrnase和約10mg組織樣本到第1個96深孔板；

2)在第2個深孔板每孔加入300μl緩沖液bb和20μl磁珠；

3)在第3、4個深孔板中每孔加入900μl抑制物去除劑ir；

4)在第5個深孔板中每孔加入900μl漂洗液wb；

5)在第6個深孔板中每孔加入150μl洗脫緩沖液te；

6)將深孔板按順序分別放置在96核酸提取儀的定位座中，然后將攪拌套插入卡槽中；

7)設(shè)置核酸提取儀的程序，具體程序如下

取提取后的核酸5μl，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖二所示。

其他樣本提取結(jié)果見說明書附圖三—附圖七

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。凡是根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容所做的均等變化與修飾，均涵蓋在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。