本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種二價(jià)雙特異性抗體雜交蛋白的表達(dá)和制備方法。

背景技術(shù)：

雙特異性抗體是指可以同時(shí)識(shí)別兩個(gè)抗原或者兩個(gè)表位的一個(gè)抗體分子，諸如能夠結(jié)合兩種以上抗原的雙特異性或者多特異型抗體在本領(lǐng)域中是已知的，可以通過(guò)細(xì)胞融合法，化學(xué)修飾法，基因重組等法，在真核表達(dá)系統(tǒng)或者在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得。

藥理學(xué)研究揭示，多數(shù)復(fù)雜疾病都涉及多種與疾病相關(guān)的信號(hào)通路，例如腫瘤壞死因子TNF、白介素6等多種促炎癥細(xì)胞因子同時(shí)介導(dǎo)免疫炎性疾病，而腫瘤細(xì)胞的增殖往往是由多個(gè)生長(zhǎng)因子受體的異常上調(diào)造成的。單一信號(hào)通路的阻斷通常療效有限，而且容易形成耐藥性。在腫瘤治療方面，由于多數(shù)癌細(xì)胞表面的MHC的表達(dá)下調(diào)甚至缺失，從而逃逸免疫殺傷。雙功能抗體可以同時(shí)結(jié)合免疫細(xì)胞，和腫瘤細(xì)胞，將免疫細(xì)胞富集定位到腫瘤上去。因此，開發(fā)能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同靶點(diǎn)的雙功能抗體及其類似物，長(zhǎng)期以來(lái)成為新結(jié)構(gòu)抗體研發(fā)的重要領(lǐng)域。

雙功能抗體的一個(gè)重要機(jī)制是介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷。近年來(lái)，隨著對(duì)癌細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入和腫瘤免疫治療(cancer immunotherapy)的興起，激活T細(xì)胞的抗體藥物研究備受重視。通常認(rèn)為有效激活T細(xì)胞需要雙重信號(hào)，第一信號(hào)來(lái)自抗原提呈細(xì)胞上MHC-抗原復(fù)合物與T細(xì)胞受體TCR-CD3的結(jié)合，第二信號(hào)為T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的非抗原特異性共刺激信號(hào)。由于多數(shù)癌細(xì)胞表面的MHC的表達(dá)下調(diào)甚至缺失，從而逃逸免疫殺傷。CD3×雙功能抗體則能夠分別結(jié)合T細(xì)胞表面CD3分子和癌細(xì)胞表面抗原，從而拉近細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，Tc或CTL)與癌細(xì)胞的距離，引導(dǎo)T細(xì)胞直接殺傷癌細(xì)胞，而不再依賴于T細(xì)胞的雙重激活信號(hào)(Baeuerle.P.A.,Cancer Res(癌癥研究)69(2009)4941-4944)。CD3×雙功能抗體獨(dú)特的T細(xì)胞激活方式被認(rèn)為是其作用機(jī)制上的重大優(yōu)勢(shì)。

雙功能抗體的另一個(gè)重要的作用機(jī)制是同時(shí)結(jié)合雙靶點(diǎn)，阻斷雙信號(hào)通路。該機(jī)制的應(yīng)用范圍更為廣泛，包括腫瘤、自身免疫性疾病、抑制血管生長(zhǎng)和抗感染等方面的治療。以在細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的跨膜酪氨酸激酶受體HER家族為例，該家族包括HER1(erbB1、EGFR)，HER2(erbB2、NEU)，HER3(erbB3)及HER4(erbB4)等成員，在很多上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞表面異常高表達(dá)，是腫瘤靶向治療的重要靶點(diǎn)。已經(jīng)上市的抗體有結(jié)合HER2D4結(jié)構(gòu)域的赫賽汀單抗、結(jié)合HER2D2結(jié)構(gòu)域的帕妥珠單抗(Perjeta)以及結(jié)合HER1/EGFR的愛必妥單抗(Erbitux)等，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體瘤的臨床治療。研究揭示，HER家族成員自身或不同成員之間的同源或異源二聚體激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)展。赫賽汀抗體阻斷HER2受體同源二聚，但不能阻斷HER2與其他受體間的異源二聚。HER2與HER3是HER家族激活初始致癌信號(hào)的最強(qiáng)二聚體形式，在臨床上將能夠阻斷該二聚化的帕妥珠單抗與赫賽汀聯(lián)用，取得了比單個(gè)抗體更好的療效，揭示了雙靶點(diǎn)阻斷的臨床效果(Kristjansdottir.K.,Expert Opin biol Ther(生物治療的專家意見)10(2010)243-250)。

斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split intein)是由N-端蛋白質(zhì)剪接區(qū)域(In,N-fragment of intein)和C-端蛋白質(zhì)剪接區(qū)域(Ic,C-fragment of intein)兩部分組成,表達(dá)前體蛋白質(zhì)的基因被分裂在兩個(gè)開放閱讀框中,斷裂位點(diǎn)是在蛋白質(zhì)內(nèi)含子序列的內(nèi)部。N-端蛋白質(zhì)外顯子(En)與斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端(In)的基因形成融合基因,翻譯形成的融合蛋白稱為N-端前體蛋白質(zhì)。而斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C-端(Ic)與C-端蛋白質(zhì)外顯子(Ec)的表達(dá)基因形成融合基因,翻譯后產(chǎn)生的融合蛋白稱為C-端前體蛋白質(zhì)。單獨(dú)的斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端(In)或C-端(Ic)不具有蛋白質(zhì)剪接功能,但是在蛋白質(zhì)翻譯以后,N-端前體蛋白質(zhì)中的In與C-端前體蛋白質(zhì)的Ic通過(guò)互相識(shí)別以非共價(jià)鍵結(jié)合,形成有功能的蛋白質(zhì)內(nèi)含子,能夠催化蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng),以肽鍵將兩個(gè)分離的蛋白質(zhì)外顯子(En、EC)連接起來(lái)(Ozawa.T.,Nat Biotechbol(自然技術(shù))21(2003)287-93)。

蛋白質(zhì)反式剪接(protein/ram-splicing)是指由斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)。在這種類型的剪接過(guò)程中,首先是斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端片段(In)和C-端片段(Ic)相互識(shí)別并以非共價(jià)鍵結(jié)合,一者結(jié)合后正確折脊其結(jié)構(gòu),重建活性中心的斷裂行蛋白質(zhì)內(nèi)含子按照典型的蛋白質(zhì)剪接途徑完成蛋白質(zhì)剪接反應(yīng),將兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子的連接(Saleh.L.,Chemical Record(化學(xué)檔案)6(2006)183-193)。

最近已經(jīng)開發(fā)了廣泛多樣的重組雙特異性抗體形式，例如通過(guò)融合例如IgG抗體形 式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價(jià)雙特異性抗體(參見例如Coloma，M.J.，等，Nature Biotech.(自然生物技術(shù))15(1997)159-163；WO 2001077342；和Morrison，S.，L.，Nature Biotech.(自然生物技術(shù))25(2007)1233-1234)。由于與天然抗體結(jié)構(gòu)相差大，進(jìn)入體內(nèi)之后會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)以及較短的半衰期。

此外，開發(fā)了能夠結(jié)合兩種以上抗原的若干其他新型形式，其中抗體中心結(jié)構(gòu)(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保持的小分子抗體。諸如雙抗體、三鏈抗體或四鏈抗體，微型抗體(minibodies)，若干單鏈形式(scFv雙-scFv)(Holliger，P.，等，Nature Biotech(自然生物技術(shù))23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobiology(病理學(xué))74(2007)3-14；Shen，J.，等，J.Immunol.Methods(免疫學(xué)方法雜志)318(2007)65-74；Wu，C.，等.，Nature Biotech(自然生物技術(shù))25(2007)1290-1297)。雖然這種將抗體的核心結(jié)合區(qū)域通過(guò)linker(連接肽)與其它抗體核心結(jié)合區(qū)相連接，雖然對(duì)雙特異性抗體改造的優(yōu)勢(shì)明顯，但是也存一些作為藥物應(yīng)用的問(wèn)題，大大限制了其成藥。實(shí)際上，這些外源可能引起針對(duì)連接肽本身或者蛋白質(zhì)和連接肽的免疫反應(yīng)，容易出現(xiàn)免疫風(fēng)暴。此外，這些連接肽靈活的本質(zhì)是使的期更傾向于蛋白質(zhì)的水解分裂，這潛地導(dǎo)致抗體穩(wěn)定性差，易于聚集，高的免疫原性以及很短的半衰期。例如安進(jìn)公司的blinatumomab血液中的半衰期只有1.25小時(shí)，必須通過(guò)注射泵24小時(shí)持續(xù)給藥才能達(dá)到治療效果，大大限制了其應(yīng)用(Bargou，R和Leo.E.,Scince(科學(xué))321(2008)974-7)。此外人們希望保留抗體的效應(yīng)功能，諸如CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)或者ADCC(細(xì)胞毒作用)與血管內(nèi)壁FcRn(Fc受體)結(jié)合的半衰期延長(zhǎng)，這些功能必須通過(guò)Fc區(qū)來(lái)介導(dǎo)。

因此，理想的雙特異性抗體是開發(fā)結(jié)構(gòu)與天然存在抗體(如IgA，IgD，IgE，IgG，IgM)極度相似雙特異性抗體，并且其與人抗體序列具有最小的偏離的人源化雙特異性抗體以及全人源的雙特異性抗體。

1983年首次利用雜交瘤融合技術(shù)(quadrom)，獲得了與天然抗體非常類似的雙特異性抗體(Milstein，C和A.C.cuello,Nature(自然)，305(1983)537-40)。在所述雜交融合技術(shù)中，將兩個(gè)不同的鼠源單克隆雜交瘤細(xì)胞株融合，融合后抗體的生成會(huì)存在10種不同的抗體類型，其中只有一種是所需要的雙特異性抗體。由于錯(cuò)配產(chǎn)物與目的產(chǎn)物的理化性質(zhì)十分相似，且目的產(chǎn)物的含量極低，其意味著需要先進(jìn)的純化程序來(lái)完成，(Morrison，S.L.,Nature Biotech(自然生物技術(shù)25(2007)1233-1234)。例如2009年在歐洲上市的雙特異性抗體Catumaxomab(Removab)由于抗體時(shí)鼠源種屬， 注射入人體內(nèi)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的免疫風(fēng)暴現(xiàn)象，限制了其前景(Framton.JE.,Drugs(藥物)72(2012)1399-410)。同樣的利用基因重組表達(dá)技術(shù)，重鏈錯(cuò)配和輕鏈錯(cuò)配現(xiàn)象仍然不能得到解決。

為了解決重鏈錯(cuò)配問(wèn)題，提出了“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”理論，其目的在于通過(guò)在抗體的CH3區(qū)引入突變，改變接觸界面，來(lái)迫使兩個(gè)不同的抗體重鏈配對(duì)。在一條CH3上大空間結(jié)構(gòu)的氨基酸被突變成短側(cè)臉的氨基酸，以形成“Hole(臼)”，相反的，將大側(cè)鏈的氨基酸引入另一個(gè)CH3區(qū)域，以形成“Knobs(杵)”。通過(guò)共表達(dá)兩條重鏈和兩條輕鏈(必須適合于這兩條重鏈)異型二聚體(杵-臼)比同型二聚體(杵-杵)(臼-臼)產(chǎn)率高(Ridgway，J.B.，Protein Eng.(蛋白質(zhì)工程)9(1996)617-621；和WO96/027011)盡管這種形式非常有吸引力，但是目前不存在臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)，這種策略的一個(gè)重要制約是兩個(gè)母體抗體的輕鏈必須相同，以防止輕鏈錯(cuò)配和形成雜質(zhì)分子。針對(duì)輕鏈錯(cuò)配問(wèn)題，通過(guò)突變改變抗體結(jié)合的特異性形成“Two-in-One”二價(jià)雙特異性抗體，使得同一個(gè)抗體特異性結(jié)合域可以與兩種抗原的結(jié)合，這種抗體對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合都是二價(jià)的，雖然可以再連接和激活型靶點(diǎn)中得到期望效果，但是對(duì)于阻斷抗原作用存在一定不足，并且這種方法需要針對(duì)每?jī)蓚€(gè)抗體序列進(jìn)行大量的突變等基因工程改造，不能夠達(dá)到簡(jiǎn)單通用的目的(Bostrom,J.,Scince(科學(xué))323(2009)1610-1614；Schaefer，G.,Cancer Cell(癌細(xì)胞)20(2011)472-486)。此外crossmab(雜交抗體)方法可以優(yōu)化輕鏈錯(cuò)配問(wèn)題，但是將其中一條Fab的輕鏈和重鏈的部分結(jié)構(gòu)域互換，形成crossmab(雜交抗體)可以很好的解決，但是雜交抗體含有非天然的結(jié)構(gòu)域連接，失去了天然的抗體結(jié)構(gòu)(Schaefer,W.,Pro.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)科學(xué)院院刊)108(2011)1187-1192)。

美國(guó)Genentech(基因泰克)公司利用分別表達(dá)兩個(gè)half-antibody(半抗體)的大腸桿菌共培養(yǎng)的方法得到雙特異性抗體，但是這種方法表達(dá)出來(lái)的抗體是沒(méi)有糖基化修飾的，將影響其ADCC效應(yīng)以及血液中的半衰期，限制了其成藥可能性(Spiess,C.,Nature Biotechnol(自然技術(shù))31(2013)753-758)。為了生產(chǎn)與天然結(jié)構(gòu)相似的，并且含有糖基化修飾的雙特異性抗體，F(xiàn)ab的界面處經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)分析定向基因突變，同時(shí)采用“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”技術(shù)通過(guò)順勢(shì)轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞來(lái)解決輕鏈錯(cuò)配和重鏈錯(cuò)配問(wèn)題，得到了極大的改進(jìn)，但是該方法必須每一個(gè)抗體都經(jīng)過(guò)建立晶體模型來(lái)設(shè)計(jì)適合的突變篩選位點(diǎn)，不能夠通用與一切雙特異性抗體的構(gòu)建(Levis,S.M.,Nature Biotechnol(自然技術(shù))32(2014)191-198)。此外cFAE“半抗體 交換技術(shù)”，通過(guò)在CH3區(qū)引入突變可以定向半抗體重新結(jié)合，通過(guò)體外還原將抗體還原為半抗體，再通過(guò)氧化為完整抗體，解決了重鏈錯(cuò)配和輕鏈錯(cuò)配問(wèn)題，但是會(huì)存在5％的錯(cuò)配現(xiàn)象無(wú)法解決，也無(wú)法通過(guò)純化方法去除，雜組份的存在極大的限制了cFAE作為藥物使用的可能(Labrijin,A.F.,Nature protocol(自然操作方法)9(2014)2045-2463)。

人們致力于建立一種生產(chǎn)雙特異性抗體的方法，不存在非天然的結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)與天然抗體(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)結(jié)構(gòu)及其相似，具有Fc結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)完整穩(wěn)定性好，并且保留了CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)或者ADCC(細(xì)胞毒作用)，并且有FcRn(Fc受體)結(jié)合活性體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，免疫原性降低；不引入任何形式的linker(連接肽)，提高抗體分子穩(wěn)定性，降低在體內(nèi)的免疫反應(yīng)；可以用于生產(chǎn)人源化的雙特異性抗體，以及全人序列的雙特異性抗體，序列與人源抗體跟接近，可以有效降低免疫反應(yīng)的發(fā)生；通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，有糖基化修飾，有更好的生物學(xué)功能，且更加穩(wěn)定，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)；有效避免了重鏈錯(cuò)配，錯(cuò)配率可降低為0％，有效避免輕鏈錯(cuò)配，輕鏈錯(cuò)賠率可降低為0％；是一種通用型雙特異性抗體的構(gòu)建方法，沒(méi)有抗體亞型(IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，IgM，以及輕鏈κ和λ型)的限制性，不需要根據(jù)具體的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)不同的突變，可以用于構(gòu)建任何雙特異性的抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種新型二價(jià)雙特異性抗體雜交蛋白的表達(dá)和制備方法。本發(fā)明首次將雙特異性抗體分割為結(jié)合抗原A，和結(jié)合抗原B兩部分，如(圖2，圖3)所示，分別表達(dá)，然后通過(guò)斷裂蛋白內(nèi)含肽的反式剪接功能將A和B兩部分連接成為完整的抗體。A部分含有A抗體的輕鏈，A抗體的完整重鏈，以及N端融合了IC的Fc鏈；B部分含有B抗體的輕鏈，和C端融合有IN的B抗體的VH+CH1鏈。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種二價(jià)雙特異性抗體的表達(dá)和制備方法，所述二價(jià)雙特異性抗體包括特異性結(jié)合第一抗原的抗體的第一輕鏈、第一重鏈，特異性結(jié)合第二抗原的抗體的第二輕鏈、第二重鏈；所述方法包括如下步驟：

S1、將所述二價(jià)雙特異性抗體的表達(dá)序列進(jìn)行拆分，獲得A部分抗體和B部分抗體；所述A部分抗體包括第一輕鏈、第一重鏈和N端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈；所述B部 分抗體包括第二輕鏈和C端融合有IN的第二重鏈的VH+CH1鏈，；

S2、經(jīng)全基因合成構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，分別獲得A部分抗體的表達(dá)載體和B部分抗體的表達(dá)載體；

S3、轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)A部分抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或者穩(wěn)定表達(dá)A部分的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，表達(dá)獲得A部分抗體；轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)B部分抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或穩(wěn)定表達(dá)B部分的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，表達(dá)獲得B部分抗體；

S4、分別純化所得的A部分抗體和B部分抗體，進(jìn)行A部分抗體和B部分抗體的體外反式剪接，即得所述二價(jià)雙特異性抗體。

優(yōu)選的，所述第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面生成了凸起，所述凸起可以定位在所述N端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹洞中。

優(yōu)選的，在第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?66位的蘇氨酸突變?yōu)樯彼嵋孕纬伤鐾蛊穑辉贜端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?66位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，368位的亮氨酸突變?yōu)楸彼幔?07位的酪氨酸突變?yōu)槔i氨酸以形成所述凹洞。

優(yōu)選的，在第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?54位的絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼?；在N端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?49位的酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

優(yōu)選的，所述第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面生成了凹洞，在所述凹洞內(nèi)可以定位在所述N端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面生成的凸起。

優(yōu)選的，在第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?66位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，368位的亮氨酸突變?yōu)楸彼幔?07位的酪氨酸突變?yōu)槔i氨酸以形成凹洞；在N端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?66位的蘇氨酸突變?yōu)樯彼嵋孕纬赏蛊稹?/p>

優(yōu)選的，在第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?49位的酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔辉贜端融合了IC的第二重鏈的Fc鏈的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?54位的絲氨酸突變?yōu)镃半胱氨酸。

本發(fā)明為了提高CH3區(qū)域結(jié)合的穩(wěn)定性，將“Knobs”(凸起)鏈上354位的S(絲氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)，“Holes”(凹洞)鏈上349位的Y(酪氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)以引入一對(duì)重鏈間二硫鍵增強(qiáng)重鏈間的穩(wěn)定性。

優(yōu)選的，步驟S2中，經(jīng)全基因合成構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體具體為：按照拆分設(shè)計(jì)好的基因序列，進(jìn)行化學(xué)全合成，并且通過(guò)PCR在起始密碼子和終止密碼子兩側(cè)加入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，分別插入含有CMV啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中，亞克隆測(cè)序質(zhì)粒抽提即可。

優(yōu)選的，步驟S3中，所述轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293-E、293-F或CHO哺乳動(dòng) 物細(xì)胞,或者為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

優(yōu)選的，步驟S4中，所述體外反式剪接為在巰基化合物存在條件下進(jìn)行的斷裂intein介導(dǎo)的體外反式剪接。

優(yōu)選的，所述體外反式剪接作用的溫度為4℃～37℃，時(shí)間為5～120min，巰基化合物的濃度為0.05～2mM。

優(yōu)選的，步驟S4中，還包括將剪接所得產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化的步驟。

本發(fā)明還涉及一種二價(jià)雙特異性抗體的免疫雜交蛋白的表達(dá)和制備方法，所述二價(jià)雙特異性抗體基于上述的方法制備，所述免疫雜交蛋白的表達(dá)和制備方法包括如下步驟：

B1、將所述免疫雜交蛋白的表達(dá)序列進(jìn)行拆分，獲得蛋白分子、A部分抗體和B部分抗體；所述A部分抗體包括第一輕鏈、第一重鏈和第二重鏈的Fc鏈，該Fc鏈的N端融合了IC；所述B部分抗體包括第二輕鏈和第二重鏈的VH+CH1鏈，該VH+CH1鏈的C端融合了IN；所述蛋白分子的一端融合了IN，所述第二重鏈的Fc鏈、第一重鏈的Fc鏈中至少一條Fc鏈的C端融合了IC；

B2、經(jīng)全基因合成構(gòu)建真核或原核生物表達(dá)載體，用瞬轉(zhuǎn)或穩(wěn)轉(zhuǎn)方法分別表達(dá)、制備獲得A部分抗體和B部分抗體；

B3、純化后，進(jìn)行A部分抗體、B部分抗體和蛋白分子的體外反式剪接,即得所述免疫雜交蛋白。

B4、或未經(jīng)純化的A部分抗體，B部分抗體和蛋白分子的體外反式剪接，及得到所述免疫雜交蛋白，后經(jīng)純化得到所述免疫雜交蛋白。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)不存在非天然的結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)與天然抗體(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)結(jié)構(gòu)及其相似，具有Fc結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)完整穩(wěn)定性好，并且保留了CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)或者ADCC(細(xì)胞毒作用)，并且有FcRn(Fc受體)結(jié)合活性體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，免疫原性降低；

2)不引入任何形式的linker(連接肽)，提高抗體分子穩(wěn)定性，降低在體內(nèi)的免疫反應(yīng)；

3)可以用于生產(chǎn)人源化的雙特異性抗體，以及全人序列的雙特異性抗體，序列與人源抗體跟接近，可以有效降低免疫反應(yīng)的發(fā)生；

4)通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，有糖基化修飾，有更好的生物學(xué)功能，且更 加穩(wěn)定，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)；

5)有效避免了重鏈錯(cuò)配，錯(cuò)配率可降低為0％，有效避免輕鏈錯(cuò)配，輕鏈錯(cuò)賠率可降低為0％；

6)是一種通用型雙特異性抗體的構(gòu)建方法，沒(méi)有抗體亞型(IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，IgM，以及輕鏈κ和λ型)的限制性，不需要根據(jù)具體的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)不同的突變，可以用于構(gòu)建任意雙特異性的抗體。

7)本發(fā)明也可以應(yīng)用于Fc片段殘缺的雙特異性抗體構(gòu)建，比如Fc區(qū)域僅留下部分CH2區(qū)，或者留下完整的CH2區(qū)域和部分CH3區(qū)域。

8)本發(fā)明也可以應(yīng)用于Fab片段殘存的雙特異性抗體構(gòu)建，比如A部分為Scfv，B部分為Fab；A部分為Fab，B部分為Scfv；或者A部分為ScfvB部分為Scfv。同時(shí)保留完整Fc區(qū)域或者殘缺Fc區(qū)域的雙特異性抗體構(gòu)建。

9)本發(fā)明可應(yīng)用于圖5中C組所指示類型的小分子抗體片段，與D組所指示類型的小分子片段抗體，通過(guò)斷裂intein介導(dǎo)反式剪接形成的雙特異性抗體構(gòu)建。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接示意圖；

圖2為雙特異性抗體分割為A抗體重鏈Knob型、Fc hole型和B抗體部分示意圖；

圖3為雙特異性抗體分割為A抗體重鏈Hole型、Fc Knob型和B抗體部分示意圖；

圖4為雙特異性抗體制備流程圖；

圖5為片段型雙特異性抗體構(gòu)建示意圖；

圖6為抗體A輕鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖7為抗體A Knob重鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖8為抗體A Hole Fc鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖9為抗體B重鏈和IN示意圖；

圖10為抗體B輕鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖11為抗體A Hole重鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖12為抗體A Hole Fc鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖13為pCEP4表達(dá)載體圖譜；

圖14為雙特異性抗體A部分抗體三表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖；

圖15為雙特異性抗體B部分抗體三表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖；

圖16為斷裂intein介導(dǎo)抗體A部分和抗體B部分剪接(一型)示意圖；

圖17為斷裂intein介導(dǎo)抗體A部分和抗體B部分剪接(二型)示意圖；

圖18為不同DTT濃度(mM)下斷裂intein的誘導(dǎo)雙特異性抗體反式剪接示意圖；

圖19為不同溫度(℃)下斷裂intein的誘導(dǎo)雙特異性抗體反式剪接示意圖；

圖20為不同反應(yīng)時(shí)間(min)下斷裂intein的誘導(dǎo)雙特異性抗體反式剪接示意圖；

圖21為ProteinA(蛋白A)親和純化雙特異性抗體SDS-PAGE電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明涉及的術(shù)語(yǔ)解釋：

抗體：指完整的單克隆抗體。所述完整抗體由兩對(duì)“輕鏈”(LC)和“重鏈”(HC)(所述輕鏈(LC)/重鏈對(duì)縮寫為L(zhǎng)C/HC)組成。所述抗體的輕鏈和重鏈?zhǔn)怯扇舾山Y(jié)構(gòu)域組成的多肽。在完整抗體中，每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3(抗體類型IgA，IgD，和IgG)和任選地，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH4(抗體類型IgE和IgM)。每條輕鏈包括輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域CL。一種天然存在的完整抗體，即IgG抗體的結(jié)構(gòu)顯示在例如圖1中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域VH和VL可以進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，它們之間分布有更加保守的區(qū)域，稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，以以下順序從氨基端向羧基端排列：FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4((Janeway，C.A.，Jr.等.，Immunobiology(免疫學(xué))，第5版，加蘭出版社(Garland Publishing)(2001)；和Woof J，Burton D Nat Rev Immunol(自然免疫學(xué)綜述)4(2004)89-99)。兩對(duì)重鏈和輕鏈(HC/LC)能夠特異性結(jié)合相同抗原。因此所述完整抗體是二價(jià)、單特異性抗體。所述“抗體”包括例如小鼠抗體、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和遺傳改造的抗體(變異或突變抗體)，條件是保持它們的特有特性。特別優(yōu)選人或人源化抗體，尤其作為重組的人或人源化抗體。存在5種由希臘字母表示的哺乳動(dòng)物抗體重鏈類型：α，δ，ε，γ，和μ(Janeway，C.A.，Jr.，等.，Immunobiology(免疫學(xué))，第5版，加蘭出版社(Garland Publishing)(2001))。存在 的重鏈的類型定義抗體的類型；這些鏈分別存在于IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM抗體中(Rhoades RA，Pflanzer RG(2002).Human Physiology(人體生理學(xué))，第4版，湯姆森知識(shí)(ThomsonLearning))。不同的重鏈在尺寸和組成上不同；α和γ含有約450個(gè)氨基酸，而μ和ε具有約550個(gè)氨基酸。每條重鏈具有兩種區(qū)域，即恒定區(qū)和可變區(qū)。恒定區(qū)在相同同種型的所有抗體中相同，但在不同同種型的抗體中不同。重鏈γ，α和δ具有由3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3(處于一條線上)組成的恒定區(qū)和用于增加靈活性的鉸鏈區(qū)(Woof，J.，Burton D Nat Rev Immunol(自然免疫學(xué)綜述)4(2004)89-99)；重鏈μ和ε具有由4個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2、CH3和CH4組成的恒定區(qū)(Janeway，C.A.，Jr.，等.，Immunobiology(免疫學(xué))，第5版，加蘭出版社(Garland Publishing)(2001))。重鏈的可變區(qū)在由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體中不同，但對(duì)由單種B細(xì)胞或B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的所有抗體都是相同的。每條重鏈的可變區(qū)長(zhǎng)約110個(gè)氨基酸且由單抗體結(jié)構(gòu)域組成。在哺乳動(dòng)物中，僅存在兩類輕鏈，其稱為λ和κ。輕鏈具有兩個(gè)連續(xù)的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CL和一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域VL。輕鏈的近似長(zhǎng)度是211-217個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，輕鏈?zhǔn)铅瘦p鏈，且恒定結(jié)構(gòu)域CL優(yōu)選是Cκ。

抗體的Fc部分：是熟練的技術(shù)人員公知的術(shù)語(yǔ)，并基于抗體的木瓜蛋白酶裂解而定義。按照本發(fā)明的抗體包含如Fc部分，優(yōu)選源自人來(lái)源的Fc部分和優(yōu)選人恒定區(qū)的全部其他部分?？贵w的Fc部分直接參與補(bǔ)體活化，C1q結(jié)合，C3活化和Fc受體結(jié)合。盡管抗體對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的影響取決于特定的條件，但是與C1q的結(jié)合由Fc部分中確定的結(jié)合位點(diǎn)所導(dǎo)致。所述結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的且記述在例如Lukas，T.J.，等.，J.Immunol.(免疫學(xué)雜志)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.(分子免疫學(xué))16(1979)907-917；Burton，D.R.，等.，Nature(自然)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等.，Mol.Immunol.(分子免疫學(xué))37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等.，J.Immunol.(免疫學(xué)雜志)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等.，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等.，Immunology(免疫學(xué))86(1995)319-324；和EP 0 307 434中。所述結(jié)合位點(diǎn)是例如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(按照Kabat的EU目錄編號(hào))。亞型IgG1，IgG2和IgG3的抗體通常表現(xiàn)出補(bǔ)體活化，C1q結(jié)合和C3活化，而IgG4不活化補(bǔ)體系統(tǒng)，不結(jié)合C1q且不活化C3。

人源化抗體：指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾為 包括與親本免疫球蛋白的特異性相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。例如將鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。(Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270)。

人抗體：包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。

重組人抗體：通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如分離自宿主細(xì)胞，諸如NS0或CHO細(xì)胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。

可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(輕鏈(VL)的可變區(qū)，重鏈(VH)的可變區(qū))直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的通用結(jié)構(gòu)且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過(guò)3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)性決定區(qū)，CDRs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且CDR可以形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過(guò)構(gòu)架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并與來(lái)自另一條鏈的CDR一起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。

二價(jià)雙特異性抗體：指如上所述的抗體，其中兩對(duì)重鏈和輕鏈(HC/LC)中的每對(duì)特異性結(jié)合不同的抗原，即第一重鏈和第一輕鏈(源自針對(duì)A抗原的抗體)特異性共同結(jié)合抗原A，且第二重鏈和第二輕鏈(源自針對(duì)B抗原的抗體)特異性共同結(jié)合B抗原；所述二價(jià)雙特異性抗體能夠同時(shí)特異性結(jié)合兩種不同的抗原，且不超過(guò)兩種抗原，與其相對(duì)照的是，一方面僅能夠結(jié)合一種抗原的單特異性抗體和另一方面例如能夠同時(shí)結(jié)合四種抗原分子的四價(jià)、四特異性抗體。

斷裂intein：斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split intein)是由N-端蛋白質(zhì)剪接區(qū)域(In,N-fragment of intein)和C-端蛋白質(zhì)剪接區(qū)域(Ic,C-fragment of intein)兩部分組成,表達(dá)前體蛋白質(zhì)的基因被分裂在兩個(gè)開放閱讀框中,斷裂位點(diǎn)是在蛋白質(zhì)內(nèi)含子序列的內(nèi)部。N-端蛋白質(zhì)外顯子(En)與斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端(In)的基因形成融合基因,翻譯形成的融合蛋白稱為N-端前體蛋白質(zhì)。而斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C-端(Ic)與C-端蛋白質(zhì)外顯子(Ec)的表達(dá)基因形成融合基因,翻譯后產(chǎn)生的融合蛋白稱為C-端前體蛋白質(zhì)。單獨(dú)的斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端(In)或C-端(Ic)不具有蛋白質(zhì)剪接功能,但是在蛋白質(zhì)翻譯以后,N-端前體蛋白質(zhì)中的In與C-端前體蛋白質(zhì)的Ic通過(guò)互相識(shí)別以非共價(jià)鍵結(jié)合,形成有功能的蛋白質(zhì)內(nèi)含子,能夠催化蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng),以肽鍵將兩 個(gè)分離的蛋白質(zhì)外顯子(En、EC)連接起來(lái)(Ozawa.T.,Nat Biotechbol(自然技術(shù))21(2003)287-93)

反式剪接：蛋白質(zhì)反式剪接(protein/ram-splicing)是指由斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)。在這種類型的剪接過(guò)程中,首先是斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端片段(In)和C-端片段(Ic)相互識(shí)別并以非共價(jià)鍵結(jié)合(圖1),一者結(jié)合后正確折脊其結(jié)構(gòu),重建活性中心的斷裂行蛋白質(zhì)內(nèi)含子按照典型的蛋白質(zhì)剪接途徑完成蛋白質(zhì)剪接反應(yīng),將兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子的連接(Saleh.L.,Chemical Record(化學(xué)檔案)6(2006)183-193)。

IN：?jiǎn)为?dú)的斷裂型蛋白內(nèi)含子的N-端部分。

IC：?jiǎn)为?dú)的斷裂型蛋白內(nèi)含子的C-端部分。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transient transfection)是將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方式之一。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，重組DNA導(dǎo)入感染性強(qiáng)的細(xì)胞系以獲得目的基因暫時(shí)但高水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合到宿主染色體，可在比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染較短時(shí)間內(nèi)收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并對(duì)溶解產(chǎn)物中目的基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明具體涉及一種新型二價(jià)雙特異性抗體雜交蛋白的表達(dá)和制備方法。本發(fā)明首次將雙特異性抗體分割為結(jié)合抗原A，和結(jié)合抗原B兩部分，如(圖2,圖3)所示，分別表達(dá)，然后通過(guò)斷裂蛋白內(nèi)含肽的反式剪接功能將A和B兩部分連接成為完整的抗體。A部分含有A抗體的輕鏈，A抗體的完整重鏈，以及N端融合了IC的Fc鏈；B部分含有B抗體的輕鏈，和C端融合有IN的B抗體的VH+CH1鏈。本發(fā)明首次將斷裂intein的反式剪接功能與雙特異性抗體的構(gòu)建結(jié)合，通過(guò)將分別表達(dá)純化的A和B兩部分抗體，通過(guò)斷裂intein的反式剪接功能連接成為完整的抗體，這種雙特異性抗體與天然存在的抗體分子結(jié)構(gòu)及其相似，避免了因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)差異引起的抗體分子不穩(wěn)定，以及體內(nèi)免疫原性高的情況。首先將獲得的抗體表達(dá)序列進(jìn)行分析拆分,經(jīng)過(guò)全基因合成構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,將純化所得的載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293E,293F,CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞,或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞。將發(fā)酵液分別收集，通過(guò)proteinL親和層析純化，純化所得A和B兩組份體外反式剪接，剪接所得產(chǎn)物進(jìn)行proteinA親和層析，即可得到較純的雙特異性抗體所示，工藝流程如(圖4)所示。

本發(fā)明也可以應(yīng)用于Fc片段殘缺的雙特異性抗體構(gòu)建，比如Fc區(qū)域僅留下部分CH2區(qū)，或者留下完整的CH2區(qū)域和部分CH3區(qū)域。此外，可以應(yīng)用于任意兩種類型的抗體片段的連接，成為新型雙特異性抗體，如(圖5)所示，C部分任意一種形式的抗體片 段，都可以通過(guò)斷裂intein的反式剪接作用于D部分任意一種形式的抗體片段連接。

本發(fā)明的新型二價(jià)雙特異性抗體雜交蛋白的表達(dá)和制備方法的具體步驟如下：

1、表達(dá)載體構(gòu)建。

為了構(gòu)建表達(dá)載體，關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等.，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國(guó)家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))以及drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供。按照EU編號(hào)對(duì)抗體鏈的氨基酸進(jìn)行編號(hào)和提及(Edelman，G.M.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等.，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國(guó)家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))。所需基因區(qū)段通過(guò)化學(xué)合成制備的寡核苷酸制備。600-1800bp長(zhǎng)的基因區(qū)段通過(guò)包括PCR擴(kuò)增的寡核苷酸的退火和連接來(lái)裝配，并隨后通過(guò)所指出的限制位點(diǎn)例如KpnI/BamHI等克隆到表達(dá)載體中，亞克隆的基因片段的DNA序列通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。Infomax載體NTI版本8.0(Infomax’s VectorNTI Advance suite version 8.0)用于序列構(gòu)建、作圖、分析、注解和說(shuō)明。

1.1.為了解決重鏈錯(cuò)配問(wèn)題，引入了“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”和去除一條重鏈的VH和CH1區(qū)域在CH2的N鉸鏈區(qū)端融合IC(斷裂intein的C段)，從而徹底阻止了重鏈形成無(wú)法純化去除的重鏈同源二聚體組份。為了引入“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”結(jié)構(gòu)，在一條CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)閃(色氨酸)形成“Knobs”結(jié)構(gòu)；同時(shí)在另一條重鏈CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，368位的L(亮氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)，407位的Y(酪氨酸)突變?yōu)閂(纈氨酸)以形成“Holes”結(jié)構(gòu)；此外為了提高CH3區(qū)域結(jié)合的穩(wěn)定性，將“Knobs”鏈上354位的S(絲氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)，“Holes”鏈上349位的Y(酪氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)以引入一對(duì)重鏈間二硫鍵增強(qiáng)重鏈間的穩(wěn)定性。

1.2.為了引入斷裂intein，在抗體B的重鏈鉸鏈區(qū)將抗體B的重鏈分割為Fc區(qū)和VH+CH1區(qū)，并且在CH1區(qū)的C端融合IN(斷裂intein的N段)，同時(shí)在CH2的N端融合IC(斷裂intein的C段)。

1.3.a.如(圖6)所示抗體A的輕鏈的序列為天然抗體A輕鏈序列；如(圖7)所示在抗體A重鏈的CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)閃(色氨酸)形成“Knobs”結(jié)構(gòu)同時(shí) 354位的S(絲氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)；如(圖8)所示，抗體A的IC+Fc(Fc的N端融合斷裂intein的C端)區(qū)域CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，368位的L(亮氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)，407位的Y(酪氨酸)突變?yōu)閂(纈氨酸)以形成“Holes”結(jié)構(gòu)，同時(shí)349位的Y(酪氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)；如(圖9)所示抗體B的重鏈VH+CH1+IN(抗體的重鏈可變區(qū)加上CH1區(qū)在C端融合intein的N段)；如(圖10)所示抗體B部分的輕鏈為天然抗體B的輕鏈序列。

1.3.b.如(圖6)所示抗體A的輕鏈的序列為天然抗體A輕鏈序列；如(圖11)所示在抗體A重鏈的CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，368位的L(亮氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)，407位的Y(酪氨酸)突變?yōu)閂(纈氨酸)以形成“Holes”結(jié)構(gòu)，同時(shí)349位的Y(酪氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)；如(圖12)所示抗體B的IC+Fc(Fc的N端融合斷裂intein的C端)區(qū)域CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)閃(色氨酸)形成“Knobs”結(jié)構(gòu)同時(shí)354位的S(絲氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)；如(圖9)所示抗體B的重鏈VH+CH1+IN(抗體的重鏈可變區(qū)加上CH1區(qū)在C端融合intein的N段)；如(圖10)所示抗體B部分的輕鏈為天然抗體B的輕鏈序列。

1.3.c.小片段抗體表達(dá)載體的構(gòu)建。如(圖5)所示，選擇C組任意一種的抗體片段，在圖中所示IN位置融合斷裂intein的N端，同時(shí)選擇D組任意一種抗體片段，在圖中所示IC位置融合斷裂intein的C端。

1.4.將上述1.3中所設(shè)計(jì)好的基因序列，進(jìn)行化學(xué)全合成，并且通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))在起始密碼子和終止密碼子兩側(cè)加入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)比如KpnI/BamHI等，分別插入含有CMV啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中，亞克隆測(cè)序質(zhì)粒抽提，為了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過(guò)來(lái)自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒制備物來(lái)制備更大量的質(zhì)粒(omega)。除抗體表達(dá)區(qū)域以外，所述載體包括：復(fù)制起點(diǎn)，其容許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制和β-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性?？贵w基因的轉(zhuǎn)錄單元由以下元件組成：5’末端處的特有限制性位點(diǎn)，來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，在cDNA構(gòu)造的情形中，隨后是內(nèi)含子A序列，人抗體基因的5’非翻譯區(qū)，免疫球蛋白輕鏈(或者其他的信號(hào)肽序列)信號(hào)肽序列，具有加A信號(hào)序列的3’非翻譯區(qū)，和3’末端處的特有限制性位點(diǎn)(圖13)。

2.使用如Current Protocols in Cell Biology(當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)方案)(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(編)，John Wiley&Sons，Inc中所述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。通過(guò)在懸 浮生長(zhǎng)的HEK293-E中或在懸浮生長(zhǎng)的HEK29-F細(xì)胞中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各種表達(dá)質(zhì)粒來(lái)表達(dá)A和B部分抗體，如下所述。

2.1.HEK293-E系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。雙特異性抗體A部分和B部分，通過(guò)分別三表達(dá)載體和二表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E(表達(dá)EB病毒核抗原的人胚腎細(xì)胞系293；美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，保藏號(hào)ATCC#CRL-10852，Lot.959218)來(lái)生成。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO₂培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日500-2000rpm 5-10min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(10-50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞數(shù)次，500-2000rpm 5-10min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為2-6×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。共轉(zhuǎn)染各個(gè)質(zhì)粒按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.25-1.5μg等摩爾比的分別編碼各鏈基因的載體，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:2-1:6加入混勻的DNA中室溫孵育5-20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，120rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)5-10天。直接收集上清純化或者收集上清-80℃冷凍保存。

2.1.a.PEI介導(dǎo)A部分抗體三表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E細(xì)胞。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日500-2000rpm 5-10min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(10-50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞數(shù)次，500-2000rpm 5-10min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為2-6×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。編碼A部分抗體三個(gè)表達(dá)載體，按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.25-1.5μg等摩爾比混勻，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:2-1:6加入混勻的DNA中室溫孵育5-20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，120rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，120rpm，5％CO₂培養(yǎng)5-10天，以獲得A部分抗體。直接收集上清純化，或者收集上清-80℃冷凍保存。

2.1.b.PEI介導(dǎo)B部分抗體兩表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E細(xì)胞。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，經(jīng)50ml Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞數(shù)次，1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為2-6×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。編碼A部分抗體兩個(gè)表達(dá)載體，按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.25-1.5μg等摩爾比混勻，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:2-1:6加入混勻的DNA中室溫孵育5-20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，120rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，120rpm，5％CO₂培養(yǎng)5-10天，以獲得B部分抗體。直接收集上清純化，或者收集上清-80℃冷凍保存。

3.發(fā)酵液抗體的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。簡(jiǎn)言之，將抗體應(yīng)用于protein L(蛋白L)親和層析(GE healthcare(GE健康護(hù)理))并用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH6.8-7.4)洗滌。用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE匯集單體抗體組分，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)離心濃縮器濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

3.1.三表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的發(fā)酵液中A部分抗體的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)與細(xì)胞過(guò)濾上清1:1混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖14)所示,非還原的樣品103KD左右出現(xiàn)組裝好的雙特異性抗體A部分抗體；還原樣品中出現(xiàn)55KD的重鏈,40KD的IC+Fc鏈,25KD的輕鏈。匯集單體抗體組分，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心 管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

3.2.兩表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的發(fā)酵液中B部分抗體的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)與細(xì)胞過(guò)濾上清1:1混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE,如(圖15)所示,非還原樣品60KD作用出現(xiàn)組裝好的雙特異性抗體B部分；還原樣品中出現(xiàn)35KD的VH+CH1+IN鏈和25KD的輕鏈。匯集單體抗體組分，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

4.1.斷裂intein介導(dǎo)的A和B兩部分體外反式剪接如(圖16，圖17)所示。步驟3中純化所得的A和B兩部分抗體，按照摩爾比1：1進(jìn)行混合，同時(shí)加入0.05mM-2mM DTT或β巰基乙醇,如(圖18)所示,分別加入DTT終濃度為0.01mM、0.05mM、1mM、2mM，結(jié)果顯示DTT濃度為0.05mM即可誘導(dǎo)斷裂intein反式剪接過(guò)程發(fā)生，在150KD處雙特異性抗體有明顯條帶出現(xiàn)。TCEP等巰基化合物誘導(dǎo)斷裂intein的反式剪接作用發(fā)生，4℃-37℃，以1mM DTT或TCEP濃度加入剪接反應(yīng)體系，分別置于4℃、22℃、和37℃，如(圖19)所示在4℃反應(yīng)即可發(fā)生，22℃、和37℃反應(yīng)效率較高，在150KD處雙特異性抗體有明顯條帶出現(xiàn)。以1mM DTT濃度加入剪接反應(yīng)體系，置于37℃下，分別靜置5min、15min、30min、60min和120min，如(圖20)所示，5min即有反應(yīng)發(fā)生生成雙特異性抗體，在60min時(shí)反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期。反應(yīng)結(jié)束需要去除巰基化合物，可以通過(guò)加入雙氧水等氧化劑去除，或者通過(guò)透析去除巰基化合物，此外還可以通過(guò)高倍緩沖液稀釋將巰基化合物稀釋到工作濃度以下，以達(dá)到終止反應(yīng)的目的。反應(yīng)終止取樣品進(jìn)行非還原SDS-PAGE檢測(cè)。

4.2.斷裂intein介導(dǎo)C和D兩部分體外反式剪接方法同4.1一致。

5.1.斷裂intein介導(dǎo)的A和B部分反式剪接產(chǎn)物的protein A(蛋白A)純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從步驟4反應(yīng)混合液中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)與樣品合適比例混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein A(蛋白A)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中 和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖21)所示，非還原樣品有明顯的150KD條帶為斷裂intein介導(dǎo)的反式剪接而生成的雙特異性抗體且純度較高，還原樣品僅出現(xiàn)50KD左右的重鏈和25KD左右的輕鏈。匯集單體抗體組分，如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存或者用于更高純度的純化，例如離子交換層析，疏水層析，以及分子排阻層析等。

5.2.斷裂intein介導(dǎo)的C和D部分反式剪接產(chǎn)物的純化。對(duì)于C和D部分反式剪接所得產(chǎn)物，需要進(jìn)行離子交換層析，疏水層析，分子排阻層析等重組蛋白純化方法純化。

具體應(yīng)用見以下實(shí)施例：

實(shí)施例1、構(gòu)建CD3×Her2雙特異性抗體

1.1.表達(dá)載體構(gòu)建

為了構(gòu)建表達(dá)載體，關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等.，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國(guó)家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))以及drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供。按照EU編號(hào)對(duì)抗體鏈的氨基酸進(jìn)行編號(hào)和提及(Edelman，G.M.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等.，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國(guó)家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))。CD3抗體序列來(lái)自于人源化OKT3藥物序列，所需基因區(qū)段通過(guò)化學(xué)合成制備的寡核苷酸制備。600-1800bp長(zhǎng)的基因區(qū)段通過(guò)包括PCR擴(kuò)增的寡核苷酸的退火和連接來(lái)裝配，并隨后通過(guò)所指出的限制位點(diǎn)例如KpnI/BamHI等克隆到表達(dá)載體中，亞克隆的基因片段的DNA序列通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。Infomax載體NTI版本8.0(Infomax’s VectorNTI Advance suite version 8.0)用于序列構(gòu)建、作圖、分析、注解和說(shuō)明。為了解決重鏈錯(cuò)配問(wèn)題，引入了“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”和去除一條重鏈的VH和CH1區(qū)域在CH2的N鉸鏈區(qū)端融合IC(斷裂intein的C段)，從而徹底阻止了重鏈形成無(wú)法純化去除的重鏈同源二聚體組份。為了引入“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”結(jié)構(gòu)，在CD3抗體CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)閃(色氨酸)形成“Knobs”結(jié)構(gòu)；同時(shí)在Her2抗體重鏈CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，368位的L(亮氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)， 407位的Y(酪氨酸)突變?yōu)閂(纈氨酸)以形成“Holes”結(jié)構(gòu)；此外為了提高CH3區(qū)域結(jié)合的穩(wěn)定性，將“Knobs”鏈上354位的S(絲氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)，“Holes”鏈上349位的Y(酪氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)以引入一對(duì)重鏈間二硫鍵增強(qiáng)重鏈間的穩(wěn)定性。

1.1.a.以CD3抗體為A部分抗體，各鏈表達(dá)載體分別按照抗體A輕鏈設(shè)計(jì)如(圖6)所示，抗體A knob重鏈表達(dá)載體設(shè)計(jì)如(圖7)所示，抗體A Hole Fc鏈設(shè)計(jì)如(圖8)所示；以Her2抗體為B部分抗體，各表達(dá)鏈分別按照抗體B重鏈IN設(shè)計(jì)如(圖9)所示，抗體B輕鏈設(shè)計(jì)，如(圖10)所示。

1.1.b.以CD3抗體為A部分抗體，各鏈表達(dá)載體分別按照抗體A輕鏈設(shè)計(jì)如(圖6)所示，抗體A Hole重鏈表達(dá)載體設(shè)計(jì)如(圖11)所示，抗體A Knob Fc鏈設(shè)計(jì)如(圖12)所示；以Her2抗體為B部分抗體，各表達(dá)鏈分別按照抗體B重鏈IN設(shè)計(jì)如(圖9)所示，抗體B輕鏈設(shè)計(jì)，如(圖10)所示。

1.1.c.以Her2抗體為A部分抗體，各鏈表達(dá)載體分別按照抗體A輕鏈設(shè)計(jì)如(圖6)，抗體A knob重鏈表達(dá)載體設(shè)計(jì)如(圖7)所示，抗體A Hole Fc鏈設(shè)計(jì)如(圖8)所示；以CD3抗體為B部分抗體，各表達(dá)鏈分別按照抗體B重鏈IN設(shè)計(jì)如(圖9)所示，抗體B輕鏈設(shè)計(jì)，如(圖10)所示。

1.1.d.以Her2抗體為A部分抗體，各鏈表達(dá)載體分別按照抗體A輕鏈設(shè)計(jì)如(圖6)所示，抗體A Hole重鏈表達(dá)載體設(shè)計(jì)如(圖11)所示，抗體A Knob Fc鏈設(shè)計(jì)如(圖12)所示；以CD3抗體為B部分抗體，各表達(dá)鏈分別按照抗體B重鏈IN設(shè)計(jì)如(圖9)所示，抗體B輕鏈設(shè)計(jì)，如(圖10)所示。

1.2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293E細(xì)胞表達(dá)

HEK293-E系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。雙特異性抗體A部分和B部分，通過(guò)分別三表達(dá)載體和二表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E(表達(dá)EB病毒核抗原的人胚腎細(xì)胞系293；美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，保藏號(hào)ATCC#CRL-10852，Lot.959218)來(lái)生成。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。共轉(zhuǎn)染各個(gè)質(zhì)粒按照每10⁶個(gè) 細(xì)胞DNA用量0.5μg等摩爾比的分別編碼各鏈基因的載體，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:3加入混勻的DNA中室溫孵育20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，110rpm，5％CO₂轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，130rpm，5％CO₂培養(yǎng)10天。直接收集上清純化或者收集上清-80℃冷凍保存。

1.2.a.PEI介導(dǎo)按照1.1.a.中構(gòu)建的A部分抗體三表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染HEK293-E細(xì)胞。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO₂培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。共轉(zhuǎn)染各個(gè)質(zhì)粒按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.5μg等摩爾比的分別編碼各鏈基因的載體，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:3加入混勻的DNA中室溫孵育20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，110rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，130rpm，5％CO₂培養(yǎng)10天。直接收集上清純化或者收集上清-80℃冷凍保存。

1.2.b.PEI介導(dǎo)按照1.1.b.中構(gòu)建的A部分抗體三表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E細(xì)胞。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。共轉(zhuǎn)染各個(gè)質(zhì)粒按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.5μg等摩爾比的分別編碼各鏈基因的載體，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:3加入混勻的DNA中室溫孵育20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，110rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉 素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，130rpm，5％CO2培養(yǎng)10天。直接收集上清純化或者收集上清-80℃冷凍保存。

1.2.c.PEI介導(dǎo)按照1.1.c.中構(gòu)建的A部分(Her2)抗體兩表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E細(xì)胞。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。共轉(zhuǎn)染各個(gè)質(zhì)粒按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.5μg等摩爾比的分別編碼各鏈基因的載體，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:3加入混勻的DNA中室溫孵育20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，110rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，130rpm，5％CO2培養(yǎng)10天。直接收集上清純化或者收集上清-80℃冷凍保存。

1.2.d.PEI介導(dǎo)按照1.1.d.中構(gòu)建的B部分抗體兩表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293-E細(xì)胞。用SFX4HEK293培養(yǎng)基(HyClone)和Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基(Gibco)以1:1的比例，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)以37℃，120rpm，5％CO2培養(yǎng)，以待次日轉(zhuǎn)染。以1L搖瓶(Coming)為例，次日1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，經(jīng)(50ml)Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，1000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用150mlGibco Freestyle 293培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml置于新的1L搖瓶(Coming)中。共轉(zhuǎn)染各個(gè)質(zhì)粒按照每10⁶個(gè)細(xì)胞DNA用量0.5μg等摩爾比的分別編碼各鏈基因的載體，用Gibco Freestyle 293培養(yǎng)基稀釋DNA至(40ng/μL)，DNA：PEI(polyscince陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑)＝1:3加入混勻的DNA中室溫孵育20min，加入細(xì)胞懸液中的混合物，37℃，110rpm，5％CO2轉(zhuǎn)染4小時(shí)，4小時(shí)后加入等體積預(yù)熱的SFX4HEK293培養(yǎng)基，添加100μg/ml遺傳霉素(geneticin)(Gibco)繼續(xù)37℃，130rpm，5％CO2培養(yǎng)10天。直接收集上清純化或者收集上清-80℃冷凍保存。

1.3.發(fā)酵液抗體的Protein L(蛋白L)親和純化

參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。簡(jiǎn)言之，將抗體應(yīng)用于 protein L(蛋白L)親和層析(GE healthcare(GE健康護(hù)理))并用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)洗滌。用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE匯集單體抗體組分，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)離心濃縮器濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

1.3.a.上述步驟1.2.a.細(xì)胞發(fā)酵液的Protein L(蛋白L)親和純化。三表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的發(fā)酵液中A部分抗體的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH6.8-7.4)與細(xì)胞過(guò)濾上清1:1混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖14)所示,非還原的樣品103KD左右出現(xiàn)組裝好的雙特異性抗體A部分抗體；還原電泳出現(xiàn)55KD的重鏈,40KD的IC+Fc鏈,25KD的輕鏈。匯集單體抗體組分，可以純化得到主要組份是A抗體部分的純化產(chǎn)品，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

1.3.b.上述步驟1.2.b.細(xì)胞發(fā)酵液的Protein L(蛋白L)親和純化。三表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的發(fā)酵液中A部分抗體的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH6.8-7.4)與細(xì)胞過(guò)濾上清1:1混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖14)所示,非還原的樣品103KD左右出現(xiàn)組裝好的雙特異性抗體A部分抗體；還原電泳出現(xiàn)55KD的重鏈,40KD的IC+Fc鏈,25KD的輕鏈。匯集單體抗體組分，可以純化得到主要組份是A抗體部分的純化產(chǎn)品，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

1.3.c.上述步驟1.2.c.細(xì)胞發(fā)酵液的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)與細(xì)胞過(guò)濾上清1:1混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖15)所示,非還原樣品60KD作用出現(xiàn)組裝好的雙特異性抗體B部分；還原樣品中出現(xiàn)35KD的VH+CH1+IN鏈和25KD的輕鏈。匯集單體抗體組分，可以純化得到主要組份是B抗體部分的純化產(chǎn)品，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

1.3.d.上述步驟1.2.d.細(xì)胞發(fā)酵液的Protein L(蛋白L)親和純化。參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)與細(xì)胞過(guò)濾上清1:1混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein L(蛋白L)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖15)所示,非還原樣品60KD作用出現(xiàn)組裝好的雙特異性抗體B部分；還原樣品中出現(xiàn)35KD的VH+CH1+IN鏈和25KD的輕鏈。匯集單體抗體組分，可以純化得到主要組份是B抗體部分的純化產(chǎn)品，以用于下一步斷裂intein介導(dǎo)的體外剪接。如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存。

1.4.斷裂intein介導(dǎo)的A和B兩部分體外反式剪接

如(圖16，圖17)所示，步驟3中純化所得的A和B兩部分抗體，按照摩爾比1：1進(jìn)行混合，同時(shí)加入0.05mM-2mM DTT或β巰基乙醇,如(圖18)所示,分別加入DTT終濃度為0.01mM、0.05mM、1mM、2mM，結(jié)果顯示DTT濃度為0.05mM即可誘導(dǎo)斷裂intein反式剪接過(guò)程發(fā)生，在150KD處雙特異性抗體有明顯條帶出現(xiàn)。TCEP等巰基化合物誘導(dǎo)斷裂intein的反式剪接作用發(fā)生，4℃-37℃，以1mMDTT或TCEP濃度加入剪接反應(yīng)體系，分別置于4℃、22℃、和37℃，如(圖19)所示在4℃反應(yīng)即可發(fā)生，22℃、和37℃反應(yīng)效率較高，在150KD處雙特異性抗體有明顯條帶出現(xiàn)。以以1mMDTT濃度加入剪接反應(yīng)體系，置于37℃下，分別靜置5min、15min、30min、60min和120min，如(圖20)所示，5min即有反應(yīng)發(fā)生生成雙特異性抗體，在60min時(shí)反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期。反應(yīng)結(jié)束需要去除巰基化合物，可以通過(guò)加入雙氧水等氧化劑去除，或者通過(guò)透析去除巰基化合物，此外還可以通過(guò)高倍緩沖液稀釋將巰基化合物稀釋到工作濃度以下，以達(dá)到終止反應(yīng)的 目的。反應(yīng)終止取樣品進(jìn)行非還原SDS-PAGE檢測(cè)。

1.5.斷裂intein介導(dǎo)的A和B部分反式剪接產(chǎn)物的protein A(蛋白A)純化

參考標(biāo)準(zhǔn)流程，從步驟4反應(yīng)混合液中純化蛋白。用PBS(在PBS中，含有20mM磷酸鹽，150mM NaCl pH 6.8-7.4)與樣品合適比例混合，流過(guò)預(yù)先用PBS平衡完畢的Protein A(蛋白A)親和層析柱，上樣完畢用PBS洗滌，用pH5.0的100mM檸檬酸緩沖液洗除去雜組份，在pH3.0的100mM檸檬酸緩沖液實(shí)現(xiàn)抗體洗脫，并隨后用PH9.0的1M tris-Hcl緩沖液立即中和樣品。提供部分樣品進(jìn)行隨后的蛋白質(zhì)分析例如SDS-PAGE如(圖21)所示，圖21為rProteinA洗脫SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色；其中，M.marker；1.上柱前(N)；2.Ni柱子洗脫(N)；3.rProteinA洗脫1(N)；4.rProteinA洗脫2(N)；5.rProteinA洗脫3(N)；6.空7.上柱前(R)；8.Ni柱子洗脫(R)；9.rProteinA洗脫1(R)10.rProteinA洗脫2(R)；N-Nonreducing非還原的；R-Reducing還原的。由圖21可知，非還原樣品有明顯的150KD條帶為斷裂intein介導(dǎo)的反式剪接而生成的雙特異性抗體且純度較高，還原樣品僅出現(xiàn)50KD左右的重鏈和25KD左右的輕鏈。匯集單體抗體組分,如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)超濾離心管濃縮，冷凍和在-20℃或-80℃保存，或者用于更高純度的純化，例如離子交換層析，疏水層析，以及分子排阻層析等。

綜上所述，本發(fā)明中為了解決重鏈錯(cuò)配問(wèn)題，引入了“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”和去除一條重鏈的VH和CH1區(qū)域在CH2的N鉸鏈區(qū)端融合IC(斷裂intein的C段)，從而徹底阻止了重鏈形成無(wú)法純化去除的重鏈同源二聚體組份。為了引入“Knobs-into-Holes(杵-進(jìn)入-臼)”結(jié)構(gòu)，在一條CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)閃(色氨酸)形成“Knobs”結(jié)構(gòu)；同時(shí)在另一條重鏈CH3區(qū)域?qū)?66位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，368位的L(亮氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)，407位的Y(酪氨酸)突變?yōu)閂(纈氨酸)以形成“Holes”結(jié)構(gòu)；此外為了提高CH3區(qū)域結(jié)合的穩(wěn)定性，將“Knobs”鏈上354位的S(絲氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)，“Holes”鏈上349位的Y(酪氨酸)突變?yōu)镃(半胱氨酸)以引入一對(duì)重鏈間二硫鍵增強(qiáng)重鏈間的穩(wěn)定性。此外最重要的是，一條完整的“Knobs”重鏈和一條“Holes”Fc鏈共同表達(dá)，由于“Knobs”重鏈同源二聚體，“Holes”Fc同源二聚體，與目的產(chǎn)物“Knobs”重鏈和“Holes”Fc異源二聚體性質(zhì)差別很大，可以很簡(jiǎn)單的分離純化開，因此最終產(chǎn)物中可以完全避免了重鏈錯(cuò)配問(wèn)題。

本發(fā)明首次將雙特異性抗體分割為結(jié)合抗原A，和結(jié)合抗原B兩部分，如(圖2,圖 3)所示，分別表達(dá)，然后通過(guò)斷裂蛋白內(nèi)含肽的反式剪接功能將A和B兩部分連接成為完整的抗體。兩條輕鏈不會(huì)同時(shí)存在，兩條VH+CH1鏈也不會(huì)同時(shí)存在，因此不會(huì)出現(xiàn)A的輕鏈結(jié)合到B的重鏈上的情況，也不會(huì)出現(xiàn)B的輕鏈結(jié)合到A的重鏈上的情況，完全避免了輕鏈錯(cuò)配的產(chǎn)生。

本發(fā)明首次將斷裂intein的反式剪接功能與雙特異性抗體的構(gòu)建結(jié)合，通過(guò)將分別表達(dá)純化的A和B兩部分抗體，通過(guò)斷裂intein的反式剪接功能連接成為完整的抗體，這種雙特異性抗體與天然存在的抗體分子結(jié)構(gòu)及其相似，避免了因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)差異引起的抗體分子不穩(wěn)定，以及體內(nèi)免疫原性高的情況。

本發(fā)明是運(yùn)用基因重組表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)雙特異性抗體，所用的序列可以是人源化的抗體序列，或者是全人的抗體序列，最終可以得到人源化或者全人的雙特異性抗體。這將極大的降低了雙特異性抗體體內(nèi)的免疫原性，為雙特異性抗體成為藥物奠定了基石。

由于A抗體部分保留了完整的Fc區(qū)域，intein介導(dǎo)的反式剪接所得到的雙特異性抗體保留完整的Fc區(qū)域，保留了抗體的效應(yīng)功能，諸如CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)或者ADCC(細(xì)胞毒作用)與血管內(nèi)壁FcRn(Fc受體)結(jié)合的半衰期延長(zhǎng)特性。

在本發(fā)明中A和B兩部分抗體，都是通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，比如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293E，293F，CHO等細(xì)胞，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO等細(xì)胞生產(chǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，是具備糖基化修飾的，與天然的抗體分子更加相近，intein介導(dǎo)的反式剪接所得到的雙特異性抗體含有良好的糖基化修飾，能夠更好的維持雙特異性抗體分子的穩(wěn)定性，以及ADCC，CDC等抗體效應(yīng)，并且體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，藥效持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)。

本發(fā)明制備雙特異性抗體的方法，純化工藝簡(jiǎn)單易于操作。首先A和B兩部分均可通過(guò)親和層析ProteinL或者ProteinA/G等高回收率的層析方法獲得，intein介導(dǎo)的反式剪接所得到的雙特異性抗體可以經(jīng)過(guò)ProteinA/G等高回收率的層析方法獲得，有利于接下來(lái)疏水層析，或者離子交換層析的操作。大大降低了純化難度，可以得到高品質(zhì)的產(chǎn)品。

由于抗體重鏈的CH1和CH2之間的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)靈活，且抗體Fc區(qū)一級(jí)Fab區(qū)域結(jié)構(gòu)基本完全一致，所以，該方法適用于任何雙特異性抗體的生產(chǎn)，無(wú)需根據(jù)每個(gè)抗體的性質(zhì)進(jìn)行性質(zhì)分析，本發(fā)明完全適用于任何抗體亞型(IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，IgM，以及輕鏈κ和λ型)的雙特異性抗體生產(chǎn)，具有廣泛的通用性。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。