本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)是一種常見的全球分布的重要真菌，具有重要的開發(fā)利用價值。這類真菌有的可以腐生在各種腐木上，有的在多種木本植物上寄生，引起木本植物的病害，有的與植物形成共生體，是許多植物的內(nèi)生真菌。在腐木上營腐生生活的葡萄座腔菌可以將木本植物殘?bào)w分解，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)中具有重要作用；同時，這類真菌還可以被開發(fā)以生產(chǎn)木質(zhì)素酶和纖維素酶，具有很好的經(jīng)濟(jì)開發(fā)前景。而屬于內(nèi)生真菌的菌株可以作為生物反應(yīng)器，如從北非雪松中分離的一株真菌可以產(chǎn)生15種新的化合物，其中有3種具有抗病原真菌、抗氧化功能。

作為植物病原菌的葡萄座腔菌菌株也有開發(fā)價值，是重要的待開發(fā)生物資源。植物病原菌要成功侵染寄主植物，就必須能夠克服植物的防衛(wèi)反應(yīng)，還要能夠穿過植物表皮等植物的物理保護(hù)屏障。因此，植物病原菌往往能夠產(chǎn)生比腐生菌更多的胞外降解酶和其他效應(yīng)子，使植物的防衛(wèi)反應(yīng)下降，并將植物表皮細(xì)胞壁成分進(jìn)行必要的降解。

一些真菌的基因組序列分析結(jié)果也表明，與腐生真菌相比，植物病原真菌的基因組中含有更多的細(xì)胞壁降解酶基因，而內(nèi)生真菌的基因組中含有的細(xì)胞壁降解酶基因最少。因此，植物病原菌可以開發(fā)成生產(chǎn)胞壁降解酶類的生物資源，如降解作物秸稈或林木殘?bào)w，在環(huán)境保護(hù)、生物質(zhì)能源開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。作為植物病原菌的葡萄座腔菌菌株還可以用于生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)特定的功能化合物，如諾卡酮(nootkatone)是重要的工業(yè)原料，葡萄座腔菌可以將巴倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為諾卡酮nootkatone，在減肥產(chǎn)品、增強(qiáng)免疫力的保健產(chǎn)品和美容產(chǎn)品。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)與傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)結(jié)合在一起，大大促進(jìn)了生物學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，無論是對生物細(xì)胞的分子改造，還是克隆有用的基因，都需要建立外源基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體系，這是對細(xì)胞進(jìn)行分子改造和研究的前提。針對葡萄座腔菌這種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的真菌，截止目前，該菌的基因轉(zhuǎn)化效率比較低。

例如，質(zhì)粒pko1-hph是絲狀真菌基因轉(zhuǎn)化中常用的載體，可以用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，對多種子囊菌進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。其上含有一個由trpc啟動子控制的抗潮霉素基因作為選擇標(biāo)記，還帶有一個由稻梨形孢菌組蛋白h3基因啟動子控制的綠色熒光蛋白(gfp)基因作為報(bào)告基因。但是本課題組在前期研究中用這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化葡萄座腔菌時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率低，綠色熒光蛋白表達(dá)很弱。

為此，本課題組構(gòu)建了新的篩選標(biāo)記，并整合到可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體上，建立了利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源dna高效轉(zhuǎn)化體系，為該類真菌的遺傳改造、開發(fā)有用的基因、分離病原真菌的藥物靶點(diǎn)基因、研究該菌的基因功能等方面的研究開發(fā)提供了可行性方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒載體，解決了現(xiàn)有質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到葡萄座腔菌時，轉(zhuǎn)化效率低的問題。

一種質(zhì)粒載體，由pcambia1300改造構(gòu)建形成，在pcambia1300多克隆位點(diǎn)插入葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子、葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子、抗性基因，所述抗性基因位于葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子的下游。

質(zhì)粒pcambia1300最早用于多種植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，后來用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的多種質(zhì)粒載體也是在這個載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成，本發(fā)明也是采用pcambia1300作為原始載體。

一般真核生物細(xì)胞中，組蛋白h3基因和轉(zhuǎn)錄延長因子α基因在細(xì)胞分裂和rna生物合成中具有重要功能，這兩個基因的啟動子在細(xì)胞中都是強(qiáng)啟動子。本發(fā)明選擇葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子作為調(diào)控外源基因(如gfp)高表達(dá)的強(qiáng)啟動子，而把葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子作為轉(zhuǎn)化葡萄座腔菌細(xì)胞時篩選標(biāo)記的強(qiáng)啟動子。

本發(fā)明研究證明，構(gòu)建的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到葡萄座腔菌中的轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于目前常用的轉(zhuǎn)化載體。以目前常用的載體pko1-hph為例，在相同的轉(zhuǎn)化條件下，以pko1-hph作為載體獲得的轉(zhuǎn)化子平均只有3個時，利用本發(fā)明的質(zhì)粒載體能夠獲得13～20個轉(zhuǎn)化子。

作為優(yōu)選，所述抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?。原始載體pcambia1300中即含有潮霉素抗性基因，但是其啟動子為35s啟動子，在真菌中表達(dá)效率很低，在葡萄座腔菌細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，與對照載體pko1-hph比較，本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體中潮霉素抗性基因的表達(dá)量高出10倍以上，證明葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子調(diào)控潮霉素抗性基因在葡萄座腔菌細(xì)胞中高表達(dá)，有利于轉(zhuǎn)化子的篩選。

作為優(yōu)選，在葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子的下游插入報(bào)告基因，可以通過報(bào)告基因來標(biāo)定目的基因的表達(dá)，所述目的基因可以是gfp基因。

本發(fā)明具體提供兩個質(zhì)粒，具體為：

一種質(zhì)粒載體，命名為pbdh3g-thy1，大小為11219bp，其中葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子的核苷酸序列如seqidno.2所示。

另一種質(zhì)粒載體，命名為pbdh3g-thy2，大小為10217bp，與pbdh3g-thy1的區(qū)別在于，只用了葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子dna片段的一部分。所述葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明還提供了構(gòu)建所述質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)擴(kuò)增分別包含所述葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子、所述葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子和所述抗性基因的dna片段；

(2)通過重組反應(yīng)將所述dna片段插入到pcambia1300載體，得到所述的質(zhì)粒載體。

具體是通過設(shè)計(jì)特異性引物使得擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物的5’和3’最末端分別帶有與相鄰片段最末端對應(yīng)的完全一致的序列，在重組酶的作用下，完成定向克隆。

作為優(yōu)選，所述葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子下游插入gfp基因，所述抗性基因?yàn)? 潮霉素抗性基因，設(shè)計(jì)引物如下：

擴(kuò)增葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子的引物為：

上游引物：cattattatggagaaacggcagcagaaagggttgagac；

下游引物：cctcgcccttgctcaccatgcagaagttgtgttgggtcgg；

擴(kuò)增gfp基因的引物為：

上游引物：atggtgagcaagggcgaggag；

下游引物：tctagattacttgtacagctcgtccatgccg；

擴(kuò)增葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子的引物為：

上游引物：ctgtacaagtaatctagatcgagagtggagagtggcgagaaa；

下游引物：gtgagttcaggctttttcattgtagaggctgaggtgtctg；

或

上游引物：ctgtacaagtaatctagaggagtcataccgtgaaca；

下游引物：gtgagttcaggctttttcattgtagaggctgaggtgtctg；

擴(kuò)增抗性基因的引物為：

上游引物：atgaaaaagcctgaactcaccg；

下游引物：acgacggccagtgccacatctactctattcctttgccc。

本發(fā)明還提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄座腔菌基因轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

(1)將目的基因插入所述質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，得到含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌；

(2)將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與恢復(fù)培養(yǎng)后的葡萄座腔菌原生質(zhì)體共培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化子。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)，本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體能夠穩(wěn)定有效地將目的基因整合到葡萄座腔菌的基因組中，并且使得目的基因在葡萄座腔菌細(xì)胞中高效的表達(dá)。以表達(dá)外源基因gfp為例，本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體使gfp基因在轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)量高于對照pko1-hph的46倍。為葡萄座腔菌的基因功能研究、遺傳改造、開發(fā)有用基因等方面研究提供技術(shù)支持。

本發(fā)明具備的有益效果：

(1)本發(fā)明通過在原始載體pcambia1300的多克隆位點(diǎn)插入依次連接的葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子、葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子、抗性基因，形成新的質(zhì)粒載體；選擇的葡萄座腔菌組蛋白h3基因和轉(zhuǎn)錄延長因子α基因啟動子的區(qū)段，能夠高效啟動連接在后面的基因，因此大大提高該質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化效率高。

(2)本發(fā)明建立了利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因高效轉(zhuǎn)化葡萄座腔菌的方法，為該菌的遺傳改造、開發(fā)有用基因、分離病原真菌的藥物靶點(diǎn)基因、研究該菌的基因功能等方面的研究開發(fā)提供可行性方案。

附圖說明

圖1為載體pbdh3g-thy1的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為三種載體的轉(zhuǎn)化葡萄腔菌的轉(zhuǎn)化率。

圖3為三種載體的轉(zhuǎn)化子的菌絲體中在熒光視野和白光視野下的狀態(tài)，其中a為載體 pbdh3g-thy1(a1是熒光視野下的狀態(tài)，a2是白光視野下的狀態(tài))；b為載體pbdh3g-thy2(b1是熒光視野下的狀態(tài)，b2是白光視野下的狀態(tài))；c為載體pko1-hph(c1是熒光視野下的狀態(tài)，c2是白光視野下的狀態(tài))。

圖4為載體pbdh3g-thy1的轉(zhuǎn)化子中，gfp在分生孢子、萌發(fā)、分生孢子器細(xì)胞中的表達(dá)情況，其中a為分生孢子(a1是熒光視野下的狀態(tài)，a2是白光視野下的狀態(tài))；b為正在萌發(fā)的分生孢子(b1是熒光視野下的狀態(tài)，b2是白光視野下的狀態(tài))；c為分生孢子器(c1是熒光視野下的狀態(tài)，c2是白光視野下的狀態(tài))。

圖5為隨機(jī)轉(zhuǎn)化子中抗潮霉素基因片段的pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中m為分子量標(biāo)記；p為陽性對照；w為野生型菌株；1-12為轉(zhuǎn)化子。

圖6為隨機(jī)轉(zhuǎn)化子中g(shù)fp基因片段的pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中m為分子量標(biāo)記；p為陽性對照；w為野生型菌株；1-12為轉(zhuǎn)化子。

圖7為三種載體的轉(zhuǎn)化子中抗潮霉素基因的相對表達(dá)量。

圖8為三種載體的轉(zhuǎn)化子中g(shù)fp基因的相對表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1用于高效轉(zhuǎn)化葡萄座腔菌的質(zhì)粒載體pbdh3g-thy的構(gòu)建

本發(fā)明質(zhì)粒pegfp購買自clontech公司；質(zhì)粒pcambia1300信息：hajdukiewiczp,svabz,maligap(1994)thesmall,versatileppzpfamilyofagrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.plantmolbiol25:989-994.；質(zhì)粒pcb1003信息：carrollam,sweigardja,barbaravc(1994)improvedvectorsforselectingresistancetohygromycin.fungalgeneticnews,41:22.上述3個質(zhì)粒都保存在浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院真菌生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

在葡萄座腔菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://genome.jgi.doe.gov/botdo1/botdo1.home.html)中進(jìn)行檢索，找到葡萄座腔菌的組蛋白h3基因和轉(zhuǎn)錄延長因子α(tef)基因，分別將其上游約1500bp(含有各自基因的啟動子)下載，然后設(shè)計(jì)引物。再以質(zhì)粒pcb1003上的潮霉素抗性基因序列，設(shè)計(jì)可以通過pcr方法擴(kuò)增潮霉素抗性基因的引物，以質(zhì)粒pegfp上的gfp基因序列，設(shè)計(jì)可以通過pcr方法gfp基因的引物。各個引物的序列見表1(由上至下依次如seqidno.4～22所示)。

表1所用的引物序列信息

(1)通過pcr擴(kuò)增獲得葡萄座腔菌組蛋白h3基因啟動子(h3promoter)：

pcr擴(kuò)增反應(yīng)在朗基mg96g型pcr儀上進(jìn)行，其中，pcr反應(yīng)體系(50μl)：引物hp1和bd-h3prd各2μm，dntps200μm，mg²⁺1.5mm，5×pspcrbuffer10μl，基因組dna10ng，primestardna聚合酶2u。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，然后35個循環(huán)包括：94℃變性30sec，59℃退火40sec，72℃延伸1.5min。最后72℃后延伸10min。

(2)通過pcr擴(kuò)增獲得葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長因子α(tef)基因啟動子(tefpromoter)：

pcr擴(kuò)增反應(yīng)在朗基mg96g型pcr儀上進(jìn)行，其中，pcr反應(yīng)體系(50μl)：引物tp1(tp4)和bdtefpdh各2μm，dntps200μm，mg²⁺1.5mm，5×pspcrbuffer10μl，基因組dna10ng，primestardna聚合酶2u。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，然后35個循環(huán)包括：94℃變性30sec，56℃退火40sec，72℃延伸1.5min。最后72℃后延伸10min。

(3)通過pcr擴(kuò)增獲得gfp基因(gfp)：

pcr擴(kuò)增反應(yīng)在朗基mg96g型pcr儀上進(jìn)行，其中，pcr反應(yīng)體系(50μl)：引物egfpu和egfpdxz各2μm，dntps200μm，mg²⁺1.5mm，5×pspcrbuffer10μl，模板(質(zhì)粒pegfp)dna1ng，primestardna聚合酶2u。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，然后35個循環(huán)包括：94℃變性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃后延伸10min。

(4)通過pcr擴(kuò)增獲得抗潮霉素基因(hygromycinb)：

pcr擴(kuò)增反應(yīng)在朗基mg96g型pcr儀上進(jìn)行，其中，pcr反應(yīng)體系(50μl)：引物hyg2和hph3各2μm，dntps200μm，mg²⁺1.5mm，5×pspcrbuffer10μl，模板(質(zhì)粒pcb1003)dna1ng，primestardna聚合酶2u。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，然后35個循環(huán)包括：94℃變性30sec，57℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃后延伸10min。

(5)載體的構(gòu)建：

用限制性內(nèi)切酶xhoⅰ和hindⅲ酶切質(zhì)粒pcambia1300，膠回收6.8kb的大片段。然后將上述獲得的pcr片段用pcr片段純化試劑盒純化后，通過一步克隆方法(vazyme公司的cloneexpressmultis試劑盒)，通過重組反應(yīng)構(gòu)建新的載體，重組體系為：5×cemultisbuffer4μl，pcambia1300酶切產(chǎn)物50ng，h3promoter、gfp、tefpromoter、hygromycinb各25ng，exnasemultis酶2μl，用ddh2o補(bǔ)足20μl，混勻后37℃保溫30min。

重組好的載體用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α：取20μl冷卻的反應(yīng)液，加入到200μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30min。42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入900μl的lb培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復(fù)蘇。37℃搖菌45min。然后離心沉淀菌體，取100μllb培養(yǎng)液重新懸菌液后，全部均勻涂布在含有50μg/ml的卡那霉素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

通過是菌落pcr進(jìn)行克隆的鑒定。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20μl的lb培養(yǎng)基中混勻，直接取1μl作為pcr模板。分別用(3)(4)方法pcr擴(kuò)增gfp和hygromycinb基因。將pcr陽性菌落的剩余菌液接種至含有50μg/ml的卡那霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取100lb送生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，然后在2ml菌液中加入甘油，使甘油濃度為25％，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

構(gòu)建的質(zhì)粒載體定名為pbdh3g-thy1，共11.2kb(圖1)，我們同時構(gòu)建了pbdh3g-thy2載體，這個載體與pbdh3g-thy1區(qū)別是只用了tefpromoter的一部分，即在步驟(2)中，用tp4代替tp1進(jìn)行pcr，其他構(gòu)建過程相同，pbdh3g-thy2載體大小為10.9kb。

實(shí)施例2葡萄座腔菌原生質(zhì)體制備

1、試劑和培養(yǎng)基的制備

(1)0.7m氯化鈉溶液：40.95g氯化鈉(nacl)溶解在1000ml水中，定容后后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)。

(2)1mtris-cl,ph＝7.5：三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般簡稱為tris)121.14溶于600ml重蒸水中，用濃鹽酸調(diào)整ph＝7.5，然后用重蒸水定容至1l，進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)，備用。

(3)細(xì)胞壁降解酶液：在天平上稱取100mg的崩潰酶(driselase)和100mg的溶壁酶(lysingenzyme)，溶解在10ml的0.7m氯化鈉溶液中，用直徑為0.22μm的濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(4)100ml的stc溶液：稱取21.8604g的山梨醇(sorbitol)，0.735g的氯化鈣加水約60ml 溶解后，加入配好的1mtris-cl(ph＝7.5)1ml，然后定容至100ml。

(5)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potatodextroseagar,pda)：在馬鈴薯200g切成小塊，加水煮沸15min，然后2層紗布過濾后，棄去馬鈴薯塊，在過濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000ml；然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)。

(6)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potatodextrosebroth,pdb)：在馬鈴薯200g切成小塊，加水煮沸15min，然后2層紗布過濾后，棄去馬鈴薯塊，在過濾液中加入葡萄糖20g，加蒸餾水定容至1000ml；然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)。

2、葡萄座腔菌原生質(zhì)體的制備

(1)將本實(shí)驗(yàn)室保存的葡萄座腔菌菌株fy-31接種到pda平板上，25℃培養(yǎng)5天后，用挑針挑取5-8塊約3×3mm²的菌絲塊，接種到100ml的pdb液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)2天。

(2)在超凈工作臺中，用四層紗布過濾菌絲，然后用0.7mnacl沖洗菌絲3次，用滅菌的濾紙和吸水紙濾干水分，稱取1g菌絲置于50ml滅菌離心管中，加入10ml配好的細(xì)胞壁降解酶液，在28℃的搖床上以80轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速酶解3.5小時。

(3)用滅菌的兩層擦鏡紙過濾酶解液，再用0.7mnacl沖洗殘留在擦鏡紙上的原生質(zhì)體兩次，每次用10ml。除去殘?jiān)瑢⑦^濾液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，置于離心機(jī)中，在4℃條件下，用3000rpm離心10min。

(4)小心棄上清，加入10-20mlstc，輕輕晃動離心管以懸浮沉淀。

(5)將50ml離心管置于離心機(jī)中，在4℃條件下,用3000rpm離心10min。

(6)小心棄上清，加入1mlstc，輕輕晃動離心管以懸浮沉淀。

(7)用血球計(jì)數(shù)板對原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量stc溶液，調(diào)整原生質(zhì)體的濃度為10⁶個/ml。

(8)將獲得的原生質(zhì)體分裝到已經(jīng)滅菌的1.5ml離心管中，每管100ul，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄座腔菌dna轉(zhuǎn)化

1、葡萄座腔菌菌株fy-31的準(zhǔn)備：

將本實(shí)驗(yàn)室保存的葡萄座腔菌菌株fy-31接種到pda平板上，25℃培養(yǎng)5天，備用。

2、質(zhì)粒的準(zhǔn)備

提取實(shí)施例1中的pbdh3g-thy1和pbdh3g-thy2，以及用于對照的pko1-hph質(zhì)粒，將質(zhì)粒的濃度調(diào)整到0.25μg/μl。

3、用凍融法將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中

(1)lb固體培養(yǎng)基配方如下：胰蛋白胨(trypone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，氯化鈉(nacl)10g，瓊脂15g,水1000ml，ph＝7.0。常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)。

lb液體培養(yǎng)基：lb固體培養(yǎng)基中不加瓊脂，其他相同。

(2)將農(nóng)桿菌菌株agl1在lb平板上劃線活化，28℃培養(yǎng)2天。然后將1個單菌落轉(zhuǎn)到5mllb液體培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)過夜。

(3)將2ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到裝有50ml的lb液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃振蕩培養(yǎng)6小時，測定其吸光度，當(dāng)od600＝0.5～1.0時停止培養(yǎng)。

(4)將培養(yǎng)好的菌液放置在冰上，然后轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，在4℃條件下用3000g離心5min。

(5)棄去上清液，沉淀用1ml預(yù)冷的20mmcacl2溶液懸浮，分裝到預(yù)冷的1.5ml離心管中，每管0.1ml。

(6)取濃度調(diào)整到0.25μg/μl的三種質(zhì)粒4μl分別加入到含有0.1ml農(nóng)桿菌的1.5ml離心管中，蓋好蓋子，輕輕混勻，然后迅速放到液氮中冷凍。

(7)取出1.5ml離心管，置于37℃水浴中保溫5min解凍。

(8)在1.5ml離心管中加入1ml的lb培養(yǎng)液，在28℃按100rpm輕搖培養(yǎng)2～4h。

(9)將離心管放入離心機(jī)中，12000rpm離心2min，棄去1ml培養(yǎng)液，然后將沉淀懸浮，涂布于含有卡那霉素的lb平板上，正面放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)2～4天。

4、利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌葡萄座腔菌菌株fy-31

農(nóng)桿菌培養(yǎng)基im配方：0.8ml1.25k-phosphate-bufferph4.8(用kh2po4和k2hpo4配制)；20mlmn-buffer(30g/lmgso4·7h2o，15g/lnacl)；1ml1％cacl2·2h2o(w/v)；10ml0.01％feso4(w/v)；5mlsporeelements(100mg/lznso4·7h2o，100mg/lcuso4·h2o，100mg/lh3bo3，100mg/lna2moo4·2h2o)(過濾滅菌)；2.5ml20％nh4no3(w/v)；10ml50％glycerol(v/v)；40ml1mmesph5.5(用naoh調(diào)ph值)；20％glucose(w/v)，液體培養(yǎng)基中加10ml，固體培養(yǎng)基加5ml；加水至1l，固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉。

100mm乙酰丁香酮儲備液(acetosyringone，as)：1.962g乙酰丁香酮用二甲基亞砜(dmso)溶解，定容到100ml，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。

農(nóng)桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基aim配方：在100ml的im培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮儲備液200μl，使乙酰丁香酮的終濃度為200μm。

恢復(fù)培養(yǎng)基yps(yeastextractpeptonesucrose)：蛋白胨(peptone)5g,酵母提取物(yeastextract)3.5g，葡萄糖(glucose)10g，蔗糖(sucrose)342.3g,水1000ml，ph＝7.0。常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)。

卡納霉素儲備液(50mg/ml)：將1g氯霉素溶解在20ml的無水乙醇中備用。

鏈霉素儲備液(10mg/ml)：將100mg鏈霉素溶解在10ml的滅菌水中備用。

頭孢霉素儲備液(400mg/ml)：將2g頭孢霉素溶解在5ml的滅菌水中備用

潮霉素儲備液：50mg/ml，由生工生物技術(shù)有限公司購買。

轉(zhuǎn)化步驟：

(1)從新鮮培養(yǎng)的lb平板(含50μg/ml卡那霉素)上挑選一農(nóng)桿菌單菌落接種于5mllb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)中，200rpm/min，28℃過夜培養(yǎng)。

(2)第二天，將400μl培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到5ml含50g/ml卡那霉素的誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基(aim)中，od值約0.15，28℃培養(yǎng)5～6個小時，使菌液的od600達(dá)到0.5～0.6。

(3)葡萄座腔菌菌株fy-31轉(zhuǎn)化材料的優(yōu)化：在含有100μl原生質(zhì)體的1.5ml離心管中加入500μl的恢復(fù)培養(yǎng)基，28℃恢復(fù)培養(yǎng)5～6小時。

(4)將100ml的im固體培養(yǎng)基中融化后，在室溫冷卻到50℃，然后加入乙酰丁香酮儲備液200μl，頭孢霉素儲備液100μl，鏈霉素儲備液100μl，卡那霉素儲備液100μl，輕輕搖動混勻后，倒入6cm一次性塑料培養(yǎng)皿中，制成誘導(dǎo)平板。待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固后，將一張直徑5cm的滅菌纖維素膜覆蓋在培養(yǎng)基表面。

(5)取100μl培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌agl-1(含載體)菌液和200μl轉(zhuǎn)化材料混合，混合液均勻涂于誘導(dǎo)平板上的硝酸纖維素膜表面，22℃共培養(yǎng)48h。

(6)將100ml的pda固體培養(yǎng)基中融化后，在室溫冷卻到50℃，然后加入乙酰丁香酮儲備液200μl，頭孢霉素儲備液100μl，鏈霉素儲備液100μl，卡那霉素儲備液100μl，潮霉素儲備液20μl，輕輕搖動混勻后，倒入6cm一次性塑料培養(yǎng)皿中，制成篩選平板。將誘導(dǎo)平板上的硝酸纖維素膜切成約0.5cm的條帶，轉(zhuǎn)移到篩選平板上，條帶之間相隔約0.5cm，置于在28℃培養(yǎng)7天，可以見到有菌絲長到硝酸纖維素膜條帶之間的培養(yǎng)基上。

(7)挑取長出的菌絲，轉(zhuǎn)移到含有10μg/ml潮霉素的pda平板上，28℃培養(yǎng)5天，確認(rèn)是否轉(zhuǎn)化成功。如果能夠生長，可確認(rèn)轉(zhuǎn)化成功。

轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖2所示：載體pbdh3g-thy1平均每個培養(yǎng)基可以獲得20轉(zhuǎn)化子以上pbdh3g-thy2可以獲得13個轉(zhuǎn)化子以上，而對照pko1-hph平均每個培養(yǎng)皿僅獲得約3個轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化效率比其它載體的轉(zhuǎn)化效率大大提高。

實(shí)施例4轉(zhuǎn)化子的檢測

1、葡萄座腔菌轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性檢測

從獲得的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選了12個轉(zhuǎn)化子，在pda培養(yǎng)基平板上28℃轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5次，然后再轉(zhuǎn)接在含有10μg/ml潮霉素的pda平板上，28℃培養(yǎng)5天。

結(jié)果這12個轉(zhuǎn)化子都可以生長，說明轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)入的抗性基因穩(wěn)定存在。

2、葡萄座腔菌轉(zhuǎn)化子的綠色熒光檢測

隨機(jī)選擇三個載體轉(zhuǎn)化的葡萄座腔菌轉(zhuǎn)化子在pda平板上，28℃培養(yǎng)5天。用挑針挑取少量菌絲，置于載玻片上，制成觀察玻片，放到顯微鏡的載物臺上。打開紫外光(450～490nm)，觀察綠色熒光。

結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明構(gòu)建的載體pbdh3g-thy1和pbdh3g-thy2的轉(zhuǎn)化子的菌絲體也可以發(fā)出較強(qiáng)的熒光，而作為對照的pko1-hph的轉(zhuǎn)化子只有少部分菌絲發(fā)出很弱的熒光。如圖4所示，本發(fā)明構(gòu)建的載體的轉(zhuǎn)化子在分生孢子、孢子萌發(fā)、菌絲體、以及分生孢子器細(xì)胞中都能表達(dá)，說明本發(fā)明構(gòu)建的載體可以使外源基因在葡萄座腔菌細(xì)胞中高效的表達(dá)。

3、葡萄座腔菌轉(zhuǎn)化子的pcr檢測。

(1)真菌基因組dna的小量提取

提取緩沖液：含有1mkcl、100mmtris-hcl、10mmedta，ph＝8.0。

(2)提取方法：

①將隨機(jī)挑選的12個轉(zhuǎn)化子菌株在pda平板上25℃生長7天后，用牙簽刮取平板上的菌絲，放入已滅菌的含有300μl提取緩沖液1.5ml離心管中；②用電磨機(jī)將挑取的菌絲磨碎，然后再加入300μl提取緩沖液，劇烈震蕩2min；

③10000rpm離心10min；

④吸取上清至另一離心管中，棄沉淀；

⑤加入等體積的異丙醇(分析純)，沉淀核酸，輕輕顛倒混勻數(shù)次后，12000rpm離心10min；

⑥輕輕倒去上清液，在吸水紙上排干水分；

⑦加入300μl70％乙醇，輕輕顛倒混勻數(shù)次后，12000rpm離心2min；

⑧輕輕倒去上清液，在吸水紙上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分揮發(fā)；

⑨用50μlddh2o重懸沉淀，得到基因組dna，濃度達(dá)到30ng/μl。

(3)轉(zhuǎn)化子中抗潮霉素基因和gfp基因的pcr擴(kuò)增

采用50μl反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，體系中含有：上下游引物各2μm，dntps200μm，mg²⁺1.5mm，10×pcrbuffer5μl，模版dna2μl，taq酶2u。

抗潮霉素基因的上游引物hph-f序列為5′-tcgttatgtttatcggcact-3′，下游引物hph-r序列為5′-gttcggtcggcatctact-3′。

gfp基因的上游引物gfp1序列為5′-ggcgagggcgagggcgatgc-3′，下游引物gfp2序列為5′-agttcaccttgatgccgttc-3′。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)在朗基mg96g型pcr儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，然后35個循環(huán)包括：94℃變性30sec，57℃退火40sec，72℃延伸1.5min。最后72℃后延伸10min。

(4)pcr產(chǎn)物的檢測

pcr反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這12個轉(zhuǎn)化子中都出現(xiàn)了約850bp的抗潮霉素基因的電泳條帶(圖5)，還出現(xiàn)了約400bp的gfp基因的的電泳條帶(圖6)，說明抗潮霉素基因和gfp基因都穩(wěn)定整合到葡萄座腔菌的基因組中。

(5)定量pcr檢測轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)量

①轉(zhuǎn)化子總rna的提取

菌絲體的培養(yǎng)方法同實(shí)施例2，用rnaisoplus來提取樣本中的總rna，具體步驟如下：

1)將0.5g菌絲樣品置于預(yù)冷的研缽中，在液氮中研磨成粉末。

2)加入1mlrnaisoplus，室溫放置5min，使其充分裂解。

3)8500rpm離心5min，棄沉淀。

4)按每毫升rnaisoplus200μl氯仿的比例加入氯仿，混勻15s，室溫放置15min，4℃8500rpm離心15min。

5)吸取上層水相，至另一個離心管中，按1:1體積加入異丙酮混勻，室溫放置10min，4℃8500rpm離心10min，棄上清，rna沉于管底。

6)按每毫升rnaisoplus1ml75％乙醇的比例加入75％乙醇，輕輕振蕩離心管，懸浮沉淀4℃，6500rpm離心5min，棄上清液，冰上晾干15min。

7)用100μl去除rna酶的h2o，溶解rna樣品。

8)測od定量rna濃度，-70℃保存。

②cdna第一條鏈的合成

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser((takara，dalianchina)合成第一條鏈。

1)總rna中基因組dna污染的除去反應(yīng)

去除反應(yīng)在冰上完成，按照表2制備去除混合液，低速離心混勻后，42℃反應(yīng)2min，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2基因組dna去除反應(yīng)混合液的制備

2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

用takara反轉(zhuǎn)錄盒將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，具體步驟為：在冰上完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液(表3)的制備，低速離心混勻后，37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s，4℃保存；用ddh2o將反應(yīng)混合液稀釋至200μl，-20℃保存。

表3反轉(zhuǎn)率反應(yīng)混合液的制備

③熒光定量pcr

定量pcr反應(yīng)引物見表1

1)以tubulin基因作為內(nèi)參，檢測tubulin基因的引物對為bd-tubu/bd-tubd，檢測抗潮霉素基因的引物對為q-hph-f/q-hph-r，檢測gfp基因的引物對為gfp-f-rt/gfp-r-rt。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

2)rt-pcr反應(yīng)體系(25μl)

根據(jù)表4在冰上制備rt-pcr反應(yīng)混合液，低速離心后，進(jìn)行rt-pcr反應(yīng)。

表4qrt-pcr反應(yīng)混合液體系制備

qrt-pcr反應(yīng)條件

qrt-pcr反應(yīng)在icyceleriq熒光定量pcr儀(bio-rad，usa)上進(jìn)行，反應(yīng)采用兩步法，反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性30s；進(jìn)入循環(huán)，95℃變性3s，55℃退火31s，共40個循環(huán)。

外源基因的相對表達(dá)量用公式e＝2^ctt-ctg計(jì)算，其中e是檢測基因的相對表達(dá)量，ctt是tubulin基因表達(dá)的ct值，ctg是待檢測基因的ct值。

本發(fā)明構(gòu)建的載體pbdh3g-thy1和pbdh3g-thy2，以及用于對照的pko1-hph質(zhì)粒轉(zhuǎn)化葡萄座腔菌后，外源基因gfp和抗潮霉素基因hygromycinb(hph)都表達(dá)，本發(fā)明構(gòu)建的載體的表達(dá)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照載體pko1-hph的表達(dá)量。其中抗潮霉素基因在pbdh3g-thy2的轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)量高于pko1-hph的11倍，而在pbdh3g-thy1中則超過108倍(圖7)。gfp基因在pbdh3g-thy1和pbdh3g-thy2的轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)量高于pko1-hph的46倍(圖8)。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。