本發(fā)明屬于油菜育種技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及的顯性基因rfp是隱性基因rfp的功能獲得性變異的同源基因。恢復(fù)基因rfp的克隆、驗(yàn)證和應(yīng)用可以加快油菜等作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系的選育，從而大大縮短育種的周期。

背景技術(shù)：

植物雄性不育是指雄配子發(fā)育異常，而雌配子發(fā)育正常，能接受外來(lái)正?；ǚ劢Y(jié)實(shí)的現(xiàn)象(hanson,m.r.ands.bentolila,interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment.plantcell,2004.16:p.s154-s169)。這一現(xiàn)象最早由德國(guó)人科勒在1763年發(fā)現(xiàn)，目前已在600多種植物中有相關(guān)報(bào)道。根據(jù)遺傳模式的差異，植物雄性不育主要分為核不育(genicmalesterility,gms)和胞質(zhì)不育(cytoplasmicmalesterility,cms)。細(xì)胞核雄性不育的遺傳方式符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，而細(xì)胞質(zhì)雄性不育則以母系遺傳的形式存在(kaul,m.l.h.,malesterilityinhigherplants.monographsontheoreticalandappliedgenetics；vol.10.1988,berlin[etc.]:springer)。而依據(jù)敗育的時(shí)期和花藥組織細(xì)胞學(xué)特征，細(xì)胞質(zhì)雄性不育又分為絨氈層和花粉無(wú)細(xì)胞發(fā)育異常的孢子體不育(sporophyticmale-sterility)和小孢子或花粉粒發(fā)育異常的配子體不育(gametophyticmale-sterility)兩種形式(guo,j.x.andy.g.liu,molecularcontrolofmalereproductivedevelopmentandpollenfertilityinrice.journalofintegrativeplantbiology,2012.54(12):p.967-978.)。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育是利用雜種優(yōu)勢(shì)極為有效的方式，在水稻、小麥、油菜、玉米、高粱等主要農(nóng)作物的雜交育種中起了很大的作用，但是其機(jī)理仍沒(méi)有被人們研究透徹(chase,c.d.,cytoplasmicmalesterility:awindowtotheworldofplantmitochondrial-nuclearinteractions.trendsingenetics,2007.23(2):p.81-90)。細(xì)胞質(zhì)雄性不育現(xiàn)象與育性恢復(fù)是受細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基因雙重調(diào)控的一種母性遺傳性狀，是研究植物細(xì)胞質(zhì)遺傳和核質(zhì)互作的一個(gè)極好的材料，對(duì)cms機(jī)理的研究有助于加強(qiáng)對(duì)核質(zhì)互作的認(rèn)識(shí)(chen,l.t.andy.g.liu,malesterilityandfertilityrestorationincrops,inannualreviewofplantbiology,vol65,s.s.merchant,editor.2014,annualreviews:paloalto.p.579-606)，同時(shí)對(duì)成花機(jī)制和花粉發(fā)育等植物花發(fā)育過(guò)程中的事件的研究無(wú)疑將起到推動(dòng)作用。因此，研究cms分子機(jī)理不僅具有重要的生產(chǎn)利用價(jià)值，還具有重要的理論意義，cms/rf系統(tǒng)也自然成為當(dāng)今一個(gè)科研熱點(diǎn)。目前，世界上可以用于油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的cms系統(tǒng)有ogu、kos、tour和波里馬。其中，波里馬cms是目前國(guó)際上公認(rèn)的最有實(shí)用價(jià)值的cms系統(tǒng)(傅廷棟,雜交油菜的育種與利用.2000:湖北科學(xué)技術(shù)出版社)。采用常規(guī)育種手段利用波里馬cms系統(tǒng)需要培育不育系、保持系和恢復(fù)系以實(shí)現(xiàn)三系配套，而在三系選育過(guò)程中伴隨著大量的雜交和多代回交需要大量的人力成本和漫長(zhǎng)的育種周期?？朔@一缺陷的可行策略是克隆波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因，開(kāi)發(fā)恢復(fù)基因的功能標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇，或者在此基礎(chǔ)上直接通過(guò)基因工程技術(shù)直接創(chuàng)制所需的育種材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的本旨在克隆得到甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp，利用該基因恢復(fù)甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的育性，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出功能標(biāo)記，用于細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系的選育，從而加快育種進(jìn)程，同時(shí)本發(fā)明克隆的基因也可通過(guò)轉(zhuǎn)基因的技術(shù)直接用于恢復(fù)系的培育。

申請(qǐng)人通過(guò)分離和克隆技術(shù)，從甘藍(lán)型油菜中分離得到甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp，該基因的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如seqidno：2所示。

分離得到不具備恢復(fù)功能的甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的隱性等位基因rfp，其核苷酸序列如序列表seqidno：3所示；該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表seqidno：4所示。

可以采用已經(jīng)克隆的多核苷酸作探針，從cdna和基因組文庫(kù)中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用pcr(polymerasechainreaction)技術(shù)，也可以從基因組、mrna和cdna中擴(kuò)增得到本發(fā)明的基因以及任何感興趣的一段多核苷酸或與其同源的一段多核苷酸。

本發(fā)明為甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育遺傳改良提供了新的技術(shù)方案，其中包括作為恢復(fù)甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育不育系的育性；或作為新的不育系、保持系或者恢復(fù)系輔助選育的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的實(shí)施例部分，申請(qǐng)人闡述了顯性基因rfp和隱性基因rfp的分離、功能驗(yàn)證和應(yīng)用過(guò)程以及這兩個(gè)基因的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

序列表seqidno:1是本發(fā)明分離的甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1953bp，該基因來(lái)源于甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系bing409。

序列表seqidno:2是本發(fā)明分離的甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp編碼的蛋白質(zhì)序列，編碼650個(gè)氨基酸，該基因來(lái)源于甘藍(lán)型油菜甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系bing409。

序列表seqidno:3是本發(fā)明分離的不具備恢復(fù)功能的甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的隱性等位基因rfp的序列，序列長(zhǎng)度為1953bp，該基因來(lái)源于甘藍(lán)型油菜甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育不育系6330a。

序列表seqidno:4是本發(fā)明分離的不具備恢復(fù)功能的甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的隱性等位基因rfp編碼的蛋白質(zhì)序列，編碼650個(gè)氨基酸，該基因來(lái)源于甘藍(lán)型油菜甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育不育系6330a。

圖1.本發(fā)明鑒定、分離、克隆并驗(yàn)證甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp和它的基因功能的流程圖。

圖2.覆蓋甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp區(qū)段的物理圖譜。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖2中：橢圓形線表示rfp基因精細(xì)定位的遺傳圖譜；分子標(biāo)記下面的數(shù)字表示在近等基因系群體中檢測(cè)到的rfp點(diǎn)與分子標(biāo)記之間發(fā)生重組交換的單株數(shù)；矩形實(shí)線表示白菜基因組測(cè)序拼接的scaffold；線上的三角形代表相應(yīng)區(qū)域白菜基因組圖譜上注釋的基因；連接分子標(biāo)記和scaffold的豎線表示通過(guò)序列比較分析證實(shí)了相對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記和scaffold具有同源性；直線表示擬南芥染色體；線上的圓形代表相應(yīng)區(qū)域擬南芥基因組圖譜上注釋的基因。

圖3.擬南芥啟動(dòng)子分析載體pbi-rfpro的構(gòu)建圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明：nptⅱ(kan^r):新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶ⅱ基因；gus：β-葡萄糖苷酸酶基因。

圖4.擬南芥t1代遺傳轉(zhuǎn)化植株花蕾gus染色結(jié)果?；謴?fù)基因rfp的啟動(dòng)子分析載體pbiprfpro-gus轉(zhuǎn)化后的t1代遺傳轉(zhuǎn)化植株花蕾可看到明顯的gus著色。

圖5.甘藍(lán)型油菜功能互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)表達(dá)載體pc2300-rfp的構(gòu)建圖。

圖6.具有6330a遺傳背景的t1代遺傳轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜植株開(kāi)花后育性表型與6330a表型的比較。6330a遺傳轉(zhuǎn)化t1代植株攜帶顯性基因rfp的候選基因，表現(xiàn)為花絲伸長(zhǎng)，育性恢復(fù)，掃描電鏡下花藥飽滿，花粉粒醋酸洋紅染色正常。

圖7.分離群體中可育株和不育株半薄切片顯微解剖結(jié)構(gòu)。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖7中的a圖、b圖、c圖、d圖、e圖和f圖分別是正?？捎ㄋ庢咴?xì)胞時(shí)期、花粉母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂前期與減數(shù)分裂后期和四分體時(shí)期的半薄切片顯微照片；圖7中的g圖、h圖、i圖、j圖、k圖和l圖分別是不育花藥對(duì)應(yīng)時(shí)期的半薄切片顯微照片；圖7中的e圖為表皮，ar為孢原細(xì)胞，ppc為初生造孢細(xì)胞，psc為初生周緣細(xì)胞，spc為初生周緣細(xì)胞，sp為小孢子母細(xì)胞，v為微管組織，en為藥室內(nèi)壁，ml為中層，t為絨氈層，tds為四分體，st為隔膜。

圖8.開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記用于恢復(fù)系和保持系的選育。附圖標(biāo)記說(shuō)明：r表示恢復(fù)系，b表示保持系，m表示maker。

圖9.開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記用于雜交種純度鑒定。附圖標(biāo)記說(shuō)明：a表示假雜種，m表示maker。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步定義本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克編著的《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》(newyork:coldspringharborlaboratory,1989)中所述的條件，或者按照生產(chǎn)廠商提供的操作手冊(cè)中建議的條件。

實(shí)施例1：構(gòu)建含甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因rfp區(qū)段的物理圖譜并精細(xì)定位不育恢復(fù)基因rfp

1.實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)施例所用的原始材料為油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6330a(zeng,f.q.,etal.,identificationofaflpandscarmarkerslinkedtothemalefertilityrestorergeneofpolcms(brassicanapusl.).euphytica,2009.165(2):p.363-369)及另一個(gè)油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系bing409(文獻(xiàn)同上：zeng,f.q.,etal.,2009)，選擇恢復(fù)系bing409作供體親本，并用6330a作為輪回親本，通過(guò)多代回交然后兄妹交后得到的近等基因系(zeng,f.q.,etal.,2009)。

波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的定位群體不育株和可育株姊妹交后構(gòu)建的近等基因系(近等基因系的構(gòu)建方法請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)：zeng,f.q.,etal.,2009)，2010年秋播種于武漢，2011年春天提取2508個(gè)來(lái)源于近等基因系的單株的dna，2011年秋播種于武漢，2012年春天提取2495個(gè)來(lái)源于近等基因系的不育單株的dna(提取dna的方法請(qǐng)參見(jiàn)stewart,c.n.,jr.andl.e.via,arapidctabdnaisolationtechniqueusefulforrapdfingerprintingandotherpcrapplications.biotechniques,1993.14(5):p.748-50)，用于基因的精細(xì)定位。

2.精細(xì)定位不育恢復(fù)基因rfp

根據(jù)初步定位的結(jié)果該基因定位于甘藍(lán)型油菜n18連鎖群的scar(sequencecharacterizedamplifiedregion)標(biāo)記ar23和ar48之間(zeng,f.q.,etal.,2009)。即rfp位點(diǎn)位于sc02和sc03之間。

設(shè)計(jì)的引物的核苷酸序列如下所示：

sc02f正向引物tagaatacgtcaaacgaggc，

sc02r反向引物ttgatcagagcgatgtactt；

sc03f正向引物tgatgcaggaaccttgaagc，

sc04r反向引物gagcatcttgcatggaggtc。

為了進(jìn)一步縮小目標(biāo)基因區(qū)域的范圍，基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列和內(nèi)含子的多態(tài)性，申請(qǐng)人根據(jù)目標(biāo)區(qū)域的序列設(shè)計(jì)了特異引物(或稱之為分子標(biāo)記)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)ssr和4個(gè)ip分子標(biāo)記(或稱引物)在親本間表現(xiàn)多態(tài)性。進(jìn)一步測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記位于甘藍(lán)型油菜的n9連鎖群上與n18連鎖群同源的一段區(qū)間。分子標(biāo)記ssr44和ip23在5003個(gè)單株中分別檢測(cè)到22個(gè)和34個(gè)重組單株，這些單株在標(biāo)記和rfp位點(diǎn)間發(fā)生了重組(圖2)。然后用其余的標(biāo)記對(duì)交換單株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩側(cè)最近的分子標(biāo)記是引物ssr48和ssr53，兩個(gè)標(biāo)記分別有1個(gè)單株和3個(gè)單株在標(biāo)記與rfp間發(fā)生重組，并有1個(gè)ssr標(biāo)記與rfp基因表現(xiàn)為共分離，將rfp基因定位于分子標(biāo)記yssr1和ssr53之間，與ssr52共分離。對(duì)與目標(biāo)區(qū)段共線的白菜區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)有10個(gè)候選基因。用于精細(xì)定位的引物多的核苷酸序列如下所示：

ip23ftgctttcggaaatgtcactct(seqidno:5)

ip23rtgatatgcgtaatgaccaacg(seqidno:6)

ip3fagtcttcccttcaggcaacc(seqidno:7)

ip3rccccaaaactccacccatta(seqidno:8)

ip14faccacggatcatctgaaagg(seqidno:9)

ip14rccaaagcccaagcgtaagta(seqidno:10)

l1fgacatcgtcgtgatctcatc(seqidno:11)

l1rcaaagatgtgactactgtgg(seqidno:12)

ssr53fttaaagattaaacggcccagt(seqidno:13)

ssr53rccaatcgtaggcatggatgt(seqidno:14)

ssr52ftcaacaacaacagcctttcg(seqidno:15)

ssr52rggaagaagtcgcttcctgtg(seqidno:16)

yssr1ftgtcattggcttctgctgtc(seqidno:17)

yssr1ratatggagagtgccgctacg(seqidno:18)

ssr48fcatgcacgcttgttcttgat(seqidno:19)

ssr48rcttctttgcctccagctcag(seqidno:20)

ssr44ftgatgcattgtttgtgaatga(seqidno:21)

ssr44rtcatccaaaattcaagttgagc(seqidno:22)

注引物名稱中最后一個(gè)英文字母含義分別為：f為正向引物；r為反向引物。

實(shí)施例2：顯性基因rfp的分離和功能驗(yàn)證

1.rfp候選基因的確定

本實(shí)施例中采用模式生物是從擬南芥網(wǎng)站的報(bào)道的blast¹⁰(http://www.arabidopsis.org/blast)軟件對(duì)分子標(biāo)記ssr48和ssr53之間、包含rfp的甘藍(lán)型油菜的序列進(jìn)行分析，顯示該區(qū)段可能存在10個(gè)基因，其中1個(gè)基因?yàn)閜pr(pentatricopeptiderepeat，登陸號(hào)ipr002885)家族成員。通過(guò)對(duì)參考基因組序列進(jìn)行分析確定這個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，利用高保真pcr聚合酶(phusion^tmhigh-fidelitydnapolymerse,購(gòu)自newenglandbiolads公司)分離基因上游非翻譯區(qū)(即包含該基因啟動(dòng)子區(qū)域)約1.5kb的片段,將擴(kuò)增片段克隆到pmd18-t(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)載體上，測(cè)序結(jié)果表明序列完全準(zhǔn)確，沒(méi)有錯(cuò)配堿基存在。提取插入片段序列正確的克隆的融合質(zhì)粒，分別用hindⅲ和kpnⅰ酶切組合處理質(zhì)粒和雙元載體pbi121(jefferson,r.a.,t.a.kavanagh,andm.w.bevan,gusfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.emboj,1987.6(13):p.3901-7),分別回收目標(biāo)片段后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)，在含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落提取質(zhì)粒，酶切檢測(cè)準(zhǔn)確的克隆所包含的載體就是包含正確啟動(dòng)子的融合載體pbirfpro-gus(見(jiàn)圖3)。構(gòu)建的啟動(dòng)子分析載體用農(nóng)桿菌沾花的方法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株(zhang,x.r.,etal.,agrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.natureprotocols,2006.1(2):p.641-646)。在含25mg/l卡那霉素的medium0培養(yǎng)基(成分見(jiàn)表1)上篩選轉(zhuǎn)化擬南芥植株的種子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的擬南芥即抗性植株根長(zhǎng)，植株較大，子葉和真葉的顏色為鮮綠色；非轉(zhuǎn)基因即抗性植株根很短，植株矮小，子葉黃化。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)到3－5片真葉后移植到土中培養(yǎng)，得到約20株轉(zhuǎn)基因植株。提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片總dna(stewart,c.n.,etal.,1993)，用pbi121載體(見(jiàn)圖3)上存在的nptⅱ基因(基因登陸號(hào)nc_004564.1)的cds序列設(shè)計(jì)的引物npt-f和npt-r(如下所示)通過(guò)pcr進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。在開(kāi)花期取轉(zhuǎn)化植株的花蕾用90％丙酮處理后，再用x-glue染色液(jefferson,r.a,etal.,1987)在37℃避光條件下染色過(guò)夜，用70％濃度的酒精脫色后觀察，發(fā)現(xiàn)具有pbirfpro-gus遺傳背景的擬南芥花蕾有g(shù)us著色信號(hào)(見(jiàn)圖4)。說(shuō)明該基因與花發(fā)育相關(guān)，因此推測(cè)該基因?yàn)閞fp基因。

npt-f(正向引物):gccacagtcgatgaatccag，

npt-r(反向引物):atggtggagcacgacactct。

2.rfp油菜轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)

本實(shí)施例采用植物表達(dá)載體pcambia2300(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家實(shí)驗(yàn)室林擁軍教授贈(zèng)送，見(jiàn)圖5)作為甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因載體。該載體編碼一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、卡那霉素抗性基因(kan’)、camv35s啟動(dòng)子、nos基因的終止子以及限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)。通過(guò)分析攜帶候選基因的參考基因組序列的酶切位點(diǎn)和候選基因的關(guān)系，利用引物rfp-f、rfp-r和高保真pcr技術(shù)(phusion^tmhigh-fidelitydnapolymerse,來(lái)自newenglandbiolads公司)擴(kuò)增獲得一個(gè)約7.8kb的片段。

rfp-f(正向引物)：gctctagaccataactgccactaccacctccataactgccact；

rfp-r(反向引物)：ggggtaccatgaagaagctcgaactgacgaacgaagacgagaa。

擴(kuò)增獲得該片段包含kpnⅰ和xbaⅰ酶切位點(diǎn)。片段包括基因上游非翻譯區(qū)3834bp的序列、基因區(qū)間1,953bp的序列和下游非翻譯區(qū)的2070bp的序列。將所得的擴(kuò)增片段用膠回收試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)回收,用kpnⅰ和xbaⅰ雙酶切后回收7.8kb的片段,連接到經(jīng)kpnⅰ和xbaⅰ雙酶切的表達(dá)載體pcambia2300上(圖5)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落提取質(zhì)粒，并用通過(guò)測(cè)序檢測(cè)確定核苷酸序列完全正確，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體pc2300-rfp(見(jiàn)圖5)。將正確的重組質(zhì)粒通過(guò)凍融法(陳葦?shù)?甘藍(lán)型油菜fad2基因的rna干擾及無(wú)篩選標(biāo)記高油酸含量轉(zhuǎn)基因油菜新種質(zhì)的獲得.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2006(06):p.665-671)導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株gv1301。甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(陳葦?shù)?2006)轉(zhuǎn)化油菜波里馬雄性不育系6330a，將6330a種子滅菌用70％濃度的酒精浸泡種子15min，0.1％升汞消毒15min，無(wú)菌水清洗3次，每次間隔5min。將滅過(guò)菌的種子播于medium0培養(yǎng)基(配方見(jiàn)表3)，于25℃暗培養(yǎng)7d。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將獲得的試管幼苗下胚軸切成0.5cm-0.8cm的小段，接種至含有農(nóng)桿菌(懸浮過(guò)夜至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)的medium1上(配方見(jiàn)表3)浸染25min-30min后，吸干液體，于25℃黑暗條件下共培養(yǎng)3d。將外植體轉(zhuǎn)到medium2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方見(jiàn)表3)上，于25℃光照培養(yǎng)15-18d(光照強(qiáng)度800-1000lx)。再將外植體轉(zhuǎn)入medium3分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)(medium3中每15-18d繼代1次)，直至分化出幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至2-3cm高時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)入medium4生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。轉(zhuǎn)化植株生根后，假植于混有腐質(zhì)土的細(xì)土紙杯中，保持70％相對(duì)濕度，一個(gè)月后移入大田。

提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片總dna，用引物npt-f和npt-r通過(guò)pcr方法進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。用轉(zhuǎn)基因t0代觀察育性的表現(xiàn)，驗(yàn)證導(dǎo)入的候選基因的功能。結(jié)果顯示在20株轉(zhuǎn)基因t0代植株中，有15株表現(xiàn)為花絲伸長(zhǎng)，育性恢復(fù)(見(jiàn)圖6)。將t0代植株自交后代播于大田中，開(kāi)花后調(diào)查植株育性，并提取葉片總dna，用引物m13-47(cgccagggttttcccagtcacgac)和rf47t(cgttccggagaacctacaaa)進(jìn)行pcr鑒定：pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系是：30ng模板dna，各35ng正向和反向特異引物，1×pcr緩沖液，1utaq酶，0.15mmol/ldntps和2.0mmol/lmg2+，加ddh2o到總體積為15μl。pcr循環(huán)參數(shù)為94℃(30s)－58℃(30s)－72℃(1min)，共32個(gè)循環(huán)。1.2％瓊脂凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物?？纱_定遺傳轉(zhuǎn)化插入的片段與植株育性恢復(fù)共分離。

表3在遺傳轉(zhuǎn)化步驟中所用的各種培養(yǎng)基的配方

實(shí)施例3：細(xì)胞學(xué)切片分析

為了進(jìn)一步確定波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育敗育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，并闡明rfp基因的功能，本發(fā)明對(duì)花藥進(jìn)行半薄切片觀察，重點(diǎn)觀察了造孢細(xì)胞時(shí)期至四分體時(shí)期過(guò)程中小孢子和絨氈層發(fā)育情況，比較了可育花藥和不育花藥絨氈層和小孢子在各時(shí)期發(fā)育的差異。半薄切片結(jié)果表明敗育時(shí)期出現(xiàn)在孢原細(xì)胞分化時(shí)期(圖7中的c圖和圖7中的i圖)，不育單株花藥中l(wèi)2層細(xì)胞不能正常分化出的藥室內(nèi)壁，中層，絨氈層以及小孢子母細(xì)胞；不育單株花藥在發(fā)育至花粉母細(xì)胞時(shí)期(圖7中的d圖和圖7中的j圖)已經(jīng)不能形成四個(gè)正常的角隅，向后發(fā)育至減數(shù)分裂時(shí)期(圖7中的e圖和圖7中的k圖)也不能形成藥室或者形成1-2個(gè)異常的藥室，而形成的藥室中四分體的發(fā)育異常(圖7中f圖)，最終不能形成產(chǎn)生花粉或者產(chǎn)生干癟的花粉。rfp的主要功能可能是在花藥發(fā)育過(guò)程中影響l2層細(xì)胞的分化，對(duì)其特化出的藥室內(nèi)壁，中層，絨氈層以及小孢子母細(xì)胞(小孢子)的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。

實(shí)施例4：恢復(fù)基因功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用

通過(guò)比較克隆到的恢復(fù)基因及其隱性等位基因的序列開(kāi)發(fā)了恢復(fù)基因的功能標(biāo)記(如下所示)，該標(biāo)記可以在含有恢復(fù)基因的甘藍(lán)型油菜dna中擴(kuò)增出大約400bp的條帶(見(jiàn)圖8)。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系是：30ng模板dna，各35ng正向和反向特異引物，1×pcr緩沖液，1utaq酶，0.15mmol/ldntps和2.0mmol/lmg2+，加ddh2o到總體積為15μl。pcr循環(huán)參數(shù)為94℃(30s)－60℃(30s)－72℃(1min)，共32個(gè)循環(huán)。1.2％瓊脂凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

rt5f(正向引物)：gggatgcgatcctgatatttg

rt5r(反向引物)：gagagaggctacagaacaaact

目前利用該標(biāo)記從甘藍(lán)型油菜自交系中篩選出大量的恢復(fù)系和保持系材料(見(jiàn)圖8)，這些材料可直接用于甘藍(lán)型油菜強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合的配制，可以有效的節(jié)約材料選育的時(shí)間，大大縮短育種了周期。同時(shí)由于該標(biāo)記能夠精確地區(qū)分波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的有無(wú)，它可用于快速準(zhǔn)確的鑒定利用波里馬系統(tǒng)進(jìn)行制種的雜交種純度(見(jiàn)圖9)。

在本發(fā)明所提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考文獻(xiàn)，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所講述內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或者修改，這些等價(jià)形式同樣屬于本申請(qǐng)所附的權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

主要參考文獻(xiàn)

1.hanson,m.r.ands.bentolila,interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment.plantcell,2004.16:p.s154‐s169.

2.傅廷棟,雜交油菜的育種與利用.2000:湖北科學(xué)技術(shù)出版社.

3.stewart,c.n.,jr.andl.e.via,arapidctabdnaisolationtechniqueusefulforrapdfingerprintingandotherpcrapplications.biotechniques,1993.14(5):p.748‐50.

4.zeng,f.q.,etal.,identificationofaflpandscarmarkerslinkedtothemalefertilityrestorergeneofpolcms(brassicanapusl.).euphytica,2009.165(2):p.363‐369.

5.altschul,s.f.,etal.,gappedblastandpsi‐blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.nucleicacidsresearch,1997.25(17):p.3389‐402.

6.jefferson,r.a.,t.a.kavanagh,andm.w.bevan,gusfusions:beta‐glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.emboj,1987.6(13):p.3901‐7.

7.zhang,x.r.,etal.,agrobacterium‐mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.natureprotocols,2006.1(2):p.641‐646.

8.陳葦?shù)?甘藍(lán)型油菜fad2基因的rna干擾及無(wú)篩選標(biāo)記高油酸含量轉(zhuǎn)基因油菜新種質(zhì)的獲得.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2006(06):p.665‐671。