本發(fā)明屬于分子生物學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及肉制品中羊源性成分含量的鑒定方法，是一種在實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)基礎(chǔ)上利用內(nèi)參基因校正外源種屬特異性基因?qū)ρ蛟葱猿煞诌M(jìn)行定量檢測的方法。

背景技術(shù)：

多源化的肉類品種是人們餐桌文化日趨豐富的重要組成部分，然而隨著市場上牛羊肉價格的不斷大幅上漲，部分不法企業(yè)及商販，為了自身經(jīng)濟(jì)利益的最大化，在高成本的牛肉或羊肉中摻入低廉的其他肉類品種，或通過牛羊油浸泡、作料添加等方式處理后冒充牛羊肉進(jìn)行銷售。

因此，大力提高市場監(jiān)管水平，配合營養(yǎng)標(biāo)簽制度的順利實(shí)施，適時修訂和完善技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)摻假輕重情節(jié)(即摻假量化數(shù)值)針對性地加大處罰及治理力度，穩(wěn)定市場秩序已顯得尤為重要，然而，要想達(dá)到及時有效的市場監(jiān)管效果，快速、精準(zhǔn)、量化的肉類鑒別方法是必不可少的關(guān)鍵技術(shù)手段。

傳統(tǒng)的肉類鑒別方法對熟肉制品的檢測有很大的局限性，如耗時長、操作繁瑣、費(fèi)用昂貴、無法鑒別近緣品種、不能量化樣品中異源動物成分含量等問題。因此，基于時效性和準(zhǔn)確性上的優(yōu)勢，實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)成為檢測動物源性成分最常用的分子生物學(xué)方法。

然而，周彤等指出經(jīng)多次高溫烘焙會對dna造成一定的損傷，所以如果標(biāo)準(zhǔn)品采用未經(jīng)高溫烘焙的肉源品種，待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品dna的斷裂程度相差太大，必然會造成結(jié)果大幅偏低，讓執(zhí)法者造成誤判，因此要想將實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)發(fā)展成為分析動物源性食品摻假量化判定的一種有效方法，引入合適的內(nèi)參基因?qū)θ庠雌贩N的整體dna損傷程度和提取效率進(jìn)行監(jiān)控，校正外源種屬特異性基因百分含量，消除量值結(jié)果的偏差是技術(shù)的關(guān)鍵，由此才可獲得真實(shí)可信的食品摻假數(shù)值，有效提高檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。

雖然在目前的相關(guān)研究以及國家、商檢的檢測標(biāo)準(zhǔn)中并沒有明確的將內(nèi)參基因的職能定義為外源種屬特異性基因量值判定的校正因子，只是將其作為監(jiān)控反應(yīng)正常進(jìn)行與否，防止假陰性結(jié)果出現(xiàn)的定性判定指標(biāo)，但內(nèi)參基因的校正量化運(yùn)用必將成為實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)量化定值判定方法的發(fā)展趨勢。國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)只能進(jìn)行成分定性檢測，無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，即只能檢測肉制品中是否含有其他成分，比例無法確定。

本發(fā)明旨在建立鮮凍畜、禽肉中羊源性成分的定量檢測方法，該方法簡單易行、靈敏、快速、費(fèi)用低、便于推廣，為動物源成分量化摻偽鑒定提供科學(xué)可靠的技術(shù)手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的肉類鑒別方法耗時長、操作繁瑣、不能量化樣品中異源動物成分含量等缺點(diǎn)，公開了一種應(yīng)用內(nèi)參基因快速檢測肉制品中羊源性成分含量的方法。本發(fā)明的羊源性成分含量鑒定方法具有簡單易行、快速靈敏、費(fèi)用低、便于推廣等優(yōu)勢。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

用于鑒定羊源性成分含量的pcr擴(kuò)增引物及探針引物，其特征在于，包括內(nèi)參基因16srdna引物正向序列：5′-gtccatatcgacgagagg-3′，16srdna反向序列：5′-gtaggactttaatcgttgaaca-3′，16srdna探針序列：5′-fam-tttacgacctcgatgttggatcaggaca-tamra-3′；外源種屬特異性基因oa-prlp引物正向序列：5′-caacatgcctttaaaccctcaaa-3′，oa-prlp反向序列：5′-tgtagccttctgactcgctctgt-3′，oa-prlp探針序列：5′-fam-accattgagactggcgg-tamra-3′。

本發(fā)明所述快速檢測羊源性成分含量的方法，該方法以供試樣品基因組dna為模板，應(yīng)用內(nèi)參基因校正外源種屬特異性基因計(jì)算羊源性成分含量，其包括如下步驟：

(1)采用內(nèi)參基因pcr引物及premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液，加入供試樣品模板dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；其中的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20μl，其各種成分分別為：2×premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液10μl，上下游引物各1μl，探針引物0.5μl，模板dna1μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至20μl；

反應(yīng)程序：95℃變性2min；進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃變性15s，60℃退火延伸1min)；在第二階段的退火延伸(60℃)時段收集熒光信號。

(2)構(gòu)建羊源性成分定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)參照物，采取sds-硅膠柱改良方法提取dna梯度稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液中羊源性成分的濃度為50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每個反應(yīng)加入1μldna做模板，每個反應(yīng)分別對應(yīng)50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每個反應(yīng)設(shè)置3個平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液pcr反應(yīng)的ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制16srdna和羊的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)設(shè)定閾值后，熒光定量pcr儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動計(jì)算每個反應(yīng)的ct值和靶標(biāo)濃度，并記錄。將羊源性成分種屬特異性基因的靶標(biāo)濃度除以16srrna內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度，計(jì)算出試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量。

本發(fā)明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為100μmol/l的貯存液，工作濃度為10μmol/l。

本發(fā)明所述的檢測方法，其中模板濃度為50～100ng/μl。

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測定方法，下面對本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以詳細(xì)的說明。

1、原理

根據(jù)牛、羊、豬、雞、鴨等的dna特征序列，篩選種間保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對通用引物和種內(nèi)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)一對種屬特異性引物，通用引物可同時擴(kuò)增牛、羊、豬、雞、鴨等多種動物源性dna，采用taqman實(shí)時熒光pcr技術(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)參照物模板含量與ct值間的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣中種屬特異性基因和內(nèi)參基因的比值，從而對鮮凍畜、禽肉中動物源性成分進(jìn)行定量檢測。

2、引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明依據(jù)牛、羊、豬、雞、鴨等的dna特征序列的種間保守區(qū)域和種內(nèi)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)1對pcr擴(kuò)增內(nèi)參基因和1對外源種屬特異性引物。引物由上海生物工程公司合成。

表1引物序列表如下：

3、反應(yīng)條件

采用內(nèi)參基因pcr引物及premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液，加入供試樣品模板dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；其中的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20μl，其各種成分分別為：2×premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液10μl，上下游引物各1μl，探針引物0.5μl，模板dna1μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至20μl；

反應(yīng)程序：95℃變性2min；進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃變性15s，60℃退火延伸1min)；在第二階段的退火延伸(60℃)時段收集熒光信號。

4、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

構(gòu)建羊源性成分定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)參照物，采取sds-硅膠柱改良方法提取dna梯度稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液中羊源性成分的濃度為50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每個反應(yīng)加入1μldna做模板，每個反應(yīng)分別對應(yīng)50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每個反應(yīng)設(shè)置3個平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液pcr反應(yīng)的ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制16srdna和羊的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

5、計(jì)算試樣中動物源性成分種屬特異性基因含量

將動物源性成分種屬特異性基因的靶標(biāo)濃度和16srdna內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度帶入公式，計(jì)算出試樣中動物源性成分種屬特異性基因百分含量。計(jì)算試樣中動物源性成分種屬特異性基因百分含量的公式：

式中：

c—試樣中動物源性成分種屬特異性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分種屬特異性基因靶標(biāo)濃度；

n16srdna—內(nèi)參基因16srdna濃度。

附圖說明:

圖1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液的擴(kuò)增曲線，繪制的16srrna基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液的擴(kuò)增曲線，繪制的羊種屬特異性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3盲樣s1羊源性成分含量擴(kuò)增結(jié)果圖。

圖4盲樣s2羊源性成分含量擴(kuò)增結(jié)果圖。

圖5盲樣s3羊源性成分含量擴(kuò)增結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，在此需加以說明的是：本發(fā)明所述的引物序列見表1。試樣模板dna的提?。簊ds-硅膠柱改良法提取(見附件)。

實(shí)施例1

(1)試劑：takara公司生產(chǎn)的premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液；上海生工合成的內(nèi)參基因和外源種屬特異性基因擴(kuò)增引物和探針。

(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20μl，其各種成分分別為：2×premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液20μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探針引物0.5μl，模板dna1μl(模板dna濃度50ng/μl)，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至20μl；反應(yīng)程序：95℃變性2min；進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃變性15s，60℃退火延伸1min)；在第二階段的退火延伸(60℃)時段收集熒光信號。

(3)構(gòu)建羊源性成分定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)參照物，采取sds-硅膠柱改良方法提取dna梯度稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液中羊源性成分的濃度為50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每個反應(yīng)加入1μldna做模板，每個反應(yīng)分別對應(yīng)50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每個反應(yīng)設(shè)置3個平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液pcr反應(yīng)的ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制16srdna和羊的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)設(shè)定閾值后，熒光定量pcr儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動計(jì)算每個反應(yīng)的ct值和靶標(biāo)濃度，并記錄。將羊源性成分種屬特異性基因的靶標(biāo)濃度和16srdna內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度帶入公式，計(jì)算出試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量為11.95％，結(jié)果如圖3。計(jì)算試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量的公式：

式中：

c—試樣中動物源性成分種屬特異性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分種屬特異性基因靶標(biāo)濃度；

表2盲樣測試結(jié)果

實(shí)施例2

(1)試劑：takara公司生產(chǎn)的premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液；上海生工合成的內(nèi)參基因和外源種屬特異性基因擴(kuò)增引物和探針。

(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20μl，其各種成分分別為：2×premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液20μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探針引物0.5μl，模板dna1μl(模板dna濃度50ng/μl)，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至20μl；反應(yīng)程序：95℃變性2min；進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃變性15s，60℃退火延伸1min)；在第二階段的退火延伸(60℃)時段收集熒光信號。

(3)構(gòu)建羊源性成分定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)參照物，采取sds-硅膠柱改良方法提取dna梯度稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液中羊源性成分的濃度為50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每個反應(yīng)加入1μldna做模板，每個反應(yīng)分別對應(yīng)50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每個反應(yīng)設(shè)置3個平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液pcr反應(yīng)的ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制16srdna和羊的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)設(shè)定閾值后，熒光定量pcr儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動計(jì)算每個反應(yīng)的ct值和靶標(biāo)濃度，并記錄。將羊源性成分種屬特異性基因的靶標(biāo)濃度和16srdna內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度帶入公式，計(jì)算出試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量為28.56％，結(jié)果如圖4。計(jì)算試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量的公式：

式中：

c—試樣中動物源性成分種屬特異性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分種屬特異性基因靶標(biāo)濃度；

表3盲樣測試結(jié)果

實(shí)施例3

(1)試劑：takara公司生產(chǎn)的premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液；上海生工合成的內(nèi)參基因和外源種屬特異性基因擴(kuò)增引物和探針。

(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20μl，其各種成分分別為：2×premixextaq(probeqpcr)預(yù)混液20μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探針引物0.5μl，模板dna1μl(模板dna濃度50ng/μl)，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至20μl；反應(yīng)程序：95℃變性2min；進(jìn)行45次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃變性15s，60℃退火延伸1min)；在第二階段的退火延伸(60℃)時段收集熒光信號。

(3)構(gòu)建羊源性成分定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)參照物，采取sds-硅膠柱改良方法提取dna梯度稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液中羊源性成分的濃度為50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每個反應(yīng)加入1μldna做模板，每個反應(yīng)分別對應(yīng)50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每個反應(yīng)設(shè)置3個平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna溶液pcr反應(yīng)的ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制16srdna和羊的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)設(shè)定閾值后，熒光定量pcr儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動計(jì)算每個反應(yīng)的ct值和靶標(biāo)濃度，并記錄。將羊源性成分種屬特異性基因的靶標(biāo)濃度和16srdna內(nèi)參基因的靶標(biāo)濃度帶入公式，計(jì)算出試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量為80.92％，結(jié)果如圖5。計(jì)算試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量的公式：

式中：

c—試樣中動物源性成分種屬特異性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分種屬特異性基因靶標(biāo)濃度；

表4盲樣測試結(jié)果

附件：sds-硅膠柱改良法提取肉制品dna

(1)取待測動物肌肉組織樣本清水洗凈后，剔去動物組織中的結(jié)締組織和脂肪，剪成約200mg的小塊，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，然后緩緩的向研缽中加入液氮，迅速研磨，直到樣品成細(xì)微的粉末狀為止，取100mg加入2ml滅菌離心管中；

(2)加入500μlsds裂解液和6μl蛋白酶k，65℃水浴60min，期間不停顛倒混勻；

(3)水浴后13200rpm/min，離心5min；小心地將上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入0.8倍異丙醇；將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱中，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液；

(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，離心30s，棄掉廢液，重復(fù)此步驟一次；

(5)將吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，離心2min，倒掉廢液；將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇；將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間位置懸空滴加100μl的洗脫緩沖液te，室溫放置2-5min，13200rpm/min，離心2min，所得溶液即為dna。