本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

地黃是我國著名的傳統(tǒng)大宗中藥材，為玄參科植物地黃的新鮮或者干燥塊根。生地藥性平和，寒而不酸，補(bǔ)而不燥，既清熱涼血，又滋陰補(bǔ)腎，故為多種方劑配伍的要藥及中成藥的主要原料，據(jù)統(tǒng)計共有80余個中成藥處方中應(yīng)用，如：六味地黃丸、四物合劑、大黃庶蟲丸、更年安片等。近幾年來，對地黃的研究和臨床應(yīng)用更加深入，在方劑中地黃的使用比重明顯增多，且多居主位。除了傳統(tǒng)的臨床應(yīng)用，地黃還有在治療一些現(xiàn)代疑難病癥，如腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、早老性癡呆癥、糖尿病等方面發(fā)揮新的作用。在保健食用方面，研究開發(fā)出含地黃的清涼滋補(bǔ)飲料啤酒、地黃精、地黃茶、鮮地黃淹制的十香地黃菜、地黃罐頭等。另外，地黃歷來是我國出口的大宗藥材，以量大優(yōu)質(zhì)而著稱于世，行銷60多個國家和地區(qū)。

地黃是高度雜交合體，自交不親和，雜交后代嚴(yán)重分離，用種子繁殖不能保持穩(wěn)定的產(chǎn)量和質(zhì)量，生產(chǎn)上主要采用塊根無性繁殖，與其他采用無性繁殖的農(nóng)作物一樣，品種退化問題是一直困擾產(chǎn)區(qū)多年的問題。有資料證實(shí)病毒的感染是導(dǎo)致地黃的退化的主要原因。目前地黃的病毒病原主要有煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus，tmv)和黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)兩種，其中有些產(chǎn)地呈二者復(fù)合感染。由于病毒的系統(tǒng)侵染，使病毒遍布地黃整個植株，在進(jìn)行無性繁殖的前提下，病毒在地黃體內(nèi)世代相傳，越積累越嚴(yán)重。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有抗植物病毒能力強(qiáng)的新型轉(zhuǎn)基因地黃，對于促進(jìn)地黃抗植物病毒育種具有重要的意義，不僅可以減少地黃種質(zhì)的退化、提高地黃的產(chǎn)量，而且可以減少農(nóng)藥的使用，從而降低對環(huán)境的污染、節(jié)約地黃的種植成本，具有較好的環(huán)境效益和社會效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是獲得抗病毒植物。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明所提供的一種培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的方法，可包括向受體植物中導(dǎo)入煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因和黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因，得到抗病毒能力高于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物。

上述方法中，所述煙草花葉病毒殼蛋白是如下a1)或a2)或a3)的蛋白質(zhì)：

a1)氨基酸序列是序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將序列表的序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有煙草花葉病毒殼蛋白功能的蛋白質(zhì)。

上述方法中，所述黃瓜花葉病毒殼蛋白是如下b1)或b2)或b3)的蛋白質(zhì)：

b1)氨基酸序列是序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)；

b2)在序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

b3)將序列表的序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有黃瓜花葉病毒殼蛋白功能的蛋白質(zhì)。

上述方法中，所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因是如下d1)或d2)或d3)所示的dna分子：

d1)核苷酸序列是序列表的序列1所示的dna分子；

d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述煙草花葉病毒殼蛋白的dna分子；

d3)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述煙草花葉病毒殼蛋白的dna分子。

上述方法中，所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因是如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的dna分子：

c1)其編碼序列是序列表的序列3自5’末端第1至657位核苷酸所示的dna分子；

c2)核苷酸序列是序列表的序列3所示的dna分子；

c3)與c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的dna分子；

c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的dna分子。

上述方法中，所述受體植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為玄參科植物。所述玄參科植物可為地黃屬植物。所述地黃屬植物可為地黃(rehmanniaglutinosalibosch.)。所述地黃(rehmanniaglutinosalibosch.)具體可為地黃優(yōu)良品種“85-5”。

上述方法中，所述抗病毒能力可為抗黃瓜花葉病毒能力和/或抗煙草花葉病毒能力。

e1)或e2)或e3)在調(diào)控植物抗病毒能力中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；

e1)煙草花葉病毒殼蛋白和/或黃瓜花葉病毒殼蛋白；

e2)所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因和/或所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基 因；

e3)含有所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體或重組微生物，和/或，含有所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體或重組微生物。

上述應(yīng)用中，所述煙草花葉病毒殼蛋白是如下a1)或a2)或a3)的蛋白質(zhì)：

a1)氨基酸序列是序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將序列表的序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有煙草花葉病毒殼蛋白功能的蛋白質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述黃瓜花葉病毒殼蛋白是如下b1)或b2)或b3)的蛋白質(zhì)：

b1)氨基酸序列是序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)；

b2)在序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

b3)將序列表的序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有黃瓜花葉病毒殼蛋白功能的蛋白質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因是如下d1)或d2)或d3)所示的dna分子：

d1)核苷酸序列是序列表的序列1所示的dna分子；

d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述煙草花葉病毒殼蛋白的dna分子；

d3)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述煙草花葉病毒殼蛋白的dna分子。

上述應(yīng)用中，所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因是如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的dna分子：

c1)其編碼序列是序列表的序列3自5’末端第1至657位核苷酸所示的dna分子；

c2)核苷酸序列是序列表的序列3所示的dna分子；

c3)與c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的dna分子；

c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的dna分子。

上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為玄參科植物。所述玄參科植物可為地黃屬植物。所述地黃屬植物可為地黃(rehmanniaglutinosalibosch.)。所述地黃(rehmanniaglutinosalibosch.)具體可為地黃優(yōu)良品種“85-5”。

上述應(yīng)用中，所述抗病毒能力為抗黃瓜花葉病毒能力和/或抗煙草花葉病毒能力。

所述含有所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因的表達(dá)盒可為表達(dá)盒乙；所述表達(dá)盒乙可包括camv35s啟動子、所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因和nos終止序列。

所述表達(dá)盒乙的核苷酸序列具體可如序列表中序列6所示，序列表中序列6第1至542位為camv35s啟動子的編碼序列，第549至1028位為煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因，第1036至1306位為nos終止序列。

所述含有所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因的表達(dá)盒可為表達(dá)盒甲；所述表達(dá)盒甲可包括camv35s啟動子、所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因和tnos終止序列。

所述表達(dá)盒甲的核苷酸序列具體可如序列表中序列5所示，序列表中序列5的第7至876位為camv35s啟動子的編碼序列，第883至1539位為黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因，第1608至1866位為tnos終止序列。

所述含有所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因的重組載體和/或所述含有所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因的重組載體具體可為將植物雙元表達(dá)載體pcambi3301的ncoi和bsteⅱ酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列1所示的雙鏈dna分子，將hindⅲ和ecori酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列5第7至1866位所示的dna分子，得到的重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm。

所述重組微生物可通過將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到。

所述出發(fā)微生物可為酵母、細(xì)菌、藻類或真菌。所述細(xì)菌可為根癌農(nóng)桿菌。所述根癌農(nóng)桿菌可為根癌農(nóng)桿菌lb4404。

本發(fā)明還提供了一種蛋白質(zhì)。

本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，是如下f1)或f2)或f3)的蛋白質(zhì)：

f1)氨基酸序列是序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)；

f2)在序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

f3)將序列表的序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述蛋白質(zhì)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦耮1)或g2)或g3)或g4)所示的dna分子：

g1)其編碼序列是序列表的序列3自5’末端第1至657位核苷酸所示的dna分子；

g2)核苷酸序列是序列表的序列3所示的dna分子；

g3)與c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；

g4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。

為解決上述問題，本發(fā)明還提供了一種dna分子。

本發(fā)明所提供的dna分子，包括表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙：所述表達(dá)盒甲包括camv35s啟動子、所述黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因和tnos終止序列；所述表達(dá)盒乙包括camv35s啟動子、所述煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因和nos終止序列。

所述表達(dá)盒甲的核苷酸序列如序列表中序列5所示，序列表中序列5的第7至876位為camv35s啟動子的編碼序列，第883至1539位為黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因，第1608至1866位為tnos終止序列。

所述表達(dá)盒乙的核苷酸序列如序列表中序列6所示，序列表中序列6第1至542位為camv35s啟動子的編碼序列，第549至1028位為煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因，第1036至1306位為nos終止序列。

含有所述dna分子的重組質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述含有所述dna分子的重組質(zhì)?？蔀橹亟M質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm。所述重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm可為將植物雙元表達(dá)載體pcambi3301的ncoi和bsteⅱ酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列1所示的雙鏈dna分子，將hindⅲ和ecori酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列5第7至1866位所示的dna分子，得到的重組質(zhì)粒。

上文中，序列表中序列1由480個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；序列表中序列3由713個核苷酸組成，其編碼序列是序列表中序列3的第1至657位核苷酸，編碼序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)。

上文中，所述“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴笨梢杂萌庋刍蛴嬎銠C(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明提供的方法獲得的轉(zhuǎn)基因地黃對黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒均有較好的抗性?？梢姡景l(fā)明提供的方法對促進(jìn)地黃抗植物病毒育種具有重要的意義，不僅可以減少地黃種質(zhì)的退化、提高地黃的產(chǎn)量，而且可以減少農(nóng)藥的使用，從而降低對環(huán)境的污染、節(jié)約地黃的種植成本，具有較好的環(huán)境效益和社會效益。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm的載體構(gòu)建示意圖。

圖2為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的pcr鑒定。

圖3為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的pcr鑒定。

圖4為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的southern雜交檢測。

圖5為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的southern雜交檢測。

圖6為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的rt-pcr檢測。

圖7為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的rt-pcr檢測。

圖8為地黃植株抗病毒效果鑒定。

圖9為地黃植株抗病毒效果鑒定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

本實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，如無特殊說明均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的地黃優(yōu)良品種“85-5”記載在如下文獻(xiàn)中：溫學(xué)森，霍得蘭，楊世林等.地黃優(yōu)良品種“85-5”脫毒苗的快速繁殖研究[j].中草藥，2002，33(5)：452-455.地黃優(yōu)良品種“85-5”在下文中簡稱85-5。

下述實(shí)施例中的黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒均記載在如下文獻(xiàn)中：牛顏冰，雷宵飛，申林炎等.煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒雙價rna沉默抗病載體的快速構(gòu)建[j].中國生物工程雜志，2009，29(1)：76-80.

植物雙元表達(dá)載體pcambia3301為cambia公司產(chǎn)品。

質(zhì)粒pbi121記載在如下文獻(xiàn)中：chenpy，wangck，soongsc，toky.(2003)completesequenceofthebinaryvectorpbi121anditsapplicationincloningt-dnainsertionfromtransgenicplants.journalmol.breed.11，287-293。

yeb液體培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度為：酵母提取物1g/l，牛肉膏5g/l，蛋白胨5g/l，蔗糖5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l；溶劑為蒸餾水；ph7.0。

yeb固體培養(yǎng)基：向yeb液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為20g/l得到的培養(yǎng)基。

無菌苗培養(yǎng)基m0：在1/2ms液體培養(yǎng)基加入瓊脂粉并使其濃度為7g/l，ph5.8。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基m1：含30g/l蔗糖、18g/l甘露醇、1mg/l2，4二氯苯氧乙酸、0.3mg/l激動素、100μm乙酰丁香酮和2.5g/l植物凝膠的ms液體培養(yǎng)基，ph5.8。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基m2：含30g/l蔗糖、18g/l甘露醇、1mg/l2,4二氯苯氧乙酸、0.3mg/l激動素、20mg/l硝酸銀、270mg/l替門汀、5mg/l草銨膦和2.5g/l植物凝膠的ms液體培養(yǎng)基，ph5.8。

芽再生培養(yǎng)基m3：含10g/l葡萄糖、0.25g/l木糖、0.6g/l2-(n-嗎琳)乙烷磺酸、0.1mg/l吲哚乙酸、2mg/l反式玉米素、270mg/l替門汀、5mg/l草銨膦和2.5g/l植物凝膠的ms液體培養(yǎng)基，ph5.8。

生根培養(yǎng)m4：含10g/l蔗糖、0.5mg/l吲哚乙酸、150mg/l替門汀和8g/l瓊脂粉的1/2ms液體培養(yǎng)基，ph5.8。

實(shí)施例1、抗病毒轉(zhuǎn)基因地黃的獲得及抗病毒效果鑒定

一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、人工合成序列表的序列1所示的雙鏈dna分子。以該雙鏈dna分子為模板，以f-tmvx1：5’-cctatgtcttatacaattgcaac-3’(方框部分為限制性內(nèi)切酶ncoi的識別序列)和r-tmvx2：5’-tcgtcaagttgcgggac-3’(方框部分為限制性內(nèi)切酶bsteⅱ的識別序列)為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到n端含有限制性內(nèi)切酶ncoi和c端含有限制性內(nèi)切酶bsteⅱ的雙鏈dna分子；用限制性內(nèi)切酶ncoi和bsteⅱ雙酶切得到的n端含有限制性內(nèi)切酶ncoi和c端含有限制性內(nèi)切酶bsteⅱ的雙鏈dna分子，回收約500bp的片段甲。

2、用限制性內(nèi)切酶ncoi和bsteⅱ雙酶切植物雙元表達(dá)載體pcambi3301，回收約9573bp的載體骨架1。

3、將載體骨架1與步驟1得到的片段甲連接，得到重組質(zhì)粒pcambi3301-tmv。

4、完成步驟3后，用限制性內(nèi)切酶hindⅲ和ecori雙酶切重組質(zhì)粒pcambi3301-tmv，回收約10050bp的載體骨架2。

5、用限制性內(nèi)切酶ecori和hindiii雙酶切質(zhì)粒pbi121，回收約3032bp的片段1。

6、將載體骨架2和片段1連接，得到重組質(zhì)粒pcambi3301-tmv-35s。

7、完成步驟6后，用限制性內(nèi)切酶smai和saci雙酶切重組質(zhì)粒pcambi3301-tmv-35s，回收約11997bp的載體骨架3。

8、人工合成序列表的序列3所示的雙鏈dna分子。以該雙鏈dna分子為模板，以f-cmvx1：5’-ccgatggacaaatctgaat-3’(方框部分為限制性內(nèi)切酶smai的識別序列)和r-cmvx2：5’-cagtgccaactcagctcccgcctcag-3’(方框部分為限制性內(nèi)切酶saci的識別序列)為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到n端含有限制性內(nèi)切酶smai和c端含有限制性內(nèi)切酶saci的雙鏈dna分子；用限制性內(nèi)切酶smai和saci雙酶切得到的n端含有限制性內(nèi)切酶smai和c端含有限制性內(nèi)切酶saci的雙鏈dna分子，回收約730bp的片段乙。

9、將載體骨架3與步驟8得到的片段乙連接，得到重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm。

重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm表達(dá)序列表的序列2所示的煙草花葉病毒殼蛋白和序列表的序列4所示的黃瓜花葉病毒殼蛋白。

載體構(gòu)建示意圖見圖1。經(jīng)酶切鑒定和測序，對重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將植物雙元表達(dá)載體pcambi3301的ncoi和bsteⅱ酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列1所示的雙鏈dna分子，將hindⅲ和ecori酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列5第7至1866位所示的dna分子，得到的重組質(zhì)粒。

重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm中具有兩個表達(dá)盒，第一個表達(dá)盒的核苷酸序列如 序列表序列5所示，第7至876位為camv35s啟動子，第883至1539位為黃瓜花葉病毒殼蛋白的編碼基因，第1608至1866位為tnos終止序列；第二個表達(dá)盒的核苷酸序列如序列表序列6所示，第1至542位為camv35s啟動子，第549至1028位為煙草花葉病毒殼蛋白的編碼基因，第1036至1306位為nos終止序列。

二、重組根癌農(nóng)桿菌的獲得和地黃轉(zhuǎn)基因植株的再生

1、將重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌lb4404，得到重組農(nóng)桿菌。

2、以85-5為實(shí)驗(yàn)材料，將在無菌苗培養(yǎng)基m0上生長10天的地黃無菌苗葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基m2上誘導(dǎo)形成1～2cm的不定芽。

3、完成步驟2后，將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化步驟2得到的不定芽，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基m1上培養(yǎng)兩天后，依次轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基m2、芽再生培養(yǎng)基m3和生根培養(yǎng)基m4，將生根后的地黃幼苗轉(zhuǎn)移到溫室得到地黃轉(zhuǎn)基因植株。

4、分別提取步驟3中地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna，并以該基因組dna為模板，采用引物對1或引物對2進(jìn)行pcr擴(kuò)增；用等體積水代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片dna，作為空白對照；用85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna，作為陰性對照；用重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna，作為陽性對照。引物對1由f1：5’-atgtcttatacaattgcaactccatccca-3’和r1：5’-tcaagttgcgggaccagaagtccag-3’組成，引物對1的靶基因如序列表中的序列1所示。引物對2由f2：5’-atggacaaatctgaatcaac-3’和r2：5’-tgccaactcagctcccgcctcag-3’，引物對2的靶基因如序列表中的序列3所示。

引物對1的pcr擴(kuò)增結(jié)果見圖2(泳道m(xù)為dnamarker，泳道1為空白對照，泳道2為陰性對照，泳道3-5為轉(zhuǎn)基因地黃，泳道6為陽性對照，其中箭頭標(biāo)注目的條帶)。引物對2的pcr擴(kuò)增結(jié)果見圖3(泳道m(xù)為dnamarker，泳道1為空白對照，泳道2為陰性對照，泳道3-5為轉(zhuǎn)基因地黃，泳道6為陽性對照，其中箭頭標(biāo)注目的條帶)。如果采用引物對1擴(kuò)增得到480bp的條帶且采用引物對2擴(kuò)增得到713bp的條帶，則該地黃轉(zhuǎn)基因植株鑒定為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株。

5、提取步驟4中鑒定的地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的基因組dna，以序列表的序列1所示的探針序列或序列表的序列3所示探針序列進(jìn)行southern雜交。

以序列表的序列1所示的探針序列進(jìn)行southern雜交的結(jié)果見圖4(泳道1為重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陽性對照，泳道2-4為轉(zhuǎn)基因地黃，泳道5為以地黃品種85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陰性對照，其中箭頭標(biāo)注目的條 帶)。以序列表的序列3所示的探針序列進(jìn)行southern雜交的結(jié)果見圖5(泳道1為重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陽性對照，泳道2-4為轉(zhuǎn)基因地黃，泳道5為以地黃品種85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陰性對照，其中箭頭標(biāo)注目的條帶)。如果用序列表的序列1所示的探針序列或序列表的序列3所示探針序列均能進(jìn)行southern雜交，則該地黃轉(zhuǎn)基因植株鑒定為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株。

6、提取步驟5中鑒定的地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，采用步驟4中的引物對1或引物對2進(jìn)行rt-pcr。

引物對1的rt-pcr結(jié)果見圖6(泳道m(xù)為dnamarker，泳道1為用等體積水代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片dna，作為空白對照；泳道2為以85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陰性對照；泳道3-5為轉(zhuǎn)基因地黃，泳道6為以85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陰性對照)。引物對2的rt-pcr結(jié)果見圖7(泳道m(xù)為dnamarker，泳道1為用等體積水代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片dna，作為空白對照；泳道2為以85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陰性對照；泳道3-5為轉(zhuǎn)基因地黃，泳道6為以85-5未轉(zhuǎn)基因的幼嫩葉片基因組dna代替地黃轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片基因組dna作為陰性對照)。如果采用引物對1擴(kuò)增得到480bp的條帶且采用引物對2擴(kuò)增得到713bp的條帶，則該地黃轉(zhuǎn)基因植株鑒定為地黃轉(zhuǎn)基因陽性植株。

步驟6中鑒定為陽性的植株即為地黃轉(zhuǎn)基因植株。

采用塊莖無性繁殖的方法繁殖地黃轉(zhuǎn)基因植株，由一個塊莖擴(kuò)繁得到的植株作為一個株系，將其中兩個株系命名為lba-1和lba-2。

三、對照根癌農(nóng)桿菌的獲得和地黃轉(zhuǎn)空載體植株的再生

用植物雙元表達(dá)載體pcambi3301代替重組質(zhì)粒pcambi3301-tm35scm，其它同步驟二，得到對照根癌農(nóng)桿菌(命名為lb4404-pcambi3301農(nóng)桿菌)和地黃轉(zhuǎn)空載體植株。

四、待測病毒的接種

1、用待測病毒(煙草花葉病毒或黃瓜花葉病毒)浸染生長至15天的地黃植株(lba-1、lba-2、地黃轉(zhuǎn)空載體植株或85-5未轉(zhuǎn)基因植株)葉片，觀察侵染不同時間后地黃植株的發(fā)病率及發(fā)病癥狀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次每個株系重復(fù)20株。將lba-1的20株地黃植株依次命名為lba-1-1至lba-1-20，lba-2的20株地黃植株依次命名為lba-2-1至lba-2-20)。具體步驟如下：

(1)用ph7.0、0.01mol/l磷酸緩沖液懸浮待測病毒，得到病毒濃度為 1*10¹⁰pfu/ml的病毒懸液。

(2)當(dāng)?shù)攸S植株的幼苗長至2～3片真葉時，葉面撒布一薄層600目的金鋼砂，以金鋼砂摩擦方式進(jìn)行接種，摩擦過程中加入病毒懸液，然后取蒸餾水裝至噴槍內(nèi)距葉片表面2～3cm清洗。接種2次，間隔2～3天。然后置于室溫20～28℃、自然光照的溫室內(nèi)培養(yǎng)。

(3)完成步驟(2)10天后，觀察地黃整個植株的表型，依據(jù)中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)煙草病害分級及調(diào)查方法(yc/t39-1996)的分級標(biāo)準(zhǔn)判斷地黃植株的抗病毒效果。

對照組1：當(dāng)85-5未轉(zhuǎn)基因植株的幼苗長至2～3片真葉時，葉面撒布一薄層600目的金鋼砂，以金鋼砂摩擦方式進(jìn)行接種，摩擦過程中加入蒸餾水，然后取蒸餾水裝至噴槍內(nèi)距葉片表面2～3cm清洗。接種2次，間隔2～3天。然后置于室溫20～28℃、自然光照的溫室內(nèi)培養(yǎng)。接種10天后，觀察地黃整個植株的表型，依據(jù)中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)煙草病害分級及調(diào)查方法(yc/t39-1996)的分級標(biāo)準(zhǔn)判斷地黃植株的抗病毒效果。將對照組1的20株地黃植株依次命名為對照-1至對照-20。

對照組2：按照對照組1的方法，除將摩擦過程中加入蒸餾水替換為摩擦過程中加入ph7.0、0.01mol/l磷酸緩沖液，其它步驟均相同。將85-5未轉(zhuǎn)基因植株的20株地黃植株依次命名為85-5-1至85-5-20。

五、地黃植株抗病毒效果鑒定

地黃植株抗病毒的效果鑒定根據(jù)中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)煙草病害分級及調(diào)查方法(yc/t39-1996)的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。所述分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：全株無病；1級：葉脈輕微花葉或上部分三分之一葉片花葉(不含三分之一)但不變形，植株無明顯矮化；2級：三分之一至二分之一葉片花葉(含三分之一，不含二分之一)、少數(shù)葉片變形、主脈變黑或植株矮化為正常株高的三分之二以上(含三分之二)；3級：二分之一至三分之二葉片花葉(含二分之一，不含三分之二)、主側(cè)脈壞死或植株矮化為正常株高的三分之二至二分之一(不含二分之一，不含三分之二)；4級：全株葉片花葉、嚴(yán)重變形、壞死或病株矮化為正常植株高度的二分之一以上(含二分之一)至三分之一(含三分之一)。

發(fā)病率的計算公式為：發(fā)病率％＝(植物總病株數(shù)/調(diào)查植物總株數(shù))×100％。

病情指數(shù)的計算公式為：病情指數(shù)＝100×∑(各級病株數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)。

對步驟四中的各組幼苗進(jìn)行病害發(fā)生情況調(diào)查并統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、圖8和圖9。結(jié)果表明，在病毒接種10天后，地黃轉(zhuǎn)基因植株(lba-1和lba-2)和85-5未轉(zhuǎn)基因植株相比具有顯著差異：煙草花葉病毒接種10天后，lba-1-4為三級 病害，lba-2-1和lba-2-4為無病害，85-5未轉(zhuǎn)基因植株和地黃轉(zhuǎn)空載體植株均為四級病害；黃瓜花葉病毒接種10天后，lba-1-4為三級病害，lba-2-1和lba-2-4為無病害，85-5未轉(zhuǎn)基因植株和地黃轉(zhuǎn)空載體植株均為四級病害。結(jié)果表明，lba-2-1和lba-2-4均為具有抗煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的效果的轉(zhuǎn)基因地黃植株。

表1、煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒分別接種地黃植株的發(fā)病率及病情指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果