本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及乙酰化酶基因osgcn5在調(diào)控水稻抗旱和根的發(fā)育中的應(yīng)用。乙酰轉(zhuǎn)移酶基因osgcn5屬于水稻gnat亞家族蛋白基因，申請(qǐng)人通過(guò)體外酶活的方法鑒定了該基因的酶活特性，利用轉(zhuǎn)基因的方法對(duì)該基因在水稻抗旱中的功能(包括對(duì)水稻抗旱反應(yīng)的調(diào)節(jié)和與干旱相關(guān)的根發(fā)育調(diào)控)進(jìn)行了分析，并提出其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上潛在的應(yīng)用價(jià)值。

背景技術(shù)：

表觀遺傳學(xué)是上世紀(jì)末逐漸興起的一門(mén)學(xué)科，是研究與經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳學(xué)法則不相符合的生命現(xiàn)象中逐漸發(fā)展起來(lái)的。表觀遺傳學(xué)是指不依賴于dna改變的可遺傳的變異(bonasioetal.,selectiverecognitionofmethylatedlysine9onhistoneh3bythehplchromodomain.nature,2001,410:120-124)。它的物質(zhì)基礎(chǔ)是dna纏繞著核小體八聚體形成的染色體空間結(jié)構(gòu)，核小體八聚體分別為兩個(gè)拷貝的組蛋白h3、h4、h2a和h2b組成，其中h3和h4蛋白的n端賴氨酸殘基上可以進(jìn)行多種甲基化和乙?；刃揎?bhaumiketal.,covalentmodificationsofhistonesduringdevelopmentanddiseasepathogenesis,2007.natstructmolbiol,14(11):1008-1016)，賴氨酸乙?；揎椏梢运沙诤诵◇w對(duì)dna的纏繞作用，進(jìn)而有利于促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄(zupkovitzetal.,negativeandpositiveregulationofgeneexpressionbymousehistonedeacetylase1.molcellbiol,2006,26(21):7913-7928.verdoneetal.,roleofhistoneacetylationinthecontrolofgeneexpression.biochemcellbiol,2005,83(3):344-353)。迄今為止，各種各樣帶有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中包括gcn5、p/caf、esa1、cbp/p300和rtt109。其中g(shù)cn5蛋白屬于gnat亞家族(gcn5相關(guān)的n端乙酰轉(zhuǎn)移酶亞家族)，是一類廣譜的乙?；?，可以乙?；痟3k9、h3k14、h3k27等多個(gè)位點(diǎn)(patricketal.,expandedlysineacetylationspecificityofgcn5innativecomplexes.thejournalofbiologicalchemistry,1999,274:5895-5900)。在后續(xù)的研究過(guò)程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；覆粌H可以修飾組蛋白也可以修飾非組蛋白，例如酵母中發(fā)現(xiàn)gcn5可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ifh1的乙?；竭M(jìn)而調(diào)控其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控(downeyetal.,gcn5andsirtuinsregulateacetylationoftheribosomalproteintranscriptionfactorifh1.currentbiology,2013,23:1638-1648)。這說(shuō)明gcn5具有除組蛋白外的更廣泛的乙酰化活性功能。除此之外，gcn5還參與了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，其乙酰化作用可以松弛轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)dna和核小體的纏繞作用，使rnapolⅱ復(fù)合物(rna聚合酶復(fù)合物)更容易結(jié)合在dna上從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄(featherstone,coactivatorsintranscriptioninitiation:hereareyourorders.curropingenetdev.2002,12(2):149-155)。目前為止，人們對(duì)于擬南芥中g(shù)cn5基因的生物學(xué)功能已經(jīng)進(jìn)行了廣泛地研究。gcn5突變體植株地下地上部分的生長(zhǎng)均變?nèi)?，花器官發(fā)育異常(vlachonasiosetal.,disruptionmutationsofada2bandgcn5transcriptionaladaptorgenesdramaticallyaffectarabidopsisgrowth,development,andgeneexpression.plantcell,2003,15:626-638)。同年bertrandetal.(bertrandetal.,arabidopsishistoneacetyltransferaseatgcn5regulatesthefloralmeristemactivitythroughthewuschel/agamouspathway.thejounalofbiologicalchemistry,2003,278:28246-28251)的研究結(jié)果進(jìn)一步表明atgcn5可以通過(guò)wuschel/agamous途徑調(diào)控花器官的發(fā)育。atgcn5通過(guò)plt途徑調(diào)控?cái)M南芥根干細(xì)胞的多少，從而影響根發(fā)育(kornetetal.,membersofthegcn5histoneacetyltransferasecomplexregulateplethora-mediatedrootstemcellnichemaintenanceandtransitamplifyingcellproliferationinarabidopsis.plantcell,2009,21(4):1070-1079)。atgcn5還可以和開(kāi)花途徑中的hd1、taf1/haf2相互作用影響擬南芥光應(yīng)答基因的表達(dá)(benhamedetal.,arabidopsisgcn5,hd1,andtaf1/haf2interacttoregulatehistoneacetylationrequiredforlight-responsivegeneexpression.plantcell,2006,18:2893-2903)。所有這些結(jié)果都表明gcn5參與了擬南芥各個(gè)發(fā)育時(shí)期和環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程中，具有非常廣泛的生物學(xué)功能。

水稻(oryzasatival.)作為人類主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量不僅與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)而且與在發(fā)育過(guò)程中應(yīng)對(duì)各種逆境的能力相關(guān)。逆境分為生物逆境和非生物逆境，其中非生物逆境包括如干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等。其中干旱是威脅水稻產(chǎn)量的主要因素之一。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中水稻進(jìn)化出了一套自己的干旱應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制，其中包括由信號(hào)分子介導(dǎo)的干旱信號(hào)傳導(dǎo)、逆境相關(guān)基因的激活和各種功能蛋白合成等。其中已經(jīng)鑒定到的參加干旱反應(yīng)的蛋白主要包括：分子伴侶、滲透壓調(diào)節(jié)蛋白(tamuraetal.,osmoticstresstoleranceoftransgenictobaccoexpressingageneencodingamembrane-locatedreceptor-likeproteinfromtobaccoplants.plantphysiol,2003,131:454-462)、離子通道(wardetal.,calcium-activatedk+channelsandcalcium-inducedcalciumreleasebyslowvacuolarionchannelsinguardcellvacuolesimplicatedinthecontrolofstomatalclosure.plantcell,1994,6:669-683)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(kleinetal.,disruptionofatmrp4,aguardcellplasmamembraneabcc-typeabctransporter,leadstoderegulationofstomatalopeningandincreaseddroughtsusceptibility.plantjournal,2004,39:219-236)和抗氧化或細(xì)胞解毒蛋白(bartelsetal.,targetingdetoxificationpathways:anefficientapproachtoobtainplantswithmultiplestresstolerance.trendsplantsci,2001,6:284-286)。在水稻遭受逆境脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)而對(duì)細(xì)胞機(jī)能造成負(fù)面影響，ros清除蛋白在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其中過(guò)氧化物酶(prx)和谷胱甘肽s基轉(zhuǎn)移酶(gstu)是參與這個(gè)過(guò)程的重要酶類(rezaeietal.,glutathiones-transferase(gst)familyinbarley:identificationofmembers,enzymeactivity,andgeneexpressionpattern.jplantphysiol,2013,170(14):1277-1284.shankeretal.,droughtstressresponsesincrops.functintegrgenomics,2014,14(1):11-22)。而這些下游基因的應(yīng)答反應(yīng)絕大部分是受到特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。其中bzip是一類由基本氨基酸構(gòu)成核心區(qū)域毗鄰一個(gè)亮氨酸拉鏈的而構(gòu)成的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，它通過(guò)識(shí)別aba應(yīng)答原件參與到了aba介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中。據(jù)報(bào)道，水稻中osbzip46參與了水稻的抗旱反應(yīng)，超表達(dá)該基因水稻表現(xiàn)出干旱敏感的表型(tangetal.,constitutiveactivationoftranscriptionfactorosbzip46improvesdroughttoleranceinrice.plantphysiology,2012,158:1755-1768)。同時(shí)osbzip23同時(shí)參與了水稻的抗鹽和抗旱反應(yīng)(xiangetal.,characterizationofosbzip23asakeyplayerofthebasicleucinezippertranscriptionfactorfamilyforconferringabscisicacidsensitivityandsalinityanddroughttoleranceinrice.plantphysiology,2008,148:1938-1952)。abi是另外一類受aba誘導(dǎo)并參與逆境應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族。

表觀修飾作為一種新型的基因調(diào)控機(jī)制，也參與到了逆境應(yīng)答反應(yīng)當(dāng)中，擬南芥已經(jīng)報(bào)道多種與表觀相關(guān)的酶參與植物的逆境反應(yīng)。ros1作為一種全新的dna去甲基化酶是在刷選調(diào)控激活rd29a啟動(dòng)子(一個(gè)擬南芥逆境應(yīng)答基因的啟動(dòng)子)的實(shí)驗(yàn)中被刷選出來(lái)的，即ros1可以去除rd29a基因啟動(dòng)子上面的dna甲基化進(jìn)而促進(jìn)下游該基因的表達(dá)，ros1突變體表現(xiàn)出對(duì)雙氧水的敏感效應(yīng)(gongetal.,ros1,arepressoroftranscriptionalgenesilencinginarabidopsis,encodesadnaglycosylase/lyase.cell,2002,111(6):803-814)。hda9作為一個(gè)組蛋白去乙?；竻⑴c了擬南芥鹽脅迫和旱脅迫中基因沉默效應(yīng)(zhengetal.,histonedeacetylasehda9negativelyregulatessaltanddroughtstressresponsivenessinarabidopsis.jexpbot,2016)。擬南芥中的gcn5復(fù)合物和冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子cbf1互作，同時(shí)根據(jù)vlachonasiosetal.(vlachonasiosetal.,disruptionmutationsofada2bandgcn5transcriptionaladaptorgenesdramaticallyaffectarabidopsisgrowth,development,andgeneexpression.plantcell,2003,15:626-638)的研究表明gcn5和ada2b的突變體中cor基因在冷誘導(dǎo)過(guò)程中上調(diào)表達(dá)相較于野生型要慢。這些結(jié)果說(shuō)明了gcn5可能直接參與調(diào)控了冷應(yīng)答基因的表達(dá)。

作為糧食作物和對(duì)干旱特別敏感的水稻中，表觀修飾特別是乙酰化修飾是如何參與到干旱響應(yīng)過(guò)程中的目前報(bào)道還很少。我們利用水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)篩選到了與擬南芥atgcn5同源的基因，命名為osgcn5，并利用該數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的信息在水稻的cdna中擴(kuò)增到了該基因的全長(zhǎng)序列。構(gòu)建酵母表達(dá)載體表達(dá)了該基因的全長(zhǎng)蛋白，體外酶活顯示該蛋白是一個(gè)廣譜的乙?；富?，利用轉(zhuǎn)基因的方法我們獲得了該基因的抑制表達(dá)材料，并發(fā)現(xiàn)該基因抑制表達(dá)后降低了水稻的抗旱能力，失水率相較于野生型有所提高。rt-pcr的結(jié)果顯示該基因的下降會(huì)影響部分逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)抑制表達(dá)材料的形態(tài)學(xué)進(jìn)一步觀察后發(fā)現(xiàn)其冠根的數(shù)目顯著下降。以上結(jié)果表明osgcn5可以同時(shí)通過(guò)調(diào)控逆境響應(yīng)基因的表達(dá)和水稻根的發(fā)育來(lái)影響水稻的抗旱反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種乙?；富騩sgcn5在調(diào)控水稻抗旱和根發(fā)育中的應(yīng)用，即鑒定一個(gè)參與水稻抗旱反應(yīng)和根(例如冠根)發(fā)育的廣譜乙?；富騩sgcn5并分析了其在水稻生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值。osgcn5基因是一個(gè)廣譜乙?；富颍诟鱾€(gè)組織中均有表達(dá)，抑制該基因的表達(dá)后植株表現(xiàn)出對(duì)干旱敏感和冠根(crownroot，cr)數(shù)目變少的表型；分子生物學(xué)的結(jié)果表明該基因參與調(diào)控了部分抗旱基因的表達(dá)。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

從水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)篩選與擬南芥atgcn5同源的水稻基因(利用蛋白質(zhì)序列同源比對(duì))，我們將該個(gè)基因命名為osgcn5，其核苷酸序列為seqidno：1所示，序列長(zhǎng)度為1536bp；其中序列的1-1536位也是其編碼區(qū)(即cds)，共編碼511個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)序列如seqidno：2所示。

擴(kuò)增了該蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(乙?；δ芙Y(jié)構(gòu)域和bromodomain結(jié)構(gòu)域)之間的一段非保守的區(qū)域，連接到抑制特異基因表達(dá)的載體pds1301(圖1)上，然后轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11，得到轉(zhuǎn)基因水稻抑制材料，提取轉(zhuǎn)基因家系mrna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna后檢測(cè)osgcn5在各個(gè)家系中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)7個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中osgcn5的表達(dá)量被明顯抑制了(圖2)。利用水稻葉片cdna擴(kuò)增獲得osgcn5的全長(zhǎng)cdna，并將其克隆到pgex6p-1的載體上(圖3)，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋白原核表達(dá)菌株，用iptg誘導(dǎo)表達(dá)osgcn5-gst的融合蛋白。并利用gstbeads純化，獲得純化后的gst蛋白和osgcn5-gst的融合蛋白(圖3)。利用體外酶活體系將osgcn5-gst融合蛋白和組蛋白h3或h4進(jìn)行孵育反應(yīng)，并利用westernblot技術(shù)用各種乙?；贵w進(jìn)行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)osgcn5可以直接乙?；痟3的k9、k27、k4、k14和h4的k5等位點(diǎn)(圖4)，進(jìn)一步證明了osgcn5是一個(gè)廣譜乙?；?。同時(shí)用水稻不同時(shí)期組織材料的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)qrt-pcr的方法檢測(cè)osgcn5基因表達(dá)的組織特異性，結(jié)果表明osgcn5在各個(gè)組織中均有表達(dá)(圖5)。將獲得的osgcn5rnai家系和對(duì)照野生型中花11進(jìn)行小紅桶干旱處理(植株生長(zhǎng)到一個(gè)月時(shí)狀態(tài)一致時(shí)處理)，發(fā)現(xiàn)osgcn5rnai家系表現(xiàn)出干旱敏感的表型(圖6a)，通過(guò)失水率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)osgcn5rnai家系失水速率更快(圖6b)。同時(shí)取干旱處理7天的葉片，抽提mrna并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用qrt-pcr的方法檢測(cè)逆境應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分逆境應(yīng)答基因在osgcn5rnai家系中表達(dá)量明顯地下降了(圖7)。研究表明根在植物抗旱反應(yīng)起到了非常重要的作用(janiaketal.,geneexpressionregulationinrootsunderdrought.2015,jexpbot,67(4):1003-1014)，于是我們對(duì)osgcn5rnai各家系和野生型中花11材料中根的表型進(jìn)行了進(jìn)一步觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)osgcn5表達(dá)量被抑制后，轉(zhuǎn)基因植株冠根的數(shù)目和根長(zhǎng)均顯著地減少(圖8)。以上結(jié)果說(shuō)明osgcn5基因可能同時(shí)通過(guò)影響水稻根的數(shù)目和逆境相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)參與水稻的抗旱反應(yīng)。

可以歸納的本發(fā)明的發(fā)明要點(diǎn)如下：

1、廣譜乙?；富騩sgcn5在調(diào)控水稻抗旱反應(yīng)中的應(yīng)用，該基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

2、osgcn5基因的應(yīng)用方式為：其編碼的蛋白質(zhì)中的乙?；该富钔ㄟ^(guò)正調(diào)控下游基因的表達(dá)，在水稻葉片抗旱逆境響應(yīng)過(guò)程中正向調(diào)控了部分逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)水稻的抗旱反應(yīng)。

3、廣譜乙?；富騩sgcn5在調(diào)控水稻根發(fā)育過(guò)程中的應(yīng)用，該基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)為一個(gè)廣譜乙酰化酶，通過(guò)正向調(diào)控水稻根的發(fā)育。

4、所述的正向調(diào)控水稻根的發(fā)育包括水稻冠根數(shù)目和根長(zhǎng)度調(diào)控的應(yīng)用。

本發(fā)明的具體操作步驟如下：

(1)通過(guò)在ricegenome網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)查找與擬南芥atgcn5基因同源的水稻的osgcn5基因(loc_os10g28040)。根據(jù)網(wǎng)站公布的序列設(shè)計(jì)相關(guān)載體的引物，以水稻葉片cdna為模板，擴(kuò)增其全長(zhǎng)cdna序列(翻譯起始位點(diǎn)至下游1536個(gè)堿基)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)我們擴(kuò)增到的cdna序列與上述網(wǎng)站公布cdna序列完全一致，如seqidno:1所示。擴(kuò)增所用引物序列如下：

osgcn5-f:5’-ggggtaccatggacgggctcgcggcgcc-3’,

osgcn5-r:5’-cgggatcctcagttcttcgttgaggcttgggc-3’

(2)根據(jù)osgcn5基因序列信息，利用smart網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其蛋白質(zhì)序列(seqidno:2)，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列存在兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別為乙?；δ芙Y(jié)構(gòu)域(211位氨基酸到287位氨基酸)和bromodomain結(jié)構(gòu)域(396位氨基酸到505位氨基酸)，在兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域中間的序列是該基因的特異序列，據(jù)此我們?cè)O(shè)計(jì)雙鏈抑制引物(dsrnai引物)，并利用步驟1)中的全長(zhǎng)cdna為模板，通過(guò)pcr擴(kuò)增得到雙鏈抑制區(qū)段特異的dna，擴(kuò)增序列如seqidno:3所示，擴(kuò)增所用的引物序列如下：

osgcn5-rnai-f:5’-gggactagtggtaccggacaaagaaagatggcaagg-3’，

osgcn5-rnai-r:5’-ggggagctcggatccgttgcctgtaagtactgtaatcagg-3’

(3)將步驟2)中擴(kuò)增得到的片段用限制性內(nèi)切酶酶切并連接載體的方法將雙鏈抑制區(qū)段dna構(gòu)建到載體pds1301上，獲得轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301。利用農(nóng)桿菌(eha105)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法(hieiet.al.,1994.efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantjournal.6:271-282)將所述的轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301導(dǎo)入水稻受體品種中花11，獲得轉(zhuǎn)化植株osgcn5-rnai(將轉(zhuǎn)化植株依次命名為osgcn5-rnai-n，n＝0，1，2，3……)。

(4)抽提轉(zhuǎn)基因各個(gè)家系的基因組dna并利用pcr方法檢測(cè)陽(yáng)性植株；然后抽提陽(yáng)性植株的mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr的方法檢測(cè)各個(gè)家系中osgcn5基因的表達(dá)量，獲得osgcn5被抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。

(5)以步驟(1)中涉及的osgcn5基因的全長(zhǎng)cdna為模板擴(kuò)增osgcn5的全長(zhǎng)dna并構(gòu)建到pgex-6p載體上(gehealthcarelifescience)，獲得osgcn5-pgex-6p載體，電轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株bl21并表達(dá)osgcn5-gst融合蛋白。利用gstbeads(glutathionesepharose4fastflow,gehealthcare,17-5132-01)純化回收表達(dá)的蛋白質(zhì)(包括gst蛋白和osgcn5-gst融合蛋白)，sds-page蛋白膠跑膠檢測(cè)。構(gòu)建該載體所用的擴(kuò)增引物序列如下：

osgcn5-6p-f:5’-ggatccatggacgggctcgcggc-3’，

osgcn5-6p-r:5’-gtcgacctcagttcttcgttgaggcttgg-3’

(6)利用步驟(5)中純化回收的osgcn5-gst融合蛋白和組蛋白h3或h4進(jìn)行孵育反應(yīng)(gst蛋白為對(duì)照)，利用westernblot技術(shù)檢測(cè)反應(yīng)后的組蛋白上的各種乙酰化修飾。

(7)抽提水稻各個(gè)組織部位的rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr檢測(cè)osgcn5在各個(gè)組織中的表達(dá)量。

(8)將osgcn5各抑制家系和野生型對(duì)照中花11種植在小紅桶中，生長(zhǎng)到一個(gè)月時(shí)進(jìn)行干旱處理，并觀察表型。干旱處理7天后，取osgcn5抑制家系和野生型的葉片，抽提mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr檢測(cè)逆境應(yīng)答相關(guān)基因在兩種材料中的表達(dá)量。

(9)在含有生根培養(yǎng)基的方皿上發(fā)芽osgcn5各抑制家系和野生型對(duì)照中花11，觀察其根部表型并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

水稻是人類的主要糧食作物之一，對(duì)保障糧食安全起到了非常重要的作用。如何提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)是一項(xiàng)重要的科學(xué)問(wèn)題。然而相對(duì)缺乏的淡水資源往往嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量，隨著我國(guó)人口持續(xù)增長(zhǎng)，水資源緊缺將成為現(xiàn)階段糧食安全的瓶頸。而解決這一問(wèn)題的一個(gè)重要途徑就是改良水稻的抗旱性(都浩，水稻中激素和肌醇磷酸代謝相關(guān)基因的抗逆功能研究，2013，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文)。水稻在抗旱方面的機(jī)制研究已經(jīng)比較多，但乙?；附閷?dǎo)的組蛋白乙酰化是如何參與水稻的抗旱反應(yīng)的還不是很清楚。本發(fā)明中所涉及到的廣譜乙酰化酶基因osgcn5，發(fā)現(xiàn)其在水稻的逆境應(yīng)答中起到了非常重要的作用。本發(fā)明通過(guò)體外酶活實(shí)驗(yàn)證明osgcn5是一個(gè)廣譜乙酰化酶(圖3、圖4)。遺傳轉(zhuǎn)化該基因雙鏈抑制rnai載體，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。干旱逆境處理發(fā)現(xiàn)，抑制該基因的表達(dá)后水稻的抗旱性明顯減弱，熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)部分抗旱基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中受到了影響(圖7)，說(shuō)明gcn5蛋白影響了部分抗旱基因的表達(dá)。同時(shí)通過(guò)發(fā)芽表型觀察發(fā)現(xiàn)osgcn5抑制材料冠根數(shù)目變少(圖8)。以上結(jié)果說(shuō)明gcn5蛋白可能同時(shí)通過(guò)影響水稻根的數(shù)目和逆境基因的表達(dá)來(lái)影響水稻的抗旱反應(yīng)。

對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述參見(jiàn)《具體實(shí)施方式》內(nèi)容。

附圖說(shuō)明

序列表seqidno:1是本發(fā)明克隆的廣譜乙酰化酶基因osgcn5的核苷酸序列。序列長(zhǎng)度為1536bp(含結(jié)尾處的終止密碼子tga)，編碼511個(gè)氨基酸。

序列表seqidno:2是廣譜乙?；富騩sgcn5的蛋白質(zhì)序列。

序列表seqidno:3是本發(fā)明構(gòu)建的的雙鏈抑制rnai載體(或稱之為轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301)的核苷酸序列。序列長(zhǎng)度為329bp。

圖1：是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化載體osgcn5-rnai(或稱之為轉(zhuǎn)化載體osgcn5-pds1301)構(gòu)建示意圖。其中上圖為該轉(zhuǎn)基因植株所用抑制表達(dá)載體pds1301的結(jié)構(gòu)示意圖，下圖為該基因被抑制的特異片段位置示意圖(抑制區(qū)段位置：876-1204bp，黃色方框標(biāo)注)。

圖2：轉(zhuǎn)基因植株osgcn5-rnai陽(yáng)性家系中osgcn5表達(dá)量檢測(cè)?？v坐標(biāo)為相對(duì)于actin(水稻內(nèi)的一個(gè)表達(dá)量非常穩(wěn)定的激動(dòng)蛋白基因，登錄號(hào)為loc_os11g06390)的相對(duì)表達(dá)量值。

圖3：osgcn5-gst融合蛋白表達(dá)。圖3a是本發(fā)明所用的表達(dá)載體pgex-6p的圖譜。圖3b左邊為大腸桿菌表達(dá)osgcn5-gst融合蛋白sds-page蛋白膠檢測(cè)圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明：從左至右泳道分別為誘導(dǎo)表達(dá)0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)大腸桿菌取樣樣品和超聲波處理后沉淀和上清樣品，“*”指示融合蛋白表達(dá)出來(lái)的位置。圖3b右邊為gstbeads(glutathionesepharose4fastflow,gehealthcare,17-5132-01)純化回收表達(dá)的蛋白質(zhì)sds-page蛋白膠檢測(cè)圖。

圖4：osgcn5體外酶活試驗(yàn)結(jié)果。用westernblot檢測(cè)和osgcn5-gst融合蛋白孵育后的組蛋白h3和h4多種乙?；揎棤顟B(tài)，gst蛋白孵育作為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)兩次。

圖5：osgcn5基因在根(發(fā)芽10天苗)、幼莖(正在伸長(zhǎng)莖桿)、幼苗(發(fā)芽5天)、幼穗(0.2cm-1cm)、葉片(2個(gè)月水稻成熟葉)中mrna水平表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果。附圖標(biāo)記說(shuō)明：縱坐標(biāo)為相對(duì)于actin的表達(dá)量。

圖6：osgcn5-rnai材料和野生型材料干旱處理及干旱應(yīng)答基因檢測(cè)。圖6a為小紅桶干旱處理試驗(yàn)，分別為處理前和干旱處理14天后復(fù)水一個(gè)星期表型。圖6b為各材料失水速率調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖7：osgcn5-rnai材料和野生型材料干旱處理7天葉片中干旱應(yīng)答基因在osgcn5-rnai材料和野生型中相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。

圖8：osgcn5-rnai材料和野生型材料初生根(pr)，冠根(cr)和地上部分的形態(tài)學(xué)差異。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖8中的左圖為形態(tài)學(xué)觀察照片，圖8中的右圖為試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：osgcn5基因的克隆

本發(fā)明的基因osgcn5的克隆(登陸號(hào)loc_os10g28040)主要通過(guò)rt-pcr(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pcr擴(kuò)增)的方法獲得(方法參見(jiàn)：j.薩姆布魯克，ef弗里奇，t曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)。具體操作步驟如下：

(1)抽提水稻品種“中花11”(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)成熟葉片mrna，mrna抽提后用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見(jiàn)該試劑盒的說(shuō)明書(shū))；

(2)rt-pcr反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈的步驟如下：①配制混合液1：抽提的總rna4μg，dnasei1μl(2u/μl),10×dnaseibuffer1μl，加不含rna酶的雙蒸水(0.01％depc處理過(guò)的雙蒸水，depc又名焦碳酸二乙酯，rna酶的強(qiáng)烈抑制劑)3μl，混勻后將混合液1在37℃放置15分鐘以除去dna，②15分鐘后將混合液1置于65℃水浴中溫浴變性10分鐘以使dnasei失活，然后置于冰上5分鐘，③向混合液1中分別加入1μl500μg/ml的oligo(dt)和1μl10mm/l的dntp的并充分混勻，④將混合液1立即置于65℃水浴中溫浴10分鐘，然后置于冰上5分鐘，使mrna徹底變性并讓oligo(dt)結(jié)合在mrna3’末端，⑤配制混合液2：5×firststrandbuffer4μl，0.1mdtt(巰基乙醇)2μl，rrⅰ，反轉(zhuǎn)錄酶ssⅲ1μl，混勻后將混合液2置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時(shí)，⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90℃干浴10分鐘變性，⑦-20℃保存最終反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購(gòu)自于invitrogen公司。

(3)然后根據(jù)ricegenome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)提供的osgcn5基因的全長(zhǎng)cdna序列設(shè)計(jì)引物利用pcr擴(kuò)增全長(zhǎng)。pcr體系具體為：反轉(zhuǎn)錄cdna產(chǎn)物1μl，10×pcrbuffer2μl，10mm/ldntp2μl，正向引物(f)和反向引物(r)各0.4μl，la-taq酶0.2μl，補(bǔ)雙蒸水12μl(所用到的pcrbuffer、dntp、taq酶等均購(gòu)自takara公司)。pcr反應(yīng)程序如下：①94℃5分鐘，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃120秒，⑤從②－④循環(huán)30次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。用來(lái)克隆osgcn5全長(zhǎng)的引物為：

osgcn5-f:5’-ggggtaccatggacgggctcgcggcgcc-3’,

osgcn5-r:5’-cgggatcctcagttcttcgttgaggcttgggc-3’

最終擴(kuò)增得到的osgcn5全長(zhǎng)連接-teasy載體(promega公司)，利用t7和sp6引物測(cè)序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的核苷酸序列與ricegenome數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的序列完全一致，如seqidno：1所示。測(cè)序用的引物序列為：

t7:5’-attatgctgagtgatatccc-3’,

sp6:5’-taaatccactgtgatatctt-3’,

實(shí)施例2：雙鏈抑制dsrnai載體的構(gòu)建

根據(jù)ricegenome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)公布的osgcn5基因的全長(zhǎng)cdna序列，利用smart網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其編碼的蛋白質(zhì)序列(seqidno:2)存在兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別為乙酰化功能結(jié)構(gòu)域(211位氨基酸到287位氨基酸)和bromodomain結(jié)構(gòu)域(396位氨基酸到505位氨基酸)，在兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域中間非保守區(qū)域設(shè)計(jì)雙鏈抑制引物(dsrnai引物),并利用實(shí)施例1中克隆到的基因全長(zhǎng)為模板pcr擴(kuò)增得到雙鏈抑制區(qū)段dna，設(shè)計(jì)引物時(shí)在上游引物5’端添加spei和kpni限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在下游引物5’端依序添加saci和bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。pcr擴(kuò)增出該目的序列后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)t/a克隆連接到-teasy載體(promega公司)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證其擴(kuò)增的dna片段(序列表seqidno:3)。利用該載體酶切獲得目標(biāo)dna片段連接后續(xù)載體pds1301。具體步驟如下：

(1)將帶有osgcn5的rnai片段的t/a克隆質(zhì)粒用kpni和bamhi限制性內(nèi)切酶酶切，回收目標(biāo)條帶，與經(jīng)kpni和bamhi酶切的載體質(zhì)粒pds1301(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已畢業(yè)博士?jī)?chǔ)昭輝改造而成；該質(zhì)粒的圖譜見(jiàn)圖1；參見(jiàn)文獻(xiàn)：chu等,promotermutationsofanessentialgeneforpollendevelopmentresultindiseaseresistanceinrice.genesdevelopment,2006,20:1250-1255.)進(jìn)行16℃、6小時(shí)連接反應(yīng)(所使用的內(nèi)切酶均購(gòu)于寶生物工程大連有限公司，按照該公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作；連接酶購(gòu)自promega公司)；

(2)將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌(dh10b菌株)感受態(tài)中，并挑取單克隆進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序驗(yàn)證，獲得pds1301連有第一鏈的克隆質(zhì)粒。

(3)用spei和saci酶切相同的帶有osgcn5的rnai片段的克隆質(zhì)粒，并利用spei和saci酶切2)中構(gòu)建好的載體，利用上述連接反應(yīng)連接外源片段和載體、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中用載體引物測(cè)序驗(yàn)證。用來(lái)構(gòu)建雙鏈抑制dsrnai載體的引物為：

osgcn5-rnai-f:5’-gggactagtggtaccggacaaagaaagatggcaagg-3’，

osgcn5-rnai-r:5’-ggggagctcggatccgttgcctgtaagtactgtaatcagg-3’

最終得到的osgcn5基因雙鏈抑制rnai載體(或稱之為表達(dá)載體osgcn5-pds1301)。

實(shí)施例3.osgcn5體外酶活驗(yàn)證

(1)以實(shí)施例1中涉及的osgcn5全長(zhǎng)載體為模板設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增osgcn5基因全長(zhǎng)，左端引物(osgcn5-6p-f)和右端引物(osgcn5-6p-r)的5’端分別添加bamhi和sali酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段連接-teasy載體(promega公司)，連接反應(yīng)條件為16℃、6小時(shí)。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受體(dh10b菌株)，并挑選單克隆進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序獲得不存在突變的克隆子。利用bamhi和sali限制性內(nèi)切酶分別酶切上述克隆獲得的載體獲得dna片段外源，同時(shí)用bamhi和sali限制性內(nèi)切酶酶切osgcn5-pgex-6p載體，將二者進(jìn)行連接反應(yīng)，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)挑選單克隆并測(cè)序獲得osgcn5-pgex-6p載體(所使用的內(nèi)切酶均購(gòu)于寶生物工程大連有限公司，參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作；連接酶購(gòu)自promega公司)。構(gòu)建該載體所用的擴(kuò)增引物序列如下：

osgcn5-6p-f:5’-ggatccatggacgggctcgcggc-3’，

osgcn5-6p-r:5’-gtcgacctcagttcttcgttgaggcttgg-3’

(2)將構(gòu)建好的osgcn5-pgex-6p載體利用電轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)菌株(bl21菌株)中，挑選單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌株搖到od值＝0.5時(shí)加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷，上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)至最終濃度為0.2mm/l，并于0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)時(shí)取樣，同時(shí)將5小時(shí)菌液收集后用緩沖液(20mm/ltris-hcl,200mm/lnacl,0.5％np-40(sigma，18896),1mm/ledtaph＝8.0,0.01g/mlproteaseinhibitor(roche，04693159001))重懸，并用超聲波儀(soniprep150，美國(guó))處理后12000rpm5分鐘離心分離出沉淀和上清樣品，溶于蛋白上樣緩沖液中(配方：62.5mmtris-hcl,ph6.8；2％sds；25％甘油(glycerol)；0.01％溴酚藍(lán)(bromophenolblue)；10％β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，95℃變性10分鐘，冰上放置5分鐘。經(jīng)濃度為15％的sds-page蛋白膠進(jìn)行電泳(電泳采用bio-rad公司的mini-protean3電泳槽系統(tǒng)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)。驗(yàn)證蛋白是否表達(dá)出來(lái)(圖3)。

(3)將步驟(2)表達(dá)的上清利用gstbeads(glutathionesepharose4fastflow,gehealthcare,17-5132-01)進(jìn)行純化回收，具體步驟如下：將gstbeads用緩沖液洗兩天，500g離心去上清，加入2)中上清液，beads和上清混勻4℃過(guò)夜，500g離心去上清，利用緩沖液重懸beads，混勻4℃搖10分鐘，離心去上清，如此清洗6遍。將上清去盡。加100μlgst溶解緩沖液(15.366mg-30.732mgglutathionereduced(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)，250μl1m/ltris-hclph＝8.0)，4℃溶解半小時(shí)。500g離心取上清，取15μl上清加入蛋白上樣緩沖液95℃變性10分鐘，冰上放置5分鐘，經(jīng)濃度為15％的sds-page蛋白膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(電泳采用bio-rad公司的mini-protean3電泳槽系統(tǒng)，按照電泳槽說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)，如圖3所示，申請(qǐng)人純化到了較為干凈的gst空蛋白和osgcn5-gst融合蛋白。

(4)利用步驟(3)中純化回收的蛋白，和組蛋白h3或h4進(jìn)行孵育反應(yīng)，并利用westernblot技術(shù)檢測(cè)組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)(方法參考：tieetal.,2009.cbp-mediatedacetylationofhistoneh3lysine27antagonizesdrosophilapolycombsilending.development.136(18):3131-3141)。孵育反應(yīng)如下：40mm/ltris-hclph＝8.0，0.1m/lnacl，10％glycerol，0.1mm/ledta，1mm/ldtt，1mm/lpmsf，5mm/l丁酸鈉，0.1mm/lacetyl-coa(sigma公司)，10μl組蛋白h3或h4(sigma公司)。30℃孵育4小時(shí)。westernblot技術(shù)如下：轉(zhuǎn)膜使用bio-rad公司的minitrans-blotcell轉(zhuǎn)印槽系統(tǒng)，按照其說(shuō)明書(shū)，將組蛋白轉(zhuǎn)至amersham公司的hybond-ppvdf膜上，含有2％小牛血清蛋白(bsa)的pbs緩沖液(nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo44.3mmol/l，kh2po41.4mmol/l，ph7.5)室溫進(jìn)行封閉2小時(shí)，以體積比1:10000加入不同的抗體(如后所示)室溫孵育1.5個(gè)小時(shí)左右。所用抗體分別為：h3(ab1791，abcom公司)、h3k9ace(07-352，millipore公司)、h3k27ace(07-360，millipore公司)、h3k4ace(07-539，millipore公司)、h3k14ace(04-1044，millipore公司)、h4k16ace(07-329，millipore公司)、h4k5ace(04-118，millipore公司)、h4(ab70701，abcom公司)。將一抗溶液回收，用pbs緩沖液洗膜六次，每次10分鐘，再加入按體積比1:10000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗兔二抗或抗鼠二抗(購(gòu)自southernbiotech公司，得博生物科技有限公司(北京)代理)，室溫孵育1.5小時(shí)，然后用pbs緩沖液洗膜六次，每次10分鐘，使用supersingnalpico(購(gòu)自pierce公司)試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作方法進(jìn)行x光片顯影，并用掃描儀記錄圖片。結(jié)果圖4所示，說(shuō)明osgcn5可以直接乙?；痟3k9、k27、k4、k14和h4k5等位點(diǎn)，為一個(gè)廣譜的乙酰化酶。

實(shí)施例4.osgcn5在調(diào)控水稻抗旱反應(yīng)中的功能驗(yàn)證

1、雙元ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性和表達(dá)量檢測(cè)：

(1)用實(shí)施例2中獲得的轉(zhuǎn)化載體pds1301-osgcn5轉(zhuǎn)化水稻受體品種“中花11”，轉(zhuǎn)化方法按照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如：專利號(hào)zl2011100940899，發(fā)明的名稱：組蛋白去甲基化酶基因osj5在提高水稻抗性中的應(yīng)用；專利公開(kāi)號(hào)：cn102732535；專利授權(quán)日：2013年08月28日的專利文獻(xiàn))進(jìn)行。所獲得的t0代轉(zhuǎn)基因植株命名為osgcn5-rnai(依次命名為osgcn5-rnai-n，n＝0，1，2，3……)。

(2)取田間種植的t0代轉(zhuǎn)化植株葉片并抽提總dna。dna抽提方法為ctab法(zhang等，geneticdiversityanddifferentiationofindicaanjaponicaricedetectedbyrflpanalysis,1992,theoreticalandappliedgenetics,83,495-499)。用pcr方法對(duì)雙鏈抑制t0代轉(zhuǎn)化植株用載體第二鏈引物(pmcg2f和pmcg2r)進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。所用pcr載體引物如下：

pmcg2f：5’-ggctcaccaaaccttaaacaa-3’，

pmcg2r：5’-ctgagctacacatgctcaggtt-3’。

(以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)

pcr反應(yīng)體系配方為：模板2μl(約100ng)，10×pcrbuffer2μl，10mm/ldntp2μl，正向引物(pmcg2f)和反向引物(pmcg2r)各0.4μl，r-taq酶0.2μl，補(bǔ)雙蒸水12μl(所用到的pcrbuffer、dntp、taq酶等均購(gòu)自takara公司)。pcr反應(yīng)條件如下：①94℃4分鐘，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃1分鐘，⑤從②－④循環(huán)32次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。pcr產(chǎn)物在1％(質(zhì)量/體積)的tbe瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。載體第二鏈引物(pmcg2f和pmcg2r)擴(kuò)增片段為轉(zhuǎn)基因植株特有，野生型植株中擴(kuò)增不出相應(yīng)片段。對(duì)t0代陽(yáng)性植株收種子(稱為t1代)，為t1代的植株性狀調(diào)查做準(zhǔn)備。(3)為了檢測(cè)pds1301-osgcn5轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的表達(dá)量，申請(qǐng)人通過(guò)熒光定量pcr的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因t0代植株進(jìn)行了表達(dá)分析。抽提t(yī)0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的總mrna并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，抽提用試劑為invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，rt-pcr中反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈的步驟如下：

①配制混合液1：抽提的總rna4μg，dnasei1μl(2u/μl),10×dnaseibuffer1μl，加不含rna酶的雙蒸水(0.01％depc處理過(guò)的雙蒸水，depc又名焦碳酸二乙酯，rna酶的強(qiáng)烈抑制劑)3μl，混勻后將混合液1在37℃放置15分鐘以除去dna；

②15分鐘后將混合液1置于65℃水浴中溫浴變性10分鐘以使dnasei失活，然后置于冰上5分鐘；

③向混合液1中分別加入1μl500μg/ml的oligo(dt)和1μl10mm/l的dntp的并充分混勻；

④將混合液1立即置于65℃水浴中溫浴10分鐘，然后置于冰上5分鐘，使mrna徹底變性并讓oligo(dt)結(jié)合在mrna3’末端；

⑤配制混合液2：5×firststrandbuffer4μl，0.1mdtt(巰基乙醇)2μl，rrⅰ，反轉(zhuǎn)錄酶mlv1μl，混勻后將混合液2置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時(shí)；

⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90℃干浴10分鐘變性；

⑦-20℃保存最終反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購(gòu)自于invitrogen公司。

得到產(chǎn)物后用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法檢測(cè)osgcn5的表達(dá)量。試劑購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。pcr儀為美國(guó)abi公司的7500，pcr參數(shù)為95℃預(yù)變性10秒，進(jìn)入循環(huán)后95℃變性5秒，60℃退火延伸40秒，45個(gè)循環(huán)。real-timepcr所用引物序列為：

osgcn5realtime-f：5'-cagataacaatgccgttggct-3’

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osgcn5表達(dá)量結(jié)果整理如圖2所示，其中osgcn5基因表達(dá)量抑制比較好的家系為2、6、10、14、18、20、48。

2、t2代轉(zhuǎn)基因植株性狀調(diào)查和表達(dá)分析：

(1)osgcn5基因在不同組織部位的表達(dá)

對(duì)水稻品種中花11的不同組織部分進(jìn)行取材，并利用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見(jiàn)該試劑盒的說(shuō)明書(shū))抽提mrna，反轉(zhuǎn)錄后利用熒光定量pcr檢測(cè)osgcn5基因在根根(發(fā)芽10天苗)、幼莖(正在伸長(zhǎng)莖桿)、幼苗(發(fā)芽5天)、幼穗(0.2cm-1cm)、葉片(2個(gè)月水稻成熟葉)中的表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示。由圖可知

分別取水稻品種中花11不同生長(zhǎng)時(shí)期的不同組織，用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見(jiàn)該試劑盒的說(shuō)明書(shū))抽提rna，反轉(zhuǎn)錄后用熒光定量pcr儀檢測(cè)osgcn5基因在根(發(fā)芽10天苗)、幼莖(正在伸長(zhǎng)莖桿)、幼苗(發(fā)芽5天)、幼穗(0.2cm-1cm)、葉片(2個(gè)月水稻成熟葉)中的表達(dá)量，結(jié)果如圖5，由圖可知，該基因各個(gè)組織和器官中均有表達(dá)，但是在葉片組織中表達(dá)量最高，這說(shuō)明osgcn5是一個(gè)組織器官組成性表達(dá)的基因。

(2)osgcn5基因在水稻抗逆中的作用檢測(cè)

將發(fā)芽10天的osgcn5各抑制家系和野生型對(duì)照中花11種植在小紅桶中(一半種植osgcn5抑制家系；一半種植野生型中花11)，當(dāng)二者生長(zhǎng)到一個(gè)月時(shí)，水稻植株大小和生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致。將桶中明水倒掉并保持持續(xù)不澆水的狀態(tài)使土壤慢慢失去水分，干旱處理14天后植株出現(xiàn)非常明顯的干旱表型，主要表現(xiàn)為葉片卷曲并慢慢枯萎，此時(shí)開(kāi)始復(fù)水讓植株重新獲得水分并觀察表型(小紅桶干旱試驗(yàn)參照：tangetal.,constitutiveactivationoftranscriptionfactorosbzip46improvesdroughttoleranceinrice,2012,plantphysiology,155,1755-1768.)，如圖6a所示。為了進(jìn)一步確認(rèn)上述觀察表型，我們?nèi)⊥瑯訔l件下生長(zhǎng)一個(gè)月的osgcn5抑制家系和野生型中花11為對(duì)照材料，測(cè)試離體葉片失水率。具體做法：將一個(gè)月水稻植株的葉片用剪刀于基部剪下，并立即稱取鮮重(g0h)，然后每隔一個(gè)小時(shí)稱取材料重量(gxh)，x小時(shí)對(duì)應(yīng)的失水率為(gxh-g0h)/g0h(方法參考：tangetal.,constitutiveactivationoftranscriptionfactorosbzip46improvesdroughttoleranceinrice.plantphysiology,2012,158:1755-1768)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖6b所示，osgcn5抑制家系失水效率高于對(duì)照野生型中花11。同時(shí)為了尋找osgcn5可能影響的下游基因，我們?nèi)「珊堤幚?天后的osgcn5抑制家系和野生型中花11的葉片，抽提mrna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用熒光定量pcr檢測(cè)逆境應(yīng)答基因在兩種材料中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)部分逆境應(yīng)答基因如過(guò)氧化物酶(prx)和谷胱甘肽s基轉(zhuǎn)移酶(gstu)等參與逆境ros(活性氧)清除的基因和部分與逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因如abi和bzip類基因在osgcn5抑制家系相對(duì)于野生型下調(diào)表達(dá)。說(shuō)明在水稻的干旱脅迫過(guò)程中osgcn5參與調(diào)控了部分逆境應(yīng)答基因的表達(dá)(圖7)。檢測(cè)用的引物序列如下：

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(3)osgcn5基因在水稻冠根發(fā)育過(guò)程中的表型觀察

由于水稻根系與水稻的抗旱反應(yīng)密切相關(guān)，于是我們考察了osgcn5抑制家系中冠根的發(fā)育狀況。具體如下，在含有生根培養(yǎng)基的方皿上發(fā)芽osgcn5各抑制家系和對(duì)照野生型中花11，7天后觀察表型，并對(duì)地上部分高度，地下部分長(zhǎng)度和冠根數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)osgcn5抑制家系地下部分明顯變?nèi)?，特別冠根數(shù)目有顯著減少(圖8)，說(shuō)明osgcn5可能通過(guò)影響水稻根的發(fā)育來(lái)參與水稻的干旱反應(yīng)。