本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種乳頭瘤病毒嵌合蛋白，及由其形成的病毒樣顆粒，以及乳頭瘤病毒嵌合蛋白或乳頭瘤病毒嵌合病毒樣顆粒在制備預(yù)防乳頭瘤病毒感染及感染誘發(fā)的疾病的疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
：目前已分離鑒定了200多型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)，分為嗜黏膜組和嗜皮膚組。黏膜組的hpv主要感染泌尿生殖道、肛門肛周及口咽部的黏膜及周圍皮膚，誘發(fā)各種良惡性病變。根據(jù)誘發(fā)病變的性質(zhì)不同，可分為誘發(fā)惡性腫瘤的高危型(包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等)；可疑高危型(hpv26、30、53、66、67、69、70、73、82、85等)；尚未確定型(hpv34、42、43、54、71、81、83、97、102、114等)；及誘發(fā)疣狀增生等良性病變的低危型(hpv6、7、11、13、32、40、42、44、61、62、72、74、81、83、84、86、87、89、90、91、106等)。嗜皮膚組主要感染上述部位之外的皮膚組織，誘發(fā)皮膚疣狀增生，并與某些皮膚癌的發(fā)生密切相關(guān)。高危型hpv感染相關(guān)的惡性腫瘤目前已確定的有：宮頸癌、陰道癌、陰唇癌、陰莖癌、肛門肛周癌、口咽癌、扁桃體癌、口腔癌，其中以宮頸癌的危害最大。宮頸癌是世界范圍第三高發(fā)的婦女惡性腫瘤，年發(fā)病約52.7萬，其中亞洲地區(qū)28.5萬；中國的年發(fā)病數(shù)7.5萬。hpv16是全球范圍內(nèi)的優(yōu)勢流行株，在hpv相關(guān)的腫瘤如宮頸癌、肛周癌、陰莖癌、外陰癌等相關(guān)癌及癌前病變中的檢出率都是最高的。例如，hpv16感染相關(guān)的宮頸癌約占中國宮頸癌總數(shù)的58.7％，占世界宮頸癌發(fā)病總數(shù)的53.5％，其余41.3％-46.5％的宮頸癌由其余約19種高危型hpv感染合并引起。目前已經(jīng)上市了多種以hpvl1蛋白的病毒樣顆粒(vlp)為基礎(chǔ)的混合性預(yù)防疫苗，如葛蘭素史克公司的二價苗cervarix(hpv16/18)，默沙東公司的四價苗gardasil(hpv6/11/16/18)及九價苗gardasil-9(hpv6/11/16/18/31/33/35/45/52/58)。由于這類疫苗誘發(fā)的免疫保護反應(yīng)主要是針對疫苗構(gòu)成型別的，因此這類疫苗多為hpv多價疫苗，如要獲得廣譜疫苗的預(yù)防效果需要繼續(xù)擴大疫苗的價次。鑒于hpv的型別目前已鑒定了200多型，高危型已鑒定多達(dá)20型，因此通過單純擴大vlp型別種類研發(fā)廣譜疫苗在經(jīng)濟成本及人體所能承受的最大接種量方面都帶來了許多挑戰(zhàn)。病毒次要衣殼蛋白l2可誘發(fā)交叉中和抗體，且具有體內(nèi)交叉保護活性。研究 發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)交叉保護活性的中和抗體表位主要分布在l2蛋白的n端多個保守區(qū)域，如hpv16l2蛋白的氨基酸(aa.)17-36多肽的免疫血清可高滴度中和hpv16/18，同時還可有效中和hpv5/6/45/52/58(gambhirar,karanamb,etal.j.virol.2007；81(24):13927–13931)，針對hpv16l2aa.17-36多肽的單抗rg-1亦具有交叉中和活性(gambhirar,karanamb,etal.j.virol.2007；81(24):13927–13931)，因此，l2蛋白的與hpv16l2的aa.17-36多肽同源區(qū)又被稱為rg-1表位。采用不同疫苗載體，如硫氧還蛋白(trx)、噬菌體vlp、植物病毒vlp及感染哺乳類的病毒vlp(腺相關(guān)病毒、牛乳頭瘤病毒-1、hpv16)，構(gòu)建以hpv16l2aa.17-36多肽為基礎(chǔ)的融合蛋白疫苗，可顯著提高多肽的免疫原性，提高中和抗體的滴度及交叉中和或保護范圍(christinas,richardr,etal.j.virol.2009；83(19):10085-10095；seitzh,canalie,etal.vaccine2014；32:2610–2617；tumbane,peabodyj,etal.plosone2011；6(8):e23310；nietok,weghoferm,etal.plosone2012；7(6):e39741)。hpvl2aa.17-36多肽區(qū)域在不同種屬的乳頭瘤病毒之間，氨基酸序列同源性很高?，F(xiàn)有的以不同hpv型別rg-1表位為基礎(chǔ)的疫苗研究如下：將hpv31/51型rg-1表位插入細(xì)菌蛋白trx的表面，獲得的免疫血清有交叉中和活性，但中和型別相對較少(seitzh,canalie,etal.vaccine2014；32:2610–2617)；將hpv16/31型rg-1表位聯(lián)合插入腺相關(guān)病毒vlp表面，獲得的免疫血清合計中和6個hpv型別(nietok,weghoferm,etal.plosone2012；7(6):e39741)；將hpv45型rg-1表位插入hpv18vlp表面，獲得的免疫血清合計中和4個hpv型別(huberb,schellenbacherc,etal.plosone2015；10(3):e0120152)。這些結(jié)果表明，上述型別的rg-1表位均有誘發(fā)交叉中和抗體的活性。此外，8種型別的rg-1區(qū)域的截短型多肽(hpv1/5/6/11/16/18/45/58l2aa.17-31)分別插入噬菌體vlp表面，形成的8種嵌合vlp(chimericvlp,cvlp)混合免疫后的小鼠可產(chǎn)生針對8種型別病毒的免疫保護反應(yīng)(tumbane,peabodyj,etal.plosone2011；6(8):e23310)，由于缺乏對每種rg-1截短多肽cvlp免疫活性的具體分析，因此不能判斷各型截短型的rg-1表位多肽的免疫活性。從上述文獻報道的中和型別分析來看，hpv16rg-1表位的免疫原性最強，無論是插入hpv及噬菌體的vlp表面均可誘發(fā)廣譜中和抗體反應(yīng)；hpv31/45/51的可能次之，其他型別的不明(缺乏報道)；值得注意的是，8種型別(hpv1/5/6/11/16/18/45/58)rg-1區(qū)域的截短型多肽(l2aa.17-31)噬菌體cvlp混合免疫獲得的抗血清，其中和的型別不多，提示其中某些型別截短多肽可能是沒有活性的或是活性很弱。具體比較分析不同型別rg-1表位多肽及截短型多肽免疫原性，可望明確其免疫原性及免疫原性的差異。因此，除hpv16外，目前對其他型別的rg-1表位區(qū)的免疫原性研究欠深入或者缺乏研究；而且缺乏針對不同型別rg-1表位區(qū)的免疫原性的比較分析；重要的是，在相關(guān)的載體疫苗研究中，rg-1表位型別的選擇不是依據(jù)其免疫原性的強弱，而是依據(jù)其他因素，如 該型別的病毒是否優(yōu)勢流行及感染相關(guān)疾病的危害程度是否嚴(yán)重。因此現(xiàn)有以rg-1表位為基礎(chǔ)的疫苗研究有待提高。hpv58是我國、東南亞、及拉丁美洲的優(yōu)勢流行株，在hpv感染相關(guān)病變及腫瘤中的檢出率較高，僅次于hpv16或僅次于hpv16/18(x.castellsaguéetal.vaccine25s(2007)c1–c26)。hpv58l1vlp的研究較多，但hpv58l2蛋白的rg-1表位區(qū)的免疫原性缺乏研究，該表位是否能誘發(fā)中和抗體及誘發(fā)抗體的中和范圍及特點都不明確。基于目前的研究進展及認(rèn)知，hpv58rg-1表位疫苗的免疫活性是無法預(yù)測的。研究發(fā)現(xiàn)，hpv16l1vlp是一個極具研發(fā)前景的表位疫苗載體，在hpv16l1蛋白表面區(qū)的特定位置按照一定的方式插入hpv16rg-1表位后，可在vlp表面展示，免疫后可誘發(fā)廣譜中和抗體及保護反應(yīng)。如在hpv16l1蛋白de環(huán)(aa136/137)位點，直接插入hpv16l2aa.17-36形成的嵌合vlp(chimericvlp，cvlp)可誘發(fā)廣譜中和抗體反應(yīng)，可中和至少14個hpv型別(schellenbacherc,rodenr,etal2009；j.virol.2009；83(19):10085–10095)；在h4區(qū)域的430/433位點，采用非等長置換法插入hpv16l2aa.18-38，可以誘發(fā)交叉中和hpv18及31型的中和抗體(kondok,ochih,etal.j.med.virol.2008；80:841–846)。目前尚未見有將hpv58l2表位嵌合在乳頭瘤病毒vlp表面的報道。由于hpv58rg-1表位與hpv16rg-1表位的氨基酸序列有一定差異(同源性約80％)，在上述位點插入后是否能形成vlp尚不清楚。另外，采用其他不同的插入方式，如在de環(huán)135-138區(qū)域，采用非等長置換合并插入片段、兩端引入氨基酸修飾，獲得的融合蛋白是否能形成vlp，插入的表位是否能在表面有效呈遞尚不清楚，插入后是否影響骨架自身的主要中和抗體表位也不清楚。最后，在上述區(qū)域插入截短型的hpv58l2rg-1表位多肽，是否能形成vlp，形成vlp以后是否具有誘發(fā)交叉保護反應(yīng)的活性，是否影響骨架自身的主要中和抗體表位，對其表達(dá)量的影響如何，同樣也是不清楚的。上述不清楚的問題是無法預(yù)測的。因此，本發(fā)明選用了hpv58rg-1表位及截短型的rg-1表位，用于hpv16cvlp的研究，結(jié)果顯示，本發(fā)明獲得的hpv58rg-1長表位及短表位的cvlp的免疫原性很強(可中和至少10個hpv型別)，可與文獻報道的hpv16rg-1cvlp的相媲美，但中和型別的范圍有所不同(schellenbacherc,rodenr,etal2009；j.virol.2009；83(19):10085–10095；schellenbacherc,kwakk,etal.j.invest.derma.2013；doi:10.1038/jid.2013.253)。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種乳頭瘤病毒(pv)嵌合蛋白，用于制備預(yù)防乳頭瘤病毒感染及感染誘發(fā)的疾病的疫苗。本發(fā)明人經(jīng)研究出人意料地發(fā)現(xiàn)，在全長或截短型hpv16l1蛋白的表面區(qū)插 入hpv58l2多肽，可提高h(yuǎn)pv58l2多肽的免疫原性，獲得的嵌合蛋白在大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中可高水平表達(dá)，該嵌合蛋白可組裝成vlp，并可誘發(fā)針對來自不同屬/亞屬的多種型別hpv的廣譜保護性免疫反應(yīng)。本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已完成，在本文實施例中提供數(shù)據(jù)?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明一方面提供了一種乳頭瘤病毒嵌合蛋白，其骨架是乳頭瘤病毒的l1蛋白或乳頭瘤病毒的l1蛋白的突變體，所述的骨架上嵌合至少一個來自hpv58l2蛋白的多肽?？蛇x地，所述的多肽選自hpv58l2蛋白(氨基酸序列如seqidno.8所示)的aa.1-200區(qū)域內(nèi)的任意連續(xù)8-33個氨基酸的片段。進一步優(yōu)選地，所述的多肽為hpv58l2蛋白rg-1表位區(qū)。優(yōu)選地，所述的多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。可選地，所述的多肽是在seqidno.1所示的氨基酸序列的n端延長或截短1-5個氨基酸和/或c端延長或截短1-5個氨基酸所獲得的多肽。優(yōu)選地，所述的多肽的氨基酸序列如seqidno.2所示?？蛇x地，所述的多肽還可以是與seqidno.1所示的氨基酸序列同源性大于60％的多肽，優(yōu)選是同源性大于70％的多肽、同源性大于80％的多肽、同源性大于90％的多肽，甚至更優(yōu)選是同源性大于95％的多肽。可選地，所述的骨架是hpv16l1蛋白或hpv16l1蛋白的突變體。優(yōu)選地，所述的hpv16l1蛋白選自高危型hpvl1蛋白或高危型hpvl1蛋白的突變體；進一步優(yōu)選地，本發(fā)明涉及的嵌合蛋白的骨架選自hpv16l1蛋白(例如ncbi數(shù)據(jù)庫aac09292.1序列)或hpv16l1蛋白突變體。hpv16l1蛋白骨架可來自但不限于hpv16phi1、tha7、alg1、sen32、fra25、fra63、114k、114b、z-1194等變異株的l1蛋白(touzea,mehdaouise,etal.j.clin.micr.1998；36(7):2046-2051)。優(yōu)選地，所述的hpv16l1蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示?？蛇x地，所述的hpv16l1蛋白的突變體是在所述的hpv16l1蛋白的n端截短0-9個氨基酸和/或c端截短0-34個氨基酸的所獲得的蛋白。可選地，所述的來自hpv58l2蛋白的多肽嵌合于所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的表面區(qū)，優(yōu)選為嵌合于所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的de環(huán)，更優(yōu)選為通過直接插入的方式嵌合于所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸136和氨基酸137之間，或者通過非等長置換的方式嵌合于所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸135-138區(qū)域，其中，所述的非等長置換的方式中，所述的來自hpv58l2蛋白的多肽的n端和/或c端含有1-3個氨基酸的連接子?？蛇x地，所述的連接子由選自甘氨酸(g)、絲氨酸(s)、丙氨酸(a)及 脯氨酸(p)的氨基酸任意組合構(gòu)成。優(yōu)選地，n端選用g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子，c端選用p(脯氨酸)連接子?？蛇x地，在所述直接插入的方式中，所述來自hpv58l2蛋白的多肽的氨基酸序列是seqidno.1或seqidno.2，插入位點為所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸136和氨基酸137之間?？蛇x地，在所述非等長置換的方式中，刪除所述hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸135-138區(qū)域后，在hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸134及139之間插入如seqidno.4或seqidno.5所示的氨基酸序列?？蛇x地，所述的來自hpv58l2蛋白的多肽嵌合于所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的表面區(qū)，優(yōu)選為嵌合于所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的h4區(qū)，更優(yōu)選為通過非等長置換的方式嵌合于hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸431-433區(qū)域，其中，所述的非等長置換的方式中，所述的來自hpv58l2蛋白的多肽的n端和/或c端含有1-3個氨基酸的連接子。可選地，所述的連接子由選自甘氨酸(g)、絲氨酸(s)、丙氨酸(a)及脯氨酸(p)的氨基酸任意組合構(gòu)成。優(yōu)選地，n端選用p(脯氨酸)g(甘氨酸)連接子?？蛇x地，在所述非等長置換的方式中，刪除所述hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸431-433區(qū)域后，在hpv16l1蛋白或c端截短31個氨基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的氨基酸430及434之間插入如seqidno.6或seqidno.7所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面涉及編碼上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含上述的多核苷酸的載體，以及包含所述的載體的細(xì)胞。本發(fā)明涉及的編碼上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸序列適用于不同的表達(dá)系統(tǒng)?？蛇x地，這些核苷酸序列采用大腸桿菌密碼子進行全基因優(yōu)化，可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)；或采用昆蟲細(xì)胞密碼子進行全基因優(yōu)化，可在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種乳頭瘤病毒外殼蛋白多聚物，優(yōu)選地，該多聚物為乳頭瘤病毒嵌合五聚體或嵌合病毒樣顆粒，其含有上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白，或者由上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白所形成。本發(fā)明還提供了上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白、乳頭瘤病毒嵌合五聚體或上述的乳頭瘤病毒嵌合病毒樣顆粒在制備預(yù)防乳頭瘤病毒感染及感染誘發(fā)的疾病的疫苗中的用途。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防乳頭瘤病毒感染及感染誘發(fā)的疾病的疫苗，其 包含上述的乳頭瘤病毒嵌合五聚體或嵌合病毒樣顆粒、佐劑、以及疫苗用賦形劑或載體，優(yōu)選地，還包含至少一種嗜黏膜組和/或嗜皮膚組的hpv的病毒樣顆?；蚯逗喜《緲宇w粒。其中，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發(fā)保護性免疫反應(yīng)的有效量?？蛇x地，所述佐劑為人用佐劑，優(yōu)選是鋁佐劑、水包油乳劑或油包水乳劑及tlr刺激劑的佐劑組合物、氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩(wěn)定劑的組合物或者mf59佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩(wěn)定劑的組合物。發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)”包括昆蟲細(xì)胞、重組桿狀病毒、重組bacmid及表達(dá)載體。其中昆蟲細(xì)胞來源于市場上可得到的細(xì)胞，在此舉例但不限于：sf9，sf21，highfive。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“原核表達(dá)系統(tǒng)”包括但不限于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。其中表達(dá)宿主菌來源于市場上可得到的菌株，在此舉例但不限于：bl21(de3)，bl21(de3)plyss，c43(de3)，rosetta-gamib(de3)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“全長hpv16l1蛋白”的例子包括但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫中編號為aac09292.1的蛋白等長的全長l1蛋白。“截短型hpv16l1蛋白”的基因片段指的是其與野生型hpv16l1蛋白基因相比，在其5’端和/或3’端缺失編碼1個或多個氨基酸的核苷酸，其中“野生型hpv16l1蛋白”的全長序列例如但不限于ncbi數(shù)據(jù)庫中的如下序列:aac09292.1、aiq82817.1、aac61736.1等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疫苗用賦形劑或載體”是指選自一種或多種，包括但不限于：ph調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，離子強度增強劑。例如，ph調(diào)節(jié)劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽離子、陰離子或非離子型表面活性劑，舉例但不限于聚山梨酯80(tween-80)，離子強度增強劑舉例但不限于氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“人用佐劑”是指在臨床上可應(yīng)用于人體的佐劑，包括當(dāng)前已獲得批準(zhǔn)的和將來可能獲得批準(zhǔn)的各種佐劑，例如但不限于鋁佐劑、mf59及各種形式的佐劑組合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“乳劑”是指由水相成分、油相成分及乳化劑按適當(dāng)比例混合，經(jīng)乳化后形成的非均相液體分散體系。其中水相成分包括但不限于磷酸鹽緩沖液、hepes緩沖液等緩沖系統(tǒng)；油相成分為可代謝脂類，包括但不限于植物油、魚油、動物油、合成油及其他脂類成分(例如但不限于角鯊烯、生育酚)；乳化劑為適宜的表面活性劑，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(span-85)、聚山梨酯80(tween-80)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“穩(wěn)定劑”是指可與佐劑中的聚肌苷酸-聚胞苷酸結(jié)合并起到穩(wěn)定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、慶大霉素)、無機鹽(例如但不限于氯化鈣、氯化鎂、磷酸鈣)、陽離子的有機復(fù) 合物(例如但不限于硬脂酸鈣、葡萄糖酸鈣)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，優(yōu)選注射。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明疫苗優(yōu)選單位劑型使用，其中單位劑型中蛋白病毒樣顆粒的劑量為5μg-100μg，優(yōu)選30μg-60μg。附圖說明圖1a-圖1b：本發(fā)明實施例5中嵌合蛋白在大腸桿菌及昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)鑒定。結(jié)果顯示，12種嵌合蛋白均可在大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞中高水平表達(dá)。圖1a：嵌合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)鑒定：1為hpv16l1de136-137/58de；2為hpv16l1de136-137/58des；3為hpv16l1de135-138/58de；4為hpv16l1de135-138/58des；5為hpv16l1h4/58de；6為hpv16l1h4/58des；圖1b：嵌合蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)鑒定：1為hpv16l1δcde136-137/58de；2為hpv16l1δcde136-137/58des；3為hpv16l1δcde135-138/58de；4為hpv16l1δcde135-138/58des；5為hpv16l1δch4/58de；6為hpv16l1δch4/58des。圖2a-圖2b：本發(fā)明實施例6中純化后獲得的cvlp的動態(tài)光散射分析結(jié)果。結(jié)果顯示hpv16l1δcde135-138/58de及hpv16l1δcde135-138/58des重組蛋白形成的病毒樣顆粒水化動力學(xué)直徑分別為91.8nm和93.4nm，顆粒組裝的百分比均為100％。圖2a：hpv16l1δcde135-138/58devlp；圖2b：hpv16l1δcde135-138/58desvlp。圖3a-圖3f：本發(fā)明實施例7中純化后獲得的cvlp的透射電鏡觀察結(jié)果。視野中可見大量的直徑為50nm左右的病毒樣顆粒，顆粒的大小與理論值相符，均一度好。bar＝200nm。圖3a：hpv16l1δcde136-137/58devlp；圖3b：hpv16l1δcde136-137/58desvlp；圖3c：hpv16l1δcde135-138/58devlp；圖3d：hpv16l1δcde135-138/58desvlp；圖3e：hpv16l1δch4/58devlp；圖3f：hpv16l1δch4/58desvlp。具體實施方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍，因為實施方案必然是多樣的。本說明書中使用的用語僅是為了闡述特定的實施方案，而非作為限制，本發(fā)明的范圍已界定在所附的權(quán)利要求中。除非特別說明，本說明書中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語均和本案所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所普遍明了的意義相同。下面就本發(fā)明的優(yōu)選方法和材料加以敘 述，但是與本說明書中所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料均可用以實施或測試本發(fā)明。下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法或產(chǎn)品說明書所描述的方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。本說明書中所提到的所有公開文獻均被并入于此作為參考，以揭示并說明所述公開文獻中的方法和/或材料。實施例1：嵌合l1蛋白的基因的合成及表達(dá)載體構(gòu)建12種嵌合l1蛋白，分別為：1)嵌合l1蛋白hpv16l1de136-137/58de：骨架為全長hpv16l1蛋白(序列如seqidno.3所示)，在其de環(huán)aa.136/137位點，直接插入hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽(插入片段序列如seqidno.1所示)。編碼hpv16l1de136-137/58de的多核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為在hpv16l1大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.9所示)的核苷酸408/409之間插入hpv58l2蛋白的aa.16-37的大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因(序列如seqidno.10所示)；2)嵌合l1蛋白hpv16l1de136-137/58des：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.3所示)，在其de環(huán)aa.136/137位點，直接插入hpv58l2蛋白的aa.17-31的多肽(插入片段序列如seqidno.2所示)。編碼hpv16l1de136-137/58des的多核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為在hpv16l1大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.9所示)的核苷酸408/409之間插入hpv58l2蛋白的aa.17-31的大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因(序列如seqidno.11所示)；3)嵌合l1蛋白hpv16l1de135-138/58de：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.3所示)，刪除其aa.135-138區(qū)域，并在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區(qū)域非等長置換插入)，插入片段的氨基酸序列如seqidno.4所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1de135-138/58de的多核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.9所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.12；4)嵌合l1蛋白hpv16l1de135-138/58des：骨架為全長hpv16l1蛋白(序列如seqidno.3所示)，刪除其aa.135-138區(qū)域，并在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區(qū)域非等長置換插入)，插入片段的氨基酸序列如seqidno.5所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1de135-138/58des的多核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.9所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.13；5)嵌合l1蛋白hpv16l1h4/58de：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.3所示)，在其h4區(qū)域的aa.430-433區(qū)域非等長置換插入hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-433區(qū)域，并在aa.430/434之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽，插入片段的氨基酸序列如seqidno.6所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽的n端融合p(脯氨酸)g(甘氨酸)連接子。編碼hpv16l1h4/58de的多核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.9所示)的核苷酸1291-1299，并在核苷酸1290/1300之間插入序列seqidno.14；6)嵌合l1蛋白hpv16l1h4/58des：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.3所示)，在其h4區(qū)域的aa.430-433區(qū)域非等長置換插入hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-433區(qū)域，并在aa.430/434之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽，插入片段的氨基酸序列如seqidno.7所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽的n端融合p(脯氨酸)g(甘氨酸)連接子。編碼hpv16l1h4/58des的多核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.9所示)的核苷酸1291-1299，并在核苷酸1290/1300之間插入序列seqidno.15；7)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde136-137/58de：骨架為c端截短31個氨基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.3的c端截短31個氨基酸)，在其de環(huán)aa.136/137位點，直接插入hpv58l2蛋白aa.16-37多肽(插入片段序列如seqidno.1所示)。編碼hpv16l1δcde136-137/58de的多核苷酸序列經(jīng)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為在hpv16l1昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.16所示)的核苷酸408/409之間插入hpv58l2蛋白的aa.16-37的昆蟲密碼子優(yōu)化基因(序列如seqidno.17所示)；8)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde136-137/58des：骨架為c端截短31個氨基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.3的c端截短31個氨基酸)，在其de環(huán)aa.136/137位點，直接插入hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽(插入片段序列如seqidno.2所示)。編碼hpv16l1δcde136-137/58des的多核苷酸序列經(jīng)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為在hpv16l1昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.16所示)的核苷酸408/409之間插入hpv58l2蛋白的aa.17-31的昆蟲密碼子優(yōu)化基因(序列如seqidno.18所示)；9)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde135-138/58de：骨架為c端截短31個氨基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.3的c端截短31個氨基酸)，刪除其aa.135-138區(qū)域，并在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區(qū)域非等長置換插入)，插入片段的氨基酸序列如seq idno.4所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1δcde135-138/58de的多核苷酸序列經(jīng)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.16所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.19；10)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde135-138/58des：骨架為c端截短31個氨基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.3的c端截短31個氨基酸)，刪除其aa.135-138區(qū)域，并在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區(qū)域非等長置換插入)，插入片段的氨基酸序列如seqidno.4所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1δcde135-138/58des的多核苷酸序列經(jīng)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.16所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.20；11)嵌合l1蛋白hpv16l1δch4/58de：骨架為c端截短31個氨基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.3的c端截短31個氨基酸)，在其h4區(qū)域的aa.430-433區(qū)域非等長置換插入hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-433區(qū)域，并在aa.430/434之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽，插入片段的氨基酸序列如seqidno.6所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.16-37多肽的n端融合p(脯氨酸)g(甘氨酸)連接子。編碼hpv16l1δch4/58de的多核苷酸序列經(jīng)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.16所示)的核苷酸1291-1299，并在核苷酸1290/1300之間插入序列seqidno.21；12)嵌合l1蛋白hpv16l1δch4/58des：骨架為c端截短31個氨基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.3的c端截短31個氨基酸)，在其h4區(qū)域的aa.430-433區(qū)域非等長置換插入hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-433區(qū)域，并在aa.430/434之間融合包含連接子的hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽，插入片段的氨基酸序列如seqidno.7所示。其中，hpv58l2蛋白的aa.17-31多肽的n端融合p(脯氨酸)g(甘氨酸)連接子。編碼hpv16l1δch4/58des的多核苷酸序列經(jīng)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化設(shè)計，構(gòu)建方式為刪除hpv16l1昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化基因骨架(序列如seqidno.16所示)的核苷酸1291-1299，并在核苷酸1290/1300之間插入序列seqidno.22。依據(jù)大腸桿菌密碼子及依據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化的嵌合l1基因，采用全基因合成的方式，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。大腸桿菌密碼子優(yōu)化的嵌合蛋白基因經(jīng)ndei/xhoi酶切后，分別插入商業(yè)化的表達(dá)載體pet22b(novagen公司生產(chǎn))。昆蟲細(xì)胞密碼子優(yōu)化的嵌合蛋白基因經(jīng) ecori/xbai酶切后，分別插入商業(yè)化表達(dá)載體pfastbac1(invitrogen公司生產(chǎn))中。得到包含嵌合蛋白基因的表達(dá)載體，分別為：pet22b-16l1de136-137/58de；pet22b-16l1de136-137/58des；pet22b-16l1de135-138/58de；pet22b-16l1de135-138/58des；pet22b-16l1h4/58de；pet22b-16l1h4/58des；pfastbac1-16l1δcde136-137/58de；pfastbac1-16l1δcde136-137/58des；pfastbac1-16l1δcde135-138/58de；pfastbac1-16l1δcde135-138/58des；pfastbac1-16l1δch4/58de；pfastbac1-16l1δch4/58des。上述酶切、連接及克隆構(gòu)建的方法都是公知的，例如專利cn101293918b。實施例2：嵌合l1蛋白的基因的重組bacmid及重組桿狀病毒的構(gòu)建分別使用包含嵌合l1基因的重組表達(dá)載體pfastbac1-16l1δcde136-137/58de，pfastbac1-16l1δcde136-137/58des，pfastbac1-16l1δcde135-138/58de，pfastbac1-16l1δcde135-138/58des，pfastbac1-16l1δch4/58de，pfastbac1-16l1δch4/58des轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)，篩選獲得重組bacmid，然后用重組bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，在sf9內(nèi)擴增重組桿狀病毒。重組bacmid的篩選及重組桿狀病毒的擴增方法都是公知的，例如專利cn101148661b。實施例3：嵌合l1蛋白的基因在sf9細(xì)胞中的表達(dá)sf9細(xì)胞分別接種6種嵌合l1基因的重組桿狀病毒，進行嵌合l1蛋白的表達(dá)，27℃培養(yǎng)約88h后收發(fā)酵液，3000rpm離心15min，棄上清，用pbs洗滌細(xì)胞后，用于表達(dá)鑒定及純化。感染表達(dá)的方法是公開的，例如專利cn101148661b。實施例4：嵌合l1蛋白的基因在大腸桿菌中的表達(dá)分別使用包含嵌合l1基因的重組表達(dá)載體pet22b-16l1de136-137/58de，pet22b-16l1de136-137/58des，pet22b-16l1de135-138/58de，pet22b-16l1de135-138/58des，pet22b-16l1h4/58de，pet22b-16l1h4/58des轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)。挑單克隆接種到3ml含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液按1：100的比例加入lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3h左右，待od600達(dá)到0.8-1.0之間，加iptg至終濃度0.5μm，16℃培養(yǎng)約12h，收取菌液。實施例5：嵌合l1蛋白的表達(dá)鑒定取實施例3及實施例4中所述表達(dá)不同嵌合l1蛋白的細(xì)胞各1×106個，重懸于200μlpbs溶液中，加入6×loadingbuffer50μl，75℃變性8分鐘，分別取10μl進行sds-page電泳及westernblot鑒定。結(jié)果如圖1所示，12種嵌合l1蛋白均可在昆蟲細(xì)胞或原核表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)，其中hpv16l1de136-137/58de、hpv16l1de136-137/58des、hpv16l1de135-138/58de、hpv16l1de135-138/58des、hpv16l1h4/58de、hpv16l1h4/58des大小約55kda，其余6種蛋白大小約50kda。sds-page電泳及westernblot鑒定的方法是公開的，例如專利cn101148661b。實施例6：嵌合l1蛋白的純化及動態(tài)光散射粒徑分析取嵌合l1的細(xì)胞發(fā)酵液適量，使用10mlpbs重懸細(xì)胞，加pmsf至終濃度1mg/ml，超聲破碎(寧波新芝超聲破碎儀，6#探頭，200w，超聲5s，間隔7s，總時間10min)，取破碎上清進行純化，純化步驟在室溫進行。在裂解液中加入4％β-巰基乙醇(w/w)對vlp進行解聚，然后使用0.22μm濾器過濾樣品，依次使用dmae陰離子交換層析或cm陽離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)、tmae陰離子交換層析或q陽離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)及羥基磷灰石層析(100mmnah2po4，30mmnacl，4％β-me，ph6.0洗脫)純化。純化產(chǎn)物采用planova超濾系統(tǒng)進行濃縮，并更換緩沖液(20mmnah2po4，500mmnacl，ph6.0)促使vlp組裝。以上純化方法均是公開的，例如專利cn101293918b、cn1976718a等。取純化后的嵌合蛋白溶液進行dls粒徑分析(zetasizernanozs90動態(tài)光散射儀，malvern公司)，結(jié)果如表1所示，其中hpv16l1δcde135-138/58de及hpv16l1δcde135-138/58des的dls分析圖如圖2所示。表1嵌合l1蛋白dls分析蛋白名稱水力學(xué)直徑(nm)pdihpv16l1de136-137/58de97.60.148hpv16l1de136-137/58des98.80.153hpv16l1de135-138/58de96.20.167hpv16l1de135-138/58des96.60.151hpv16l1h4/58de94.80.146hpv16l1h4/58des96.80.133hpv16l1δcde136-137/58de92.60.145hpv16l1δcde136-137/58des95.20.138hpv16l1δcde135-138/58de91.80.141hpv16l1δcde135-138/58des93.40.138hpv16l1δch4/58de90.80.146hpv16l1δch4/58des91.40.129實施例7：嵌合vlp的透射電鏡觀察按實施例6所述的層析純化方法，對嵌合vlp分別進行純化，使用透析后的vlp制備銅網(wǎng)，并用1％醋酸鈾進行染色，充分干燥后使用jem-1400電鏡(奧林巴斯)進行觀察。結(jié)果如圖3所示，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的嵌合vlp直徑約為50nm，大小均勻，形狀規(guī)則。原核表達(dá)的cvlp直徑也在45-50nm之間。銅網(wǎng)制備及電鏡觀察的方法均是公開的，例如專利cn101148661b。實施例8：嵌合vlp的小鼠免疫及中和抗體滴度測定取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機分組，每組5只，用cvlp10μg，al(oh)350μg及pika佐劑50μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，2，4，6周免疫，共4次。第4次免疫后2周尾靜脈采血，分離血清。使用12種hpv假病毒對免疫血清的中和抗體滴度進行檢測，結(jié)果如表2所示，cvlp免疫小鼠后均可有效誘發(fā)交叉中和抗體，中和范圍廣。其中hpv16l1δcde136-137/58de等昆蟲細(xì)胞表達(dá)的cvlp免疫血清可中和至少12個型別的假病毒。假病毒制備及假病毒中和實驗的方法均是公開的，例如專利cn104418942a。此外，本發(fā)明包括的在de區(qū)域或h4區(qū)域采用其他柔性連接子連接l2表位構(gòu)建的嵌合蛋白，均能形成的cvlp，采用上述策略免疫小鼠后，誘發(fā)的交叉中和抗體水平與表2所示的cvlp相比沒有差異。由前述12種嵌合l1蛋白分別構(gòu)成的五聚體，采用上述策略免疫小鼠后，也可誘發(fā)交叉中和抗體。表2不同cvlp在小鼠中誘發(fā)的中和抗體滴度當(dāng)前第1頁12