本發(fā)明涉及一類基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料、其制備方法，以及利用該類熒光識別染料對癌癥細(xì)胞和組織識別中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
醫(yī)療衛(wèi)生一直是全球關(guān)注的重點問題之一。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《世界癌癥報告》顯示，在全球范圍內(nèi)癌癥的發(fā)病形勢嚴(yán)峻，發(fā)病率和死亡率均明顯上升。新增病例一半出現(xiàn)在亞洲，并且大部分集中在中國。癌癥在我國已經(jīng)超越其他疾病成為致死率最高的疾病，因此建立一種快速、靈敏、簡便的癌癥診斷手段顯得尤為重要。當(dāng)前成熟的癌癥診斷技術(shù)主要有核磁共振成像、紅外成像、超聲波成像、正電子發(fā)射斷層成像，單電子發(fā)射計算機斷層成像等。然而，上述的癌癥檢測技術(shù)有一定的缺點：儀器成本高，醫(yī)療價格昂貴；放射性損傷大，對身體造成傷害；空間分辨率低，容易造成誤診；時間效率差，只能到癌癥的中晚期才能得到有效的診斷結(jié)果。另外，上述診斷方法在治療過程中，特別是手術(shù)切除過程中，不能實時監(jiān)測，指導(dǎo)醫(yī)生辨別腫瘤邊界，這也造成了癌癥治愈難，易反復(fù)。熒光成像技術(shù)由于其簡便、毒性低、靈敏度高、非入侵性實時監(jiān)測等優(yōu)點，逐漸發(fā)展為腫瘤識別和動態(tài)監(jiān)測的有效技術(shù)，開發(fā)良好性能的腫瘤熒光識別染料則是熒光成像技術(shù)的關(guān)鍵。近幾年，越來越多的癌癥治療的靶點被研究者發(fā)現(xiàn)，相關(guān)生物標(biāo)志物的功能，代謝通路逐漸清晰，基于生物標(biāo)志物得熒光識別染料的設(shè)計開發(fā)取得了良好的進(jìn)展。本發(fā)明中所涉及熒光識別染料靶向的生物標(biāo)志物為KIAA1363(中性膽固醇酯水解酶)，該酶是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要水解酶，其表達(dá)含量與癌癥的發(fā)生，腫瘤生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在大部分癌癥組織中，特別是原發(fā)性腫瘤和侵略性腫瘤，例如乳腺癌以及前列腺癌中，酶KIAA1363表達(dá)的含量遠(yuǎn)超出正常水平?；诿窴IAA1363在癌癥和非癌癥細(xì)胞核組織中表達(dá)量的差異而進(jìn)行識別和標(biāo)記，有助于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)及診斷，該領(lǐng)域需要具有酶特異性的熒光標(biāo)記化合物來實現(xiàn)此目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一類基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料，所述熒光識別染料依靠酶KIAA1363在癌癥和非癌癥細(xì)胞核組織中表達(dá)量的差異，對離體的癌癥細(xì)胞和組織和非癌細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明首先提供一類基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料，具有通式Ⅰ的結(jié)構(gòu)：通式Ⅰ中：R1、R2、R3和R4各自獨立的選自C1-8烷基、C1-6烷基磺酸基、C1-6烷基羧酸基；X為鹵素；n為1-4的整數(shù)。另一方面，本發(fā)明提供上述基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料的制備方法，包括下述步驟：(1)6-羥基-2-萘甲酯與鹵代試劑按摩爾比1：1～2反應(yīng)，制備式Ⅱ的化合物：反應(yīng)時間為6～36h，反應(yīng)溫度為10～80℃，反應(yīng)溶劑為二氯甲烷、乙醇、二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯或其混合物；(2)式Ⅱ的化合物與式Ⅲ的化合物按摩爾比1:1～5反應(yīng)制備式Ⅳ的化合物：反應(yīng)時間為16～48h，反應(yīng)溫度為-5～5℃，反應(yīng)使用堿性物質(zhì)作為縛酸劑，反應(yīng)溶劑為丙酮、乙腈、DMSO或其混合物；(3)式Ⅳ的化合物與式Ⅴ的化合物按照摩爾比1～3:1反應(yīng)制備式Ⅰ的化合物:反應(yīng)時間為12～48h，反應(yīng)溫度為10～100℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺，乙二醇單甲醚，THF(四氫呋喃)或者其混合物，反應(yīng)使用催化劑為有機弱堿。另一方面，本發(fā)明提供上述基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料在生物樣品識別標(biāo)記中的應(yīng)用，尤其是離體的癌癥細(xì)胞和組織樣本與非癌癥細(xì)胞和組織樣本的差異標(biāo)記與識別。本發(fā)明所述的基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料通過特異性識別基團(tuán)靶向到生物標(biāo)志物KIAA1363，并依靠KIAA1363在癌癥和非癌癥細(xì)胞和組織中表達(dá)量的顯著差異識別癌癥和非癌癥細(xì)胞和組織。并且，本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料激發(fā)和發(fā)射波長均在近紅外區(qū)域，具有低的生物質(zhì)背景熒光，大的信噪比，具有高的靈敏性。同時，本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料具有低生物毒性和光毒性，良好的光穩(wěn)定性、細(xì)胞通透性。因此，本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料是一類操作簡便，靈敏度高，特異性的原位實時監(jiān)測識別染料，有良好的癌癥檢測以及術(shù)中輔助成像的應(yīng)用前景。附圖說明本發(fā)明附圖7幅：圖1是本發(fā)明所述的基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料的結(jié)構(gòu)通式I。圖2是熒光識別染料N1(5μM)分別加入不同溶劑中的紫外吸收光譜(圖2a)、熒光發(fā)射光譜(圖2b)、摩爾消光系數(shù)及熒光量子產(chǎn)率(圖2c)。所用儀器分別是AgIIlent8453紫外分光光度計，AgIIlentCaryEclIIpse熒光分光光度計，絕對熒光量子產(chǎn)率儀。圖3是熒光識別染料N1(2.5μM)對癌癥細(xì)胞與非癌癥細(xì)胞識別的激光共聚焦成像圖。熒光識別染料N1(2.5μM)分別對已經(jīng)孵育好的MCF-7細(xì)胞，Hela細(xì)胞，RWPE-1細(xì)胞，LO-2細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng)密度105cells/ml，皿底覆蓋70-80％)在培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO2條件下孵育染色20min，然后使用PBS震蕩漂洗1min×3，再加入無血清培養(yǎng)基。選擇代表性區(qū)域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)波長635nm，接收波段655-755nm，重復(fù)實驗3次。a,a’,b,b’,c,c’,d,d’分別為MCF-7，Hela，RWPE-1，LO-2的熒光通道圖和白光通道圖。圖4是熒光識別染料N1(2.5μM,5μM)進(jìn)行細(xì)胞毒性實驗圖。選取MCF-7細(xì)胞為研究對象，MTT實驗方法，24h實驗時間，測定570nm、630nm處的吸光值，計算細(xì)胞的存活率，并以細(xì)胞的存活率來表征熒光識別染料N1對細(xì)胞毒性的大小。圖5是熒光識別染料N1(2.5μM)用流式細(xì)胞儀對癌癥細(xì)胞和非癌癥細(xì)胞分選圖。激發(fā)波長為630nm，接受波段為700±10nm。a,e；b,f；c,g和d,h分別為RWPE-1，LO-2，MCF-7和Hela的分選結(jié)果。圖6是熒光識別染料N1(10μM)對癌癥組織與非癌癥組織識別的激光共聚焦成像圖。熒光識別染料N1(10μM)分別對癌癥組織和非癌癥組織切片染色5min，然后使用PBS震蕩漂洗5min×3，選擇代表性區(qū)域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)波長635nm，接收波段655-755nm，重復(fù)實驗3次。a,c和b，d分別為癌癥組織和正常組織的熒光通道圖和白光通道圖。圖7是熒光識別染料N1(50μM)對癌癥組織與非癌癥組織識別的活體儀成像結(jié)果。熒光識別染料N1(50μM)分別對癌癥組織和非癌癥組織塊染色10min，空白對照組使用癌癥組織塊使用PBS震蕩漂洗5min×3，激發(fā)波長630nm，接收波段700±10nm，重復(fù)實驗3次。組織1，1’為正常組織，組織2，2’為癌癥組織實驗組，組織3，3’為癌癥組織對照組。具體實施方式除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。本文中使用的術(shù)語“烷基”包括直鏈烷基和支鏈烷基。如提及單個烷基如“丙基”，則只特指直鏈烷基，如提及單個支鏈烷基如“異丙基”，則只特指支鏈烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。本文中使用的術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。本發(fā)明提供一類基于尼羅藍(lán)母體的熒光識別染料，具有通式Ⅰ的結(jié)構(gòu)：通式Ⅰ中：R1、R2、R3和R4各自獨立的選自C1-8烷基、C1-6烷基磺酸基、C1-6烷基羧酸基；X為鹵素；優(yōu)選Cl或Br，最優(yōu)選Br。n為1-4的整數(shù)，優(yōu)選n＝3或4，最優(yōu)選n＝3。實施方式之一，所述的R1優(yōu)選C1-8烷基，進(jìn)一步優(yōu)選C1-4烷基，尤其優(yōu)選甲基或乙基。實施方式之一，所述的R2優(yōu)選C1-8烷基，進(jìn)一步優(yōu)選C1-4烷基，尤其優(yōu)選甲基或乙基。實施方式之一，所述的R3優(yōu)選C1-8烷基，進(jìn)一步優(yōu)選C1-4烷基，尤其優(yōu)選甲基。實施方式之一，所述的R4優(yōu)選C1-8烷基，進(jìn)一步優(yōu)選C1-4烷基，尤其優(yōu)選甲基。具體實施方式中，也可以由所述優(yōu)選技術(shù)特征組合構(gòu)成本發(fā)明所述熒光識別染料的優(yōu)選技術(shù)方案，優(yōu)選的技術(shù)方案包括，所述的R1、R2、R3和R4均為甲基。最為優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明所述的熒光識別染料，具有化學(xué)式N1結(jié)構(gòu)：本發(fā)明另一方面提供一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料的制備方法，所述方法包括如下步驟：(1)6-羥基-2-萘甲酯與鹵代試劑按摩爾比1：1～2反應(yīng)，制備式Ⅱ的化合物：反應(yīng)時間為6～36h，反應(yīng)溫度為10～80℃，反應(yīng)溶劑為二氯甲烷、乙醇、二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯或其混合物；優(yōu)選的實施方式中，6-羥基-2-萘甲酯與鹵代試劑按摩爾比為1：1～1.5，反應(yīng)時間為10-30h，反應(yīng)溫度為20～60℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺、乙醇、乙酸乙酯或其混合物；更優(yōu)選實施方式中，6-羥基-2-萘甲酯與鹵代試劑按摩爾比為1:1～1.3，反應(yīng)時間為20-30h，反應(yīng)溫度為25～40℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺、乙酸乙酯或其混合物；最優(yōu)選實施方式中，6-羥基-2-萘甲酯與鹵代試劑按摩爾比為1:1～1.2，反應(yīng)時間為22-25h，反應(yīng)溫度為28～32℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺；(2)式Ⅱ的化合物與式Ⅲ的化合物按摩爾比1:1～5反應(yīng)制備式Ⅳ的化合物：反應(yīng)時間為16～48h，反應(yīng)溫度為-5～5℃，反應(yīng)使用堿性物質(zhì)作為縛酸劑，反應(yīng)溶劑為丙酮、乙腈、DMSO或其混合物；優(yōu)選的實施方式中，具有通式Ⅱ的化合物與具有通式Ⅲ的化合物按摩爾比為1:2～5，反應(yīng)時間為20～45h，反應(yīng)溫度為-3～4℃，反應(yīng)使用縛酸劑為碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉、氫氧化鈉或其混合物，反應(yīng)溶劑為丙酮、乙腈或其混合物；更優(yōu)選的實施方式中，具有結(jié)構(gòu)通式Ⅱ的化合物與具有結(jié)構(gòu)通式Ⅲ的化合物按摩爾比為1:2.5～4.5，反應(yīng)時間為25～40h，反應(yīng)溫度為-2～2℃，反應(yīng)使用縛酸劑為碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫或其混合物，反應(yīng)溶劑為丙酮、乙腈或其混合物；最優(yōu)選的實施方式中，具有結(jié)構(gòu)通式Ⅱ的化合物與具有結(jié)構(gòu)通式Ⅲ的化合物按摩爾比為1:3～3.5，反應(yīng)時間為28～30h，反應(yīng)溫度為0～1℃，反應(yīng)使用縛酸劑為碳酸銫，反應(yīng)溶劑為丙酮；(3)式Ⅳ的化合物與式Ⅴ的化合物按照摩爾比1～3:1反應(yīng)制備式Ⅰ的化合物，反應(yīng)時間為12～48h，反應(yīng)溫度為10～100℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺，乙二醇單甲醚，THF(四氫呋喃)或者其混合物，反應(yīng)使用催化劑為有機弱堿。優(yōu)選的實施方式中，具有結(jié)構(gòu)通式Ⅳ的化合物與具有結(jié)構(gòu)通式Ⅴ的化合物按照摩爾比為1.5～2.5:1，反應(yīng)時間為18～40h，反應(yīng)溫度為15～80℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺，乙二醇單甲醚，THF(四氫呋喃)或者其混合物，反應(yīng)使用催化劑為吡啶，三乙胺，DMAP，EDC，苯胺，HOBT或者其混合物；更優(yōu)選的實施方式中，具有結(jié)構(gòu)通式Ⅳ的化合物與具有結(jié)構(gòu)通式Ⅴ的化合物按照摩爾比為1.5～2.0:1，反應(yīng)時間為20～35h，反應(yīng)溫度為20～60℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺，乙二醇單甲醚或者其混合物，反應(yīng)使用催化劑為三乙胺，DMAP，EDC，HOBT或者其混合物；最優(yōu)選的實施方式中，具有結(jié)構(gòu)通式Ⅳ的化合物與具有結(jié)構(gòu)通式Ⅴ的化合物按照摩爾比為1.6～1.8:1，反應(yīng)時間為24～28h，反應(yīng)溫度為25～35℃，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺，反應(yīng)使用催化劑為DMAP，HOBT或者其混合物。本發(fā)明上述的制備方法中溶劑最優(yōu)選均為除水溶劑；本發(fā)明上述的制備方法中，各個取代基(R1，R2，R3，R4)，X和n的定義及優(yōu)選均與本發(fā)明中所述化合物的定義及優(yōu)選相同；本發(fā)明上述的制備方法中提純方法采用常規(guī)方法，沒有特別限制，優(yōu)選二氯甲烷/甲醇作為洗脫劑色譜柱分離、重結(jié)晶或兩者結(jié)合。并且所得染料可通過本領(lǐng)域公知的分離和純化技術(shù)回收，已達(dá)到需要純度；本發(fā)明上述的制備方法中所使用的原料均可市售或本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法制備得到；本發(fā)明上述的制備方法中合成的化合物均采用高分辨質(zhì)譜，核磁共振氫譜和核磁共振碳譜來確認(rèn)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料具有如下優(yōu)點：本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料熒光激發(fā)和發(fā)射波長大于630nm，具有優(yōu)異的近紅外熒光染料特性，適用于生物樣本檢測，具有低的生物質(zhì)背景熒光干擾，高靈敏度；本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料具有低的生物毒性，良好的光穩(wěn)定性、生物相容性、細(xì)胞及組織滲透性，可以對生物組織快速檢測，并且具有優(yōu)良的深度成像功能；本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料引入專一性靶向識別基團(tuán)，特異性識別癌癥細(xì)胞及組織中過量表達(dá)的酶KIAA1363，具有良好的特異性，可以對癌癥細(xì)胞及組織識別，對離體的癌癥細(xì)胞和組織樣本和非癌癥細(xì)胞和組織樣本差異性識別尤為突出；本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料原料易得，制備簡單，易產(chǎn)業(yè)化。鑒于此，本發(fā)明所述的一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料可用于癌癥細(xì)胞和組織識別，可用于深度組織成像和動物活體成像，對癌癥的實時原位檢測以及手術(shù)術(shù)中輔助成像有著良好的應(yīng)用前景。除了以本文中所述的形式直接用于腫瘤細(xì)胞和組織的染色外，含有本發(fā)明所述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料的組合物也可以用于腫瘤細(xì)胞和組織的染色。該組合物中應(yīng)當(dāng)包含有效量的本發(fā)明所提供的雙光子熒光探針化合物之一或其混合物。另外，生物樣品染色所需要的其它組分，例如溶劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些組分都是本行業(yè)內(nèi)已知的。上述組合物可以以水溶液形式存在，或者可以以臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。再一方面，本發(fā)明還提供使用上述一類基于尼羅藍(lán)母體熒光識別染料識別癌癥細(xì)胞核組織生物樣品的方法，該方法包括使所述化合物與生物樣品接觸的步驟。本文中使用的術(shù)語“接觸”可包括在溶液或固相中接觸。下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1熒光探針化合物N1的合成：(1)中間體2的合成將6-羥基-2-萘甲酯(10mmol)、NBS(12mmol)分別用10ml二甲基甲酰胺溶解，將6-羥基-2-萘甲酯的二甲基甲酰胺溶液加入圓底燒瓶中，NBS使用恒壓滴液漏斗逐滴加入圓底燒瓶。反應(yīng)過程中，控制反應(yīng)溫度在28～32℃，反應(yīng)體系充氮氣保護(hù)、加快速磁力攪拌，反應(yīng)持續(xù)時間24h。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液倒入冰水中，靜置后有白的沉淀析出，抽濾干燥，色譜柱分離得到白色固體中間體1(60.5％)。(2)中間體2的合成將中間體1(3mmol)溶解在10ml丙酮中和碳酸銫(6mmol)加入圓底燒瓶，N,N-2甲基甲酰氯(10.5mmol)使用5ml丙酮溶解，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加到圓底燒瓶。反應(yīng)過程中，控制反應(yīng)溫度在0～1℃，反應(yīng)體系充氮氣保護(hù)、加快速磁力攪拌，反應(yīng)持續(xù)時間30h。反應(yīng)完成后，加壓旋蒸出去溶劑，色譜柱分離得到淡黃色固體中間體2(82.07％)(3)熒光識別染料N1的合成將中間體2(1.6mmol)、中間體3(1mmol)、DMAP(2mmol)、HOBT(2mmol)用20ml二甲基甲酰胺溶解，加入圓底燒瓶中。反應(yīng)過程中，控制反應(yīng)溫度在30℃，反應(yīng)體系充氮氣保護(hù)、加快速磁力攪拌，反應(yīng)持續(xù)時間28h。反應(yīng)完成后反應(yīng)液用二氯甲烷稀釋20倍，色譜柱分離得到藍(lán)紫色固體熒光識別染料N1(31.59％)。1HNMR(400MHz,MeOD),δ8.84(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(s,1H),8.14–8.06(m,1H),7.91(t,J＝7.5Hz,1H),7.83(dd,J＝18.4,9.1Hz,4H),7.36(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(d,J＝9.4Hz,1H),6.93(s,1H),6.76(s,1H),3.78(t,J＝7.0Hz,2H),3.66(s,3H),3.48(t,J＝6.8Hz,2H),3.28(d,J＝8.8Hz,6H),3.07(s,3H),2.00–1.94(m,2H),1.80–1.74(m,2H),1.62(m,4H).13CNMR(100MHz,DMSO),δ165.52,154.89,154.02,152.87,152.06,148.91,148.01,147.33,145.70,141.51,132.84,132.46,131.03,130.14,129.74,129.60,129.44,127.81,126.38,126.13,124.22,123.97,123.76,123.20,114.20,109.20,96.75,95.83,50.27,38.58,36.44,36.26,30.68,29.09,26.88,26.43.TOFMS:m/zcalcdforC43H43ClN5O4+:708.2185,710.2165,found:708.2176,710.2176.實施例2熒光識別染料N1的光物理性質(zhì)使用實施例1中制備的熒光識別染料N1分別加入到Tris-HCl緩沖液，PBS緩沖液，HEPES緩沖液，二甲基亞砜，甲醇，丙酮，1,4-二氧六環(huán)，氯仿，乙酸乙酯，四氫呋喃，二氯甲烷中測試紫外吸收光譜(圖2a)、熒光發(fā)射光譜(圖2b)、摩爾消光系數(shù)及熒光量子產(chǎn)率(圖2c)，染料濃度5μM。所用儀器分別是AgIIlent8453紫外分光光度計和AgIIlentCaryEclIIpse熒光分光光度計。圖2表明熒光識別染料N1最大吸收和發(fā)射波長大于630nm處于紅外區(qū)，具有良好的光物理性能，適用于生物成像應(yīng)用。實施例3熒光識別染料N1對癌癥細(xì)胞和非癌癥細(xì)胞的識別使用實施例1中制備的熒光識別染料N1對癌癥細(xì)胞與非癌癥細(xì)胞識別的激光共聚焦成像圖。熒光識別染料N1(2.5μM)分別對已經(jīng)孵育好的MCF-7細(xì)胞，Hela細(xì)胞，RWPE-1細(xì)胞，LO-2細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng)密度105cells/ml，皿底70-80％覆蓋)培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO2條件下孵育染色20min，然后使用PBS震蕩漂洗1min×3，再加入無血清培養(yǎng)基。選擇代表性區(qū)域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦顯微鏡成像，激發(fā)波長635nm，接收波段655-755nm，重復(fù)實驗3次(圖3)。結(jié)果顯示，a,a’,b,b’,c,c’,d,d’分別為MCF-7，Hela，RWPE-1，LO-2的熒光通道圖和白光通道圖。通過對a，b，c，d的熒光強度對比發(fā)現(xiàn)，癌癥細(xì)胞MCF-7，Hlea細(xì)胞的有強的熒光信號，而正常細(xì)胞RWPE-1，LO-2只有微弱的熒光信號，表明熒光識別染料N1可以對癌癥細(xì)胞和非癌癥細(xì)胞區(qū)分。實施例4使用實施例1中制備的熒光識別染料N1(2.5μM,5μM)進(jìn)行細(xì)胞毒性實驗結(jié)果。選取MCF-7細(xì)胞為研究對象，MTT實驗方法，24h實驗時間，測定570nm、630nm處的吸光值，計算細(xì)胞存活率，并以細(xì)胞的存活率來表征熒光識別染料N1對細(xì)胞毒性的大小(圖4)。熒光識別染料N1在2.5μM,5μM細(xì)胞的存活率都在90％以上，說明熒光識別染料N1具有低的生物毒性，具有良好的生物檢測應(yīng)用前景。實施例5使用實施例1中制備的熒光識別染料N1流式細(xì)胞儀對癌癥細(xì)胞和非癌癥細(xì)胞分選結(jié)果。熒光識別染料N1濃度為2.5μM，激發(fā)波長630nm，接收波段690±10nm(圖5)。結(jié)果顯示，非癌癥細(xì)胞RWPE-1，LO-2的的熒光強度在102數(shù)量級，而癌癥細(xì)胞MCF-7，Hlea的熒光強度在104數(shù)量級，癌癥細(xì)胞與非癌癥細(xì)胞經(jīng)過熒光識別染料N染色后1的熒光強度差別明顯，熒光識別染料N1可以滿足在大量細(xì)胞分選中對癌癥細(xì)胞和非癌癥細(xì)胞識別區(qū)分。實施例6使用實施例1中制備的熒光識別染料N1(10μM)對癌癥組織與非癌癥組織識別的激光共聚焦成像圖。熒光識別染料N1(10μM)分別對癌癥組織和非癌癥組織切片染色5min，然后使用PBS震蕩漂洗5min×3，選擇代表性區(qū)域使用OlympusFV1000-IX81激光共聚焦顯微鏡成像，重復(fù)實驗3次，激發(fā)波長635nm，接收波段655-755nm(圖6)。a,c和b，d分別為癌癥組織和正常組織的熒光通道圖和白光通道圖，癌癥組織和正常組織經(jīng)過熒光識別染料N1染色后，使用635nm激光激發(fā)，獲得不同強度的熒光信號，并且癌癥組織的熒光信號遠(yuǎn)強于正常組織的熒光信號，熒光識別染料N1可以應(yīng)用于對癌癥組織與正常組織的區(qū)分，具有重要的醫(yī)學(xué)診斷以及熒光導(dǎo)向治療的意義。實施例7使用實施例1中制備的熒光識別染料N1(50μM)對癌癥組織與非癌癥組織識別的活體儀成像圖。熒光識別染料N1(50μM)分別對癌癥組織和非癌癥組織塊染色10min，空白對照組使用癌癥組織塊一直使用PBS作用。然后使用PBS震蕩漂洗5min×3，重復(fù)實驗3次。激發(fā)波長630nm，接收波段700±10nm(圖7)。組織1，1’為正常組織，組織2，2’為癌癥組織實驗組，組織3，3’為癌癥組織對照組，實驗結(jié)果顯示，熒光識別染料N1可以通過熒光強度的對比對癌癥組織腫塊和正常組織小塊明顯區(qū)分，有潛在的癌癥治療手術(shù)中術(shù)中成像應(yīng)用前景，可以應(yīng)用為良好的癌癥治療檢測熒光識別染料工具。