本發(fā)明涉及一種迅速測量油田污水和成品油中細菌含量的方法。

背景技術(shù)：

由細菌等微生物的生命活動引起的材料的腐蝕破壞被稱為微生物腐蝕(mic)。mic是一種普遍存在的現(xiàn)象。油氣田、油罐、加油站、油路甚至汽車油箱中都存在著大量的細菌。每年因腐蝕而造成的經(jīng)濟損失在一百億美元以上。其中最主要的腐蝕微生物為硫酸鹽還原菌(srb)，造成了美國生產(chǎn)油井77％以上的腐蝕損失。srb能夠在無氧環(huán)境下，以環(huán)境中的有機物為碳源，利用細菌生物膜內(nèi)產(chǎn)生的氫，將硫酸鹽還原為硫化氫，從氧化還原反應中獲得能量，而金屬也在此過程中被氧化腐蝕。目前srb的檢測方法主要有三種，分別為：培養(yǎng)檢測技術(shù)、顯微鏡檢測技術(shù)和生化直接檢測技術(shù)。培養(yǎng)檢測技術(shù)是目前應用較為廣泛的一種方法，其原理是將樣品做梯度稀釋，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上進行培養(yǎng)，最終根據(jù)稀釋倍數(shù)和細菌的陽性反應進行定量。該法的主要依據(jù)是美國石油協(xié)會api推薦的絕跡稀釋法，我國石油行業(yè)標準sy/t0532-2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》中也有詳細規(guī)定。相關(guān)專利已有報道(如cn102329851a、cn103983636a、cn1769472a、cn200510010459等)，目前市場上也存在srb專用測試瓶可供購買。培養(yǎng)檢測技術(shù)的優(yōu)點在于操作簡單、成本低廉，結(jié)果準確性較高。其主要缺點在于耗時長(2-14天)，培養(yǎng)菌種不完全導致定量結(jié)果偏低。一旦陰性對照組出現(xiàn)菌類生長，需要重做實驗，很難保證重新采樣結(jié)果與原樣本一致。

顯微鏡檢測技術(shù)結(jié)合了特異性染色方法與熒光計數(shù)方法，將熒光基團選擇性地標記到srb的表面，然后在熒光顯微鏡下計數(shù)以定量。但此種方法仍然需要短期培養(yǎng)以提高菌類濃度，培養(yǎng)周期在兩天左右。雖然其操作相對簡單、定量成本低，但需要染料分子的高特異性，且不能提供細菌活性的相關(guān)信息。

生化直接檢測技術(shù)包含了多種具體方式【關(guān)淑霞葉海春范瑩瑩油田污水中硫酸鹽還原菌檢測技術(shù)的研究進展化學與生物工程20122917】，可以檢測srb內(nèi)部或表面的某種蛋白(如用酶聯(lián)免疫吸附劑測定elisa方法測定腺苷-5’-磷酸硫酸鹽還原酶aps【如 gb2354072b、cn103983636a、ep272916a1】)，可以檢測srb特異性的核酸分子序列(如聚合酶鏈式反應pcr方法【cn105112543a、cn1769472a、cn200510010459】、熒光原位雜交fish方法【王明義梁小兵鄭婭萍趙由之魏中青硫酸鹽還原菌鑒定和檢測方法的研究進展微生物學雜志20052581】)，也可以檢測srb的代謝產(chǎn)物(如電位法或指示劑法測定h2s)【李婉義趙自光硫酸鹽還原菌菌量檢測方法的研究—硫離子選擇電極法化學傳感器19911164】。這些檢測方法準確性高、特異性高、檢測周期短(幾小時左右)，但操作復雜，一般只能在專門的生化實驗室內(nèi)由受過訓練的專業(yè)人員進行實驗。其中的aps檢測法相對簡單，國外已有商品化的試劑盒出售，可以實現(xiàn)快速現(xiàn)場測量，但該方法的缺點有：1)同時檢出所有具有aps的細菌種類，結(jié)果可能偏高；2)結(jié)果以顏色變化為指標定量不準確；3)細菌裂解可能不徹底造成檢出結(jié)果偏低。

綜上所述，目前缺乏一種快速、便捷、準確的現(xiàn)場測定方法和裝備。本專利描述的是一種基于核酸分子放大技術(shù)的樣品中細菌的特異性、自動化、可攜帶式定量檢測裝置。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中測量速度較慢、不便捷、結(jié)果不準確的問題，提供一種新的迅速測量油田污水和成品油中細菌含量的方法。該方法具有快速、便捷、準確的優(yōu)點。

為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種迅速測量油田污水和成品油中細菌含量的方法，在液體樣品中細菌含量測量裝置上，進行液體樣品中細菌含量的測量；所述裝置包括箱體、細菌富集和核酸分子提取設備，所述細菌富集和核酸分子提取設備包括試劑管放置位置(1)和試劑管放置位置(4)、濾膜(2)、吸附層(3)反應池(5)、光源(6)、濾光片(7)、感光器(8)以及至少四個閥門，所述試劑管放置位置(1)底部與濾膜(2)上方空間連通，濾膜(2)下方空間分為兩路，一路與閥門a入口端相連，另一路與閥門b入口端相連，閥門a出口端與廢液池相連，閥門b出口端通過管道與吸附層(3)入口側(cè)相連，吸附層(3)出口側(cè)的管道分為兩路，一路與閥門c入口端相連，閥門c出口端與廢液池相連，另一路經(jīng)過閥門d后與反應池(5)相連；試劑管放置位置(4)底部與通過管道與閥門b與吸附層入口側(cè)之間的管道相連；光源(6)為反應池(5)提供染料分子激發(fā)能量，產(chǎn)生的熒光透過濾光片(7)后由感光器(8)接收；濾膜(2)上方空間的頂部、試劑管放置位置(4)的底部均設有金屬尖刺，當試劑管放置在試劑管放置 位置(1)或試劑管放置位置(4)上時可以刺破試劑管底部的鋁箔；油田污水和成品油中細菌含量的測量步驟包括：

(a)在試劑管中裝入樣品，放置于試劑管放置位置(1)，試劑管底部鋁箔包裝被下部金屬尖刺破，液體流入濾膜上方，小于濾膜孔徑的液體穿過濾膜后進入廢液池；

(b)當試劑管中的樣品全部流過濾膜后，程序自動控制試劑管更替為預置在箱體內(nèi)的盛裝乙醇溶液的試劑管，重復上述加壓流程以沖洗濾膜，然后繼續(xù)自動控制試劑管更替為盛裝去離子水或緩沖液的試劑管進行沖洗操作；

(c)對濾膜的沖洗完成后，在試劑管放置位置(1)上更換為盛裝細菌裂解液試劑管，將試劑管中的細菌裂解液流經(jīng)吸附層(3)后進入廢液池；

(d)在試劑管放置位置(4)上放置盛裝洗滌液的試劑管進行沖洗，移除細菌裂解液中的雜質(zhì)；

(e)沖洗結(jié)束后，在試劑管放置位置(4)上放置盛裝緩沖液的試劑管，緩沖液流經(jīng)吸附層3時將dna洗脫下來，沖洗至反應池(5)；

(f)當核酸放大反應在反應池(5)中發(fā)生時，光源(6)發(fā)出的光激發(fā)反應池(5)中的染料分子，產(chǎn)生的熒光由感光器(8)接收，染料分子的濃度與溶液中核酸分子的濃度正相關(guān)，由此判斷核酸分子的初始濃度。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，當試劑管放置在試劑管放置位置(1)上時，在試劑管上部放置活塞，將試劑管中的試劑向下壓入濾膜(2)上方的空間中。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述細菌富集和核算分子捕捉設備集成在所述箱體內(nèi)。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，閥門a～閥門d為程序控制的電磁閥，或采用微流控的微閥技術(shù)，由氣泵控制其開關(guān)。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，反應池(5)的上方為開口或透光性材料，內(nèi)部預置反應母液或冷凍干燥后的試劑球，核酸洗脫液流入反應池(5)后與預置溶液或試劑球混合。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，感光器(8)出的信號被送至信號處理單元進行分析。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，試劑管放置位置(1)或試劑管放置位置(4)置于較高位置，便于液體下流至較低位置。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，當采用pcr方法時，需要在反應池(5)周邊設置快速加熱-冷卻模塊以實現(xiàn)變性-退火-延伸的溫度循環(huán)；當采用等溫放大方法的時候，反應池周圍只需要設置加熱模塊即可。

上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，試劑管的更換通過自動控制系統(tǒng)完成。

本發(fā)明中，細菌富集是通過樣品流經(jīng)濾膜實現(xiàn)的。當樣品加入后，樣品管底部鋁箔包裝被下部金屬尖刺破，液體流入濾膜2上方，此時在上方施加壓力，推動液體經(jīng)過濾膜，大于濾膜孔徑的固體物質(zhì)被留在濾膜上，液體流出。此時閥門a開啟，閥門b關(guān)閉，廢液流出至廢液池。當樣品為油田廢水等水相物質(zhì)時，采用親水性濾膜，濾膜尺寸應在0.5微米以下，以確保目標微生物能夠保留在濾膜上。當樣品為成品油等油相物質(zhì)時，采用親油性濾膜。當樣品全部流經(jīng)濾膜后，程序自動控制樣品管更替為預置在箱體內(nèi)的乙醇溶液，重復上述加壓流程以沖洗濾膜。繼續(xù)更替為去離子水或合適ph的緩沖液進行沖洗。當沖洗結(jié)束后，加入細菌裂解液，等待一定時間后開始加壓，此時閥門a關(guān)閉，閥門b開啟，細菌裂解液進入核酸提取單元。核酸提取單元中預置了dna吸附柱(吸附層3內(nèi))，上游流入的細菌裂解液在流經(jīng)吸附層3時，其中的dna被吸附在吸附層3上，液相流入廢液池。此時閥門c開，閥門d關(guān)閉。試劑管放置位置4上的試管內(nèi)為預置的洗滌液，同樣通過壓力使其流經(jīng)吸附層3以帶走雜質(zhì)。更換試劑管放置位置4上的試管以重復洗滌流程。當洗滌結(jié)束時，更換試劑管放置位置4上的試管內(nèi)溶液為少量ph合適的緩沖液。此時閥門c關(guān)閉，閥門d開啟。緩沖液流經(jīng)吸附層3時將dna洗脫下來，沖洗至反應池5。反應池5中預置了核酸放大反應需要的各個成份，可以為配制好的母液，也可以為了長期保存目的放置冷凍干燥后的試劑，由沖入的緩沖液溶解。放大及檢測單元由反應池5、光源(鹵燈或led)6、濾光片7、感光器(ccd或pmt)8組成。當核酸放大反應在反應池5中發(fā)生時，光源6發(fā)出的光激發(fā)反應池5中的染料分子，產(chǎn)生的熒光由感光器8接收。染料分子的濃度與溶液中核酸分子的濃度正相關(guān)，可以由此判斷核酸分子的初始濃度。

本發(fā)明所述裝置包含了細菌富集、核酸分子提取和放大讀出三個單元，是一種整合型可攜帶式自動化儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場測量。細菌富集單元采用樣品流經(jīng)過濾膜的方式實現(xiàn)細菌的分離和富集，所需時間與培養(yǎng)法相比大大縮短。核酸分子提取和放大讀出均在微流控平臺上實現(xiàn)。提取部分采用二氧化硅吸附柱技術(shù)吸附dna分子，由程序控制以壓力推動試劑分別流經(jīng)吸附柱，最終得到純凈的核酸分子。在放大讀出單元中，可以選擇性采用pcr方法或環(huán)介導等溫放大(lamp)方法。與常規(guī)pcr方法相比，lamp方法的特異性更高，對反應介質(zhì)中雜質(zhì)的耐受性更高，反應效率更高，檢出時間更短(可縮短至20分鐘)，且不需要變性-退火-延伸的溫度循環(huán)，降低了對溫控模塊的要求。所有操作由程序控制，除加樣外無需手動操作，提高了測試的平行性和便捷性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述裝置的外觀示意圖；

圖2為本發(fā)明所述裝置內(nèi)部各模塊結(jié)構(gòu)示意圖；

圖1、圖2中，1為試劑管放置位置；2為濾膜；3為吸附層；4為試劑管放置位置；5為反應池；6為光源；7為濾光片；8為感光器；a～d為閥門。

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但不僅限于本實施例。

具體實施方式

【實施例1】

一種迅速測量油田污水和成品油中細菌含量的方法，如圖1、圖2所示。在液體樣品中細菌含量測量裝置上，進行液體樣品中細菌含量的測量；所述裝置包括箱體、細菌富集和核酸分子提取設備，所述細菌富集和核酸分子提取設備包括試劑管放置位置(1)和試劑管放置位置(4)、濾膜(2)、吸附層(3)反應池(5)、光源(6)、濾光片(7)、感光器(8)以及至少四個閥門，所述試劑管放置位置(1)底部與濾膜(2)上方空間連通，濾膜(2)下方空間分為兩路，一路與閥門a入口端相連，另一路與閥門b入口端相連，閥門a出口端與廢液池相連，閥門b出口端通過管道與吸附層(3)入口側(cè)相連，吸附層(3)出口側(cè)的管道分為兩路，一路與閥門c入口端相連，閥門c出口端與廢液池相連，另一路經(jīng)過閥門d后與反應池(5)相連；試劑管放置位置(4)底部與通過管道與閥門b與吸附層入口側(cè)之間的管道相連；光源(6)為反應池(5)提供染料分子激發(fā)能量，產(chǎn)生的熒光透過濾光片(7)后由感光器(8)接收；濾膜(2)上方空間的頂部、試劑管放置位置(4)的底部均設有金屬尖刺，當試劑管放置在試劑管放置位置(1)或試劑管放置位置(4)上時可以刺破試劑管底部的鋁箔。

本發(fā)明所述的裝置集成在0.5m*0.4m*0.4m的金屬箱體中，箱體外殼上設有控制面板以及可以掀開的操作板，用戶只需要根據(jù)需要打開面板裝入約1ml液體樣品即可。

本發(fā)明中，細菌富集是通過樣品流經(jīng)濾膜實現(xiàn)的。當樣品加入后，樣品管底部鋁箔包裝被下部金屬尖刺破，液體流入濾膜2上方，此時在上方施加壓力，推動液體經(jīng)過濾膜，大于濾膜孔徑的固體物質(zhì)被留在濾膜上，液體流出。此時閥門a開啟，閥門b關(guān)閉，廢液流出至廢液池。當樣品為油田廢水等水相物質(zhì)時，采用親水性濾膜，濾膜尺寸應在0.5微米以下，以確保目標微生物能夠保留在濾膜上。當樣品為成品油等油相物質(zhì)時，采用親油性濾膜。當樣品全部流經(jīng)濾膜后，程序自動控制樣品管更替為預置在箱體內(nèi)的乙醇溶液，重復上述加壓流程以沖洗濾膜。繼續(xù)更替為去離子水或合適ph的緩沖液進行沖 洗。當沖洗結(jié)束后，加入細菌裂解液，等待一定時間后開始加壓，此時閥門a關(guān)閉，閥門b開啟，細菌裂解液進入核酸提取單元。核酸提取單元中預置了dna吸附柱(吸附層3內(nèi))，上游流入的細菌裂解液在流經(jīng)吸附層3時，其中的dna被吸附在吸附層3上，液相流入廢液池。此時閥門c開，閥門d關(guān)閉。試劑管放置位置4上的試管內(nèi)為預置的洗滌液，同樣通過壓力使其流經(jīng)吸附層3以帶走雜質(zhì)。更換試劑管放置位置4上的試管以重復洗滌流程。當洗滌結(jié)束時，更換試劑管放置位置4上的試管內(nèi)溶液為少量ph合適的緩沖液。此時閥門c關(guān)閉，閥門d開啟。緩沖液流經(jīng)吸附層3時將dna洗脫下來，沖洗至反應池5。反應池5中預置了核酸放大反應需要的各個成份，可以為配制好的母液，也可以為了長期保存目的放置冷凍干燥后的試劑，由沖入的緩沖液溶解。放大及檢測單元由反應池5、光源(鹵燈或led)6、濾光片7、感光器(ccd或pmt)8組成。當核酸放大反應在反應池5中發(fā)生時，光源6發(fā)出的光激發(fā)反應池5中的染料分子，產(chǎn)生的熒光由感光器8接收。染料分子的濃度與溶液中核酸分子的濃度正相關(guān)，可以由此判斷核酸分子的初始濃度。

為了使本發(fā)明的優(yōu)點、技術(shù)方案更加清楚、明確，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的步驟做詳細說明。

液體在設備中的流動通過壓力驅(qū)動實現(xiàn)，其中試劑管放置位置1、試劑管放置位置4置于較高位置，便于液體下流至較低位置，上方橡膠活塞在向下移動過程中產(chǎn)生推力，使液體流過濾膜和吸附柱。試劑管放置位置1和試劑管放置位置4的底部位置為鋁箔材質(zhì)，在進入指定位置時會被下方固定的金屬針尖刺破，使里面的液體流出。試劑管放置位置1位置預置溶液為乙醇沖洗液、緩沖液沖洗液以及細胞裂解液(含溶菌酶、ctab或sds)；4位置預置溶液為洗滌液(兩次)和緩沖液洗脫液。

濾膜2的選用：可以根據(jù)樣品的區(qū)別選用不同性質(zhì)的濾膜，濾膜2所在部分為可拆卸式，位于裝置的前端，可以由用戶拆卸。濾膜可以選用尼龍、聚偏氟乙烯、纖維素、聚丙烯、ptfe、陶瓷等，根據(jù)樣品的親水和疏水性以及可能含有的雜質(zhì)選擇不同的濾膜。吸附層3中的核酸吸附柱采用二氧化硅材料，能夠特異性吸附dna和rna分子，通過調(diào)節(jié)溶液的ph值控制核酸分子的吸脫附。

閥門a～d可以為程序控制的電磁閥，也可以采用微流控的微閥技術(shù)，由氣泵控制管路的開關(guān)。

反應池5位置上方為開口或透光性材料，內(nèi)部預置反應母液或冷凍干燥后的試劑球，核酸洗脫液流入反應池5后與預置溶液或試劑球混合。此時加熱模塊開始工作，核酸放大 反應開始。隨著反應的進行，溶液中染料與形成的核酸分子結(jié)合(sybrgreen檢出)或溶液中生成能夠發(fā)出熒光的染料分子(qaqman檢出)或溶液中的染料與反應副產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光(lampcalcein檢出)，熒光由光源激發(fā)，感受器檢測，檢出的信號被送至信號處理單元進行分析(此部分未展示在示意圖中)。

油田廢水中srb的定量檢測

由于樣品為水溶液，采用孔徑在0.2微米的纖維素膜。用戶需要首先更換濾膜部分，用特定樣品管收集油田廢水1ml，打開機蓋將其放入裝置中，在面板上設定相關(guān)參數(shù)，啟動檢測流程。整個流程大約持續(xù)30～120分鐘。

針對srb菌種，使用srb特異性核酸放大試劑盒，其中的pcr引物和探針設計可以參考相關(guān)文獻或自行設計。對于lamp反應，目前還未有相關(guān)文獻報道，市場上也還未有成品試劑盒，需要進一步針對srb的16srdna區(qū)域進行引物設計和開發(fā)。

檢測結(jié)束后可以獲得熒光的實時變化趨勢，根據(jù)反應的動力學數(shù)據(jù)可以推算出樣品中srb的濃度，計算方法預設在程序中。結(jié)果可以顯示在面板上，導出至計算機中，通過郵件或短信形式發(fā)送，或直接上傳至云中供統(tǒng)計用。

在本實施例中，放入樣品為0.8ml含有10⁷cfusrb的水溶液，操作總時長為75分鐘，根據(jù)lamp曲線拐點位置計算得出試劑濃度為1.2×10⁷cfu/ml，與樣品值相同。

需要說明的是，在本說明書的教導下本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以作出這樣或那樣的容易變化方式，諸如等同方式，或明顯變形方式，均應在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。