本發(fā)明涉及一種萘啶酮類化合物、及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

丙型肝炎是常見(jiàn)的血源性傳染疾病，其病因是丙型肝炎病毒(hapatitiscvirus，hcv)的感染。hcv感染人肝細(xì)胞，導(dǎo)致慢性肝炎，肝纖維化，肝硬化和肝癌。全球范圍內(nèi)約有1.7億人感染丙肝病毒，我國(guó)普通人群抗hcv陽(yáng)性檢出率達(dá)3.2％，預(yù)計(jì)hcv感染者在4千萬(wàn)以上。hcv屬黃病毒科肝炎病毒屬，病毒粒子球形，有包膜?；蚪M為單正鏈rna，全長(zhǎng)約9.6kb，有兩側(cè)非編碼區(qū)(utr)和中間以開(kāi)放讀碼框(orf)組成。5’utr帶有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)，非常保守；3’utr與復(fù)制起始有關(guān)。orf編碼3010-3033個(gè)氨基酸的nh2-c-e1-e2-p7-ns2-ns3-ns4a-ns5a-ns5b-cooh多聚蛋白前體。

ns3蛋白酶也稱絲氨酸蛋白酶，位于631個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的ns3蛋白的n末端區(qū)，由180氨基酸構(gòu)成，是一種序列相對(duì)保守的多功能蛋白酶。ns3n端180個(gè)氨基酸與ns2可構(gòu)成含zn²⁺的金屬蛋白酶，催化ns2-3的裂解，與ns4a結(jié)合則構(gòu)成絲氨酸蛋白酶，可以水解病毒前體蛋白，ns3-ns4a-ns4b-ns5a-ns5b間的連接，直接決定著病毒各功能蛋白的成熟，而且ns3蛋白酶還直接影響著ns3c端螺旋酶/ntpase和ns5brna復(fù)制酶活性，因此，抑制其活性可有效地抑制病毒前體蛋白成熟和病毒復(fù)制，是丙型肝炎治療藥物研究的重要靶點(diǎn)。目前已成功的開(kāi)發(fā)了多種ns3/4a蛋白酶抑制劑，已上市的有特拉匹韋、波普瑞韋和司美匹韋。然而，由于ns3/4a蛋白酶抑制劑耐藥屏障低，易交叉耐藥，因此開(kāi)發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、價(jià)格低廉的新型hcvns3/4a絲氨酸蛋白酶抑制藥物顯得十分必要。

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物歷來(lái)是天然藥物的重要來(lái)源，天然產(chǎn)物具有獨(dú)特的 生物活性機(jī)制，具有立體構(gòu)型的優(yōu)勢(shì)。微生物藥物來(lái)源豐富、化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，因此篩選新的菌株合成生物體原本難以合成的化合物機(jī)率較大，并且微生物發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分離純化過(guò)程具有條件溫和、環(huán)境友好、成本低、可在人工控制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種萘啶酮類化合物、及其制備方法和應(yīng)用。萘啶酮類化合物1，2-二甲基-5-(三氮環(huán)雜丙烷)-2，3-二氫-2，7-萘啶-4(1h)-酮對(duì)丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶具有一定的抑制作用；且該化合物的制備方法具有材料來(lái)源方便、制備周期短、綠色環(huán)保和工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明提供了一種如式i所示的萘啶酮類化合物1，2-二甲基-5-(三氮雜環(huán)丙烷)-2，3-二氫-2，7-萘啶-4(1h)-酮：

本發(fā)明還提供了一種上述式i化合物的制備方法，其包括以下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)畢赤屬真菌(pichia)，收集菌體，將菌體與有機(jī)溶劑混合，破碎菌體，固液分離，收集上層清液，即可。

本發(fā)明所述的畢赤屬真菌可為本領(lǐng)域常規(guī)的畢赤屬真菌，只要屬于畢赤屬真菌屬并且在發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生式i化合物，即可。所述的畢赤屬真菌較佳地為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)保藏的菌株編號(hào)為2.3663的蒙畢赤酵母(pichiaguilliermondii)。

本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)畢赤屬真菌的發(fā)酵條件可采用本領(lǐng)域畢赤屬真 菌發(fā)酵培養(yǎng)的常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)條件，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基較佳地為：葡萄糖25～30g/l(更佳地為30g/l)，(nh4)so415～20g/l(更佳地為20g/l)，酵母提取物8～10g/l10g/l)，mgso4·7h2o0.8～1g/l(更佳地為1g/l)，feso4·7h2o0.05～0.08g/l(更佳地為0.05g/l)，水(優(yōu)選去離子水)，g/l是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為5～7.5(更佳地為5.5～6.5)。培養(yǎng)溫度較佳地為25～37℃，更較佳地為30～35℃；培養(yǎng)時(shí)間較佳地為144～240h，更較佳地為168h；震蕩速度較佳地為150～250r/minr/min，更較佳地為220～240r/min。

其中，在所述的發(fā)酵培養(yǎng)畢赤屬真菌之前還可包括畢赤屬真菌菌株種子液的制備過(guò)程，其制備的步驟和條件可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，本發(fā)明較佳地包括以下步驟：將保藏在甘油管的畢赤屬真菌菌株接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可；其中，所述的種子培養(yǎng)基較佳地為：酵母提取物5～15g/l(更佳地為5g/l，葡萄糖10～30g/l(更佳地為20g/l)，蛋白胨5～15g/(更佳地為10g/l)，水(優(yōu)選去離子水)，g/l是指各組分與種子培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比；所述的種子培養(yǎng)基的ph為5～7.5(更佳地為5.5)。所述的甘油管中為甘油水溶液，所述的甘油水溶液的濃度可為本領(lǐng)域常規(guī)的濃度，較佳地為20％的甘油水溶液，所述的百分比為體積百分比。所述的種子液的制備過(guò)程中，培養(yǎng)溫度較佳地為25～35℃，更佳地為30℃；震蕩速度較佳地為150～250r/min，更佳地為220r/min；培養(yǎng)時(shí)間較佳地為16～36h，更佳地為24h。在所述的種子液制備好之后，還可包括將所述的種子液接種至所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的過(guò)程，其中，所述的接種的方法和條件可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，所述的種子液與所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比可為本領(lǐng)域常規(guī)的體積比，本發(fā)明較佳地1∶100～1∶250，較佳地為1∶200～1∶220。

本發(fā)明所述的式i化合物的制備方法中，所述的收集菌體的方法可參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，一般為將發(fā)酵培養(yǎng)畢赤屬真菌(pichia)得到的發(fā)酵液經(jīng)固液分離，得到所述的菌體；其中，所述的固液分離的方法可參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，較佳地為離心方法；所述的離心方法中，轉(zhuǎn)速較佳地為3000～ 5000r/min，離心時(shí)間較佳地0.5～1h。

本發(fā)明所述的式i化合物的制備方法中，所述有機(jī)溶劑可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為酮類有機(jī)溶劑和/或醇類有機(jī)溶劑；所述的酮類有機(jī)溶劑較佳地為丙酮；所述的醇類有機(jī)溶劑較佳地為甲醇或乙醇。所述的破碎菌體的方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)破碎菌體的方法，較佳地為超聲處理法或高壓勻漿破壁法。所述超聲處理法的條件可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，超聲頻率較佳地為40～70khz(更佳地為42khz)；超聲處理時(shí)間較佳地為60～120min(更佳地為40min)；超聲處理的次數(shù)較佳地為3次。所述的固液分離的方法可參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，較佳地為離心方法；所述的離心的條件為，轉(zhuǎn)速較佳地為3000～5000r/min，離心時(shí)間較佳地為0.5～1h。

本發(fā)明所述的式i化合物的制備方法，還可進(jìn)一步包括濃縮所述的上層清液，得式i化合物粗品的過(guò)程。所述的濃縮可采用本領(lǐng)域常規(guī)的濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮。所述的減壓濃縮的條件可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，溫度較佳地為40～50℃(優(yōu)選40～45℃)，真空度較佳地為700～800mmhg(例如758mmhg)。

本發(fā)明還提供了一種式i化合物的分離純化方法，包括以下步驟：

(1)將上述式i化合物粗品采用反相硅膠柱層析分離，以流動(dòng)相為水進(jìn)行洗脫，或者以流動(dòng)相依次為水、甲醇-水混合液、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，收集含式i化合物的洗脫液并濃縮；

(2)將步驟(1)所得產(chǎn)物采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相為體積含量為15％的甲醇水溶液，收集含式i化合物的洗脫液并濃縮；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相為體積含量為10％的甲醇水溶液，收集含式i化合物的洗脫液并濃縮。

步驟(1)中，所述的反相硅膠層析柱可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地以十八烷基硅烷鍵合硅膠(ods-c18)為填充劑，更佳地為ymc公司生產(chǎn)的批號(hào)為9955的ods-c18。流動(dòng)相的流速可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明較佳地10～40ml/min，更佳地10ml/min。所述的濃縮可采用 本領(lǐng)域常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮。所述反相硅膠層析柱的填充物與步驟(1)所得產(chǎn)物的質(zhì)量比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明較佳地為6∶1～1∶1，更佳地為4.4∶1。

步驟(1)中，當(dāng)流動(dòng)相為水進(jìn)行洗脫時(shí)，所述的水與步驟(1)所得產(chǎn)物的體積質(zhì)量比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明較佳地為80～40ml/g，更佳地為55ml/g。

步驟(1)中，當(dāng)流動(dòng)相依次為水、甲醇-水混合液、甲醇進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，所述的流動(dòng)相較佳地為梯度依次為水、20％、40％、50％、60％、80％和100％的甲醇-水混合液，其中，所述的百分比為甲醇占甲醇-水混合液的體積比。每個(gè)梯度洗脫液與步驟(1)所得產(chǎn)物的體積質(zhì)量比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明較佳地為80～40ml/g，更佳地為55ml/g。所述的收集含式i化合物的洗脫液，較佳地為收集流動(dòng)相較佳地為收集0％甲醇-水混合液。

步驟(1)所得產(chǎn)物的儲(chǔ)存條件一般為4℃下進(jìn)行低溫保存。

步驟(2)中，所述的反相硅膠層析柱可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為aq-c18反相硅膠層析柱；所述反向硅膠層析柱的柱內(nèi)徑×柱長(zhǎng)較佳地為14×150～14×250mm；所述的aq-c18的粒徑較佳地為10μm。流動(dòng)相的流速可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明較佳地為2～4ml/min，更佳地為4ml/min。柱溫可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為40℃。進(jìn)樣量可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選400μl；所述的式i化合物的出峰時(shí)間較佳地為9.5～10.5min(更較佳地為10min)?；衔锏臋z測(cè)波長(zhǎng)可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，一般為210nm。所述的濃縮可采用本領(lǐng)域常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮。所述的減壓濃縮的條件可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，溫度較佳地為40～50℃，真空度較佳地為700～800mmhg。

步驟(3)中，所述的反相硅膠層析柱可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為aq-c18反相硅膠層析柱；所述反向硅膠層析柱的柱內(nèi)徑×柱長(zhǎng)較佳地為14×150～14×250mm；所述的aq-c18的粒徑較佳地為5μm。流動(dòng)相 的流速可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明較佳地為2～4ml/min，更佳地為4ml/min?；衔锏臋z測(cè)波長(zhǎng)可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，一般為210nm。進(jìn)樣量可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選400μl；所述的式i化合物的出峰時(shí)間較佳地為15.0～16min(更較佳地為15.5min)。所述的濃縮可采用本領(lǐng)域常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮。柱溫可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為40℃。所述的減壓濃縮的條件可參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，溫度較佳地為40～50℃，真空度較佳地為700～800mmhg。

步驟(1)、步驟(2)或步驟(3)中可以采用液相檢測(cè)洗脫液中是否含式i化合物，所述的液相檢測(cè)的檢測(cè)條件較佳地為：色譜柱：ultimateaq-c18，ultimateaq-c18的粒徑為5μm，柱內(nèi)徑×柱長(zhǎng)為14×150mm；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：a)甲醇b)水，流速：1ml/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣：10μl，洗脫濃度：30％(v/v)甲醇。式i化合物的出峰時(shí)間一般為7.4～7.5min(較佳地為7.45min)。

本發(fā)明還提供了一種式i化合物在制備丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種式i化合物在制備用于治療和/或預(yù)防與丙型肝炎病毒相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的式i化合物，和藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。

本發(fā)明還提供了一種式i化合物在制備用于免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗纖維化、降血糖、抗細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指所限定的化合物、鹽、組合物、賦形劑或載體等在化學(xué)和/或毒理學(xué)上與對(duì)象相容，并且在與對(duì)象接觸時(shí)不引發(fā)過(guò)度的毒性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)或其它不良反應(yīng)并且不損及其有益效果。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指足以提供需要或預(yù)期的生物學(xué)效果的量，該生物學(xué)效果可以是減輕和/或緩解疾病或醫(yī)學(xué)狀況的體征、癥狀或起因，或者對(duì)生物系統(tǒng)的任何其它期望的改變。具體地，在疾病狀態(tài)、癥狀 或醫(yī)學(xué)狀況中提供臨床相關(guān)變化所需的式i所示化合物或其藥學(xué)可接受的鹽或藥物組合物的量，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)具體情況通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。

可以將本發(fā)明所述的式i化合物或所述的藥物組合物配制成適合于期望的給藥途徑的劑型，可為：適合于口服給藥的劑型，例如片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、糖漿劑、酏劑、混懸劑、溶液劑、乳劑和錠劑等；適合于舌下給藥的劑型例如含片劑等；適合于腸胃外給藥的劑型，例如無(wú)菌溶液劑和混懸劑等；適合于透皮給藥的劑型，例如透皮貼劑等；適合于直腸給藥的劑型，例如栓劑；適合于鼻腔或口腔吸入給藥的劑型，例如氣霧劑和干粉劑等；適合于局部給藥的劑型，例如乳膏劑、洗劑、糊劑、噴霧劑、泡沫劑和凝膠劑等，以及其它本領(lǐng)域已知的適合于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)等給藥途徑的劑型。所述劑型可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行配制。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑”是指與本發(fā)明所述藥物組合物的給藥方式或劑型相容并且在與對(duì)象接觸時(shí)不引發(fā)過(guò)度的毒性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)或其它不良反應(yīng)并且不損及該組合物本身的有益效果的載體和/或賦形劑?？捎糜诒景l(fā)明所述的藥物組合物中的賦形劑的實(shí)例包括但不限于，例如，稀釋劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、造粒劑、包衣劑、潤(rùn)濕劑、溶劑、共溶劑、助懸劑、乳化劑、甜味劑、矯味劑、掩味劑、著色劑、防結(jié)塊劑、保濕劑、螯合劑、塑化劑、增粘劑、抗氧化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖劑及其它本領(lǐng)域已知的常規(guī)賦形劑?？捎糜诒景l(fā)明所述的藥物組合物中的載體的實(shí)例包括但不限于，例如，增溶劑、等滲劑、緩沖劑、含水載體、水溶性載體、油性載體及其它本領(lǐng)域已知的常規(guī)載體。適合的含水載體包括但不限于，例如，無(wú)菌水、生理鹽水、林格溶液、等滲葡萄糖注射液，及其它本領(lǐng)域已知的常規(guī)含水載體。適合的油性載體包括但不限于，例如，植物來(lái)源的非揮發(fā)油例如蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄欖油、花生油、薄荷油、紅花油、芝麻油、豆油、豆油、椰子油、棕櫚油或其氫化衍生物，及其它本領(lǐng)域已知的常規(guī)油性載體。適合的水溶性載體包 括但不限于，例如，一元醇如乙醇、二元醇如乙二醇、丙二醇或丁二醇，多元醇如甘油、聚乙二醇、n-甲基-2-吡咯烷酮、n，n-二甲基乙酰胺、二甲亞砜，及其它本領(lǐng)域已知的常規(guī)水溶性載體。

在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明中式i化合物1，2-二甲基-5-(三氮雜環(huán)丙烷)-2，3-二氫-2，7-萘啶-4(1h)-酮對(duì)丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶有一定的抑制作用；且該化合物的制備方法具有材料來(lái)源方便、制備周期短、綠色環(huán)保和工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中步驟(1)的流程圖。

圖2為實(shí)施例1中步驟(2)的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。

實(shí)施例1

步驟(1)真菌的發(fā)酵：

將保藏在甘油管(20％v/v的甘油水溶液)中的季也蒙畢赤酵母(pichiaguilliermondii)菌種接種至含50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，30℃，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。

種子培養(yǎng)基：酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，實(shí)驗(yàn)用水，ph5.5。

接種1ml的種子液至750ml的三角搖瓶(含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基)中，30℃， 220r/min的條件下培養(yǎng)168h。共富集30l真菌發(fā)酵液。

發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30g/l，(nh4)so420g/l，酵母提取物10g/l，mgso4·7h2o1g/l，feso4·7h2o0.05g/l，實(shí)驗(yàn)用水，ph5.5。

制備發(fā)酵粗產(chǎn)物

富集得到30l真菌發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，棄去上層清液，加入15l丙酮浸泡菌體，輔以超聲(42khz)處理40min。反復(fù)三次超聲處理。4000r/min離心30min，取上層清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40-45℃，真空度758mmhg)至干，得到真菌菌體的丙酮萃取組分(即式i化合物粗品)，共18g，真菌發(fā)酵液預(yù)處理過(guò)程如圖1所示。

步驟(2)式i化合物1，2-二甲基-5-(三氮雜環(huán)丙烷)-2，3-二氫-2，7-萘啶-4(1h)-酮的分離純化

1)、將步驟(1)得到的式i化合物粗品用40ml甲醇溶解，采用反相硅膠柱層析(80g，ods-c18)(ymc公司，批號(hào)：9955)依次用0％、20％、40％、60％、80％、100％甲醇-水混合液洗脫(所述的百分比為甲醇占甲醇-水混合液的體積比)，流速10ml/min，每個(gè)梯度用1l洗脫液洗脫，將0％甲醇-水混合液洗脫液減壓濃縮至干，低溫(4℃)保存，備用，所述分離純化過(guò)程如圖2所示。產(chǎn)物的hplc的色譜分析條件如下：色譜柱：ultimateaq-c18(5μm)(14×150mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：a)甲醇b)水，流速：1ml/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣：10μl，洗脫濃度：30％甲醇(即體積含量為30％的甲醇水溶液)。所得產(chǎn)物的出峰時(shí)間：7.45min。

2)、將1)得到的產(chǎn)品分離純化

將將步驟1)得到的0％甲醇-水混合液的洗脫組分用5-10ml水溶解，采用反相硅膠柱層析(10μm，aq-c18)，制備用反相硅膠柱分離條件如下：層析柱：ultimateaq-c18(10μm)(14×250mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：a)甲醇b)水，流速：4ml/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：400μl。洗脫濃度：15％甲醇(即體積含量為15％的甲醇水溶液)。所得產(chǎn)物出峰時(shí)間：10min。收集10min出峰產(chǎn)物，合并液減壓濃縮至干。

3)、將2)得到的產(chǎn)品的分離純化

將2)得到的產(chǎn)品用5ml水溶解，采用反相硅膠柱層析(5μm，aq-c18)，制備用反相硅膠柱分離條件如下：層析柱：ultimateaq-c18(5μm)(14×250mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：a)甲醇b)水，流速：4ml/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣：400μl。洗脫濃度：10％甲醇。所得產(chǎn)物出峰時(shí)間：15.5min。收集15.5min出峰產(chǎn)物，合并液減壓濃縮至干，得式i化合物，共12mg，其理化性質(zhì)及核磁共振波譜數(shù)據(jù)如下：

白色粉末，可溶于二甲基亞砜、水、甲醇等有機(jī)溶劑。esi-msm/z：242.06[m+na]^＋，hr-msm/z：220.1192[m+h]+，分子式為c10h13on5。¹h(400mhz，dmso-d6)和¹³c(100mhz，dmso-d6)核磁共振數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1式i化合物的碳?xì)浠瘜W(xué)位移數(shù)據(jù)

效果實(shí)施例1：式i化合物體外抑制丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)

采用ns3/4a蛋白酶抑制劑篩選模型來(lái)檢測(cè)式i化合物對(duì)ns3/4a蛋白酶抑制活性，具體的ns3/4a蛋白酶抑制劑篩選模型參照專利：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶及基因、檢測(cè)抑制劑活性的方法，cn201510098364.2，2015-03-06。

式i化合物的ns3/4a蛋白酶抑制活性檢測(cè)方法：

將ns3/4a蛋白酶與底物p06221進(jìn)行反應(yīng)，用式i所示化合物進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)儀器為biotek多功能酶標(biāo)儀和96孔黑色酶標(biāo)板。式i所示化合物用甲醇溶解，分別稀釋至10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.1mg/ml，在反應(yīng)體系中加入ns3/4a蛋白酶、底物，進(jìn)行溫育，所述的反應(yīng)體系為：1μl待測(cè)化合物、96.5μlns3/4a蛋白酶液，2.5μl底物，ph7.5條件下溫育60分鐘。30℃溫育后在360nm的激發(fā)光和512nm的發(fā)射光下檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2式i化合物對(duì)ns3/4a蛋白酶的抑制率(％)

表2的結(jié)果說(shuō)明，式i所示化合物的ic50值為8.23mg/ml，表明該化合物具有一定的ns3/4a蛋白酶抑制活性，有望成為丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶抑制劑的先導(dǎo)化合物。

其中，所述的底物p06221是一條多肽(ac-asp-glu-glu-glu-glu-alg-ala-ser-lys)，并用熒光劑edans和猝滅劑dabcul標(biāo)記(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)

其中，所述的hcvns3/4a蛋白酶的制備方法參考專利申請(qǐng)文件記載內(nèi)容(專利申請(qǐng)?zhí)枺篶n201510098364.2)，具體為：

1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pet28a-ns3

1)從ncbi網(wǎng)站獲得所有報(bào)道的丙型肝炎1b亞型的全基因序列共計(jì)164 條，利用http：//www.drive5.com/uclust軟件進(jìn)行聚類分析，選擇相似度達(dá)到90％以上的、最具有代表性的序列作為研究對(duì)象，即序列hcv-1b/us/bid-v130/1994(genbank：eu155330.2)。選取其中的編碼ns3/4a的全部序列，該序列的核酸全長(zhǎng)為2055bp，編碼685個(gè)氨基酸。為了增加ns3/4a蛋白酶的體外活性及穩(wěn)定性，對(duì)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。對(duì)優(yōu)化后的基因采用化學(xué)合成的方法進(jìn)行全基因合成(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，把合成的全長(zhǎng)基因連接到載體pgh(購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司)上，獲得克隆載體pgh-ns3，測(cè)序驗(yàn)證序列完全正確(由上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證)。

2)設(shè)計(jì)用于pcr擴(kuò)增ns3/4a蛋白酶基因的引物，上游引物s3-up的序列為5’-aaacatatggcgcctatcacggcttactc-3’，下游引物s4a-down的序列為5’-aaaggatccttattacttcttctttcc-3’。

3)以含有密碼子優(yōu)化的ns3/4a蛋白酶序列的克隆載體pgh-ns3為模板，利用引物s3-up和s4a-down在la(takara)的催化下進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得2.1kb的ns3/4a蛋白酶序列。擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5min。

4)用bamhi和ndei分別對(duì)pcr擴(kuò)增獲得的ns3/4a蛋白酶基因的核苷酸序列和大腸桿菌表達(dá)載體pet28a(購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用t4連接酶(購(gòu)自takara)于4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α，利用含有30μg/ml卡那霉素的lb瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h。

5)挑取抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落接種5ml含有30μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，200rpm37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行bamhi和ndei雙酶切鑒定，得到含有ns3/4a蛋白酶基因的核苷酸序列的重組質(zhì)粒pet28a-ns3。對(duì)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2、構(gòu)建重組菌株、誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化。

1)將重組質(zhì)粒pet28a-ns3轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌bl21(de3)中，涂布含有30μg/ml卡那霉素的lb瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h。挑取抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落接種于5ml含有30μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，200rpm37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行bamhi和ndei雙酶切鑒定，即獲得重組菌株。保存驗(yàn)證正確的菌株。

2)接50μl步驟(1))所述驗(yàn)證正確的單菌落于5mllb中，200rpm37℃下震蕩過(guò)夜，得過(guò)夜培養(yǎng)物。接500μl過(guò)夜培養(yǎng)物于50mllb中，200rpm37℃下震蕩培養(yǎng)至od600為0.6時(shí)，添加0.5mmiptg進(jìn)行誘導(dǎo)，18℃，200rpm下誘導(dǎo)培養(yǎng)22h后收集菌液。

3)將步驟(2))獲得的收集菌液4℃7000～8000g離心10min，收集沉淀的菌體。將1g菌體加20ml裂解緩沖液(包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)25mm、nacl300mm、咪唑(imidazole)10mm、edta1mm、甘油10％和tritonx-100)，在冰上混合，渦旋震蕩混勻。將細(xì)胞懸浮起來(lái)，加入溶菌酶(0.3mg/ml)，混勻，冰上靜置30min。加入10％tritonx-100，使triton的終濃度為0.05％，所述的百分比為體積百分比，充分混勻，超聲破碎細(xì)胞，4℃8000g離心30min，取上清。在上清中加入1mlresin(上海生工)4℃震蕩過(guò)夜，充分結(jié)合，過(guò)親和層析柱空柱，依次用15ml緩沖液(包括hepes25mm、nacl300mm、imidazole10mm、edta1mm、甘油10％和tritonx-100)、15ml沖洗緩沖液(包括hepes25mm、nacl300mm、imidazole20mm、edta1mm、甘油10％和tritonx-100)洗脫，得洗脫液。洗脫液中含有目的蛋白ns3/4a蛋白酶，將目的蛋白進(jìn)行透析，用1l的透析液(包括hepes25mm、nacl150mm、甘油10％、tritonx-1000.1％和二硫蘇糖醇(dtt)10mm，ph7.5)4℃透析過(guò)夜后得純化的目的蛋白，通過(guò)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)純化的目的蛋白的大小及純度。后在純化的目的蛋白中加入10mm的dtt，分裝，-70℃保存。