本發(fā)明涉及一種快速制作細(xì)胞二維圖形的技術(shù)，具體是一種基于數(shù)字微鏡陣列的快速無(wú)掩模的細(xì)胞二維圖形化制作方法。

背景技術(shù)：

生物學(xué)被認(rèn)為是21世紀(jì)最有前景的學(xué)科，不僅僅是因?yàn)樯飳W(xué)目前有大量需要亟需解決的問(wèn)題和挑戰(zhàn)，更為重要的是，它與人類(lèi)生活諸如人口、疾病、健康等問(wèn)題息息相關(guān)。而細(xì)胞生物學(xué)是生物學(xué)重要的基礎(chǔ)學(xué)科之一，是在顯微、亞顯微和分子水平三個(gè)層次上，研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命規(guī)律的一門(mén)學(xué)科。細(xì)胞在生物學(xué)中扮演著至關(guān)重要的角色，作為個(gè)體，細(xì)胞是獨(dú)立的能夠生長(zhǎng)、增殖、凋亡，作為整體，細(xì)胞又能共同協(xié)作配合形成具有特定功能的組織和器官進(jìn)而構(gòu)成一個(gè)生命體。1665年英國(guó)學(xué)者胡克用自制的顯微鏡第一次開(kāi)啟了細(xì)胞的世界，至此拉開(kāi)了對(duì)細(xì)胞探索的序幕。

通過(guò)對(duì)細(xì)胞差別生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移、粘附和細(xì)胞連接等細(xì)胞行為學(xué)的研究，不僅僅可以揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)和細(xì)節(jié)，而且能夠有效的解決當(dāng)今重大疑難疾病治療的世界性難題。特別是治療癌癥，系統(tǒng)免疫性疾病，一些常規(guī)藥物無(wú)法達(dá)到治療效果的病例，應(yīng)用細(xì)胞治療都可以得到較為理想的效果，現(xiàn)在在國(guó)內(nèi)應(yīng)用自身免疫細(xì)胞治療疾病也有很大的發(fā)展。由于細(xì)胞生物學(xué)所研究的主要對(duì)象是細(xì)胞，如果直接在生物體內(nèi)進(jìn)行研究是非常困難的，這主要是因?yàn)榧?xì)胞所在身體內(nèi)環(huán)境是不斷變化而且不可控的，而且使得細(xì)胞行為發(fā)生變化的原因會(huì)存在多種，無(wú)法實(shí)現(xiàn)可控的研究單一因素的影響。因此，需要我們?cè)隗w外構(gòu)建細(xì)胞的微環(huán)境，將對(duì)細(xì)胞行為的研究由復(fù)雜不可控的體內(nèi)環(huán)境轉(zhuǎn)移到體外可控便于操作的環(huán)境中，這對(duì)于研究細(xì)胞生物學(xué)具有重要的意義。

上世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的基于微納加工的細(xì)胞圖形化技術(shù)，使得研究人員能夠精確的在二維平面控制多種細(xì)胞位置，甚至單細(xì)胞形狀，不僅為細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究提供了強(qiáng)大的工具，而且使將來(lái)體外模擬組織器官的機(jī)構(gòu)和功能 成為了可能?，F(xiàn)有的圖形化的方法多為自上而下的加工方法，如光刻法，但是這些方法的成本高，環(huán)境要求高。另外一些方法則是自下而上的圖形化方法，主要有，軟光刻，掃描探針加工以及納米壓印等方法，這些方法中，其準(zhǔn)備過(guò)程和操作都非常復(fù)雜，耗時(shí)較多，有的還需要進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)修飾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足之處，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速無(wú)掩模的細(xì)胞二維圖形化制作方法。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：一種快速無(wú)掩模的細(xì)胞二維圖形化制作方法，包括以下步驟：

將設(shè)計(jì)的二進(jìn)制圖形導(dǎo)入到數(shù)字微鏡陣列中，并將聚乙二醇二丙烯酸甲酯pegda與光引發(fā)劑2,4,6-三甲基苯甲?；?二苯基氧化膦tpo的混合溶液滴在蓋玻片表面；

數(shù)字微鏡陣列將紫外入射光投影到蓋玻片表面；

調(diào)整紫外入射光的功率，激發(fā)混合溶液發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)并固化粘附在蓋玻片表面，使固化后的水凝膠形狀與設(shè)計(jì)圖形的形狀和光斑形狀一致；

將蓋玻片經(jīng)過(guò)酒精浸泡和磷酸鹽緩沖液沖洗后，放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并加入細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

所述混合溶液為使用75％的酒精配置的聚乙二醇二丙烯酸酯pegda和光引發(fā)劑tpo混合溶液，pegda的濃度為40％，tpo的濃度為0.5wt％。

所述混合溶液的制備方法包括以下步驟：

將pegda溶于酒精之中，待攪拌均勻后再加入光引發(fā)劑tpo，pegda的最終濃度為40％，tpo的濃度為0.5wt％。

所述將蓋玻片經(jīng)過(guò)酒精浸泡和磷酸鹽緩沖液沖洗，包括以下步驟：

將帶有固化后的pegda水凝膠微結(jié)構(gòu)的蓋玻片放入75％的酒精中，清洗掉未反應(yīng)的水凝膠；

將酒精清洗后蓋玻片放入磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行二次清洗，除去附著在表面的酒精。

所述蓋玻片為玻璃。

所述細(xì)胞培養(yǎng)基為hyclonerpmi-1640，加入量為7-10ml。

所述細(xì)胞懸浮液為100μl乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)濃度為3×106細(xì)胞懸浮液。

本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)化，程序化的細(xì)胞圖形化方法，并不需要任何物理模板以及表面化學(xué)修飾，并且基底為普通的玻璃，無(wú)需特殊材料。具體具有以下特點(diǎn)：

1.紫外光照射激發(fā)光引發(fā)產(chǎn)生自由基，自由基與pegda單體相結(jié)合，從而引發(fā)水凝膠的交聯(lián)反應(yīng)。自由基只在光斑照射的地方存在。

2.通過(guò)控制光斑的形狀來(lái)控制pegda交聯(lián)聚合后的形狀，制作出各種水凝膠固化圖案。利用這種微圖形的制作方法，可以不需要物理模板，直接根據(jù)所需形狀設(shè)計(jì)光斑，并且可以動(dòng)態(tài)化的控制水凝膠形狀的大小和位置。

3.pegda是一種生物兼容性的材料，并且對(duì)蛋白質(zhì)具有防止粘附的作用從而能夠阻止細(xì)胞粘附，而玻璃可以進(jìn)行細(xì)胞的粘附培養(yǎng)。通過(guò)上述這種方法，可以控制細(xì)胞的生長(zhǎng)位置，生長(zhǎng)圖形，并且可以通過(guò)改變pegda的形狀和尺寸來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)形狀，研究外部物理微環(huán)境對(duì)細(xì)胞行為的影響。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的pegda水凝膠交聯(lián)反應(yīng)的原理圖；

圖2為光斑經(jīng)過(guò)聚焦物鏡投射到玻璃基底上的示意圖；

圖3為光學(xué)顯微圖片；

其中，圖3(a)為固化后pegda水凝膠的結(jié)果圖，圖3(b)為乳腺癌細(xì)胞圖形化后的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明是基于數(shù)字微鏡陣列紫外光固化水凝膠的細(xì)胞二維圖形化方法：通 過(guò)數(shù)字微鏡陣列將圖案反射到玻璃基底上，水凝膠混合溶液中的光引發(fā)劑吸收紫外光產(chǎn)生自由基，從而引起水凝膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成固化的水凝膠微結(jié)構(gòu)，并且pegda水凝膠的形狀與照射的光斑的大小和形狀一致，因此，通過(guò)控制光斑的位置、形狀和尺寸，就能在玻璃表面的任意位置生長(zhǎng)出任意形狀的水凝膠微結(jié)構(gòu)。此外，利用細(xì)胞不在水凝膠表面粘附而在玻璃表面粘附的特性，可以通過(guò)控制pegda水凝膠的微結(jié)構(gòu)的位置、形狀和尺寸來(lái)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的位置、形狀和大小。

利用紫外光照射使得水凝膠固化的原理具有以下特點(diǎn)(如圖1所示)：

1：光引發(fā)劑tpo在紫外光的照射下會(huì)產(chǎn)生自由基，單個(gè)tpo分子會(huì)分裂產(chǎn)生兩個(gè)自由基。

2：自由基于pegda的分子反應(yīng)，打開(kāi)pegda分子中的碳碳雙鍵使得pegda分子變成活性分子，pegda活性分子相結(jié)合，交聯(lián)成聚合物鏈，使得溶液變?yōu)楣腆w狀。

3：光斑經(jīng)過(guò)聚焦物鏡投射到玻璃基底上(如圖2所示)

實(shí)施例一

1、將一片蓋玻片用無(wú)水乙醇清洗兩次，利用氮?dú)鈱⑸w玻片吹干待用。

2、使用75％的酒精配置聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)和光引發(fā)劑(tpo)的混合溶液，pegda的濃度為40％，tpo的濃度為0.5wt％。

3、取0.5ml配置好的溶液，滴在蓋玻片上，使得溶液均勻平鋪在蓋玻片表面。

4、將蓋玻片放置在架子上，在電腦中繪制需要的圖片形狀(三角形圖形如圖3左下角的光斑)，將繪制好的圖片導(dǎo)入到數(shù)字微鏡陣列中，數(shù)字微鏡陣列將紫外光反射到玻璃基底上，投射到玻璃基底上的圖形會(huì)誘導(dǎo)聚乙二醇二丙烯酸酯和光引發(fā)劑的混合溶液發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)并固化粘附在玻璃表面，而水凝膠的形狀與設(shè)計(jì)圖片形狀和投射光斑形狀一致。如圖3(a)所示，在圖3(a)中，灰色區(qū)域?yàn)閜egda水凝膠，黑色區(qū)域?yàn)槁懵兜牟ＡЩ住?/p>

5、將帶有固化后的pegda水凝膠微結(jié)構(gòu)的蓋玻片放入75％的酒精中，清洗掉未反應(yīng)的水凝膠。

6、將酒精清洗后蓋玻片放入磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行二次清洗除去附著在表面的酒精。

7、將磷酸鹽緩沖液清洗后的蓋玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入hyclonerpmi-1640培養(yǎng)基10ml，并且放入100μl乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)濃度為3×106細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，co2為5％)，并且每天更換培養(yǎng)基，觀察并記錄細(xì)胞的狀態(tài)。因?yàn)樗z表面會(huì)阻止細(xì)胞粘附，細(xì)胞則會(huì)生長(zhǎng)在玻璃基底上，所以細(xì)胞就是生長(zhǎng)成為特定的形狀，如圖3(b)所示，mcf-7細(xì)胞生長(zhǎng)在玻璃基底上，形成一個(gè)三角形圖形。