本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鐵皮石斛菌根真菌節(jié)菱孢菌株(Arthriniumsp.)ZJ11C12及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
作為中國(guó)著名傳統(tǒng)藥材，鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)早在《本草綱目》鐵皮石斛就被列為藥用，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，在《道藏》中被列為“中華九大仙草”之首。鐵皮石斛不但具有滋陰養(yǎng)胃、潤(rùn)肺止咳、清熱明目的功效，還有增強(qiáng)人體免疫力，消除腫瘤，抑制癌癥等作用。由于鐵皮石斛非常名貴，近年來(lái)，鐵皮石斛人工栽培產(chǎn)業(yè)在全國(guó)范圍內(nèi)發(fā)展比較迅速。但是，石斛生長(zhǎng)發(fā)育中特有的復(fù)雜性使石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的難度加大。其中一個(gè)主要原因是石斛是菌根植物，自然生長(zhǎng)狀態(tài)下，都必須部分或完全依賴與真菌建立共生關(guān)系形成菌根才能實(shí)現(xiàn)正常生命活動(dòng)。而人工條件下進(jìn)行石斛大規(guī)模擴(kuò)繁時(shí)，往往因缺少適宜的共生真菌的參與，種子萌發(fā)率極低，菌根無(wú)法形成，造成石斛生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，影響國(guó)內(nèi)外石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，作為一種新的微生物資源，包括植物菌根菌在內(nèi)的內(nèi)生真菌引起了廣泛關(guān)注。植物的內(nèi)生真菌是指在植物生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌。目前，已從內(nèi)生真菌中分離出多種生物活性物質(zhì)，包括抗菌、抗腫瘤、抗氧化等天然化合物，其中不少是新物質(zhì)，具有特殊生物活性，在醫(yī)藥、保健品、植物菌肥菌劑等各個(gè)領(lǐng)域都展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，而且植物內(nèi)生真菌是一類可持續(xù)利用的資源，對(duì)自然資源破壞極少，能夠解決自然資源不足的問(wèn)題。節(jié)菱孢類菌根菌作為一種植物內(nèi)生真菌，其代謝產(chǎn)物具有抗氧化活性，對(duì)植物的健康成長(zhǎng)、病害防治具有重要意義。本發(fā)明提供一種新型的節(jié)菱孢類菌根菌，該菌株能與鐵皮石斛無(wú)菌苗共生形成典型的菌根結(jié)構(gòu)，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，提高其移栽存活率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株節(jié)菱孢ZJ11C12菌株，其于2013年12月06日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)CGMCCNo.8602；分類命名為節(jié)菱孢Arthriniumsp.；本發(fā)明節(jié)菱孢ZJ11C12是從野生藥用植物鐵皮石斛根系中分離出來(lái)的。其分離方法為：取新鮮的鐵皮石斛營(yíng)養(yǎng)根4～5cm，沖洗表面泥沙，清水緩慢流洗30min。將根放入無(wú)菌杯中，75％酒精處理30s，倒掉酒精，再加入0.1％升汞，滅菌5min左右。倒掉升汞，無(wú)菌水沖洗4～5次。隨后用解剖刀將材料橫切成3～5mm的薄片，置于PDA培養(yǎng)基中，切面朝向培養(yǎng)基。每個(gè)培養(yǎng)皿4～5塊組織，25℃恒溫避光培養(yǎng)。培養(yǎng)3～7天后菌絲體從組織塊上長(zhǎng)出，并形成一定大小的菌落，以組織塊為中心向周圍擴(kuò)散生長(zhǎng)。從其邊緣挑取菌絲體移到另一PDA平板，重復(fù)至獲得純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入PDA斜面保存。將分離到的ZJ11C12菌株接種至PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)觀察，黑暗培養(yǎng)7d后菌落直徑7.5cm。氣生菌絲發(fā)達(dá)，質(zhì)地絨毛狀，近絮狀，菌落呈白色，邊緣不整齊。顯微鏡觀察菌絲無(wú)色，具隔膜，分枝，直徑2.5-5μm，分生孢子未見(jiàn)。采用常規(guī)手段提取ZJ11C12菌株的基因組DNA，并利用真菌的ITS區(qū)的通用引物擴(kuò)增其ITS區(qū)間，其堿基序列如SEQIDNO.1所示。通過(guò)在GenBank中進(jìn)行blast檢索，發(fā)現(xiàn)其與節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)菌株ML-2004(GeneBank登錄號(hào)AY425967)同源性最高，達(dá)99％，鑒定該菌株為節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)真菌。本發(fā)明的第二個(gè)目的是所述的節(jié)菱孢菌株ZJ11C12在與鐵皮石斛無(wú)菌苗建立共生體系，形成典型的菌根結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用，或上述的節(jié)菱孢真菌促進(jìn)石斛生長(zhǎng)和生物活性物質(zhì)積累的應(yīng)用，節(jié)菱孢真菌與石斛幼苗共生后，促進(jìn)幼苗移栽存活率、提高幼苗長(zhǎng)勢(shì)。本發(fā)明的菌株能與鐵皮石斛無(wú)菌苗共生形成典型的菌根結(jié)構(gòu)，并通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)證實(shí)，形成菌根結(jié)構(gòu)后的幼苗移栽存活率明顯高于普通無(wú)菌幼苗，且長(zhǎng)勢(shì)明顯提高。節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)ZJ11C12，于2013年12月06日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCCNo.8602。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的節(jié)菱孢ZJ11C12菌株在PDA培養(yǎng)基中的菌落特征圖；圖2為本發(fā)明的節(jié)菱孢ZJ11C12菌株的菌絲顯微鏡觀察圖片；圖3為本發(fā)明的節(jié)菱孢ZJ11C12菌株與鐵皮石斛無(wú)菌苗共生后形成的菌根橫切面顯微結(jié)構(gòu)圖；其中A、菌根共生7d，菌絲開(kāi)始侵染根被(×100)；B、菌根共生14d，菌絲由通道細(xì)胞進(jìn)入外皮層(×400)；C、菌根共生21d，菌絲進(jìn)入皮層細(xì)胞(×200)；D、菌根共生28d，皮層細(xì)胞中有大量衰敗的菌絲團(tuán)(×200)；E、菌根共生35d，菌絲團(tuán)進(jìn)入內(nèi)皮層細(xì)胞(×200)；F、對(duì)照根橫切面(×100)。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但并非限制本發(fā)明。實(shí)施例1：節(jié)菱孢ZJ11C12的分離培養(yǎng)：節(jié)菱孢ZJ11C12是從采自云南省昆明市的藥用植物鐵皮石斛分離得到，其分離方法為：取新鮮的鐵皮石斛營(yíng)養(yǎng)根4～5cm，沖洗表面泥沙，清水緩慢流洗30min。將根放入無(wú)菌杯中，75％酒精處理30s，倒掉酒精，再加入0.1％升汞，滅菌5min左右。倒掉升汞，無(wú)菌水沖洗4～5次。隨后用解剖刀將材料橫切成3～5mm的薄片，置于PDA培養(yǎng)基中，切面朝向培養(yǎng)基。每個(gè)培養(yǎng)皿4～5塊組織，25℃恒溫避光培養(yǎng)。培養(yǎng)3～7天后菌絲體從組織塊上長(zhǎng)出，并形成一定大小的菌落，以組織塊為中心向周圍擴(kuò)散生長(zhǎng)。從其邊緣挑取菌絲體移到另一PDA平板，重復(fù)至獲得純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入PDA斜面保存。本發(fā)明的節(jié)菱孢ZJ11C12形態(tài)特征如下：如圖1和圖2所示，節(jié)菱孢ZJ11C12菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)溫度為25℃，氣生菌絲發(fā)達(dá)，質(zhì)地絨毛狀，近絮狀，菌落呈白色，邊緣不整齊。顯微鏡觀察菌絲無(wú)色，具隔膜，分枝，直徑2.5-5μm，分生孢子未見(jiàn)。采用常規(guī)手段提取ZJ11C12菌株的基因組DNA，并利用真菌的ITS區(qū)的通用引物擴(kuò)增其ITS區(qū)間，其堿基序列如SEQIDNO.1所示。通過(guò)在GenBank中進(jìn)行blast檢索，發(fā)現(xiàn)其與節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)菌株ML-2004(GeneBank登錄號(hào)AY425967)同源性最高，達(dá)99％，鑒定該菌株為節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)真菌。節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)ZJ11C12，于2013年12月06日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCCNo.8602。實(shí)施例2：鐵皮石斛-節(jié)菱孢菌株ZJ11C12共生體系的建立將6月齡生長(zhǎng)較一致的鐵皮石斛無(wú)菌組培苗接種于含有50ml共生培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種3株苗，共接種30瓶，置于25℃、光照強(qiáng)度2000Lx、每日光照12～14h的恒溫光照培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)一周左右。同時(shí)，將ZJ11C12菌株接種PDA固體培養(yǎng)基，在25℃培養(yǎng)5d后，用打孔器取菌落邊緣菌塊，接種到盛有100mLPDB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶?jī)?nèi)，置25℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)3d，得到節(jié)菱孢ZJ11C12種子液。取種子液中的等量大小的菌體球(直徑為0.3cm)，用接種針將菌球接種于與石斛苗相距2cm培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察共生體系形成情況。實(shí)施例3：節(jié)菱孢菌株ZJ11C12與鐵皮石斛無(wú)菌苗共生形成典型的菌根結(jié)構(gòu)通過(guò)對(duì)不同共生時(shí)期的鐵皮石斛菌根石蠟切片的觀察，發(fā)現(xiàn)ZJ11C12菌株與鐵皮石斛幼苗能形成完整的菌根結(jié)構(gòu)。鐵皮石斛根的結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)依次為根被、外皮層、皮層、內(nèi)皮層和中柱。根被通常由3～4層細(xì)胞構(gòu)成，排列較為規(guī)則，細(xì)胞壁較厚，多為死細(xì)胞；外皮層為單層細(xì)胞，除通道細(xì)胞外多為死細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，排列規(guī)則；皮層由5～6層活細(xì)胞組成，壁薄，與外皮層、內(nèi)皮層相鄰的1～2層細(xì)胞體積較小，中間部分體積較大，呈不規(guī)則的多邊形狀；內(nèi)皮層細(xì)胞單層，體積較小；皮層細(xì)胞在鐵皮石斛根中所占比例最大，細(xì)胞壁薄，可消化侵入的菌絲，為蘭科植物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[83]。顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，菌苗共生7天時(shí)，菌絲接觸到鐵皮石斛的根被組織并在根被外積聚(圖3-A)；14天時(shí)，菌絲由通道細(xì)胞進(jìn)入外皮層(圖3-B)；21天時(shí)，菌絲繼續(xù)侵入皮層的薄壁細(xì)胞，通常以一條或多條菌絲彎曲聚集，呈現(xiàn)出典型的菌絲結(jié)結(jié)構(gòu)并且菌絲量增多,有些菌絲則溶解成深色的膠狀物(圖3-C)；28天時(shí)，皮層細(xì)胞出現(xiàn)大量衰敗的菌絲團(tuán)(圖3-D)；35天時(shí)，內(nèi)皮層附近有菌絲出現(xiàn)，外皮層出現(xiàn)新形成的菌絲團(tuán)纏繞通道細(xì)胞的細(xì)胞核(圖3-E)。在未接菌的對(duì)照組中，則能觀察到正常的根結(jié)構(gòu)，而未見(jiàn)到上述的染菌結(jié)構(gòu)(圖3-F)。實(shí)施例4：節(jié)菱孢菌株ZJ11C12促進(jìn)鐵皮石斛幼苗移栽存活率根據(jù)上述結(jié)果，將共生14天后的鐵皮石斛幼苗移栽至穴盤(pán)中，觀察幼苗存活情況。溫室培養(yǎng)，常規(guī)日照，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)幼苗存活率。共處理石斛幼苗4000株(對(duì)照和處理組各2000株)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)移栽苗的存活率分別為93.99％和99.95％，即處理后存活率上升了5.96％，且處理組石斛幼苗長(zhǎng)勢(shì)明顯高于對(duì)照組。SEQUENCELISTING<110>杭州師范大學(xué)<120>一種鐵皮石斛菌根真菌節(jié)菱孢菌株ZJ11C12及其應(yīng)用<130>1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>580<212>DNA<213>人工合成<400>1tccgtaggtgaacctgcggagggatcattacagagttatacaactcccataccatctgtt60aacctacccagttatgcctcggcgtaagctcggttggaggcacctgcagctaccctgtag120ttgcggactgccaactccagccgcggcccgccggcggtacactaaactctgttttatttt180atattctgagcgtcttattttaataagttaaaactttcaacaacggatctcttggttctg240gcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaat300catcgaatctttgaacgcacattgcgcccatcagtattctggtgggcatgcctgttcgag360cgtcatttcaacccttaagcctagcttagtgttgggaatctgctgtactgcagttcctta420aagacagtggcggagcggcggtagtcctctgagcgtagtaat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