本發(fā)明涉及高密度脂蛋白模擬肽Reverse-D-4F的應(yīng)用領(lǐng)域，具體為治療LPS誘導(dǎo)呼吸窘迫綜合癥的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種常見(jiàn)的臨床綜合征，具有較高的死亡率，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫、困難,通過(guò)傳統(tǒng)氧療糾正缺氧。ARDS的發(fā)病機(jī)制可分為生物和非生物病原菌。生物病原體包括細(xì)菌、病毒、真菌、非典型病原體和惡性腫瘤，而非生物病原包括酸性物質(zhì)、藥物、有毒氣體吸入和機(jī)械通氣相關(guān)的傷害。最初，在血液循環(huán)中的內(nèi)毒素等有害物質(zhì)損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(PCEC)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，以及收縮和死亡。損傷約2小時(shí)后，出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫發(fā)生；損傷12至24小時(shí)后，出現(xiàn)肺泡水腫。

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥在急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。伯翰等表明生存率與內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)克隆數(shù)呈正相關(guān)。在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞移植可維持肺泡毛細(xì)血管屏障的完整性，恢復(fù)血管內(nèi)皮功能，改善炎癥狀態(tài)。因此，EPCs對(duì)修復(fù)ARDS的內(nèi)皮損傷和抑制ARDS發(fā)生發(fā)展具有重要作用。但是，ARDS患者體內(nèi)促炎因子水平提高(如氧化低密度脂蛋白、IL-6、TNF-αα)，這些炎癥因子損害內(nèi)EPCs的功能，包括細(xì)胞增殖、遷移和血管形成。這些受損的內(nèi)皮祖細(xì)胞無(wú)法恢復(fù)ARDS患者受損的血管內(nèi)皮系統(tǒng)。因此，增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，減輕炎性因子引起的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙可能在抑制ARDS發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

高密度脂蛋白(HDL)已被證明具有動(dòng)員骨髓EPCs，抑制EPCs凋亡和促進(jìn)EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的功能。載脂蛋白A-I(apoA-I)是高密度脂蛋白的重要功能性成分，有243種氨基酸，已被證明能提高膿毒癥大鼠的生存率。因?yàn)閍poA-I脂質(zhì)結(jié)合能力與其兩親性螺旋結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，因此最近根據(jù)該特性設(shè)計(jì)了模擬肽，該模擬肽在疏水表面含有四個(gè)苯丙氨酸殘基(4F；F代表苯丙氨酸)，并模 仿的A類兩親性螺旋，該模擬肽與apoA-I沒(méi)有序列同源性。據(jù)報(bào)道，4F有抗炎、抗氧化作用，改善膿毒癥大鼠的生存率。Reverse-D-4F是按照D-4F(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2)的反向序列合成的模擬肽，該模擬肽對(duì)膿毒癥治療并沒(méi)有報(bào)道。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了Reverse-D-4F能修復(fù)LPS誘導(dǎo)的EPCs功能損傷,抑制LPS誘導(dǎo)的EPCs凋亡，因而Reverse-D-4F通過(guò)動(dòng)員EPCs并修復(fù)其功能來(lái)對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷進(jìn)行治療，是治療肺損傷的一個(gè)有效治療劑，由此完成本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種高密度蛋白模擬肽Reverse-D-4F,其序列為Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一種高密度蛋白模擬肽Reverse-D-4F在制備治療LPS誘導(dǎo)呼吸窘迫綜合癥的藥物或試劑盒中的應(yīng)用，所述高密度蛋白模擬肽的序列為Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一種高密度蛋白模擬肽Reverse-D-4F在制備內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)內(nèi)皮損傷藥物或試劑盒中的應(yīng)用，所述高密度蛋白模擬肽的序列為Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一種高密度蛋白模擬肽Reverse-D-4F在制備預(yù)防或治療肺損傷藥物或試劑盒中的應(yīng)用，所述高密度蛋白模擬肽的序列為Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一種高密度蛋白模擬肽Reverse-D-4F在制備預(yù)防或治療膿毒癥藥物或試劑盒中的應(yīng)用，所述高密度蛋白模擬肽的序列為Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

其中所述肺損傷為肺水腫，所述試劑盒還進(jìn)一步包括佐劑，所述佐劑為氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子或明礬。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)提出Reverse-D-4F能抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型的肺水腫，抑制體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生，抑制肺泡壁增厚，胞間隙紅細(xì)胞和白細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及肺血管內(nèi)皮炎癥標(biāo)志的產(chǎn)生(ICAM-1、VCAM-1和iNOS)，增加內(nèi)皮的標(biāo)志(eNOS和vWF)。Reverse-D-4F促進(jìn)LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型EPCs動(dòng)員，無(wú)論在體外還是在體內(nèi)，Reverse-D-4F均能修復(fù)LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型EPCs損傷的功能。

附圖說(shuō)明

圖1所示是Reverse-D-4F能抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型的肺水腫和體內(nèi) 炎癥因子的產(chǎn)生。

圖2所示是Reverse-D-4F抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型肺泡壁增厚，胞間隙紅細(xì)胞和白細(xì)胞的浸潤(rùn)

圖3所示是Reverse-D-4F抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型肺血管內(nèi)皮炎癥標(biāo)志的產(chǎn)生(ICAM-1、VCAM-1和iNOS)，并增加內(nèi)皮的標(biāo)志(eNOS和vWF)。

圖4所示是Reverse-D-4F動(dòng)員LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型的EPCs。

圖5所示是Reverse-D-4F修復(fù)LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型EPCs損傷的功能。

圖6所示是Reverse-D-4F體外修復(fù)LPS誘導(dǎo)EPCs損傷的功能。

具體實(shí)施方式

Reverse-D-4F治療LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型。

動(dòng)物ARDS模型建立，24只雄性C57小鼠分為4組：

(1)對(duì)照組(腹腔注射PBS)；

(2)Reverse-D-4F組(腹腔注射Reverse-D-4F 10mg/Kg)

(3)模型組(腹腔注射LPS 10mg/Kg)；

(4)Reverse-D-4F處理組(腹腔注射Reverse-D-4F 10mg/Kg和LPS10mg/Kg)

模型制作2天后，通過(guò)鹽酸氯胺酮靜脈注射全麻后處死，取左肺，肺組織表面液體用吸水紙吸干凈，稱取左肺的重量被認(rèn)為是濕重；左肺被放置在干燥箱60℃干燥48小時(shí)，然后稱取重量為干重。濕干重比值來(lái)評(píng)價(jià)肺水腫程度。

用ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)小鼠血漿中腫瘤壞死因子-α和ET-1的表達(dá)水平。

肺部的右葉均經(jīng)10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片6μm，然后用蘇木精-伊紅染色。用特異性抗體(VCAM-1、ICAM-1、iNOS、eNOS、vWF和Sca-1)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和HE染色。

用高倍鏡隨機(jī)挑選10個(gè)視野觀察HE染色肺切片，并對(duì)浸潤(rùn)的紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)肺泡壁厚度進(jìn)行測(cè)量。

用紅細(xì)胞裂解緩沖液裂解外周血紅細(xì)胞。然后用抗體FITC-CD34(BD)，PE-Flk-1，和APC-CD133標(biāo)記細(xì)胞。流式分析陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

C57小鼠麻醉后斷頭處死，75％乙醇浸泡15min，剪取股骨和脛骨；冷PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔直至沖洗液清亮，將沖洗液反復(fù)吹打，100μm濾網(wǎng)過(guò)濾成單 細(xì)胞懸液；沖洗液與Ficoll分離液的體積比為1∶1，20℃下2 000r/min離心20min。輕輕吸取離心管中間乳白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層到新的離心管中，磷酸鹽緩沖液PBS洗細(xì)胞沉淀2次；完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,反復(fù)輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按10⁶/cm²的密度接種在預(yù)先用Fibronectin包被的六孔板或培養(yǎng)瓶上；培養(yǎng)3d后,用PBS液洗掉非貼壁細(xì)胞，每3d更換培養(yǎng)液一次。

EPCs與2.5mg/L的DiI-acLDL在37℃孵育2h；然后用1-2％多聚甲醛固定細(xì)胞5min；PBS浸洗后，加入10mg/L的FITC-UEA，37℃孵育1h后，洗去多余染料后，中性甘油封片，用熒光顯微鏡或激光共聚焦觀察；顯示紅色熒光的為DiI-acLDL陽(yáng)性，顯示綠色熒光的為FITC-UEA-1陽(yáng)性，顯示黃色的為免疫雙熒光陽(yáng)性，被確認(rèn)為DiI-acLDL和FITC-UEA雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

將EPCs胰酶消化后接種于預(yù)先鋪好纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，同培養(yǎng)液孵育30min，隨即取5個(gè)高倍鏡(×10)視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。細(xì)胞接種于鋪有纖維連接蛋白的96孔板中，每孔接種3000個(gè)細(xì)胞，24h后，每孔加入MTT(5g/L)20μL后37℃繼續(xù)孵育4h，棄上清，各孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩10min，酶標(biāo)儀492nm讀取吸光度值。

將消化好的EPC接種于預(yù)先鋪有matrigel膠的培養(yǎng)板上，37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)后，顯微鏡觀察成血管情況。

用8μm 24孔板檢測(cè)EPCs的遷移。不同處理后的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，1.2×10⁴細(xì)胞液分別置于上腔。EGM-2MV培養(yǎng)基置于下室。37℃培養(yǎng)24h，上部細(xì)胞用棉簽去除，下室用DAPI染色。隨機(jī)選五個(gè)視野觀察(×10)遷移的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

培養(yǎng)7天的小鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化，10³細(xì)胞置于96孔板中。每隔一天用0.25％胰蛋白酶消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

附圖1表征了Reverse-D-4F能抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型的肺水腫和體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生情況，小鼠經(jīng)LPS或Rev-D4F處理48小時(shí)后處死，取肺左葉檢測(cè)濕干比(A)；取小鼠血漿檢測(cè)ET-1(B)和TNF-α(C)水平。據(jù)圖1所示，LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中肺水腫明顯增加，模型血液中炎癥因子TNF- α和ET-1明顯增加；給予高密度脂蛋白模擬肽Reverse-D-4F治療后，小鼠肺水腫明顯降低，并且血液中炎癥因子TNF-α和ET-1的增加水平明顯得到抑制。

附圖2是Reverse-D-4F抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型肺泡壁增厚，胞間隙紅細(xì)胞和白細(xì)胞的浸潤(rùn)，Rev-D4F對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的修復(fù)作用。A,肺右葉進(jìn)行HE染色；B，量取肺泡壁厚度，以對(duì)照組為100％，分別計(jì)算各組肺泡壁厚度的百分比；C，各組選取十個(gè)視野數(shù)紅細(xì)胞數(shù)，最后取其均值；D，各組選取十個(gè)視野數(shù)白細(xì)胞數(shù)，最后取其均值。據(jù)圖2所示，LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中肺泡壁厚度明顯增加，且肺胞間隙明顯出現(xiàn)紅細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤(rùn)；給予Reverse-D-4F治療后，明顯改善小鼠肺損傷模型的上述表現(xiàn)。LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中

附圖3是Reverse-D-4F抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型肺血管內(nèi)皮炎癥標(biāo)志的產(chǎn)生(ICAM-1、VCAM-1和iNOS)，并增加內(nèi)皮的標(biāo)志(eNOS和vWF)。免疫組化對(duì)肺組織各指標(biāo)檢測(cè)：ICAM-1、VCAM-1和iNOS是肺內(nèi)皮炎癥標(biāo)志物，eNOS和vWF是肺內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。據(jù)圖3所示，LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型肺組織中內(nèi)皮損傷的炎癥標(biāo)志因子VCAM-1、ICAM-1和iNOS表達(dá)水平明顯增加，而正常內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志因子eNOS和vWF明顯降低；給予Reverse-D-4F治療后，明顯降低內(nèi)皮損傷的炎癥標(biāo)志因子VCAM-1、ICAM-1和iNOS的表達(dá)水平，同時(shí)提高正常內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志因子eNOS和vWF的表達(dá)水平。

附圖4是Reverse-D-4F動(dòng)員LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型的EPCs，其中，A，小鼠外周血中CD34⁺、FLK-1⁺、CD133⁺、CD34⁺/FLK-1⁺、FLK-1⁺/CD133⁺和CD34⁺/CD133⁺各亞群百分比(NS為100％)；B，免疫組化染祖細(xì)胞標(biāo)志Sca-1，檢測(cè)肺組織祖細(xì)胞歸巢情況。據(jù)圖4所示，LPS能動(dòng)員干細(xì)胞至外周血，如CD34⁺、FLK-1⁺、CD133⁺、CD34/FLK-1⁺、FLK-1/CD133⁺和CD34/CD133⁺細(xì)胞明顯增加，在肺組織中帶有干細(xì)胞標(biāo)志因子Sca-1⁺的細(xì)胞也明顯增加；給予Reverse-D-4F治療后，外周血CD34⁺、CD34/FLK-1⁺和CD34/CD133⁺細(xì)胞的增加明顯得到抑制，而FLK-1⁺、CD133⁺和FLK-1/CD133⁺帶有內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞進(jìn)一步增加，在肺組織中Sca-1⁺細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加來(lái)修復(fù)LPS誘導(dǎo)的肺損傷。

附圖5表征了Reverse-D-4F修復(fù)LPS誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型EPCs損傷的功能。 取各組小鼠骨髓誘導(dǎo)分化為EPCs并檢測(cè)其功能：A，各組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞以10⁶/cm²接種于六孔培養(yǎng)板，3天后去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞選取五個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后各組取均值；B，各組小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化EPCs胰酶消化后，取12000個(gè)細(xì)胞接種于遷移小室上室，下室加入EGM-2MV誘導(dǎo)24小時(shí)后，DAPI染色，選取五個(gè)視野熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)；C，各組小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化EPCs進(jìn)行吸附低密度脂蛋白(紅色)和結(jié)合凝集素(綠色)實(shí)驗(yàn)，選取五個(gè)視野熒光顯微鏡下觀察，雙陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比；D，各組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7天，胰酶消化，以每孔1000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞每隔1天計(jì)數(shù)一次。據(jù)圖5所示，不同組小鼠骨髓取出并誘導(dǎo)分化為EPCs，并檢測(cè)其功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠EPCs分化的細(xì)胞數(shù)減少，盡管模型組EPCs能迅速增殖，但其粘附能力和遷移能力較對(duì)照組有所下降；給予Reverse-D-4F治療后，小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化為EPCs的數(shù)量有所增加，其粘附和遷移功能的損傷也得到了修復(fù)。

附圖6表征了Reverse-D-4F體外修復(fù)LPS誘導(dǎo)EPCs損傷的功能，其中，A，MTT檢測(cè)各組EPCs活力，以對(duì)照組的OD值為100％；B，遷移小室方法檢測(cè)各組EPCs的遷移能力；C，Matrigel凝膠方法檢測(cè)EPCs的體外成血管能力。據(jù)圖6體外研究所示，LPS(30μg/ml)明顯損傷EPCs的增殖、遷移和體外血管生成的功能，而Reverse-D-4F能明顯修復(fù)LPS誘導(dǎo)上述功能的損傷，用LY294002(PI3K抑制劑)明顯抑制Reverse-D-4F對(duì)EPCs功能損傷的修復(fù)作用。