本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及公開一種用于微擬球藻基因沉默的rnai載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微藻是一個(gè)具有高度多樣性的生物群體，廣泛分布于海洋、胡泊、陸地等各種棲息環(huán)境，也是地球上最古老的生命類群之一。它們不僅在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色，而且在進(jìn)化關(guān)系上也跨越原核和真核生物兩界。因此，它們擁有相對(duì)獨(dú)特的進(jìn)化地位，微藻進(jìn)化研究一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。由于微藻進(jìn)化歷史和棲息環(huán)境的多樣性和復(fù)雜性，不同的藻類在代謝途徑、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控以及生活史等發(fā)面都有差異及其獨(dú)特性，而我們對(duì)其認(rèn)識(shí)是非常有限的。另外，隨著全球化石能源日益短缺，以及現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展帶來的全球氣候變暖等問題，發(fā)展清潔、可再生型新能源已成為必然趨勢(shì)，微藻生物能源就是其中被寄予厚望的救世主，同時(shí)微藻也能夠用于生產(chǎn)多種高附加值化學(xué)品(如多糖、多不飽和脂肪酸和蝦青素)，廣泛用于食品、保健品和化妝品等方面工業(yè)應(yīng)用。微藻生物學(xué)功能的研究將有助于我們理解微藻遺傳資源和加以利用，這些都迫切需要人類去認(rèn)識(shí)微藻及改造微藻。

隨著高通量基因測(cè)序的發(fā)展，許多藻類的基因組已經(jīng)被測(cè)序，包括萊茵衣藻、硅藻、微擬球藻、小球藻、團(tuán)藻、褐藻和紅藻等。盡管對(duì)其開展全基因組測(cè)序，但是它們基因絕大多數(shù)(占30％以上)都是未知功能的，對(duì)于代謝過程的理解仍然是一個(gè)“黑箱”。這就需要我們發(fā)展遺傳轉(zhuǎn)化方法和基因操作工具去揭開這個(gè)“黑箱”之謎。反向遺傳學(xué)工具如插入突變、靶基因的敲除只有在少數(shù)幾個(gè)微藻(萊茵衣藻等)中建立。另外，據(jù)報(bào)道在微藻中建立同源重組方法是相對(duì)較困難的。因此，為實(shí)現(xiàn)基因的功能研究，rnai技術(shù)是一種比較好的選擇，而且通過基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在絕大多數(shù)微藻中都存在有rnai元件如dicer酶、rna依賴的rna聚合酶和arogonute蛋白等。rnai指通過反義rna與正鏈rna形成雙鏈rna特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈rna(有義rna和反義rna),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mrna降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。rnai發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細(xì)胞內(nèi)，并且在萊茵衣藻、三角褐指藻和杜氏鹽藻中建立了rnai反向遺傳學(xué)工具用于基因功能研究。

微擬球藻是一種單細(xì)胞光合微藻，廣泛分布于海洋、淡水等環(huán)境水域。由于它的油脂含量高、較好的環(huán)境適應(yīng)性及適于煙道氣培養(yǎng)等特性，在微藻生物能源領(lǐng)域備受青睞。截至目前，已有多株微擬球藻的全基因組測(cè)序，基本涵蓋了本屬內(nèi)的已知代表物種。同時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化方法也基本已經(jīng)建立，反向遺傳學(xué)工具如插入突變、過表達(dá)和同源重組的方法在不同種里面也有報(bào)道，唯獨(dú)rnai這一強(qiáng)有力的遺傳工具尚未建立，而本申請(qǐng)專利建立的方法將填補(bǔ)這一空白，將與其他遺傳工具形成互補(bǔ)，能夠更好地用于微擬球藻基因功能及未來的大規(guī)模遺傳篩選研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于微擬球藻基因沉默的rnai載體及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種用于微擬球藻基因沉默的rnai載體，載體以硅藻用rnai表達(dá)載體作為骨架，微擬球藻內(nèi)源基因微管蛋白(tublin)啟動(dòng)子為啟動(dòng)子、終止子、抗性選擇標(biāo)記基因和靶基因。

所述微擬球藻內(nèi)源基因微管蛋白(tubulin)啟動(dòng)子為

(1)具有序列表seqidno.1中的核苷酸序列；

或，(2)具有與序列表中seqidno.1的dna序列有較高的序列同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列。

上述微擬球藻微管蛋白tubulin基因，命名為tub，來源于工業(yè)微藻(nannochloropsisoceanicaimet1)，其中，序列表中的seqidno.1由1218個(gè)堿基組成，編碼一個(gè)完整的開放閱讀框，它編碼具有序列表seqidno.2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。

所述靶基因?yàn)槌聊谢蚣拔M球藻本身rnai元件識(shí)別的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)為針對(duì)靶基因形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列；即，針對(duì)沉默靶基因序列設(shè)計(jì)約400bp的正向序列和約200bp的反向序列，其中這兩個(gè)序列用于共同的200bp序列，在反向連接后能夠互補(bǔ)形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)。

利用所述rnai技術(shù)的rnai表達(dá)載體為在微擬球藻中實(shí)現(xiàn)靶基因的沉默，需要設(shè)計(jì)靶基因的正反向重復(fù)序列形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明比較了微擬球藻rnai所要行駛功能的主要元件比較，發(fā)現(xiàn)在微擬球藻中存在三個(gè)基本元件：arogonuate蛋白、dicer酶及rna依賴的rna聚合酶，它們存在保守的遺傳。

所述抗性選擇標(biāo)記基因?yàn)椴﹣砻顾乜剐曰騜le，所用啟動(dòng)子為微管蛋白(tubulin)基因啟動(dòng)子，終止子為硅藻fcp基因終止子。

本發(fā)明構(gòu)建了用于反向遺傳學(xué)研究rna干涉(rnai)技術(shù)的表達(dá)載體，其載體骨架主要包括啟動(dòng)子序列(微擬球藻內(nèi)源tublin基因啟動(dòng)子)，ble抗性基因序列以及針對(duì)靶基因形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列，其原理主要是基于不同基因的反向重復(fù)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而被微擬球藻本身固有的rnai元件所識(shí)別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的特異下調(diào)。

rnai表達(dá)載體構(gòu)建，

rnai表達(dá)載體的構(gòu)建主要包括如下步驟：采用硅藻用rnai表達(dá)載體作為骨架，將骨架的硅藻fcp基因啟動(dòng)子置換為微擬球藻內(nèi)源啟動(dòng)子，并克隆微擬球藻中需要沉默的靶基因的正反向重復(fù)序列，再連接到載體得到rnai表達(dá)載體；而后通過電脈沖轉(zhuǎn)化微擬球藻，轉(zhuǎn)化后微擬球藻培養(yǎng)液于不同的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，篩選其特定表型的遺傳轉(zhuǎn)化株，通過熒光定量pcr測(cè)定靶基因是否被沉默及沉默效率，通過生理評(píng)估遺傳轉(zhuǎn)化株表型。。

一種用于微擬球藻基因沉默的rnai載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

一種宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞為包含權(quán)利要求1所述的載體。

所述宿主細(xì)胞為微擬球藻，包括微擬球藻屬內(nèi)所有種、亞種及不同株，如微擬球藻代表種nannochloropsisoceanica、nannochloropsissalina、nannochloropsisoculata、nannochloropsisgadatina等。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明構(gòu)建的rnai表達(dá)載體能夠用于微擬球藻相關(guān)藻株的基因功能鑒定，所構(gòu)建rnai載體具有在表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)靶基因基因敲低(geneknockdown)，rnai這一強(qiáng)有力的反向遺傳工具在微擬球藻中的建立，將與其他遺傳工具形成互補(bǔ)，能夠更好地用于微擬球藻基因功能及未來的大規(guī)模遺傳篩選研究，更好地服務(wù)于藻類生物學(xué)及工業(yè)應(yīng)用研究。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的微擬球藻中存在的rnai元件(dicer酶、rna依賴的rna聚合酶)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明提供的微擬球藻靶基因rnai表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖，主要包括啟動(dòng)子，抗性基因和目的基因的正反向重復(fù)序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

圖3為本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化株的pcr驗(yàn)證的電泳圖，利用pcr擴(kuò)增抗性基因序列，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株存在目的條帶約400bp(第二、三、四、五、六、泳道有條帶)，其中wt為野生型(第八泳道無條帶)，第一泳道為陽性對(duì)照(質(zhì)粒dna為pcr模板)；

圖4為本發(fā)明提供的突變株和野生型的ca(基因號(hào)：g2209)基因在空氣水平co2濃度下相對(duì)表達(dá)豐度變化突變株的碳酸酐酶基因ca2在rna表達(dá)水平明顯被抑制，相對(duì)表達(dá)豐度降低在60％-80％左右，而其他幾個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化株顯示基因沒有被明顯抑制。

圖5為本發(fā)明提供的ca(g2209)遺傳轉(zhuǎn)化株和野生型在空氣水平co2培養(yǎng)條件下表型點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)和液體培養(yǎng)下的表型表征；

圖6為本發(fā)明提供的突變株和野生型微擬球藻在空氣水平co2濃度培養(yǎng)條件下的生長曲線；

圖7為本發(fā)明提供的來自空氣水平co2濃度培養(yǎng)條件下突變株和野生型微擬球藻細(xì)胞的光合放氧速率；

圖8為本發(fā)明提供的來自空氣水平co2濃度培養(yǎng)條件下突變株和野生型光合系統(tǒng)ii的光合活性。

圖9為本發(fā)明提供的微擬球藻imet1基因bct-g1855敲低實(shí)施例結(jié)果

圖10為本發(fā)明提供的微擬球藻ccmp1779基因ca2敲低實(shí)施例結(jié)果

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。

本發(fā)明通過反向遺傳學(xué)策略rna干涉(rnai)技術(shù)敲低工業(yè)微藻微擬球藻中的感興趣靶基因基因進(jìn)而獲得了能夠用于基因功能研究的轉(zhuǎn)化株，通過對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化株生理、生化表型等測(cè)量進(jìn)一步鑒定沉默基因的功能，通過本發(fā)明建立的rnai方法可用于微擬球藻其他未知基因的功能研究，也可用于大規(guī)模遺傳表型篩選。本發(fā)明所公開的方法為工業(yè)微藻固定工業(yè)co2廢氣及生物能源產(chǎn)業(yè)應(yīng)用奠定了分子遺傳基礎(chǔ)及可行性方法。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。

實(shí)施例1微擬球藻(nannochloropsisoceanicaimet1)碳酸酐酶(基因號(hào)：g2209)全序列的獲得

通過對(duì)微擬球藻全基因組測(cè)序，初步獲得了核基因組編碼的碳酸酐酶(g2209)的全序列，如seqidno.1和seqidno.2所示。

進(jìn)一步通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr驗(yàn)證獲得其碳酸酐酶的完整閱讀框(orf)，pcr引物序列為：f1為5’atgagcgtacaggcagtgcgag3’；r1為5’ctactcagacagcttcgccttc3’。pcr反應(yīng)體系包括5xpcr反應(yīng)緩沖液(5xdnabuffer)5ul、脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul、硫酸鎂(mgso4)2ul、正向引物(forwardprimer)2ul、反向引物(reverseprimer)2ul、dna3ul、dna聚合酶(koddnapoleymase)0.5ul、ddh2o為32.5ul,總反應(yīng)體系為50ul；

pcr反應(yīng)程序均為第一步95℃5min，第二步95℃反應(yīng)1min、58℃30s、72℃反應(yīng)30s(30個(gè)循環(huán))，第三步72℃延伸7min，第四步4℃反應(yīng)5min。經(jīng)過pcr驗(yàn)證閱讀框的結(jié)果是seqidno.1，與基因組注釋預(yù)測(cè)序列相符。

實(shí)施例2

1)rnai表達(dá)載體的構(gòu)建

rnai表達(dá)載體的構(gòu)建以phir-ptgus為載體骨架，首先通過pcr擴(kuò)增反應(yīng)以微擬球藻基因組為模板，擴(kuò)增獲得208bp的片段(ca-2209基因序列195bp到413bp位置)和404bp片段(ca2基因序列195bp到599bp位置)兩個(gè)pcr片段；

其中，擴(kuò)增208bp的片段的引物為：

ca2209_fw(5’cggaattcatttttcgtgcctgcgttt3’；包含ecori位點(diǎn))/ca2209_rv1(5’gctctagatggtctaaatgtcgattgttcg3’；包含xbai位點(diǎn))；

擴(kuò)增404bp的片段的引物為：

ca2209_fw(5’cggaattcatttttcgtgcctgcgttt3’；包含ecori位點(diǎn))/ca2209_rv2(5’gctctagagctccttgtgcttctccgta3’；包含xbai位點(diǎn))。

上述進(jìn)行pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系均為50ul：包括5xpcr反應(yīng)緩沖液(5xdnabuffer)5ul、脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul、硫酸鎂(mgso4)2ul、正向引物(forwardprimer)2ul、反向引物(reverseprimer)2ul、dna3ul、重組dna聚合酶(koddnapoleymase)0.5ul、ddh2o為32.5ul,總反應(yīng)體系為50ul；

pcr反應(yīng)程序均為第一步95℃5min，第二步95℃反應(yīng)1min、60℃30s、72℃反應(yīng)30s(30個(gè)循環(huán))，第三步72℃延伸7min，第四步4℃反應(yīng)5min。

由上述獲得兩個(gè)片段含有一個(gè)共同的片段為209bp，目的形成反向互補(bǔ)序列(頸環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu))。然后用ecori和xbai限制內(nèi)切酶消化以上兩個(gè)pcr片段并用pcr產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，同時(shí)用ecori消化phir-ptgus載體并用牛小腸堿性磷酸酶進(jìn)行片段去磷酸化處理后純化。再將ecori和xbai消化的兩個(gè)pcr片段與線性化載體(phir-ptgus的ecori消化后線性片段)用t4連接酶進(jìn)行連接得到質(zhì)粒phir-ptca2。微擬球藻beta-tubulin基因的啟動(dòng)子使用引物notub_fw(5’gcgagctcgccagctgcctcat3’；包含saci位點(diǎn))和notub_rv(5’ggccatgg3tgtgtccgccgcc’；包含ncoi位點(diǎn))被擴(kuò)增，然后用saci和ncoi限制性內(nèi)切酶酶切，同時(shí)載體phir-ptca2也用用saci和ncoi限制性內(nèi)切酶酶切并純化，隨后再將beta-tubulin基因的啟動(dòng)子片段與線性化載體(beta-tubulin基因的啟動(dòng)子)用t4dna連接酶進(jìn)行連接得到載體phir-ngca2，其載體包含beta-tubulin基因的啟動(dòng)子區(qū)、抗性基因ble、ca2的正反向重復(fù)序列以及fcp基因的終止子，組成表達(dá)盒(如圖1所示)。

2)rnai表達(dá)盒的pcr擴(kuò)增

用pcr引物(f1：5’cccagtcacgacgttgtaaaacg3’；r1：5’ggaaacagctatgaccatg3’)擴(kuò)增以上實(shí)施例2的表達(dá)載體得到包含有tub基因啟動(dòng)子、抗性基因ble、能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ca2序列以及轉(zhuǎn)錄終止子序列，pcr反應(yīng)體系為5xpcr反應(yīng)緩沖液(5xdnabuffer)5ul，脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul,硫酸鎂(mgso4)2ul,正向引物(primerf1)2ul,反向引物(primerr1)2ul,模板dna(dna)3ul,dna聚合酶(koddnapoleymase)0.5ul,ddh2o32.5ul,總反應(yīng)體系為50ul；pcr反應(yīng)程序?yàn)榈谝徊?5℃5min，第二步95℃1min56℃30s72℃45s(30個(gè)循環(huán))，第三步72℃延伸7min，第四步4℃5min。待pcr擴(kuò)增反應(yīng)完成后，將得到的pcr產(chǎn)物電泳檢測(cè)和進(jìn)一步pcr產(chǎn)物純化，使其濃度達(dá)到3-5ug/ul，放于-20℃保存，待下一步電脈沖轉(zhuǎn)化時(shí)備用。

3)微擬球藻突變株的獲得

采用電脈沖轉(zhuǎn)化方法將上述得到rnai表達(dá)盒片段導(dǎo)入野生型微擬球藻。具體實(shí)施方法為：將野生型微擬球藻在f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度達(dá)到3×10⁷cells/ml(培養(yǎng)條件為25℃，連續(xù)光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為50umol/m^-2s^-1，通氣量為100ml/min)，離心收集微藻細(xì)胞倒掉上清液，然后用4℃預(yù)冷的375mm的山梨醇溶液洗滌藻細(xì)胞三次并用其重懸藻細(xì)胞，使藻細(xì)胞濃度為8×10⁸cells/ml；將濃縮后的藻細(xì)胞溶液分成200ul一份，然后向每份中加入3ug上述獲得線性化載體和1ul鮭魚精dna(15ug/ml)，混勻后冰上放置10min；再將混合物轉(zhuǎn)移入2mm電擊杯，以2200v(hv)，600歐姆，50微法(uf)進(jìn)行電擊，電擊后立即將藻體以5ml新鮮的f/2培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入無菌的白頭玻璃管，遮光后在光照搖床中培養(yǎng)(用弱光進(jìn)行復(fù)蘇)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為100rpm，25℃復(fù)蘇48h；復(fù)蘇后將其在5000g離心5min，棄盡上清，而后用1ml20％玉米淀粉重懸藻體后，倒在瓊脂含量0.8％的f/2的平板上，均勻鋪開并將平板在超凈工作臺(tái)吹干后密封，放于25℃光照培養(yǎng)，待3-4周后挑選轉(zhuǎn)化子。

所述20％玉米淀粉為取2g玉米淀粉，用無水乙醇和超純水交替洗3遍，再用10ml70％乙醇重懸即成，以f/2培養(yǎng)基洗4次，再以10ml含0.8％peg8000的f/2培養(yǎng)液進(jìn)行重懸。

所述瓊脂含量0.8％的f/2的平板上為預(yù)先制備瓊脂平板，再添加3-5ug/ml的zeocin抗生素)

實(shí)施例3轉(zhuǎn)化子的pcr驗(yàn)證

用牙簽挑選轉(zhuǎn)化子于新鮮的f/2培養(yǎng)基(包含3-5ug/ml的zeocin抗生素)，放于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其生長2-3周，離心收集藻細(xì)胞，用基因組dna提取試劑盒(omegahpdnaextrationkit)提取轉(zhuǎn)化株的基因組dna，同時(shí)也提取野生型微擬球藻的基因組dna，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。提取基因組并用nannodrop定量后，用正向引物f1(5’ttatcaacggcataccggcactg3’)和反向引物r1(5’ctgatgaacagggtcacgtcgt3’)進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為50ul：5xpcr反應(yīng)緩沖液(5xdnabuffer)5ul，脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)4ul,硫酸鎂(mgso4)2ul,正向引物(primerf1)2ul,反向引物(primerr1)2ul,模版dna(dna)3ul,dna聚合酶(kodplusdnapoleymase)為0.5ul,ddh2o32.5ul,總反應(yīng)體系為50ul。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊?5℃5min，第二步95℃1min56℃30s72℃45s(30個(gè)循環(huán))，第三步72℃延伸7min，第四步4℃5min。pcr擴(kuò)增反應(yīng)完成后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，看是否使用轉(zhuǎn)化子dna為模板有400bp條帶，而且野生型沒有條帶，如圖所示2，證實(shí)外源片段已經(jīng)整合到微擬球藻基因組，電脈沖轉(zhuǎn)化成功，得到突變株，突變株可分別標(biāo)記為m1、m2、m3、m4和m5。

實(shí)施例4微擬球藻突變株ca(g2209)基因相對(duì)表達(dá)水平測(cè)量

將上述獲得突變株和野生型分別在空氣水平co2濃度下培養(yǎng)，光強(qiáng)控制一致在50umol/m²/s，通氣速率在100ml/min。待微藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)收集微藻，5000g離心5min，然后用液氮迅速冷凍，保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

突變株表達(dá)豐度實(shí)驗(yàn)測(cè)量分為以下三步：

第一步rna的提取，將冷凍保存的藻細(xì)胞進(jìn)行rna提取，首先采用液氮研磨的方式破碎藻細(xì)胞，一般液氮研磨5-10min，然后加入1mltrizol(invitrogen公司)迅速充分混勻并加入200ul氯仿在12000rpm下離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管中再加入等體積氯仿，充分振蕩混勻，靜置2-3min后以12000rpm下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管并加入等體積異丙醇室溫沉淀15min，離心15min后，再用75％乙醇洗滌沉淀后，吹干加入50uldepc處理的ddh2o，測(cè)量rna濃度后，保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

第二步，cdna的制備，rna樣本按照takara試劑rtreagentkitwithgdnaeraserkit的流程說明使用隨機(jī)引物進(jìn)行cdna的合成，備注基因組dna去除反應(yīng)體系為20ul，其中包括2ug的總rna、5xreactionbuffer和gdnaeraser酶；

第三步，熒光定量pcr反應(yīng)，通過480ii(采用羅氏的快速啟動(dòng)通用綠色熒光)熒光定量qrt-pcr進(jìn)行定量。pcr的反應(yīng)體系為1ul的cdna(來自上一步的反轉(zhuǎn)錄制備)、正反向引物各1ul、10ul的2xrochefaststartsybrgreenmaster(rox)、ddh2o添加7ul補(bǔ)足至20ul，其中引物序列為正向引物：5’atccaggaacaattatttcgct3’；反向引物：5’gagtcggaacaagcaataa3’。反應(yīng)條件參照roche試劑盒說明執(zhí)行。實(shí)時(shí)熒光qpcr結(jié)果數(shù)據(jù)的分析使用2^-δδct方法,其中δδct值為(ctca-2209基因-ct內(nèi)參基因)突變株-(ctca-2209基因-ct內(nèi)參基因)野生型。

通過以上方法計(jì)算ca-2209基因在突變株中的相對(duì)野生型的基因表達(dá)豐度，結(jié)果證實(shí)突變株(m4或m5)的ca-2209基因表達(dá)豐度無論是在空氣水平co2濃度培養(yǎng)條件下顯著低于野生型ca-2209的表達(dá)，證實(shí)ca-2209基因在轉(zhuǎn)錄水平被抑制，大約下調(diào)60％-80％，如圖3所示，進(jìn)一步證實(shí)ca-2209基因在突變株m4、m5中被沉默，而突變株m1、m2和m3中ca-2209基因沒有被沉默。

實(shí)施例5微擬球藻ca-2209基因沉默轉(zhuǎn)化株的生長表型測(cè)量

將微擬球藻ca-2209基因沉默轉(zhuǎn)化株和野生型微擬球藻分別用牙簽挑取單藻落置于f/2培養(yǎng)基中在50ml三角瓶中培養(yǎng)2-3周，然后測(cè)量od750下的細(xì)胞密度，而后重新接種至新鮮的f/2培養(yǎng)基，使接種濃度保持一致，即相同的od750值＝0.5-1.0，然后連續(xù)傳代培養(yǎng)2-3次，將微藻接種至200ml的柱式反應(yīng)器培養(yǎng)(反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基)，當(dāng)生長到對(duì)數(shù)生長期后，將突變株和野生型微擬球藻分別稀釋至相同的濃度(上述測(cè)定od750值相同)，分別吸取10ul稀釋液滴到預(yù)先制備好的f/2固體瓊脂平板上(瓊脂濃度為0.8％并且不添加抗生素)，每個(gè)藻樣分別滴到兩塊平板上(在空氣水平co2濃度下培養(yǎng)，兩個(gè)重復(fù))，在超凈工作臺(tái)上吹干后，在室溫、無光或低光環(huán)境下放置2-3天，然后將平板放置于簡易培養(yǎng)箱(專利申請(qǐng)?zhí)枺?01410339234.9)，并將向培養(yǎng)箱通入空氣濃度co2(0.04％)，光強(qiáng)50umol/m²/s，用此培養(yǎng)箱可以進(jìn)行相對(duì)封閉式培養(yǎng)篩選，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱進(jìn)氣口和出氣口閥門可以控制培養(yǎng)箱內(nèi)部穩(wěn)定的co2環(huán)境，不定期觀察微藻(突變株和野生型)的生長情況(圖4)。同時(shí)，也將從200ml柱式反應(yīng)器中接種微藻到新鮮液體培養(yǎng)基中測(cè)量生長曲線和干重等生理指標(biāo)。測(cè)量結(jié)果如圖5，6所示，發(fā)現(xiàn)突變株在空氣水平co2濃度下生長明顯慢于野生型，經(jīng)10天培養(yǎng)后干重增加30％左右(圖6)。因此，通過基因敲低的方法驗(yàn)證了碳酸酐酶ca-2209的基因功能，這個(gè)基因在微擬球藻低co2濃度(如空氣水平co2濃度)生長中扮演重要角色，可能是參與co2濃縮機(jī)制的重要酶，此基因的功能鑒定為工業(yè)化煙道氣下培養(yǎng)工業(yè)微藻打下了堅(jiān)實(shí)的產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)。

實(shí)施例6微擬球藻ca-2209基因沉默轉(zhuǎn)化株的生理表型測(cè)量

將上述微擬球藻ca-2209基因沉默轉(zhuǎn)化株和野生型細(xì)胞的光合放氧速率測(cè)定采用clark-ii型氧電極(英國hansatech公司)進(jìn)行，測(cè)定時(shí)反應(yīng)槽的溫度為4℃(水浴調(diào)整)，光強(qiáng)用遮光片調(diào)整為300μmolm^-2s^-1。將微擬球藻突變株和野生型細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以5000g離心5min收集藻細(xì)胞與15ml離心管，每個(gè)樣品收集兩份，一份用于測(cè)定光合放氧速率，另外一份用于葉綠素含量的測(cè)量。收集的微藻細(xì)胞先用無碳水(預(yù)先通入n2排除掉溶液中的co2)洗滌，然后又懸浮在不同ph值的緩沖液中，依次為20mmoll-1的mes緩沖液，20mmoll-1tris緩沖液和20mmoll-1的apes緩沖液的無碳水中(ph分別是6.0、7.8或9.0)，緩沖液的配置用海水然后分別測(cè)定突變株和野生型細(xì)胞在不同ph條件下的光合放氧速率。同時(shí)每個(gè)樣品留取一份用來測(cè)量葉綠素a的含量，葉綠素a的測(cè)量采用甲醇抽提的方法，采用以下這個(gè)公式計(jì)算葉綠素a(chla)的含量：

chla的含量(ug/ml)＝16.5169xa665-8.0962xa652

光合放氧速率用葉綠素a的含量進(jìn)行換算。測(cè)量結(jié)果顯示，突變株細(xì)胞的光合放氧速率在ph6.0條件下，微擬球藻ca-2209基因沉默轉(zhuǎn)化株株的光合放氧速率有顯著提高，而在ph9.0條件下，突變株的光合放氧速率又顯著降低，因此突變株能夠抵抗由于co2濃度升高導(dǎo)致的ph降低，在一定程度上顯示出耐酸性，可能葉綠體內(nèi)部的微環(huán)境得到改善，即ph得到提升，但在ph堿性條件下基因被抑制，所以顯現(xiàn)出慢速生長，如圖7所示。此外，通過測(cè)定光合系統(tǒng)ii的光合光能轉(zhuǎn)換效率，也顯示微擬球藻ca-2209基因沉默轉(zhuǎn)化株有較低的光合活性值，如圖8所示，也進(jìn)一步證實(shí)微擬球藻ca-2209基因在光合作用中起著非常關(guān)鍵作用。

實(shí)施例7微擬球藻imet1中敲低碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(bct-g1855)參照實(shí)施例2、3的載體構(gòu)建方法，將表達(dá)載體中imet1中基因ca-2209正反向重復(fù)序列替換為bct-1855基因的正反向重復(fù)序列(基因序列為seqidno.3)，實(shí)現(xiàn)敲低一個(gè)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，通過定量pcr驗(yàn)證轉(zhuǎn)化株的表達(dá)水平被抑制60-80％，然而，通過表型測(cè)量未發(fā)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化株有明顯表型變化(如圖9)，推測(cè)與此基因的組成型表達(dá)有關(guān)系，因?yàn)榇嘶蛟诓煌瑺I養(yǎng)鹽條件下(二氧化碳限制或氮元素缺乏)的表達(dá)均未變化。

實(shí)施例8微擬球藻ccmp1779體系建立rnai技術(shù)平臺(tái)以上實(shí)施例是在微擬球藻imet1中建立的rnai基因敲低方法，為了驗(yàn)證本發(fā)明構(gòu)建的rnai表達(dá)載體更有普遍適用性，在微擬球藻ccmp1779中參照實(shí)施例2、3的載體構(gòu)建方法，將實(shí)施例2中rnai表達(dá)載體中imet1中基因ca-2209正反向重復(fù)序列替換為ccmp1779的ca2基因(基因序列為seqidno.4)的正反向重復(fù)序列，實(shí)現(xiàn)敲低一個(gè)碳酸酐酶ca2基因，通過定量pcr驗(yàn)證轉(zhuǎn)化株的表達(dá)水平被抑制，通過表型測(cè)量發(fā)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化株在空氣水平co2條件下生長速率未有明顯變化，而在高co2(5％)培養(yǎng)條件下敲低了ca2基因的遺傳轉(zhuǎn)化株較野生型微擬球藻ccmp1779有較高的生長速率，提高約30-40％，如圖10。

seqidno.1

atgagcgtacaggcagtgcgaggaacggcatggttgcatttttcgtgcctgcgtttcgggctttgggtgaggaggcgagcttggcgaagggactctcggaggaggcagaccaaacatggcagggtgcttattcttgataatccgtccatttcacgctttggcacctcattcatacactcttggccattctatttgagactgctgtgtccgggtggtgtatttggttctggggttggggtggttggcccgaacaatcgacatttagaccaagcatcatcatcctcatcctcgaagcaagcagggcaagcaaaatctagtcacccgcatcgcctttacacccgcacaggctactctacgacacgcagcagcatgtcgcgcatgattcggaaaggattggacacgctgggcaaggcgttgcgggagaccggtcaagctttggaccgagcaggcctcgaggctttgggtacggagaagcacaaggagctttggtcacgacaccgccaagtctccaaccttttcgaccaacgcccgcgcgtcgccagcaatgccttcgtcgccccatcggccacggtcgtgggtgaagtcgagctctgggacaaggtctccatctggtacggcgctgtcatccgcggcgatcgcaacagcgtcaagatcgggaattgtaccaatgtgcaagaccacgcggttatcaccacagtccccacactcgatacgggctttcccgccaaggttgacatcggacacatggtcactatcggccacggcgcgaccatcacctcagccaccatccaagacaaagcactcatcgggatcgggagcgtcgtctccgaaggcgcgcttgtcgaaaccggcgcccagctcgcggccggttccgtggtcccgcccgggcgccgcatccctgcaggagagctctggggcggcaaccccgtcaaatttatccgtaagctggaggatgaggaggtagtggcaaatgtgacggcagcagaggcctaccatgccttggctcgcacccatgagaatgagttccaaccctttggggctgcttacctggacgcggagaaggcgaagctgtctgagtag

(a)序列特征：orf序列

●長度：1080bp

●類型：dna序列

●鏈型：單鏈

●拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：全部為外顯子序列

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：微擬球藻imet1

seqidno.2

msvqavrgtawlhfsclrfglwvrrrawrrdsrrrqtkhgrvlildnpsisrfgtsfihswpfylrllcpggvfgsgvgvvgpnnrhldqasssssskqagqaksshphrlytrtgysttrssmsrmirkgldtlgkalretgqaldraglealgtekhkelwsrhrqvsnlfdqrprvasnafvapsatvvgevelwdkvsiwygavirgdrnsvkignctnvqdhavittvptldtgfpakvdighmvtighgatitsatiqdkaligigsvvsegalvetgaqlaagsvvppgrripagelwggnpvkfirkledeevvanvtaaeayhalarthenefqpfgaayldaekaklse

(a)序列特征：氨基酸序列

●長度：359aa

●類型：蛋白質(zhì)編碼序列

●鏈型：單鏈

●拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：氨基酸

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：微擬球藻imet1

seqidno.3

atgctatccaaacgccagcttacgggaggcgtagcgctagcactattcagcgcgtatccggcacactccttctgttactcccgtttcagtttgccagttgtggatagaacgactctctcctccgcctccccctcctcctccatttcctcctcctcccctttctctggcagatcgctaccaagcagtcgcggcggcaacgcacgcacgtatggagagcctctacgtgtctcgatgccctttcacataaggtttagtaccggtgtagccatgccaccggacgactctccctcctcctattcctcctcatcccggtcatcatccaccgcttccctctactcagcccccacctcctcctcttccccctcctctttccccgccttgcccagccgaggatggagaatagaatggtttaagggcctcagggaggacattgccaatcgtaggccgctctataaatcggattggaccgatggaatgaaagtaaagacgattccgaccatcctctttttatactttgcctgtttggctcctgcggttgcatttggagggatcagctatgggttgacacagggggctatgggcgtcattgagttcttgctgtcttgtggggtgtcgggcatgttgtatgcaattttttcggggcagccaatgaccttcatcggccccacgggactgacattgtgttttatggctgcgctcttcaatttttgcaattcttttgggttggcgttcatgcccatgtacacctgggtagggatctggacgagcctgatgcttgtgacgctgtcatccgcgaatgcctgtttgttgaccaagcactgtacgcgctttacggacgaggtgttcaacgcgctcttggcgctgaattttacctacgaagctctcaaaaatatcgtcgtccgcttcttctccaccggtaccgacaaaacccaacccttcctcgccctcaacatggccttggcaacatttgccctgtcccaacgcctggtctcgtaccgttcttcgatcctcttcacgcgtcgcatccgaggcttcttgtcggatttcggccccgccctcaccatcatcatcatgacgttgctcggctccctacccatggtccgtggcctgggcatcgagtatttgaaagccccgaaacggttccagttcggtaacgggcggcgtttattcgtccctttgtgggatttaccggtctgggcgcgtggattggcgttggtaccggcggcggccttgacagtgttgttctttttagatcacaatattagtgtgcgggtggtaaattcacccgacaacaagatgaagaaaagcccggcgtatcacctggatttgtttgtgctagggagcattgtctttttgtgctcgattgtggggttgccgtggatgtgtgcggcgacgattcagagcctgaatcatgtgaggagtgtcactgagtatgaacctgtcggagtaggagaaggaggaaagggggggggaacagcagcagtagttgtaagcggaagcggaggaggtaaaggagatgtaaaacaggaagaggaagagacggcgactgtgatggagacgcggttgacgggcttggggatccacgccctggtgttgtcgagcattggccttttgcctctattgagacgtatcccgattcccgtgatcagtggcatctttctttatcttggccggacggtcatgacgggcaatacgttcttacaacgggtcaagggcgcgttttttgacaagagtatgctacccgaagactcgcccttcaaacggttggggagaacgactgtgaacaagtttacggcgattcaggtgggctgcttggcggtgttgtggaccttgaagagtaatccggcaaccgggatgtttttcccgagcgtgattgggatgttgattctgacgaggatcttggtgatcccgcggttgttttccaaggaggagatttcggtgttggatgtggattag

(a)序列特征：orf序列

●長度：1956bp

●類型：dna序列

●鏈型：單鏈

●拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：全部為外顯子序列

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：微擬球藻imet1

seqidno.4

atgtggcggcgtgtgctcgcatattcctcgagattcgatgtaacacatctcaatagcgaggtaacgctatccacgtatctcaccattgtctccaccctctctattaaccccatctttctatgcagttcgcaaaaatctccgatacgcggccctgcggttaatccaacaagtcaagaccttgaaacgtcggaaatgagcaacccgccgtctcctgtcgtgccgtctcccagccttacacaatcaaatcatgacatgctcaccagcatccgcagccacctagacgaccaagaggtcaagatccaggaacaattatttcgcttccagggcattaagagggccattgaccgcatttgcaagaatgacgaggcctacatggactcccccgatattgtcaaggcacagaccacgctcgaagatcgcccggagctggaaaggaaaggagagactgctgctgaagccttgcgcctgctcaaagtgggcaacgctgcctttttgcgcgatgaggttgtgcctgtccaccgctctgacagacatattggcctacattttgcccagaaaccccacgccataattattgcttgttccgactctcgggtcccgccggagatgatctttaattgcgcgtttggtgaactcttcgtcatccgccttgccggcaacaccgtcgatgcactcgctcgcgccagcctcctttacgcggtgcaacacctccaatctcccctggtcgttgttctgggccacgaaaagtgcggcgccgtcacagccgccttgcagccggaagaggagctggcggatgctcccggggacattaagaccttggtgcgaaacatcaaaaggggcatagagtgcgaattgattgacccgagcgcccacattttcggcgatgaaagactgttgtgcgcgattgtctgcaacgtgcattacgtggcccgcaccctgtcggaacaccccgatatccgcccatttattgaccgaaggaaactgtccgtcgtgggcgcctactacgcttttagtggggtggtgtcgttctttgacgaccaggatgagggaggaaggatggagagagggcgggtgtttgggggtgtggagggaaacggatccttgtgcttaagttgttccggaactttgtccggaaactcgagtccgatggcggggggagggagcaagggatccagtccgcctccgagcgtgcaggatggggttaataaaagcgtctag

(a)序列特征：orf序列

●長度：1218bp

●類型：dna序列

●鏈型：單鏈

●拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：全部為外顯子序列

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：微擬球藻ccmp1779。