本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的方法。
背景技術(shù)：
：固相多肽合成中，一些多肽由于有困難序列的存在，反應(yīng)不完全，容易形成缺省肽(非目的肽)雜質(zhì)。有一些缺省肽雜質(zhì)的性質(zhì)和產(chǎn)品本身十分接近，現(xiàn)有的分離技術(shù)對(duì)其幾乎沒(méi)有分離效果。fmoc固相合成方法中，缺省肽的產(chǎn)生主要是因?yàn)殡逆湹木奂?，臨時(shí)保護(hù)基fmoc脫除不完全或縮合反應(yīng)不完全導(dǎo)致。對(duì)于fmoc脫除不完全，一般采用2％的dbu可以達(dá)到完全脫除的效果，但伴隨著副反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)于縮合反應(yīng)不完全，采用假脯氨酸有較好的效果，但假脯氨酸價(jià)格昂貴，且需要有絲氨酸和蘇氨酸時(shí)才可以使用，不具有通用性。另外，缺省肽雜質(zhì)的產(chǎn)生一般是fmoc脫除不完全和縮合反應(yīng)不完全同時(shí)作用的結(jié)果，單種方法并不能完全解決氨基酸缺省的問(wèn)題。glp-1類(lèi)化合物中存在兩個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域，分子內(nèi)的相互作用使得肽鏈發(fā)生聚集，反應(yīng)在這兩個(gè)區(qū)域很難進(jìn)行，容易產(chǎn)生多種缺省肽雜質(zhì)。作為glp-1類(lèi)似物的利拉魯肽，在采用fmoc固相方法進(jìn)行制備時(shí)，產(chǎn)生的ala2缺省雜質(zhì)和thr5缺省雜質(zhì)在色譜上離主峰很近，現(xiàn)有的hplc純化方法無(wú)法將它們有效去除。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的方法。該方法采用包含缺省氨基酸和其之前氨基酸(c-n)的全保護(hù)肽片段進(jìn)行多肽的固相合成，同時(shí)解決了fmoc脫除不完全和縮合反應(yīng)不完全導(dǎo)致的氨基酸缺省，可以在合成階段將缺省肽雜質(zhì)降低到質(zhì)控限度以下。具體表現(xiàn)為可將利 拉魯肽中ala2缺省雜質(zhì)和thr5缺省雜質(zhì)分別由原來(lái)的1％以上降低到不能檢出和0.15％以下，并能將奈西利肽中ser19缺省肽雜質(zhì)降低到未檢出。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了缺省氨基酸與緊鄰所述缺省氨基酸并靠近c(diǎn)端的氨基酸組成的肽段在減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的用途。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述緊鄰缺省氨基酸并靠近c(diǎn)端的氨基酸的數(shù)量至少為1個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述缺省肽占所述多肽的質(zhì)量百分含量不高于0.15％。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述多肽為利拉魯肽，所述缺省氨基酸為ala2、thr5。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述肽段為全保護(hù)肽段。本發(fā)明還提供了一種減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的方法，采用包含缺省氨基酸與緊鄰所述缺省氨基酸并靠近c(diǎn)端的氨基酸進(jìn)行固相合成。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，固相合成方法中所述緊鄰缺省氨基酸并靠近c(diǎn)端的氨基酸的數(shù)量至少為1個(gè)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，固相合成方法中所述缺省肽占所述多肽的質(zhì)量百分含量不高于0.15％。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，固相合成方法中所述多肽為利拉魯肽，所述缺省氨基酸為ala2、thr5；或所述多肽為奈西利肽，所述缺省氨基酸為ser19；所述肽段為全保護(hù)肽段。本發(fā)明還提供了一種減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的方法，所述多肽為利拉魯肽，包括如下步驟：步驟1：將wangresin和fmoc-gly-oh反應(yīng)制備fmoc-gly-wangresin；步驟2：按利拉魯肽序列，依次連接fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ala-glu(otbu)-oh、boc-his(trt)-oh、fmoc-glu-otbu和棕櫚酸，得到利拉魯肽肽樹(shù)脂；步驟3：裂解利拉魯肽肽樹(shù)脂，得到利拉魯肽粗品；步驟4：hplc純化所述利拉魯肽粗品，得到利拉魯肽純品；所述多肽為奈西利肽，包括如下步驟：步驟1：將2-ctc樹(shù)脂和fmoc-his(trt)-oh反應(yīng)制備fmoc-his(trt)-2-ctcresin；步驟2：按奈西利肽序列，依次連接fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-oh和fmoc-ile-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh和fmoc-ser(tbu)-oh，得到奈西利肽肽樹(shù)脂；步驟3：裂解奈西利肽肽樹(shù)脂，得到奈西利肽粗品；步驟4：hplc純化奈西利肽粗品，得到奈西利肽純品。本發(fā)明提供了缺省氨基酸與緊鄰所述缺省氨基酸并靠近c(diǎn)端的氨基酸組成的肽段在減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的用途。本發(fā)明采用包含缺省氨基酸和其之前氨基酸(c-n)的全保護(hù)肽片段進(jìn)行多肽的固相合成，同時(shí)解決了fmoc脫除不完全和縮合反應(yīng)不完全導(dǎo)致的氨基酸缺省，可以在合成階段將缺省肽雜質(zhì)降低到質(zhì)控限度以下。具體表現(xiàn)為可將利拉魯肽中ala2缺省雜質(zhì)和thr5缺省雜質(zhì)分別由原來(lái)的1％以上降低到不能檢出和0.15％以下，并能將奈西利肽中ser19缺省肽雜質(zhì)降低到未檢出。本發(fā)明采用缺省氨基酸有關(guān)全保護(hù)肽片段進(jìn)行固相合成，不僅原料價(jià)廉易得，而且能有效降低缺省肽雜質(zhì)，可以在所有多肽的合成中應(yīng)用，具有廣泛工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示實(shí)施例3制得的利拉魯肽粗品的hplc譜圖；圖2示對(duì)比例制得的利拉魯肽粗品的hplc譜圖；圖3示實(shí)施例4制得的利拉魯肽純品的hplc譜圖；圖4示實(shí)施例9制得的奈西利肽純品的hplc譜圖；圖5示對(duì)比例制得的利拉魯肽純品的hplc譜圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供了一種多肽合成中氨基酸缺省的解決方法，具體指glp-1化合物，特指利拉魯肽，詳細(xì)步驟如下：步驟1：將wangresin和fmoc-gly-oh反應(yīng)制備fmoc-gly-wangresin；步驟2：按利拉魯肽序列，依次連接fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ala-glu(otbu)-oh、boc-his(trt)-oh、fmoc-glu-otbu和棕櫚酸，得到利拉魯肽肽樹(shù)脂；步驟3：裂解利拉魯肽肽樹(shù)脂，得到利拉魯肽粗品；步驟4：hplc純化利拉魯肽粗品，得到利拉魯肽純品。奈西利肽的具體步驟如下：步驟1：將2-ctc樹(shù)脂和fmoc-his(trt)-oh反應(yīng)制備fmoc-his(trt)-2-ctcresin；步驟2：按奈西利肽序列，依次連接fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-oh和fmoc-ile-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh和fmoc-ser(tbu)-oh，得到奈西利肽肽樹(shù)脂；步驟3：裂解奈西利肽肽樹(shù)脂，得到奈西利肽粗品；步驟4：hplc純化奈西利肽粗品，得到奈西利肽純品。本發(fā)明提供了缺省氨基酸與緊鄰所述缺省氨基酸并靠近c(diǎn)端的氨基酸組成的肽段在減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的用途。本發(fā)明采用包含缺省氨基酸和其之前氨基酸(c-n)的全保護(hù)肽片段進(jìn)行多肽的固相合成，同時(shí)解決了fmoc脫除不完全和縮合反應(yīng)不完全導(dǎo)致的氨基酸缺省，可以在合成階段將缺省肽雜質(zhì)降低到質(zhì)控限度以下。具體表現(xiàn)為可將利拉魯肽中ala2缺省雜質(zhì)和thr5缺省雜質(zhì)分別由原來(lái)的1％以上降低到不能檢出和0.15％以下，并能將奈西利肽中ser19缺省肽雜質(zhì)降低到未檢出。1、本發(fā)明首先欲保護(hù)的一種解決氨基酸缺省的方法，具體描述為采用包含缺省氨基酸和其之前氨基酸的全保護(hù)肽片段進(jìn)行固相合成；2、本發(fā)明方法主要應(yīng)用在利拉魯肽中ala2和thr5缺省雜質(zhì)的去除，本發(fā)明欲保護(hù)所有針對(duì)這兩個(gè)雜質(zhì)的制備方法；或奈西利肽中ser19缺省肽雜質(zhì)的去除。3、本發(fā)明所述方法具有通用性，尤其是該方法在利拉魯肽和奈西利肽中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種減少和/或去除多肽固相合成中缺省肽的方法中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。本發(fā)明所涉及的縮寫(xiě)及英文含義請(qǐng)見(jiàn)表1：表1本發(fā)明所涉及的縮寫(xiě)及英文含義縮寫(xiě)及英文含義dicn,n'-二異丙基碳二亞胺dcm二氯甲烷et2o無(wú)水乙醚meoh甲醇dmap4-二甲氨基吡啶hobt1-羥基苯并三唑tfa三氟乙酸edt1，2-乙二硫醇dmfn,n-二甲基甲酰胺phenol苯酚20％dblk20％六氫吡啶(v)/n,n-二甲基甲酰胺(v)dbu1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1fmoc-gly-wangresin的制備稱(chēng)取40g替代度為0.75mmol/g的wangresin加入到固相反應(yīng)柱中，dmf洗滌2次，dmf溶脹30min，dmf洗滌2次，將fmoc-gly-oh(13.38g，45mmol)和hobt(6.38g，47.3mmol)溶解于dmf中，冰浴10min后加入dic(5.95g，47.3mmol)活化3～5min后加入反應(yīng)柱，同時(shí)加入dmap(0.55g，4.5mmol)，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，抽干反應(yīng)液，dmf洗滌4次，dcm洗滌3次，加入乙酸酐(61.2g，600mmol)和吡啶(47.5g，600mmol)的dcm溶液封閉8h，抽掉封閉液，dmf洗滌6次，dcm洗滌2次，meoh收縮，干燥，得到43.6gfmoc-gly-wangresin，替代度0.32mmol/g。實(shí)施例2利拉魯肽肽樹(shù)脂的合成稱(chēng)取31.3g替代度為0.32mmol/g的fmoc-gly-wangresin加入到固相反應(yīng)柱中，dmf洗滌2次，dmf溶脹30min，dmf洗滌2次，將fmoc-arg(pbf)-oh(19.46g，30mmol)和hobt(4.26g，31.5mmol)溶解于dmf中，冰浴10min，加入dic(3.97g，31.5mmol)活化3～5min后加入到固相反應(yīng)柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，茚三酮檢測(cè)反應(yīng)完全，抽掉反應(yīng)液，dmf洗滌3次，20％dblk脫保護(hù)(5+7min)，dmf洗滌6次；將fmoc-gly-oh(8.92g，30mmol)和hobt(4.26g，31.5mmol)溶解于dmf中，冰浴10min，加入dic(3.97g，31.5mmol)活化3～5min后加入到固相反應(yīng)柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，茚三酮檢測(cè)反應(yīng)完全，抽掉反應(yīng)液，dmf洗滌3次，20％dblk脫保護(hù)(5+7min)，dmf洗滌6次；按上述步驟依次連接fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ala-glu(otbu)-oh、boc-his(trt)-oh、fmoc-glu-otbu和棕櫚酸，得到86.2g利拉魯肽肽樹(shù)脂。實(shí)施例3利拉魯肽肽樹(shù)脂裂解將86.2g利拉魯肽肽樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至1000ml單口圓底燒瓶中，加入860ml冰凍2h的裂解液(tfa:phenol：h2o：edt＝87.5：5：5：2.5)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，過(guò)濾，濾液加入到8.6l冰凍無(wú)水乙醚中，離心、洗滌、干燥后得到37.3g粗肽，收率：99.5％，純度：53.79％，見(jiàn)圖1。實(shí)施例4利拉魯肽純品的制備1.樣品處理：將固體粗肽用10％乙腈/90％水(v/v)，超聲使樣品完全溶解后用濾膜過(guò)濾，收集濾液備用。2.hplc純化：純化條件：色譜柱：以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為：50mm×250mm。流動(dòng)相：a相：0.1％三氟乙酸85％水/15％異丙醇溶液水溶液；b相：0.1％三氟醋酸的乙腈，流速：50-80ml/min，梯度：40％b—60％b,檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm。進(jìn)樣量為3g。純化過(guò)程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為1.5-3g。線性梯度洗脫40min，收集目的峰，得到純度大于95％以上餾分，將收集的目的峰餾分于水溫不超過(guò)35℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約10-30mg/ml后作第二步純化樣品。3.第二步hplc純化：純化條件：色譜柱：以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為：50mm×250mm。流動(dòng)相：0.15％高氯酸水溶液為a相，0.15％高氯酸的乙腈溶液為b相，梯度：40％b—70％b，檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm。進(jìn)樣量為1.8g。純化過(guò)程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈平衡后將第一步純化餾分上樣，上樣量為1.9g。線性梯度洗脫40min，收集目的峰，得到純度大于97％以上餾分，將收集的目的峰餾分于水溫不超過(guò)35℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約15-25mg/ml后作第三步脫鹽純化樣品。4.第三步hplc脫鹽純化：色譜柱：以八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為：50mm×250mm。0.01％氨水的水溶液為a相，色譜純乙腈為b相，梯度：30％b—60％b，檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm。進(jìn)樣量為1.2g。純化過(guò)程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈平衡后將第二步純化餾分上樣，上樣量為1.3g。線性梯度洗脫30min，收集目的峰，得到純度大于98％以上餾分，將收集的目的峰餾分于水溫不超過(guò)35℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約65mg/ml后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到0.76g純度99.65％的利拉魯肽精肽，總收率25.3％，見(jiàn)圖3。實(shí)施例5fmoc-his(trt)-2-ctcresin的制備稱(chēng)取60g替代度為0.5mmol/g的2-ctcresin加入到固相反應(yīng)柱中，dmf洗滌2次，dmf溶脹30min，dmf洗滌2次，將fmoc-his(trt)-oh(74.4g， 120mmol)溶解于dmf中，冰浴5min后加入dipea(30.96g，240mmol)活化3～5min后加入反應(yīng)柱，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)1h，向反應(yīng)液中加入meoh(19.2g，600mmol)，繼續(xù)氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)20min，抽干反應(yīng)液，dmf洗滌4次，dcm洗滌3次，meoh收縮，干燥，得到66gfmoc-his(trt)-2-ctcresin，替代度0.28mmol/g。實(shí)施例6奈西利肽肽樹(shù)脂的合成稱(chēng)取34.7g替代度為0.28mmol/g的fmoc-his(trt)-2-ctcresin加入到固相反應(yīng)柱中，dmf洗滌2次，dmf溶脹30min，dmf洗滌2次，將fmoc-arg(pbf)-oh(19.46g，30mmol)、pybop(15.6g，30mmol)和hobt(4.26g，31.5mmol)溶解于dmf中，冰浴10min，加入dipea(7.74g，60mmol)活化3～5min后加入到固相反應(yīng)柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，茚三酮檢測(cè)反應(yīng)完全，抽掉反應(yīng)液，dmf洗滌3次，20％dblk脫保護(hù)(5+7min)，dmf洗滌6次；將fmoc-arg(pbf)-oh(19.46g，30mmol)、pybop(15.6g，30mmol)和hobt(4.26g，31.5mmol)溶解于dmf中，冰浴10min，加入dipea(7.74g，60mmol)活化3～5min后加入到固相反應(yīng)柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，茚三酮檢測(cè)反應(yīng)完全，抽掉反應(yīng)液，dmf洗滌3次，20％dblk脫保護(hù)(5+7min)，dmf洗滌6次；按上述步驟依次連接fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-ser(tbu)-gly-oh和fmoc-ile-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh和fmoc-ser(tbu)-oh，得到61g奈西利肽肽 樹(shù)脂。實(shí)施例7奈西利肽肽樹(shù)脂裂解將61g利拉魯肽肽樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至1000ml單口圓底燒瓶中，加入610ml冰凍2h的裂解液(tfa:phenol：phsme：h2o：edt＝82.5：5：5：5：2.5)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，過(guò)濾，濾液加入到:6.1l冰凍無(wú)水乙醚中，離心、洗滌、干燥后得到25.3g線性肽，收率：99.5％，純度：73.1％。實(shí)施例8奈西利肽線性肽氧化稱(chēng)取25.3g線性肽，按8-10mg/ml的比例配置反應(yīng)液[純化水和乙腈的混合溶液中(1:1＝v：v)]。線性肽充分研磨后，緩慢加入反應(yīng)液中，邊加邊攪拌，直到完全溶解，用25％氨水將反應(yīng)溶液ph值調(diào)到8.1-8.4，通入氧氣，攪拌反應(yīng)4h，hplc顯示氧化完全，停止反應(yīng)，用tfa調(diào)ph至3.0～3.5。實(shí)施例9奈西利肽純品的制備1.樣品處理：將實(shí)施例8中氧化好的粗肽溶液減壓旋蒸濃縮，去除溶液中的大部分乙腈，即旋蒸后體積為旋蒸前體積的50％—60％。0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液合并。2.hplc純化：純化條件：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為：50mm×250mm。流動(dòng)相：a相：0.2％硫酸溶液，氨水調(diào)節(jié)ph至3.0；b相：乙腈，流速：50-80ml/min，梯度：10％b—30％b,檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm。進(jìn)樣量為3g。純化過(guò)程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為1.5-3g。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，得到純度大于95％以上餾分，將收集的目的峰餾分于水溫不超過(guò)32℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約10-30mg/ml 后作第二步純化樣品。3.第二步hplc純化：純化條件：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為：50mm×250mm。流動(dòng)相：0.2％磷酸溶液(用氨水調(diào)節(jié)ph至6.5)做為a相，乙腈溶液為b相，梯度：10％b—30％b，檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm。進(jìn)樣量為1.8g。純化過(guò)程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈平衡后將第一步純化餾分上樣，上樣量為1.9g。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，得到純度大于97％以上餾分，將收集的目的峰餾分于水溫不超過(guò)32℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約15-25mg/ml后作第三步脫鹽純化樣品。4.第三步hplc脫鹽純化：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為：50mm×250mm。0.2％醋酸銨溶液為a相，色譜純乙腈為b相，梯度：30％b—60％b，檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm。進(jìn)樣量為1.2g。純化過(guò)程：將色譜柱用50％以上的乙腈沖洗干凈平衡后將第二步純化餾分上樣，上樣量為1.3g。線性梯度洗脫30min，收集目的峰，得到純度大于98％以上餾分，將收集的目的峰餾分于水溫不超過(guò)35℃的條件下減壓旋蒸濃縮至約65mg/ml后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到0.76g純度大于98.5％的活性藥物奈西利肽，總收率25.3％，見(jiàn)圖4。對(duì)比例利拉魯肽合成稱(chēng)取6.25g替代度為0.32mmol/g的fmoc-gly-wangresin加入到固相反應(yīng)柱中，dmf洗滌2次，dmf溶脹30min，dmf洗滌2次，將fmoc-arg(pbf)-oh(3.89g，6mmol)和hobt(0.85g，6.3mmol)溶解于dmf中，冰浴10min，加入dic(0.79g，6.3mmol)活化3～5min后加入到固相反應(yīng)柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，茚三酮檢測(cè)反應(yīng)完全，抽掉反應(yīng)液，dmf洗滌3次，20％dblk脫 保護(hù)(5+7min)，dmf洗滌6次；將fmoc-gly-oh(1.78g，6mmol)和hobt(0.85g，6.3mmol)溶解于dmf中，冰浴10min，加入dic(0.79g，6.3mmol)活化3～5min后加入到固相反應(yīng)柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)2h，茚三酮檢測(cè)反應(yīng)完全，抽掉反應(yīng)液，dmf洗滌3次，20％dblk脫保護(hù)(5+7min)，dmf洗滌6次；按上述步驟依次連接fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、boc-his(trt)oh、fmoc-glu-otbu和棕櫚酸，得到16.9g利拉魯肽肽樹(shù)脂。按實(shí)施例3方法將利拉魯肽肽樹(shù)脂裂解，得到利拉魯肽粗肽7.3g，收率：97.3％，純度：50.08％，譜圖見(jiàn)圖2。將得到的利拉魯肽粗肽按實(shí)施例4的方法進(jìn)行純化，得到0.70g純度97.74％的利拉魯肽精肽，總收率23.3％，見(jiàn)圖5。與實(shí)施例3和實(shí)施例4制得的利拉魯肽比較，結(jié)果見(jiàn)表2：表2對(duì)比例與實(shí)施例制得的利拉魯肽的比較結(jié)果實(shí)施例3和對(duì)比例相比，采用本發(fā)明所述方法得到的粗肽，無(wú)論是純度還是缺省肽雜質(zhì)均顯著(p＜0.05)優(yōu)于對(duì)比方法，另外，采用相同的方法對(duì)粗肽進(jìn)行純化，實(shí)施例4得到的精肽無(wú)論是純度還是缺省肽雜質(zhì)均顯著優(yōu)于對(duì)比例得到的精肽。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12