本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及預(yù)測與防治自然流產(chǎn)的生物標記物，具體涉及表達tim-3的外周血nk細胞在制備自然流產(chǎn)生物標記物中的用途。該自然流產(chǎn)的生物標記物可用于作為早期妊娠失敗的預(yù)測與防治靶點。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了有關(guān)妊娠結(jié)局的預(yù)測方法主要是根據(jù)孕婦的外周血hcg-β與孕酮水平，但實踐中大量的證據(jù)表明孕婦外周血p水平與妊娠結(jié)局關(guān)系并不完全一致；盡管hcg-β能比較真實的反應(yīng)孕婦的妊娠預(yù)后，但越來越多的臨床資料表明：一旦孕婦外周血hcg下降(除了hcg-β生理性下降)，胚胎已無法挽救；另外，部分孕婦盡管持續(xù)分泌大量的hcg-β與p，但胚胎仍停止發(fā)育(或是空胚囊)；顯然hcg-β與p作為檢測妊娠結(jié)局的指標存在諸多的缺陷，臨床實踐迫切需要一個反映早孕期妊娠狀態(tài)的早期預(yù)測與防治的生物指標。

研究公開了，胚胎表達父系抗原，因而可視為一種半同種移植物，作為這種半同種移植物的胚胎能夠在母體內(nèi)存活直至分娩實際是反應(yīng)了母體對胚胎的免疫耐受。一旦這種母-胎免疫耐受被打破，將會導(dǎo)致妊娠失敗或自然流產(chǎn)與妊娠并發(fā)癥。自然流產(chǎn)是嚴重危害人類生殖健康的常見疾患之一，其發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計資料表明，目前，自然流產(chǎn)發(fā)生率高達15～40％，即便是在輔助生育技術(shù)飛速發(fā)展的今天，仍不能克服因母-胎免疫調(diào)節(jié)紊亂造成的妊娠失敗，遺憾的是臨床實踐中仍缺乏對之有效的早期診斷與防治策略。自然流產(chǎn)的發(fā)生多歸因于遺傳、感染、內(nèi)分泌、生殖道畸形等等，但臨床仍有50％以上的流產(chǎn)尤其是反復(fù)自然流產(chǎn)病因不明，其中，母-胎免疫調(diào)節(jié)失衡被認為是重要原因之一；有研究顯示，免疫細胞是母-胎免疫耐受的執(zhí)行者與效應(yīng)者，其中nk細胞在母-胎耐受中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用；本申請的前期研究發(fā)現(xiàn)，蛻膜nk細胞對母-胎耐受的建立和維持至關(guān)重要，妊娠期蛻膜nk細胞通過細胞表面分子與細胞 內(nèi)各種因子的作用，維持母-胎耐受與正常妊娠的進行，然而由于妊娠期蛻膜組織不易獲取，用于臨床診斷與防治靶點幾無可能。因此，臨床實踐中迫切需要一個簡單可靠的方法對早期自然流產(chǎn)的免疫學(xué)狀態(tài)進行客觀的評估，并能對之進行干預(yù)以達到防治自然流產(chǎn)挽救妊娠胚胎的目的。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種預(yù)測與防治自然流產(chǎn)的生物標記物，尤其是表達tim-3的外周血nk細胞在用于制備自然流產(chǎn)生物標記物中的用途。該自然流產(chǎn)的生物標記物可用于作為早期妊娠失敗的預(yù)測與防治靶點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目地是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種預(yù)測與防治自然流產(chǎn)的生物標記物，具體涉及表達tim-3的外周血nk細胞在用于制備自然流產(chǎn)生物標記物中的用途。該自然流產(chǎn)的生物標記物可用于作為早期妊娠失敗的預(yù)測與防治靶點。

本發(fā)明中，進行了不同妊娠狀態(tài)外周血tim-3⁺nk細胞百分率比較實驗與差異分析，分析tim-3在不同妊娠狀態(tài)外周血nk細胞的表達特征及其調(diào)節(jié)情況；結(jié)果顯示，tim-3在nk細胞表達水平在不同孕期有明顯差異，妊娠早期外周血nk細胞tim-3表達明顯上調(diào)，妊娠中期降至未孕期水平；妊娠早期，妊娠相關(guān)激素(主要是孕酮)與th2型細胞因子(il-4)參與外周nk細胞的tim-3表達上調(diào)；

本發(fā)明中，進行了galectin-9/tim-3信號介導(dǎo)早孕外周nk細胞免疫耐受試驗，結(jié)果顯示：與tim3^-nk細胞相比，tim-3⁺nk細胞產(chǎn)生較高水平的th2型細胞因子和較低水平的th1型細胞因子，并呈現(xiàn)出較弱的殺傷活性，這些表型特征將更有利于維持妊娠外周免疫的耐受狀態(tài)；，nk細胞上的tim-3受體與galectin-9相互作用，通過活化akt、jnk信號通路，促進轉(zhuǎn)錄因子id-2、blimp1、gata-3的表達，進而誘導(dǎo)外周nk細胞向免疫耐受表型分化；tim-3/gal-9信號參與nk細胞優(yōu)勢產(chǎn)生th2型細胞因子；

本發(fā)明中，進行了早孕外周nk細胞galectin-9/tim-3信號異常致nk功能障礙與妊娠失敗的試驗，結(jié)果表明，外周nk細胞tim-3表達的降低及外周gal-9產(chǎn)生水平的下調(diào)破壞外周nk細胞通過分泌細胞因子和維持較低的殺傷活性而發(fā)揮的免疫耐受作用，進而導(dǎo)致自然流產(chǎn)；

進一步，本發(fā)明進行了干擾gal-9/tim-3信號通路對妊娠結(jié)局的影響試驗以及過繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細胞挽救妊娠失敗實驗，結(jié)果顯示，tim-3在正常妊娠過程中通過調(diào)節(jié)外周nk細胞的功能起保護作用，如果tim-3所介導(dǎo)的信號通路被破壞，會影響外周nk細胞的功能甚至分化發(fā)育，從而影響妊娠的正常進行和胚胎的發(fā)育，尤其galectin-9/tim-3信號通路異常會引起早孕外周血nk細胞功能紊亂致不良妊娠結(jié)局；經(jīng)過il-4和孕酮刺激的tim-3⁺nk細胞有效緩解流產(chǎn)模型高胚胎吸收率；過繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細胞降低nk細胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，過繼轉(zhuǎn)輸tim-3^-nk細胞不影響妊娠結(jié)局。

本發(fā)明經(jīng)試驗證明了一種耐受性nk亞群在正常妊娠外周血的高表達，而自然流產(chǎn)患者這種細胞數(shù)量下降、功能紊亂；拮抗nk細胞的tim-3導(dǎo)致妊娠失敗，過繼轉(zhuǎn)輸該nk細胞亞群可挽救免疫性自然流產(chǎn)模型以及nk敲除所致的妊娠失??；所述的表達tim-3的外周血nk細胞可用于制備自然流產(chǎn)生物標記物，進一步作為臨床不明原因自然流產(chǎn)的新型預(yù)測與防治靶點。

本項發(fā)明的優(yōu)點在于：

提供了表達tim-3的外周血nk細胞可用于制備自然流產(chǎn)生物標記物，進一步作為臨床不明原因自然流產(chǎn)的新型預(yù)測與防治靶點；

所述的tim-3⁺nk細胞在婦女外周血存在，其表型與功能在早孕外周與蛻膜局部高度一致，只需抽取少許外周血，通過流式細胞分析即可監(jiān)測孕婦的子宮局部與全身的免疫耐受狀態(tài)；不僅如此，針對這群細胞，通過體外刺激(如il-4、p)后過繼轉(zhuǎn)輸該亞群細胞可用于直接防治反復(fù)自然流產(chǎn)患者的再次妊娠失敗。

附圖說明

圖1：顯示人早孕外周血不同免疫細胞亞群tim-3的表達情況以及tim-3⁺nk細胞在不同孕期的比例，其中tim-3⁺nk細胞在早孕期比例明顯高于非孕與中孕期。

圖2，顯示il-4/stat6信號與妊娠相關(guān)的孕激素上調(diào)外周血tim3⁺nk細胞比例，

其中，th2型細胞因子il-4通過活化stat6信號上調(diào)tim-3表達，stat6抑制劑與th1型細胞因子抑制il-4的這種調(diào)節(jié)作用，經(jīng)典的保胎劑孕酮亦促進pnk細胞表達tim-3。

圖3，顯示人早孕外周血tim-3⁺nk細胞呈現(xiàn)免疫耐受表型，

其中，芯片分析結(jié)果顯示tim-3+nk細胞和tim-3-nk細胞是有差異基因表達的兩群nk細胞亞群，tim-3⁺nk細胞中865個基因上調(diào)表達，100個基因下調(diào)表達，并且上調(diào)表達的基因多與th2型免疫應(yīng)答及免疫耐受有關(guān)；fcm分析人早孕外周血tim-3⁺與tim-3^-的nk細胞，發(fā)現(xiàn)與tim-3^-nk細胞相比，tim-3⁺nk細胞產(chǎn)生更高水平il-4、il-10與tgf-β，更低水平的tnf-α與perforin；其對滋養(yǎng)細胞的殺傷活性亦明顯下降。

圖4：galectin-9/tim-3信號通過活化jnk與akt信號調(diào)控外周nk細胞呈現(xiàn)耐受表型，其中顯示，tim-3的天然配體gal-9刺激pnk細胞，qpcr與westernblot顯示gal-9刺激后活化與nk細胞發(fā)育分化以及細胞毒性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子水平，上調(diào)il-4/il-10、下調(diào)tnf-1/perforin與細胞毒性。

圖5：自然流產(chǎn)患者外周血nk細胞tim-3/gal-9表達異常，伴有nk細胞功能紊亂，其中，圖5.1顯示自然流產(chǎn)患者外周血nk細胞tim-3表達下降、外周血gal-9水平低下，伴隨tim-3⁺nk細胞抗炎細胞因子基因啟動子和增強子區(qū)域的染色質(zhì)可接近性顯著降低，促炎細胞因子生成降低，導(dǎo)致th2/th1型細胞因子紊亂、細胞殺傷毒性增強；圖5.2顯示早孕小鼠外周血與脾臟nk細胞gal-9/tim-3表達高于中孕期；自然流產(chǎn)小鼠組低于正常妊娠小鼠；自然流產(chǎn)小鼠外周血與脾臟tim-3⁺nk細胞產(chǎn)生th2/th1型細胞因子紊亂。

圖6：阻斷tim-3信號損傷nk細胞功能導(dǎo)致妊娠失敗，其中，

圖示正常妊娠與自然流產(chǎn)模型小鼠的胚胎吸收與發(fā)育以及nk細胞的功能，阻斷tim-3信號降低正常妊娠與自然流產(chǎn)小鼠的窩崽數(shù)、增加其胚胎吸收、抑制胚胎生長；這種作用在自然流產(chǎn)組更顯著，外源性給予gal-9不影響正常妊娠的窩崽數(shù)、胚胎大小與吸收率與nk細胞功能，但顯著抑制自然流產(chǎn)小鼠的胚胎吸收，并且改善nk細胞的功能。

圖7：過繼轉(zhuǎn)輸正常妊娠脾臟tim-3⁺nk細胞緩解胚胎丟失，

其中，a為實驗流程圖，b，c，d，e顯示過繼轉(zhuǎn)輸正常妊娠脾臟tim-3⁺nk細胞緩解自然流產(chǎn)模型胚胎吸收，而過繼轉(zhuǎn)輸自然流產(chǎn)小鼠tim-3^-nk則無改善作用；將自然流產(chǎn)小鼠nk細胞經(jīng)il-4、p處理后的tim-3⁺nk過繼轉(zhuǎn)輸給自然流產(chǎn)小鼠后，胚胎吸收率顯著下降；nk細胞缺陷小鼠妊娠模型，其胚胎吸收率顯著升高，過繼轉(zhuǎn)輸正常tim-3⁺nk而不是tim-3^-nk細胞，顯著降低nk缺陷鼠的胚胎吸收率。

圖8為表達tim-3的外周血nk細胞作為自然流產(chǎn)生物標記物用于早期妊娠失敗的 預(yù)測與防治靶點實驗流程總圖。

具體實施方式

實施例1：不同妊娠狀態(tài)外周血tim-3⁺nk細胞百分率比較與差異分析/分析tim-3在不同妊娠狀態(tài)外周血nk細胞的表達特征及其調(diào)節(jié)

1)分析tim-3在不同妊娠狀態(tài)外周血nk細胞的表達特征

首先分離正常非孕、早孕、中孕期婦女外周血，ficoll分離淋巴細胞，fcm分析tim-3在cd4⁺t細胞、cd8⁺t細胞、nk細胞、nkt細胞、dc細胞和單核細胞的表達(如圖1a所示)，結(jié)果顯示，nk細胞、dc細胞和單核細胞高表達tim-3(分別為80％、80％、90％)，tim-3在nk細胞表達水平在不同孕期有明顯差異，圖1b，c所示，妊娠早期外周血nk細胞tim-3表達明顯上調(diào)，妊娠中期降至未孕期水平。

2)tim-3在人早孕外周血nk細胞的表達調(diào)節(jié)

由于早孕期外周血與母-胎界面呈現(xiàn)th2優(yōu)勢，妊娠相關(guān)激素如e、p、hcg亦升高，本發(fā)明進一步探討nk細胞tim-3表達上調(diào)的可能因素，用磁珠將未孕婦女外周nk細胞分離純化后，單獨或聯(lián)合添加重組人il-4(100ng/ml)和ifn-γ(35ng/ml)培養(yǎng)48h，收集細胞，用流式細胞術(shù)檢測nk細胞tim-3的表達情況；圖2顯示th2型細胞因子il-4處理nk細胞后顯著上調(diào)tim-3表達，這種作用被ifn-γ所削弱；為了進一步探討il-4/ifn-γ調(diào)控nk細胞tim-3表達的作用機制，本實驗首先用流式細胞術(shù)檢測上述方法處理后nk細胞中stat6(il-4作用的下游信號分子)的磷酸化水平，結(jié)果顯示，il-4處理的nk細胞組，其stat6的磷酸化水平確實明顯提高，而聯(lián)合應(yīng)用ifn-γ與il-4抑制il-4誘導(dǎo)的stat6磷酸化水平(圖2c，d)。westernblot檢測得到一致的結(jié)果如圖2e所示)，stat6的特異性阻斷劑a77-1726可以抑制il-4對tim-3的上調(diào)作用(如圖2f所示)，th2型細胞因子il-4通過活化其下游分子stat6進一步促進nk細胞tim-3的表達，而th1型細胞因子ifn-γ可以拮抗這一作用；

妊娠早期，不僅外周血中的th2/th1型細胞因子格局發(fā)生改變，母體的激素水平也發(fā)生明顯的變化，因此，本實驗進一步觀察妊娠相關(guān)激素是否也會影響外周nk細胞tim-3的表達，用不同濃度梯度的雌、孕激素、hcg-β刺激純化的未孕女性外周nk細胞，流式細胞術(shù)檢測nk細胞tim-3的表達情況，如圖2g所示，孕激素以濃度依賴的方式對nk細胞tim-3的表達進行調(diào)控，較低濃度的孕激素促進nk細胞tim-3的表達，更高濃 度時，這種上調(diào)作用就消失甚至抑制nk細胞tim-3的表達，而雌激素與hcg-β對nk細胞tim-3的表達無顯著影響；

結(jié)果表明，妊娠早期，妊娠相關(guān)激素(主要是孕酮)與th2型細胞因子(il-4)參與外周nk細胞的tim-3表達上調(diào)。

實施例2：galectin-9/tim-3信號介導(dǎo)早孕外周nk細胞免疫耐受實驗

1)外周血tim-3+nk與tim3-nk細胞的表型比較

為了探討tim-3在nk細胞上的表達是否與nk細胞功能相關(guān)，將分離得到的外周單個核細胞進一步用磁珠分選出tim-3⁺nk與tim3^-nk細胞，鑒定分選純度為92％，滿足實驗要求，提取總rna后進行全基因組芯片分析；如圖3a、b所示，tim-3+和tim-3-nk細胞是有差異基因表達的兩群nk細胞亞群，tim-3⁺nk細胞中865個基因上調(diào)表達，100個基因下調(diào)表達，并且上調(diào)表達的基因多與th2型免疫應(yīng)答及免疫耐受有關(guān)；本實驗用pma、離子霉素及bfa刺激4至6小時后上進一步用流式檢測th2型、th1型細胞因子的蛋白表達水平，如圖3c，d所示，th2型細胞因子il-4、il-10、tgf-β在tim-3⁺pnk細胞的表達水平明顯高于tim-3^-pnk細胞而th1型細胞因子tnf-α在兩群細胞的表達水平則相反；ifn-γ在tim-3⁺nk與tim3^-nk細胞的表達幾無差異(如圖3e，f所示)；

進一步比較tim-3⁺nk與tim3^-nk細胞的殺傷活性，將純化的這兩群細胞分別與靶細胞htr-8(絨毛外細胞滋養(yǎng)細胞系)接觸培養(yǎng)，用non-radioactivecytotoxicityassay試劑盒檢測細胞殺傷活性，如圖3i所示，tim-3⁺nk與tim3^-nk細胞的殺傷活性均隨著效靶比的下降而降低，但tim-3⁺nk細胞的殺傷活性始終低于tim3^-nk細胞；流式細胞術(shù)分析tim-3⁺nk與tim3^-nk細胞產(chǎn)生穿孔素perforin的水平，結(jié)果顯示perforin在tim-3⁺nk細胞的表達水平明顯低于tim-3-nk細胞(如圖3g，h)；實驗些結(jié)果顯示：與tim3^-nk細胞相比，tim-3⁺nk細胞產(chǎn)生較高水平的th2型細胞因子和較低水平的th1型細胞因子，并呈現(xiàn)出較弱的殺傷活性，這些表型特征將更有利于維持妊娠外周免疫的耐受狀態(tài)。

2)tim-3天然配體gal-9對外周血nk細胞分化發(fā)育與功能相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)節(jié)

用tim-3的天然配體galectin-9處理外周nk細胞能明顯促進與nk細胞分化發(fā)育及功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子id-2、blimp1、gata-3在mrna水平的表達，而調(diào)控nk細胞殺傷活性的轉(zhuǎn)錄因子eomes的表達則明顯下調(diào)，進一步分析發(fā)現(xiàn)，gal-9通過活化akt、 jnk兩條信號通路，促進nk細胞產(chǎn)生th2型細胞因子，抑制其th1型細胞因子生成，并且有效降低nk細胞殺傷活性；因此，nk細胞上的tim-3受體與galectin-9相互作用，通過活化akt、jnk信號通路，促進轉(zhuǎn)錄因子id-2、blimpl、gata-3的表達，進而誘導(dǎo)外周nk細胞向免疫耐受表型分化。

3)，gal-9/tim-3信號對外周血nk細胞的細胞因子分泌格局和殺傷活性的影響

研究提示tim-3通過與其配體gal-9結(jié)合可能參加nk細胞的表型與功能調(diào)節(jié)，因此，進一步在外周nk細胞的培養(yǎng)體系中加入了rhgal-9或anti-tim-3中和性抗體，處理48小時后，rhgal-9處理組il-4、il-10產(chǎn)生水平明顯升高，而tnf-α產(chǎn)生水平則明顯降低；單獨用anti-tim-3中和性抗體處理組細胞因子的產(chǎn)生水平在處理前后無明顯變化，但是rhgal-9和anti-tim-3聯(lián)合處理組il-4、il-10產(chǎn)生水平明顯低于rhgal-9處理組，tnf-α產(chǎn)生水平則相反；實驗結(jié)果提示tim-3/gal-9信號參與nk細胞優(yōu)勢產(chǎn)生th2型細胞因子(如圖4c所示)；

此外，rhgal-9處理后的外周血nk細胞殺傷活性顯著下降，這一作用被anti-tim-3中和性抗體部分恢復(fù)，而單獨用anti-tim-3中和性抗體則無明顯作用；同樣，用流式細胞術(shù)檢測rhgal-9或anti-tim-3中和性抗體處理后的nk細胞穿孔素perforin的產(chǎn)生水平也發(fā)生了上述改變(如圖4d，e所示)。

4)gal-9/tim-3相互作用通過活化jnk、akt信號調(diào)節(jié)外周血nk細胞功能實驗

為了進一步解析tim-3/gal-9調(diào)節(jié)外周血nk細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，本實驗用rhgal-9分別刺激純化的外周血nk細胞10分鐘、30分鐘、60分鐘，westernblot檢測外周血nk細胞信號通路相關(guān)分子的表達情況，如圖4f所示，與nk細胞單獨培養(yǎng)相比，rhgal-9刺激后，akt、jnk和erk的磷酸化水平顯著升高而nk-κb的磷酸化水平在刺激前后沒有明顯變化，提示tim-3/gal-9很有可能通過活化akt、jnk和erk這三條信號通路來調(diào)控外周nk細胞的功能；

為了明確上述可能的信號通路，將akt、jnk和erk三條信號通路的特異性抑制劑加入gal-9處理nk細胞的培養(yǎng)體系中，然后用流式細胞術(shù)檢測nk細胞細胞因子和穿孔素的產(chǎn)生水平，如圖4g所示，用jnk或akt的特異性阻斷劑可以抑制gal-9對nk細胞的調(diào)節(jié)作用，而erk的特異性阻斷劑則沒有明顯作用；結(jié)果表明，gal-9是通過活化jnk、akt兩條信號通路進一步改變nk細胞的生物學(xué)功能，而不是erk。

實施例3：早孕外周nk細胞galectin-9/tim-3信號異常致nk功能障礙與妊娠失敗實驗

1)自然流產(chǎn)患者外周nk細胞tim-3表達水平下降gal-9產(chǎn)生水平降低，nk細胞細

胞因子分泌水平紊亂，殺傷活性增強

為研究外周nk細胞數(shù)量與功能的異常與自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，進一步證實正常妊娠和自然流產(chǎn)患者的外周血nk細胞tim-3的表達是否有差異，血液中g(shù)al-9的含量是否有改變，nk細胞的功能是否也相應(yīng)變化？本實驗采集了早期正常妊娠和不明原因自然流產(chǎn)患者的外周血，用流式細胞術(shù)針對以上問題進行了檢測和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管tim-3+nk細胞在外周免疫活性細胞中所占的比例沒有發(fā)生明顯升降，但是tim-3在nk細胞表達的熒光密度在流產(chǎn)患者外周血中顯著降低(如圖5.1a所示)，進一步系統(tǒng)比較正常妊娠和反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周tim-3+nk細胞的差異，利用atac-seq技術(shù)檢測和分析正常妊娠和反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周tim-3+nk細胞和tim-3-nk細胞的染色質(zhì)可接近性，主要成分分析結(jié)果顯示，病人tim-3+nk細胞和tim-3-nk細胞與正常人nk細胞可以很好的區(qū)分開(如圖5.1d所示)，聚類分析的結(jié)果與主要成分分析結(jié)果是一致的，提示tim-3+nk細胞是與妊娠結(jié)局密切相關(guān)的功能細胞；進一步對流產(chǎn)患者和正常妊娠女性外周tim-3+nk細胞進行比較和分析，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)患者tim-3+nk細胞中有260個基因位點的染色質(zhì)可接近性下降，360個基因位點的染色質(zhì)可接近性升高(如圖5.1e所示)，結(jié)合已知的人cd56+nk細胞的chip-seq結(jié)果分析，染色質(zhì)可接近性降低的基因位點主要是增強子，而染色質(zhì)可接近性升高的基因位點主要的是啟動子，其中，tgf-β1的3’端的染色質(zhì)可接近性降低最顯著，與此同時，tgf-β1的啟動子區(qū)域的染色質(zhì)可接近性也明顯降低，提示tgf-β13’端區(qū)域可能發(fā)揮著增強子的作用，與tgf-β1啟動子協(xié)同調(diào)控tgf-β1的表達(如圖5.1f所示)，il-10的染色質(zhì)可接近性也有同樣的改變(如圖5.1g所示)；

進一步檢測nk細胞產(chǎn)生th2、th1型細胞因子和反應(yīng)其殺傷活性的穿孔素perforin發(fā)現(xiàn)，由tim-3⁺pnk細胞產(chǎn)生的th2型細胞因子(l-4，il-10及tgf-β1)在流產(chǎn)患者外周血明顯下降，相反地，th1型細胞因子(tnf-α、ifn-γ)則明顯升高，tim-3^-pnk細胞產(chǎn)生的細胞因子水平在兩種樣本中并無明顯的差異(如圖5.1h，i所示)；同樣地，tim-3⁺pnk細胞而不是tim-3^-pnk細胞產(chǎn)生的穿孔素perforin在流產(chǎn)患者外周血中明 顯上調(diào)(如圖5.1j所示)，提示流產(chǎn)患者外周nk細胞殺傷活性明顯增強，而這主要是因為tim-3⁺pnk細胞毒性的升高；

如圖5.1b所示，流產(chǎn)患者外周血gal-9分泌水平由正常情況下的1.84ng/ml下降到0.965ng/ml，另外，包括nk細胞自身在內(nèi)的各外周免疫活性細胞(cd4⁺、cd8⁺tcells，cd14⁺單核細胞和cd11c⁺樹突狀細胞)產(chǎn)生gal-9的水平也均有明顯的下調(diào)(如圖5.1c所示)；上述結(jié)果說明外周nk細胞tim-3表達的降低及外周gal-9產(chǎn)生水平的下調(diào)可能破壞了外周nk細胞通過分泌細胞因子和維持較低的殺傷活性而發(fā)揮的免疫耐受作用，進而導(dǎo)致自然流產(chǎn)。

實施例4：干擾gal-9/tim-3信號通路對妊娠結(jié)局的影響實驗

基于已經(jīng)驗證了gal-9/tim-3在妊娠早期外周血中異常表達可能與自然流產(chǎn)有關(guān)，為了進一步解析這一對分子介導(dǎo)的信號通路對妊娠結(jié)局的影響及分子機制，本實驗對正常和流產(chǎn)小鼠模型的gal-9/tim-3信號進行人為干預(yù)；首先建立正常和流產(chǎn)小鼠模型，比較早孕和中孕期小鼠外周(包括外周血和脾臟)nk細胞tim-3的表達，結(jié)果顯示，正常妊娠小鼠的早孕期外周nk細胞tim-3表達高于中孕期，與人是一致的，也就是說tim-3+nk細胞在妊娠早期富集；圖5.1a的結(jié)果顯示流產(chǎn)患者外周nk細胞gal-9/tim-3差異表達伴隨nk細胞功能紊亂，本實驗分析比較了tim-3與gal-9在正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型早孕期外周nk細胞上的表達，如圖5.2a，b所示，相對于正常妊娠小鼠，自然流產(chǎn)小鼠nk細胞在外周血和脾臟中表達tim-3和gal-9的水平均明顯下降，不僅如此，自然流產(chǎn)模型tim-3+pnk產(chǎn)生th2型細胞因子(il-4，il-10及tgf-β)的水平降低，而產(chǎn)生th1型細胞因子的水平(tnf-α)則升高；流式細胞術(shù)分析顆粒酶a(granzymea，反映nk細胞的殺傷活性)也發(fā)現(xiàn)在自然流產(chǎn)模型外周tim-3+nk細胞中的表達明顯高于正常妊娠模型tim-3+nk；分析脾臟中的上述指標，與外周血的結(jié)果是一致的；(圖5.2c，d)顯示了不管是在外周血還是，在脾臟，tim-3-nk分泌細胞因子的功能和殺傷活性在正常妊娠和自熱流產(chǎn)模型中幾乎沒有差異，結(jié)果表明gal-9/tim-3與妊娠外周nk細胞正常功能的發(fā)揮密切相關(guān)；

為了明確tim-3/gal-9在妊娠中的作用，本實驗用重組的外源性的gal-9和rm3-23(tim-3信號通路的阻斷劑)來干預(yù)妊娠小鼠體內(nèi)gal-9/tim-3信號通路，正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型在用rmt3-23阻斷tim-3信號通路后，兩組的胚胎吸收率均明顯 上升，正常妊娠模型由5％左右的胚胎吸收率增加至17％，而自然流產(chǎn)模型原本就較高的胚胎吸收率由約27％增加至約46％(圖6a，d)；相應(yīng)的，正常妊娠模型存活下來的胎仔數(shù)由10只降到6只，自然流產(chǎn)模型則由干預(yù)前的7只降到4只(如圖6a，c所示)；盡管正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型的胚胎吸收率有明顯的差異，但是存活的胚胎大小并無差異；然而，用rmt3-23注射小鼠后，兩種模型的小鼠胚胎體積均明顯小于未注射組，推測tim-3信號的阻斷不僅會影響胚胎吸收率，對胚胎的生長發(fā)育也有顯著的抑制作用(如圖6b，e所示)；為了證明tim-3信號的阻斷是否會對nk細胞的功能產(chǎn)生影響，本實驗用流式細胞術(shù)檢測分析了上述處理組小鼠的外周血和脾臟nk細胞，結(jié)果顯示，注射了rmt3-23的小鼠其外周血中的nk細胞數(shù)量急劇降低，由處理前的5-10％降到1-2％，甚至達到刪除水平，但是脾臟中的nk細胞數(shù)量并沒有發(fā)生改變；進一步分析脾臟nk細胞的功能，發(fā)現(xiàn)正常妊娠小鼠脾臟nk細胞il-4、il-10、tgf-β的產(chǎn)生水平在阻斷tim-3信號后顯著下降，tnf-α則顯著上升，inf-上在阻斷前后無明顯差異；tim-3信號阻斷對正常妊娠脾臟nk細胞的作用在自然流產(chǎn)模型中體現(xiàn)得更加顯著(如圖6f所示)；對脾臟nk細胞顆粒酶a(granzymea)的檢測發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)模型在tim-3阻斷后產(chǎn)生更高水平的granzymea，提示nk細胞的殺傷活性增強，而tim-3阻斷沒有增強正常妊娠組nk細胞的殺傷活性，反而呈現(xiàn)出一定水平的降低，實驗數(shù)據(jù)提示，tim-3在正常妊娠過程中通過調(diào)節(jié)外周nk細胞的功能起保護作用，如果tim-3所介導(dǎo)的信號通路被破壞，會影響外周nk細胞的功能甚至分化發(fā)育，從而影響妊娠的正常進行和胚胎的發(fā)育；

本實驗給孕鼠注射外源性重組gal-9，以期是否會對妊娠結(jié)局有所改善，結(jié)果顯示，給予外源性gal-9確實能在一定程度上改善妊娠結(jié)局：對于自然妊娠模型，能降低胚胎吸收率，增加存活的胎仔數(shù)，但對tim-3阻斷的自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型的妊娠結(jié)局無明顯的改善作用；檢測脾臟nk細胞的功能發(fā)現(xiàn)，注射gal-9的自然流產(chǎn)模型的nk細胞il-4、tgf-β的產(chǎn)生水平上升，inf-γ下降，granzymea也下降，而il-10、tnf-α沒有明顯改變；預(yù)先用rmt3-23阻斷tim-3的正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型，給予gal-9后nk細胞的細胞因子產(chǎn)生水平和殺傷活性均沒有顯著變化；上述實驗數(shù)據(jù)說明，gal-9是通過與其受體tim-3結(jié)合并相互作用來調(diào)節(jié)外周nk細胞的功能從而維持正常妊娠順利進行，如果tim-3的信號通路被阻斷，則gal-9無法與tim-3正常結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(如圖6所示)；

因此，galectin-9/tim-3信號通路異常會引起早孕外周血nk細胞功能紊亂致不良妊娠結(jié)局。

實施例5：過繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細胞挽救妊娠失敗實驗

從正常妊娠小鼠的脾臟中流式分選出tim-3⁺nk，tim-3^-nk和總nk細胞，分別將上述三種細胞重懸于200ulpbs中，經(jīng)尾靜脈注射過繼轉(zhuǎn)輸給懷孕第4.5天的流產(chǎn)小鼠；用同樣的方法從流產(chǎn)小鼠的脾臟中得到tim-3⁺nk，tim-3^-nk和總nk細胞，tim-3⁺nk，tim-3^-nk和其中一部分nk細胞用同樣的方法過繼轉(zhuǎn)輸給流產(chǎn)小鼠，另一部分nk細胞分別用il-4和孕酮體外刺激，48小時后，再次流式分選tim-3⁺nk，tim-3^-nk細胞，按照上述方法過繼轉(zhuǎn)輸給流產(chǎn)小鼠，孕14.5天處死流產(chǎn)小鼠，觀察胚胎吸收情況(如圖7a所示)，結(jié)果顯示，正常妊娠小鼠tim-3⁺nk降低流產(chǎn)模型胚胎吸收率，而流產(chǎn)小鼠tim-3⁺nk無顯著作用，但是經(jīng)過il-4和孕酮刺激的tim-3⁺nk細胞有效緩解流產(chǎn)模型高胚胎吸收率(圖7d所示)；

建立nk細胞缺陷小鼠(nfil3^-/^-)的早孕模型，于孕4.5天按上述方法過繼轉(zhuǎn)輸正常妊娠nfil3⁺/⁺小鼠脾臟的tim-3⁺nk與tim-3^-nk細胞，于孕14.5天處死nfil3^-/^-孕鼠，觀察胚胎著床數(shù)與胚胎吸收率，結(jié)果顯示過繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細胞降低nk細胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，過繼轉(zhuǎn)輸tim-3^-nk細胞不影響妊娠結(jié)局(如圖7e，f所示)。