本發(fā)明涉及利用生物標記分子篩檢膀胱癌或泌尿系統(tǒng)癌癥的檢測方法及套組。
背景技術：
：癌癥是目前世界上十大死亡原因之一，各國積極研究提早預防性檢測或是罹癌預后檢測的方法，期能在早期癌癥時提早篩檢，提高治愈機率。傳統(tǒng)檢驗癌癥的有無，例如x光、抹片、血液腫瘤標志、超音波等等，癌癥篩檢率約為0.2～0.3％，但這些檢驗與判讀往往耗工費時，方便性不足，且篩檢率偏低，迄今仍無法說服大眾這些一般性健康檢查能有效的早期診斷癌癥。過去的研究顯示，在特定基因的高度甲基化(site-specifichypermethylation)與其功能的喪失有關，從而被利用在癌癥診斷，例如，臺灣專利第i-329743號(亦即美國專利us7820386b2)，是關于一種子宮頸癌高危險性篩檢的方法，利用檢測一子宮頸樣本檢體中目標基因的cpg序列甲基化狀態(tài)判斷子宮頸癌的可能性，該目標基因是由sox1、pax1、lmx1a、nkx6-1、wt1及onecut1所組成。另一件臺灣專利第i-385252號(亦即美國專利us8048634b2)，也是利用檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態(tài)以篩檢癌癥的方法，該目標基因是由ptprr,znf582,pde8b及dbc1所組成?；蚣谆瘷z測學理雖發(fā)展已有相當時日，亦為學術研究者廣泛使用，然如欲應用于醫(yī)療檢測等臨床相關領域，則測試穩(wěn)定度及具有重復性是非常重要，針對不同目標基因于不同癌癥醫(yī)療檢測的應用尚需進一步開發(fā)及驗證。在美國癌癥患者排名中，膀胱癌在男性名列前四名，女性則位居第九。每年有超過47,000位男性和16,000女性被診斷出膀胱癌。而一般膀胱癌或泌尿系統(tǒng)癌的診斷不外乎身體檢查、尿液培養(yǎng)、膀胱鏡、靜脈注射腎盂攝影術等，但尚無一可用于早期診斷的方法。2011年chung等教示六種特定基因的甲基化與膀胱癌有關，包括myo3a、ca10、sox11、nkx6-2、penk及dbc1，可使用于尿液檢體臨床上的檢查。(chung等，cancerepiodemiolbiomarkersprev.20(7):1483-1491,2011)。另有一文獻提及brca1,rarb及wt1可供檢測膀胱癌，于尿液檢體中抑制甲基化的標識基因，利用包含多個抑制甲基化的標識基因的專一于甲基化的多叢連結依賴探針(methylation-specificmultiplexligation-dependentprobe，ms-mldp)檢測尿液檢體(cabello等，j.mol.diagn.13:29-40,2011)。但其他目標基因尚無建立與膀胱癌在臨床上的意義及相關驗證。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的，即在提供針對膀胱癌或泌尿系統(tǒng)癌癥檢測，有別于已知標識基因的具高特異性及靈敏度的標識基因，檢測檢體中該等基因甲基化的有無，進而判斷癌變發(fā)生的可能性，尤其可利用在早期診斷上。又因為方法快速且簡便，且可用于尿液等檢體的檢測，成本低且對受檢個體不會造成壓力，可開發(fā)為一般消費者使用或大量篩檢的檢測套組。因此，本發(fā)明一方面提供一種檢測膀胱癌或泌尿系統(tǒng)癌癥的方法，包含：分析待檢測個體的檢體中一或多個目標基因甲基化狀態(tài)判斷膀胱或泌尿系統(tǒng)發(fā)生癌變的可能性，其中該目標基因系選自由pax1、sox1、znf582、nkx6-1及ptprr組成的群，如一個體的檢體經(jīng)檢測判定該目標基因有甲基化，判定膀胱或泌尿系統(tǒng)有發(fā)生癌變的可能性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可用于尿液、血液、粘液、泌尿系統(tǒng)上皮細胞、黏膜脫落細胞或手術后的癌癥組織等離體的檢體的檢測，泌尿系統(tǒng)尤佳為尿液。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明方法可用于早期診斷及術后或治療后追蹤。根據(jù)本發(fā)明的實施例所述的癌癥包含膀胱癌及泌尿道細胞癌。另一方面，本發(fā)明提供用于一種檢測套組以供實施本發(fā)明方法。附圖說明圖1提供疾病組與正常組針對目標基因pax1甲基化狀態(tài)的甲基化狀態(tài)分布。圖2提供疾病組與正常組針對目標基因sox1甲基化狀態(tài)的甲基化狀態(tài)分布。圖3提供疾病組與正常組針對目標基因znf582甲基化狀態(tài)的甲基化狀態(tài)分布。圖4提供疾病組與正常組針對目標基因pax1甲基化狀態(tài)檢測診斷膀胱癌發(fā)生可能性的roc曲線及auc。圖5提供疾病組與正常組針對目標基因sox1甲基化狀態(tài)檢測診斷膀胱癌發(fā)生可能性的roc曲線及auc。圖6提供疾病組與正常組針對目標基因znf582甲基化狀態(tài)甲基化狀態(tài)檢測診斷膀胱癌發(fā)生可能性的roc曲線及auc。具體實施方式本發(fā)明提供一種檢測膀胱癌或泌尿系統(tǒng)癌的方法，包含：分析待檢測個體的檢體中一或多個目標基因甲基化狀態(tài)判斷膀胱癌或泌尿系統(tǒng)發(fā)生癌變的可能性，其中該目標基因系選自由pax1、sox1、znf582、nkx6-1及ptprr組成的群，如一個體檢體經(jīng)檢測判定目標基因有甲基化，判定膀胱或泌尿系統(tǒng)有發(fā)生癌變的可能性。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明方法可用以檢測泌尿系統(tǒng)不正常細胞增生現(xiàn)象，包括但不限于癌前病變檢測、腫瘤檢測、腫瘤復發(fā)檢測或腫瘤用藥預測或愈后效果檢測。本文中使用的術語“泌尿系統(tǒng)”，系指負責尿液的產(chǎn)生、運送、儲存與排泄的系統(tǒng)。人類的泌尿系統(tǒng)包括左右兩顆腎臟、左右兩條輸尿管、膀胱、內(nèi)外兩道括約肌，以及尿道。本文中使用的術語“檢體”，系指來自待測個體的體液或組織，包含但不限于尿液、血液、泌尿系統(tǒng)上皮細胞或手術后的癌癥組織等離體的檢體。為進行本發(fā)明目標基因及內(nèi)部控制基因檢測，可以連鎖擴增產(chǎn)物的鑒定方法進行，包括但不限于熒光法、定序法(sequencing)、微數(shù)組(microarrays)、質譜儀分析(massspectrometer)、變性高效液相色譜(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,dhplc)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。為實施本發(fā)明方法，本發(fā)明亦提供一種檢測套組，其包含：含偵測目標基因的混合液，其至少包含有針對一或多個目標基因甲基化區(qū)域的正向引子、反向引子對或探針；其中該目標基因系選自由pax1、sox1、znf582、nkx6-1及ptprr組成的群；含偵測內(nèi)部控制基因的混合液，其至少包含可偵測內(nèi)部控制基因的正向引子、反向引子對或探針；一聚合酶連鎖擴增反應主要混合液?？蓞⒖寂_灣專利第i-513822號所述方法，將該待測個體檢體萃取出其gdna，經(jīng)適當前處理及化學反應，檢測檢體中基因cpg序列甲基化的存在與否。根據(jù)本發(fā)明，該針對目標基因ptprr甲基化區(qū)域的正向引子、反向引子或探針的序列系選自seqidno：69-84所示的核苷酸序列，其具有至少80％或至少90％同一性的序列，與其任一序列中至少連續(xù)十個核苷酸相同的序列，及其互補序列組成的群。根據(jù)本發(fā)明，可利用該目標基因引子對及/或探針進行偵測。其目標基因引子對及/或探針序列系選自seqidno：1-84所示的核苷酸序列，其具有至少有80％或90％同一性的序列，與其任一序列中至少連續(xù)十個核苷酸相同的序列，及其互補序列組成的群。根據(jù)本發(fā)明，其中該內(nèi)部控制基因系選自于由以下至少一種或一種以上的基因：col2a、β-globin、gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、β-actin所組成的群。根據(jù)本發(fā)明實施例，該可偵測內(nèi)部控制基因擴增產(chǎn)物的正向引子、反向引子探針對及/或探針序列系選自seqidno：85-94所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列，其具有至少80％或至少90％同一性的序列，與其任一序列中連續(xù)至少十個核苷酸相同的序列，及其互補序列組成的群。根據(jù)本發(fā)明實施例，該聚合酶連鎖擴增反應主要混合液的主要成分至少包含聚合酶、dntps及鎂鹽。根據(jù)本發(fā)明實施例，其中該偵測目標基因的混合液與偵測內(nèi)部控制基因的混合液可混合成為單管核酸分子偵測混合液。以下提供實施本發(fā)明方法的具體實施例，用以闡述本發(fā)明的技術特征與功效；但不應作為限縮或被解釋為實施本發(fā)明的限制。實施例實施例1檢驗方法的建立及套組的制備參考臺灣專利第i-513822號所述方法，于檢體中抽取其dna，經(jīng)重亞硫酸鹽(bisulfite)的轉換，并以表1至表6所示用于擴增目標基因pax1、sox1、znf582、nkx6-1、ptprr甲基化區(qū)域及內(nèi)部控制基因的引子及探針組進行甲基化檢測。表1用來擴增目標基因pax1甲基化區(qū)域的引子對及探針組表2用來擴增目標基因znf582甲基化區(qū)域的引子對及探針組序列編號znf582引子及探針組seqidno:265’acgatttacgcggagttagaag3’seqidno:275’tgacggttttttgtttattcggttattc3’seqidno:285’agtgacggttttttgtttattcggttattc3’seqidno:295’cggagggatattgcggcgtcggt3’seqidno:305’atgggaacgtaacggatga3’seqidno:315’atttaacgatttacgcggag3’seqidno:325’aaacgtacctacgcaatacgcga3’seqidno:335’cgaacgcaaacgtacctacgc3’seqidno:345’accgaacgcaaacgtacctacgca3’seqidno:355’acccaaaacgcgcttccacca3’seqidno:365’cgaataaccgaataaac3’seqidno:375’tacgcgaaaaaatac3’seqidno:385’cgccgtacgcaaccga3’seqidno:395’atttcaaaataaaaccgaacgc3’seqidno:405’acccgaccttaaaaccgaat3’表3用來擴增目標基因sox1甲基化區(qū)域的引子對及探針組表4用來擴增目標基因nkx6-1甲基化區(qū)域的引子對及探針組表5用來擴增目標基因ptprr甲基化區(qū)域的引子對及探針組序列編號ptprr引子及探針組seqidno:695’gcgttgttgttgggttgtt3’seqidno:705’aagtcgtcgttaagattcggagaagcgg3’seqidno:715’cggcgttgggtatgtttagtagtc3’seqidno:725’agtcgcggcgttgttgttg3’seqidno:735’tgggtatgtttagtagtcgcgg3’seqidno:745’agattcggagaagcggaattt3’seqidno:755’gttggcgcggagtttattt3’seqidno:765’tacctaaccttctaaacgccca3’seqidno:775’actaaacatacccaacgccgaccc3’seqidno:785’acgacaaatacctaaccttctaaacgccc3’seqidno:795’acgacaaatacctaacctt3’seqidno:805’tccgaaattcaaatcctcgacta3’seqidno:815’aattacgaataaaaaaaacaaaaacgctc3’seqidno:825’accgccaaaaatcttctaatctccgaa3’seqidno:835’ttgtcggcgttatagattgattgttt3’seqidno:845’caatcaatctataacgccgacaaa3’表6用來擴增內(nèi)部控制組基因甲基化區(qū)域的引子對及探針組序列編號內(nèi)部基因控制組引子及探針組seqidno:855’agggttattttgaaaagggagatat3’seqidno:865’ttttaaggggaagatgggatagaag3’seqidno:875’agaggtggggataggtattgggt3’seqidno:885’cttctatcccatcttccc3’seqidno:895’ttcattctaacccaatacct3’seqidno:905’tgttagagtaaagtatagagt3’seqidno:915’aacccaatacctatccccacctc3’seqidno:925’aacaattataaactccaaccaccaaac3’seqidno:935’actccaaccaccaaaccttcattct3’seqidno:945’accgaccccactaatacccg3’聚合酶連鎖反應pcr擴增反應方法步驟如下：(i)在95℃下活化聚合酶10分鐘，(ii)在95℃下變性dna模板10秒及在60℃下鍵合/延長dna鏈40秒，及(iii)進行變性/鍵合/延長循環(huán)30至50次。同時針對不同目標基因或其基因組合可制成診斷套組，供市售或方便使用，其包含：-含目標基因引子及/或探針的混合液，其至少包含針對一或多個目標基因甲基化區(qū)域的正向引子、反向引子對及/或探針；-含內(nèi)部控制基因的混合液，其至少包含針對內(nèi)部控制基因的正向引子、反向引子對及/或探針；-聚合酶連鎖擴增反應主要混合液；及-正對照組：一個目標基因及內(nèi)部控制組基因。實施例2不同目標基因的甲基化分析本實施例采6個與泌尿系統(tǒng)相關癌癥細胞株或上皮細胞相關的癌癥細胞株進行測試，利用表1至表6所揭示用來擴增目標基因pax1、znf582、sox1、nkx6-1、ptprr及內(nèi)部控制組基因甲基化區(qū)域的引子對及探針組，來進行不同目標基因的甲基化程度的分布分析，甲基化程度以目標基因與內(nèi)控基因的cp值(循環(huán)數(shù)值)差異計算：△cp＝cp目標基因–cp內(nèi)部控制組。pax1、sox1、znf582、nkx6-1及ptprr的甲基化狀態(tài)分析結果與已知標識基因wt1、dbc1比較如表7所示。表7不同目標基因甲基化檢測泌尿系統(tǒng)癌癥細胞株的結果實施例3不同目標基因的甲基化分析本實施例采6個癌癥組織，利用表1至表6所揭示用來擴增目標基因pax1、znf582、sox1、nkx6-1、ptprr及內(nèi)部控制組基因甲基化區(qū)域的引子對及探針組，來進行不同目標基因的甲基化程度的分布分析，甲基化程度以目標基因與內(nèi)控基因的cp值(循環(huán)數(shù)值)差異計算：△cp＝cp目標基因–cp內(nèi)部控制組。pax1、sox1、znf582、nkx6-1及ptprr的甲基化狀態(tài)分析檢測膀胱癌與肺癌結果如表8所示，顯示該等目標基因相對于肺癌細胞，特別專一于膀胱癌的檢測。表8不同目標基因于膀胱癌與肺癌細胞的甲基化表現(xiàn)實施例4不同目標基因的甲基化程度分析本實施例采14個正常尿液檢體(正常組)及22個確診為膀胱癌個體的尿液檢體(疾病組)，利用表1至表6所揭示用來擴增目標基因pax1、znf582、sox1及內(nèi)部控制組基因甲基化區(qū)域的引子對及探針組，來進行不同目標基因的甲基化程度的分布分析，甲基化程度以目標基因與內(nèi)控基因的cp值(循環(huán)數(shù)值)差異計算：△cp＝cp目標基因–cp內(nèi)部控制組。pax1、sox1及znf582的甲基化狀態(tài)分析結果如圖1、2及3所示。如圖1、2及3所示，疾病組針對不同目標基因pax1、sox1及znf582的甲基化狀態(tài)分布及其平均值相對于正常組，均有一顯著的差異，足以區(qū)分為癌變檢體與正常檢體，證實確可作為篩檢膀胱癌有無的篩檢指標。實施例5尿液檢體檢測方法敏感度及特異性的計算本實施例使用已確診為正常(正常組)與膀胱癌(疾病組)的尿液檢體共36個，包括正常組14個及疾病組22個，經(jīng)抽取dna，重亞硫酸鹽(bisulfite)轉換，并以表1至表3揭示用于擴增pax1、sox1及znf582甲基化區(qū)域的引子對及探針組檢測其甲基化狀態(tài)，分別針對目標基因pax1、sox1及znf582甲基化區(qū)域及其不同組合進行分析，并計算使用該等目標基因或目標基因組合檢驗方法的敏感度(sensitivity)及特異性(specificity)，其結果見表9。進一步分析其接收者操作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc曲線)并計算曲線下面積(areaunderthecurve,auc)，針對不同目標基因pax1、sox1及znf582甲基化狀態(tài)檢測診斷膀胱癌發(fā)生可能性的roc曲線及auc如圖4、5及6所示。如表9所示，不同目標基因于正常組呈現(xiàn)甲基化的檢體數(shù)，以單一基因分析分別為pax1有1位，sox1有2位及znf582有1位，以其組合分析分別為pax1/znf582有1位，pax1/sox1有2位，sox1/znf582有2位，以及pax1/sox1/znf582有2位；而于疾病組呈現(xiàn)甲基化的檢體數(shù)，以單一基因分析分別為pax1有17位，sox1有18位及znf582有13位，以其組合分析分別為pax1/znf582有18位，pax1/sox1有18位，sox1/znf582有19位，以及pax1/sox1/znf582有19位，計算其膀胱癌診斷的敏感度均在50％以上，甚至高達86％以上(sox1/znf582)，其特異性則高于85％，更高達92％以上(pax1及znf582)，足以證實該等基因及其任一組合可作為膀胱癌的篩檢指標。綜上，無論是檢測單獨的pax1、sox1、znf582的甲基化狀態(tài)，或其任一組合，均可有效于尿液、組織檢體中診斷膀胱或泌尿系統(tǒng)發(fā)生癌變的可能性。表9不同目標基因甲基化檢測診斷膀胱癌結果以及敏感度與特異性當前第1頁12