本發(fā)明涉及與尿酸水平異常相關(guān)的病癥治療的新型化合物及其可藥用鹽、其制備方法和含有該化合物的藥物組合物，以及其作為urat1抑制劑用于治療痛風、治療高尿酸血癥和降低血清尿酸等用途。
背景技術(shù)：
痛風(gout)是人體內(nèi)長期嘌吟代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所引起的一組異質(zhì)性、代謝性疾病，分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥(hyperuricemia)和尿酸鹽結(jié)晶沉積，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)炎、痛風性腎病、痛風凝結(jié)物沉積、尿酸性泌尿系統(tǒng)凝結(jié)物生成等(醫(yī)藥導(dǎo)報.2006,25(8):803-806)。高尿酸血癥是血清中尿酸含量超過正常值，一般男性超過417μmol/l(7.0mg/dl)，女性超過357μmol/l(6.0mg/dl)。當血尿酸濃度過飽和，就有尿酸單鈉鹽結(jié)晶產(chǎn)生，沉積在滑膜液、外周關(guān)節(jié)的軟骨，耳朵的耳廓和手肘的鷹嘴囊等處(thececiltextbookofmedicine.23rded.2008:2069-2075.；lancet.2010,375(9711):318-328.；conn’scurrenttherapy2010,1sted.2008:588-591.)，出現(xiàn)此類癥狀，可診斷為痛風。
痛風與高尿酸血癥的發(fā)生不僅受年齡、性別、地域、種族、遺傳、環(huán)境等因素影響，還與其它代謝綜合征(metabolicsyndrome)如肥胖、高血壓、高血脂、冠心病、胰島素抵抗及糖尿病密切相關(guān)(circj2005,69(8):928-933.；metabolism.2008,57(1)71-76.；curropinrheumatol.2005,17(3):341-345.)。研究表明，高尿酸血癥和高血壓作為代謝綜合征的主要成因，存在相互影響機制，可加劇心血管病的危險系數(shù)(koreanjgastroenterol,2008,49(3)：173-176.)。同時，也有文獻報道，二型糖尿病患者的血尿酸水平明顯高于正常人群，高尿酸血癥對二型糖尿病患者糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展起到了加速作用(eurjclininvest,2001,31(4):318-321.)。近年來，多項危險因素干預(yù)試驗也表明，高尿酸血癥是心肌梗死的一項獨立危險因素(bmcpublichealth,2011,11:832.)。因此，痛風、高尿酸血癥與糖尿病一樣，是危害人類健康的一種嚴重的代謝疾病。
隨著中國近30年來社會經(jīng)濟的發(fā)展和生活方式的改變，中國痛風發(fā)病率直線上升， 2009年上海地區(qū)高尿酸血癥患病率為10.0％；北京市1120例受試者高尿酸血癥患病率為17.86％；廣州地區(qū)患病率居全國首位，男性27.9％，女性12.4％，總患病率高達21.81％。西方發(fā)達國家痛風患病率也較高，其中美國大約有610萬人罹患痛風(partii.arthritisrheum.2008,58(1):26-35.)。
尿酸在腎臟的轉(zhuǎn)運可直接調(diào)控血尿酸水平的高低，大約有85％的痛風是由于尿酸排泄減少所致(curropinnephrolhypertens,2009,18(5):428-432.)。生理學(xué)和藥理學(xué)的研究定義腎臟尿酸轉(zhuǎn)運的經(jīng)典模式為：腎小球的濾過，腎小管的重吸收，腎小管的分泌，分泌后的重吸收，尤其是腎小管重吸收是影響尿酸排泄的最重要因素。目前已證實參與尿酸重吸收的蛋白有：產(chǎn)電的尿酸鹽單向運輸體(uat)，有機陰離子轉(zhuǎn)運體oat1和oat3，尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體(urateaniontransporter1，urat1)。urat1負責尿酸通過近曲小管刷狀緣毛膜一側(cè)轉(zhuǎn)運入上皮細胞內(nèi)，是人體內(nèi)主要的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白，在近曲小管上皮細胞特異性的表達，不受膜電壓和細胞內(nèi)外ph值的影響，為電中性尿酸鹽交換體，呈時間依賴性，有飽和現(xiàn)象(nature.2002,417(6887):447-452.)。尿酸在近端腎小管的重吸收大部分依靠urat1完成(arthritisandrheumatism,1975,18(6):805-809.)。urat1是有機陰離子轉(zhuǎn)運體(oat)超家族成員，是由slc22a12基因編碼，由10個內(nèi)含子9個外顯子組成，擁有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，其cdna全長2642bp，編碼區(qū)1659bp，存在多種突變，易引起尿酸代謝異常，一項meta分析表明slc22a12基因?qū)ρ蛩崴接?.13％的變量貢獻。(jclininvest,2010,120(6):1791-1799.)。亦有研究發(fā)現(xiàn)，腎性低尿酸血癥患者攜帶的slc22a12基因發(fā)生突變，喪失編碼urat1成熟蛋白的能力，提示urat1對腎臟的尿酸重吸收功能具有重要意義。taniguchi等發(fā)現(xiàn)scl22a12基因的g774a突變是痛風發(fā)生的抑制因子，雜合子g774a突變的患者血清尿酸水平明顯比健康人低(arthritisrheum.2005；52(8):2576-2577.)。guan等在124名原發(fā)性痛風患者和168名健康中國男性受試者中，研究slc22a12中基因序列sr893006的多態(tài)性，提示該基因序列的多態(tài)性可能是中國男性高尿酸血癥患者的基因風險因素(scandjrheumatol.2009；38(4):276-81.)。因此，urat1將仍是今后開發(fā)治療痛風和高尿酸血癥藥物的主要靶點之一。
目前市場上用于治療痛風的促尿酸排泄藥有苯溴馬隆(benzbromarone)、丙磺舒(probenecid)、磺吡酮(sulfinpyrazone)、lesinurad等。苯溴馬隆為目前最常用的治療高尿酸血癥和痛風藥物，主要通過抑制urat1對于尿酸的重吸收而起到促尿酸排泄作用，為典型促尿酸排泄藥。相比苯溴馬隆，丙磺舒和磺吡酮對促尿酸排泄治療痛風的療效甚差。苯溴馬隆是苯并呋喃衍生物，上世紀60年代由法國labaz公司開發(fā)，于1971年在德國上 市，曾廣泛用于痛風和高血尿酸癥的治療。但苯溴馬隆存在嚴重的肝損害等副作用，2003年國際上報道該藥可引起爆發(fā)性肝炎的危險后，陸續(xù)在一些國家撤市(醫(yī)藥導(dǎo)報,2006,25(8):803)。
美國fda于2015年12月批準了阿斯利康公司開發(fā)的zurampic(lesinurad)用于治療痛風，該藥為目前最新進入臨床使用的urat1抑制劑。阿斯利康公司同時開發(fā)了lesinurad與別嘌呤醇的復(fù)方制劑，也已進入三期臨床研究。lesinurad為口服固體制劑，該藥可與黃嘌呤氧化酶抑制劑聯(lián)用，用于治療與痛風相關(guān)高尿酸血癥。但lesinurad存在許多不良反應(yīng)：當它與黃嘌呤氧化酶抑制劑合用時常見頭痛，流感，血肌酐增加和胃食管反流??；當在400mg劑量時常出現(xiàn)腎功能相關(guān)的不良反應(yīng)，也可導(dǎo)致嚴重心血管不良反應(yīng)。同時，lesinurad為細胞色素cyp2c9的中度抑制劑，也是敏感cyp3a底物，對嚴重肝損傷患者不建議使用。
目前阿斯利康公司開發(fā)的rdea-3170已在二期臨床，部分公開的uratl抑制劑專利包括wo2005121112,wo2011159839,wo2007086504,wo2008062740,wo2009070740,wo2011085009,wo2014017643,wo2014183555,wo2014077285等。
為了更好地滿足市場需求，我們希望研發(fā)出新的高效、低毒的urat1抑制劑。本發(fā)明將提供一種新型結(jié)構(gòu)urat1抑制劑，并發(fā)現(xiàn)該類化合物具有良好的urat1抑制活性，期待該新型urat1抑制劑可用于治療痛風、高尿酸血癥和相關(guān)腎病，以及降低血尿酸濃度。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供一類新型的urat1抑制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述urat1抑制劑在醫(yī)藥方面的用途。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到：
一類式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體及其混合物形式，及其藥學(xué)上可接受的鹽，
其中，
y或z分別獨立地為n或ch，
r1或r2分別獨立地選自h、d、鹵素、氰基、羥基、羧基、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、c3-4環(huán)烷基、c1-4烷氧基、取代的c1-4烷氧基、苯基、取代的苯基、雜芳基或取代的雜芳基，其取代基選自鹵素、氰基、羥基、氨基、c1-2烷基、c1-2鹵代烷基、c1-2烷氧基或c1-2鹵代烷氧基，
r3或r4分別獨立地選自h或c1-3烷基，或者r3和r4共同構(gòu)成3-6元環(huán)烷基，
r5為h、c1-4烷基或取代的c1-4烷基，其取代基選自c1-2烷氧基、羥基或氨基。
在另一種優(yōu)選方案中，化合物選自式(ii)、式(iii)或式(iv)所示的化合物，
在一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r1或r2分別獨立地選自h、d、鹵素、氰基、羥基、羧基、c1-3烷基、取代的c1-3烷基、c3-4環(huán)烷基、c1-3烷氧基、取代的c1-3烷氧基、苯基、取代的苯基、噻吩基、取代的噻吩基、呋喃基、取代的呋喃基、噻唑基或取代的噻唑基，所述的取代基分別獨立地選自鹵素、氰基、氨基、羥基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r1或r2分別獨立地選自h、d、鹵素、氰基、羥基、羧基、c1-3烷基、c1-3烷氧基、c1-3氟代烷基、c1-3氟代烷氧基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r3或r4分別獨立地選自h、甲基、乙基、正丙基或異丙基，或者r3和r4共同構(gòu)成3-5元環(huán)烷基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r5為h或c1-3烷基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物可選自：
2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸，
2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸甲酯，
2-[(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸，
2-[(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸甲酯，
2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸，
2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸甲酯，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)巰基-2-甲基丙酸，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)巰基-2-甲基丙酸甲酯，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸甲酯，
2-甲基-2-{(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基}丙酸，
2-甲基-2-{(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基}丙酸甲酯，
7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸，
7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸甲酯，
2-甲基-2-{{5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基}巰基}丙酸，
2-甲基-2-{{5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基}巰基}丙酸甲酯，
2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸，
2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸甲酯，
1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸，
1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸乙酯。
本發(fā)明還提供一種制備通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體及其混合物形式，及其可藥用鹽的方法，該方法包括：
通式(ia)化合物與通式(ib)化合物進行取代反應(yīng)，任選進一步在堿性條件下進行水解反應(yīng)得到通式(i)化合物；其中：x1為離去基團或sh，所述的離去基團為鹵素、 oms(甲磺酰氧基)、ots(對甲苯磺酰氧基)或otf(三氟甲磺酰氧基)，優(yōu)選鹵素；x2為鹵素、oms、ots或sh；當x1為離去基團，x2為sh；當x1為sh，x2為鹵素、oms、ots。其它基團的定義如權(quán)利要求及發(fā)明內(nèi)容中通式(i)所述。
除非另外說明，在說明書和權(quán)利要求中使用的以下術(shù)語具有下面討論的含義：
“烷基”用于表示飽和烴基，c1-4烷基是指含有1～4個碳原子的飽和烴基，其包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和新丁基。本發(fā)明中的烷基優(yōu)選為c1-4烷基，進一步優(yōu)選c1-3烷基。取代烷基是指具有一個或大于一個取代基的烷基，當取代基的數(shù)目為2個以上(包含2個)時，各取代基可以相同，也可以不同。取代的c1-4烷基是指具有一個或多個(2個或2個以上)取代基的含有1～4個碳原子的飽和烴基；例如“氟代甲基”是指具有一個、兩個或三個氟取代基的甲基，“氟代乙基”是指具有1～5個氟取代基的乙基。
“環(huán)烷基”表示全部為碳的單環(huán)或稠合的環(huán)(“稠合”環(huán)意味著系統(tǒng)中的每個環(huán)與系統(tǒng)中的其它環(huán)共享毗鄰的一對碳原子)基團，其中一個或多個環(huán)不具有完全連接的π電子系統(tǒng)，環(huán)烷基的實例(不局限于)為環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烷、金剛烷、環(huán)己二烯、環(huán)庚烷和環(huán)庚三烯。環(huán)烷基可為取代的和未取代的。當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個各自選自以下的基團，包括：烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷巰基、芳巰基、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、c‐羧基、o‐羧基、o‐氨基甲?；?、n‐氨基甲酰基，c‐酰氨基、n‐酰氨基、硝基、氨基和‐nr10r11，其中r10和r11定義同上。
“雜芳基”表示5至12個環(huán)原子的單環(huán)或稠合環(huán)基團，含有一個、兩個、三個或四個選自n、o或s的環(huán)雜原子，其余環(huán)原子是c，另外具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。未取代的雜芳基地非限制性實例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、喹啉、異喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。雜芳基可以是取代的或未取代的。當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個，更為優(yōu)選為一個、兩個或三個，進而更為優(yōu)選一個或兩個，獨立地選自以下基團，包括：低級烷基、三鹵烷基、鹵素、羥基、低級烷氧基、巰基、(低級烷基)硫基、氰基、?；?、硫代?；?、o‐氨基甲酰基、n‐氨基甲?；?、o‐硫代氨基甲?；?、n‐硫代氨基甲?；‐酰氨基、n‐酰氨基、硝基、n‐磺酰氨基、s‐磺酰氨基、r10s(o)‐、r10s(o)2‐、‐c(o)or10、r10c(o)o‐和‐nr10r11，其中r10和r11定義同上。優(yōu)選的雜芳基可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、n‐酰氨基、單或二烷基胺基、羧基或n‐磺酰氨基。
“鹵代c1-4烷基”是指具有一個或多個(即2個或2個以上)鹵素取代基的含有1～4個碳原子的飽和烴基，其中各鹵素取代基可以相同，也可以不同?！胺鷆1-3烷氧基”是指具有一個或多個(即2個或2個以上)氟取代基的含有1～3個碳原子的飽和烴基。本發(fā)明中的鹵代c1-4烷基包括但不限于鹵代甲基、鹵代乙基、鹵代正丙基、鹵代異丙基、鹵代正丁基、鹵代異丁基、鹵代新丁基等，更具體的基團包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、四氟乙基、三氟乙基、二氟乙基、一氟乙基、三氯乙基、二氯乙基、一氯乙基等。
“鹵素”包括氟(f)、氯(cl)、溴(br)和碘(i)。
“烷氧基”是指“-o-烷基”基團，其碳原子數(shù)一般為1～10個。c1-4烷氧基是指該烷氧基中含有1～4個碳原子。本發(fā)明中的烷氧基優(yōu)選為c1-4烷氧基，進一步優(yōu)選c1-3烷氧基。取代烷氧基是指具有一個或大于一個取代基的烷氧基，當取代基的數(shù)目為2個以上(包含2個)時，各取代基可以相同，也可以不同。取代的c1-4烷氧基是指具有一個或多個(即2個或2個以上)取代基的含有1～4個碳原子的烷氧基。本發(fā)明中的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基和新丁氧基等。
“羥基”是指“-oh”基團。
“d”是指氫的同類位氘。
“氰基”是指-cn基團。
“羧基”是指-cooh基團。
“藥學(xué)上可接受的鹽”表示保留母體化合物的生物有效性和性質(zhì)的那些鹽。這類鹽包括：
(1)與酸成鹽，通過母體化合物的游離堿與無機酸或有機酸的反應(yīng)而得，無機酸例如(但不限于)鹽酸、氫溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亞硫酸和高氯酸等，有機酸例如(但不限于)乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(d)或(l)蘋果酸、富馬酸、馬來酸、羥基苯甲酸、γ-羥基丁酸、甲氧基苯甲酸、鄰苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等，優(yōu)選鹽酸或(l)蘋果酸。
(2)存在于母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子代替或者與有機堿配位化合所生成的鹽，金屬離子例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子，有機堿例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等。
本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其以本發(fā)明所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為活 性成分或主要活性成分，輔以藥學(xué)上可接受的輔料。
本發(fā)明所涉及的各化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可應(yīng)用于制備促尿酸排泄藥物方面，特別是應(yīng)用于制備治療或預(yù)防高尿酸血癥或痛風藥物方面。
具體實施方式
給出下列制備實施例和生物學(xué)實施例，使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更清楚地理解和實施本發(fā)明。它們不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍，僅僅是其例證和代表。
實施例1：2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(6)的合成
步驟a：將溴代異丁酸甲酯(7.0g，38.7mmol)和硫代乙酸鉀(4.83g，42.3mmol)的混合物在丙酮(36ml)中回流下攪拌2小時。冷卻后減壓蒸除溶劑，然后用二氯甲烷(70ml×3)提取，合并的二氯甲烷溶液依次用水(40ml)和飽和食鹽水(30ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，得2-乙酰巰基-2-甲基丙酸甲酯(1)(7.3g)，該化合物不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。
步驟b：將氫氧化鉀(8.98g，160mmol)溶解于甲醇(90ml)，然后在冰水浴下加入化合物1的粗品(7.3g)，所得混合物在0～10℃攪拌過夜。加入適量水，用2m鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3～4。用二氯甲烷(60ml×3)萃取，合并的有機相依次用水(50ml×3)和飽和食鹽水(30ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。常溫下減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，二氯甲烷:石油醚＝1:50洗脫)，得巰基異丁酸甲酯(2)(3.12g)。 步驟a和b兩步反應(yīng)總收率為60.0％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ3.74(s，3h)，1.60(s，6h)。ms(ei，m/z)：133.0[m-h]-。
步驟c：在冰水浴下，將溴(4.31g，27.0mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液滴加到2-氨基-6-(三氟甲基)吡啶(4.37g，27.0mmol)的二氯甲烷(70ml)溶液中，所得混合物在室溫下攪拌過夜。加入飽和碳酸氫鈉水溶液(40ml)，分層，收集有機層。水層用二氯甲烷(70ml)萃取，合并的有機層依次用和飽和硫代硫酸鈉水溶液(20ml)和飽和食鹽水(20ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:50～1:30洗脫)，得3-溴-6-(三氟甲基)吡啶-2-胺(3)(2.79g)。收率為42.9％。1hnmr(cdcl3，300mhz)δ7.79(d，j＝9.0hz，1h)，6.90(d，j＝9.0hz，1h)，5.22(s，2h)。
步驟d：將含有化合物3(2.77g，11.5mmol)、40％氯乙醛水溶液(6.77g，34.5mmol)、碳酸氫鈉(966mg，11.5mmol)和乙醇(25ml)的混合物在110℃下封管攪拌過夜。稍微冷卻后，再加入40％氯乙醛水溶液(6.77g，34.5mmol)和碳酸氫鈉(966mg，11.5mmol)，然后在110℃繼續(xù)攪拌過夜。冷卻后減壓蒸除大部分溶劑，加入適量水，用乙酸乙酯(40ml×4)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:50～1:30洗脫)，得8-溴-5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(4)(2.0g)。收率為65.6％。1hnmr(dmso-d6，500mhz)δ8.21(d，j＝1.0hz，1h)，7.91(s，1h)，7.81(d，j＝7.5hz，1h)，7.51(d，j＝7.5hz，1h)。ms(ei，m/z)：265.0[m+h]+。
步驟e：向三口燒瓶a中依次加入二氧六環(huán)(6ml)、化合物4(100mg，0.377mmol)、pd2(dba)3(17.3mg，0.0189mmol)和4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲氧基雜蒽(xantphos)(22mg，0.0380mmol)，所得混合物在氮氣下攪拌40分鐘。向另一個三口燒瓶b中加入二氧六環(huán)(4ml)、化合物2(100mg，0.745mmol)和二異丙基乙基胺(98mg，0.758mmol)，該混合液在氮氣下攪拌20分鐘，然后通過注射器將三口燒瓶a中混合物轉(zhuǎn)移到上述三口燒瓶b中。所得混合物在回流下攪拌過夜。冷卻到室溫，加入水(30ml)，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(20ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:50～1:25洗脫)，得2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸甲酯(5)(54mg)。收率為45.0％。ms(ei，m/z)：341.0[m+na]+。
步驟f：將含有化合物5(54mg，0.170mmol)、thf(1ml)、甲醇(2ml)、水(2ml)和氫氧化鈉(21mg，0.525mmol)的混合物在室溫下攪拌過夜。加入水(10ml)，用甲基叔丁基醚(mtbe)(10ml×2)洗滌，收集水相。水相用稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3～4，然后用乙酸乙酯(15ml×2)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，所得產(chǎn)物用石油醚/乙酸乙酯重結(jié)晶，得2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(6)(18mg)。收率為34.8％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ12.96(s，1h)，8.06(s，1h)，7.78(s，1h)，7.57(d，j＝7.5hz，1h)，7.29(d，j＝7.5hz，1h)，1.62(s，6h)。ms(ei，m/z)：305.1[m+h]+。
實施例2：2-[(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸(10)的合成
以2-氨基-5-氟吡啶為原料，制備化合物10的實驗操作依次參見實施例1中的步驟c、d、e和f。
化合物8：1hnmr(cdcl3，500mhz)δ8.10-8.09(m，1h)，7.43(s，1h)，7.69(s，1h)，7.45-7.43(m，1h)。
化合物10：1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ9.22(s，1h)，8.35(s，1h)，8.12(s，1h)，8.01(s，1h)，1.52(s，6h)。ms(ei，m/z)：255.0.0[m+h]+。
實施例3：2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸(14)的合成
步驟a：在冰水浴下，將溴(5.25g，32.9mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液滴加到6-氨基吡啶甲酸甲酯(5.0g，32.9mmol)的二氯甲烷(70ml)溶液中，所得混合物在室溫下攪拌過夜。加入飽和碳酸氫鈉水溶液(40ml)，分層，收集有機層。水層用二氯甲烷(70ml)萃取，合并的有機層依次用和飽和硫代硫酸鈉水溶液(20ml)和飽和食鹽水(20ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20～1:5洗脫)，得6-氨基-5-溴吡啶甲酸甲酯(11)(1.83g)。收率為24.1％。1hnmr(cdcl3，500mhz)δ7.78(d，j＝8.0hz，1h)，7.36(d，j＝8.0hz，1h)，3.96(s，3h)。
步驟b：將含有化合物11(1.83g，7.92mmol)、40％氯乙醛水溶液(4.76g，23.7mmol)、二氧六環(huán)(16ml)、碳酸氫鈉(670mg，7.98mmol)和水(4ml)的混合物在90℃封管攪拌過夜。稍微冷卻后，再加入40％氯乙醛水溶液(2.38g，12.1mmol)，然后在90℃封管繼續(xù)攪拌過夜。冷卻后減壓蒸除大部分溶劑，加入水(20ml)，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)ph值到7～8。用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20～1:15洗脫)，得8-溴咪唑并[1,2-a]吡啶-5-甲酸甲酯(12)(1.24g)。收率為61.4％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ8.85(s，1h)，7.84(s，1h)，7.77-7.68(m，2h)，3.97(s，3h)。
步驟c：將含有化合物12(100mg，0.392mmol)、水合硫化鈉(122mg，0.508mmol)和dmf(4ml)的混合物在70℃攪拌1小時，稍微冷卻后，加入溴代異丁酸甲酯(284mg，1.57mmol)和碳酸鉀(81mg，0.587mmol)，所得混合物在60℃攪拌過夜。加入水(20ml)，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(15ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油 醚＝1:20～1:10洗脫)，得8-[(1-甲氧基-2-甲基-1-丙酰-2-基)巰基]咪唑并[1,2-a]吡啶-5-甲酸甲酯(13)(34mg)。收率為28.1％。1hnmr(cdcl3，500mhz)δ8.84(s，1h)，7.78(s，1h)，7.73(d，j＝7.5hz，1h)，7.27(d，j＝7.5hz，1h)，4.01(s，3h)，3.71(s，3h)，1.69(s，6h)。
步驟d：將化合物13(32mg，0.104mmol)溶解在thf(1ml)和甲醇(2ml)中，加入2m氫氧化鈉溶液(3ml)，所得混合物在40℃攪拌1小時。在40℃減壓蒸除約一半溶劑，加入水(20ml)，用mtbe(10ml×2)洗滌，收集水相。水相用稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值至5～6，減壓蒸除溶劑，所得產(chǎn)物用二氯甲烷/甲醇＝5/1(15ml×4)提取，合并的溶液用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，得2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基巰基)-2-甲基丙酸(14)。1hnmr(dmso-d6，500mhz)δ9.08(s，1h)，7.52-7.50(m，1h)，7.39-7.38(m，2h)，7.27(d，j＝7.5hz，1h)，1.43(s，6h)。ms(ei，m/z)：235.1[m-h]-。
實施例4：2-[(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)巰基]-2-甲基丙酸(19)和2-[(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸(22)的合成
以2-氨基-6-氰基吡啶為原料，制備化合物19和22的實驗操作依次參見實施例1中的步驟c、d、e和f。
化合物17：1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ8.20(s，1h)，7.96(d，j＝5.7hz，1h)，7.85(d，j＝0.6hz，1h)，7.60(d，j＝5.7hz，1h)。
化合物19：1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.20(s，1h)，8.01-7.98(m，1h)，7.89(d，j＝1.5hz，1h)，7.41(d，j＝7.5hz，1h)，1.51(s，6h)。ms(ei，m/z)：260.1[m-h]-。
化合物20：1hnmr(dmso-d6，500mhz)δ8.32(d，j＝1.5hz，1h)，7.90(d，j＝1.5hz，1h)，7.79-7.76(m，2h)。
化合物22：ms(ei，m/z)：260.1[m-h]-。
實施例5：2-甲基-2-[(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基]丙酸(25)的合成
步驟a：將含有2-氨基-6-氟吡啶(500mg，4.46mmol)、溴丙酮(1.83g，13.4mmol)、乙醇(10ml)和碳酸氫鈉(375mg，4.46mmol)的混合物在90℃封管攪拌過夜。冷卻后減壓蒸除大部分溶劑，加入適量水，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至7～8。用乙酸乙酯(20ml×3)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20～1:3洗脫)，得5-氟-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶(23)(108mg)。收率為16.1％。
步驟b：將含有化合物23(108mg，0.719mmol)、三乙胺(182mg，1.80mmol)、化合物2(193mg，1.44mmol)和dmf(5ml)的混合物在70℃攪拌60小時。加入水(20ml)，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(10ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:8～1:1洗脫)，得2-甲基-2-[(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基]丙酸甲酯(24)(35mg)。收率為18.4％。
步驟c：化合物24按實施例3中實驗步驟d方法水解，并酸化后得2-甲基-2-[(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基]丙酸(25)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.34(s，1h)，7.98(d，j＝8.8hz，1h)，7.88-7.84(m，1h)，7.65(d，j＝7.2hz，1h)，2.51(s，3h)，1.52(s，6h)。ms(ei，m/z)：251.1[m+h]+。
實施例6：7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸(29)的合成
步驟a：將含有1-氨基碘化吡啶(6.17g，27.8mmol)、丙炔酸乙酯(3.0g，30.6mmol)、碳酸鉀(8.44g，61.2mmol)和dmf(40ml)的混合物在室溫下攪拌過夜。加入水(200ml)，用乙酸乙酯(60ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(30ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:30～1:10洗脫)，得吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯(26)(3.46g)。收率為65.4％。
步驟b：在-30～-40℃下將2.0m雙三甲基硅基胺基鈉thf溶液(16ml，32mmol)滴加到化合物26(3.4g，17.9mmol)的thf(15ml)溶解中，加完后繼續(xù)攪拌1小時。然后在該溫度下滴加碘(5.4g，21.3mmol)的thf(10ml)溶液，加完后繼續(xù)攪拌40分鐘。加入飽和食鹽水(40ml)，然后滴加飽和硫代硫酸鈉溶液至顏色褪去，用乙酸乙酯(40ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(25ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:15洗脫)，得7-碘吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯(27)(1.96g)。收率為34.6％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ8.53(s，1h)，8.11(dd，j＝1.2，8.7hz，1h)，7.75-7.72(m，1h)，7.33(dd，j＝1.2，8.7hz，1h)，4.31(q，j＝6.9hz，2h)，1.34(t，j＝6.9hz，3h)。
步驟c和d的實驗操作參見實施例1中的步驟e和f，得7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸(29)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.42(s，1h)，8.03(dd，j＝0.8，8.8hz，1h)，7.56-7.52(m，1h)，7.17(d，j＝6.4hz，1h)，1.58(s，6h)。ms(ei，m/z)：279.1[m-h]-。
實施例7：2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(33)的合成
步驟a：將含有化合物3(300mg，1.24mmol)、異丙醇(4ml)和n，n-二甲基甲酰胺二甲基縮醛(dmfdma)(195mg，1.64mmol)的混合物在氮氣下回流攪拌3小時。冷卻到50℃，然后加入鹽酸羥胺(114mg，1.64mmol)，所得混合物在該溫度下攪拌6小時。減壓蒸除溶劑，加入適量水，用乙酸乙酯(15ml×2)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20洗脫)，得n-[3-溴-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]-n’-羥基甲脒(30)(300mg)。收率為84.9％。
步驟b：將含有化合物30(290mg，1.02mmol)、thf(10ml)和多聚磷酸(700mg，2.07mmol)在100℃封管攪拌過夜，減壓蒸除大部分溶劑。加入適量水，用2m氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至8～9，然后用乙酸乙酯(15ml×2)萃取，無水硫酸鈉干燥。產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:10洗脫)，得8-溴-5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶(31)(190mg)。收率為55.8％。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.79(s，1h)，8.20(d，j＝8.0hz，1h)，7.76(d，j＝8.0hz，1h)。
步驟c和d的實驗操作參見實施例1中的步驟e和f，得2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(33)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ13.19(s，1h)，8.71(s，1h)，7.85(d，j＝7.6hz，1h)，7.69(d，j＝7.6hz，1h)，1.62(s，6h)。ms(ei，m/z)：304.0[m-h]-。
實施例8：2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸(37)的合成
化合物5-溴-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶(35)的制備方法參見實施例7中的步驟a和b。其中步驟a中的化合物3用2-氨基-6-溴吡啶替代。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.62(s，1h)，7.91(dd，j＝2.8，7.2hz，1h)，7.66-7.62(m，2h)。
化合物2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸(37)的制備方法參見實施例1中的步驟e和f，其中實施例1步驟e中的化合物4用化合物35替代。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.55(s，1h)，7.88-7.85(m，1h)，7.71-7.67(m，1h)，7.30-7.28(m，1h)，1.57(s，6h)。ms(ei，m/z)：236.1[m-h]-。
實施例9：1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸(40)的合成
實驗操作參見實施例1中的步驟a和b，將1-溴環(huán)丁烷甲酸乙酯與硫代乙酸鉀反應(yīng)，所得化合物利用氫氧化鉀醇解，得1-巰基環(huán)丁烷甲酸乙酯(38)。實驗操作參見實施例1中的步驟e和f，將化合物38與化合物4進行反應(yīng)，所得化合物進行水解并酸化，得1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸(40)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ13.19(s，1h)，8.06(s，1h)，7.77(s，1h)，7.57(d，j＝8.0hz，1h)，6.93(d，j＝8.0hz，1h)，2.94-2.91(m，2h)，2.37-2.21(m，4h)。ms(ei，m/z)：315.0[m-h]-。
實施例10：化合物生物學(xué)評價
體外hurat1轉(zhuǎn)運尿酸的抑制試驗可用于篩選具有降低血尿酸的潛在活性化合物。本發(fā)明預(yù)先構(gòu)建高表達hurat1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并通過檢測化合物阻斷穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株攝取放射性同位素標記的尿酸的能力，評估化合物對hurat1轉(zhuǎn)運尿酸的抑制活性。
高表達hurat1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建：
通過質(zhì)粒pcmv6-hurat1(購自origenetechnologies,inc)轉(zhuǎn)染hek293細胞株(人類胚胎腎細胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心)，并以濃度為500μg/ml的g418(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)進行抗性篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株。該細胞株的膜表面高表達hurat1轉(zhuǎn)運蛋白，可作為本發(fā)明體外篩選hurat1轉(zhuǎn)運尿酸抑制劑的模式細胞(toxicologicalsciences,2009,113(2):305-314.)。
體外hurat1轉(zhuǎn)運尿酸的抑制試驗：
1.細胞板的包被：按200μl/孔加入0.1mg/ml多聚賴氨酸溶液(poly-d-lysin)(購自sigma-aldrichco.llc),并置室溫下過夜。用無菌水清洗晾干，待用。
2.細胞的培養(yǎng)：將hurat1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞按2×105個/孔接入包被過的細胞板中，在37℃，5％co2孵箱中培養(yǎng)3天。
3.緩沖液hbss的配制：按125mm葡萄糖酸鈉、4.8mm葡萄糖酸鉀、1.3mm葡萄糖酸鈣、1.2mmkh2po4、1.2mmmgso4、5.6mm葡萄糖、25mmhepes(均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)配制hbss緩沖液，并調(diào)節(jié)ph至7.4，實驗之前置37℃中溫浴。
4.先用hbss輕輕洗滌細胞板中細胞，然后按160μl/孔加入hbss，并按20μl/孔加入終濃度為500nm受試化合物，做為試驗化合物孔；按180μl/孔加入hbss但不加試驗化合物，做為空白對照孔。放置室溫下10min。按20μl/孔加入終濃度為50μm的14c尿酸(購自americanradiolabeledchemicals,inc)，放置室溫下20min。
5.吸凈每孔溶液并用hbss洗滌細胞并吸凈。最后加入0.2mnaoh溶解細胞，收集細胞碎片并加入適量閃爍液置于perkinelmermicrobetatrilux1450液體閃爍分析儀上檢測同位素14c的放射強度(cpm值)。每個試驗組均設(shè)三個重復(fù)孔，試驗結(jié)果取平均值，并計算sd值。
在hurat1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中，化合物對hurat1轉(zhuǎn)運尿酸的抑制率計算公式如下：
結(jié)果顯示，受試化合物與陽性藥物lesinurad、苯溴馬隆相比較，在濃度為500nm下，化合物對hek293轉(zhuǎn)染細胞中hurat1轉(zhuǎn)運尿酸具有良好的抑制作用。
表1.受試化合物、lesinurad和苯溴馬隆對穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中hurat1轉(zhuǎn)運尿酸的抑制率