本發(fā)明涉及一種新型熒光探針的構(gòu)建及其制備方法和用途，屬于化學(xué)合成、化學(xué)分析和生物分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

G-四鏈體DNA是一種特殊的DNA結(jié)構(gòu)，是富含鳥嘌呤堿基的單鏈DNA序列在一定條件下由自身四個(gè)鳥嘌呤環(huán)通過Hoogsteen氫鍵自組裝成G-四分體，兩個(gè)或多個(gè)G-四分體通過π-π堆積作用進(jìn)而形成的一種高級DNA二級結(jié)構(gòu)。近年來生物信息學(xué)的研究表明，在人體內(nèi)大約有37萬組可能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的富含鳥嘌呤的基因序列，特別是在人體端粒末端和癌基因啟動(dòng)子區(qū)(如c-myc、ckit、bcl-2、Pu27、kRAS、VEGFR、TERT等)較為常見。G-四鏈體結(jié)構(gòu)對于維持染色體穩(wěn)定以及在相關(guān)基因的表達(dá)方面有著重要的作用，且與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)及現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)對G-四鏈體重要生理功能的揭示，為解決抗腫瘤藥物中靶向性問題提供了一個(gè)新的契機(jī)。尋求特異性靶向這種特殊G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)的分子，就有可能影響到腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)展，促使其調(diào)亡。

在自然界中存在著與特定結(jié)構(gòu)核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，但是目前這類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜不利于修飾改進(jìn)，而且與核酸結(jié)合機(jī)制十分復(fù)雜。因此，這類研究還存在諸多困難。有機(jī)小分子具有多種多樣的立體結(jié)構(gòu)，自身具有可修飾性及可控性，為發(fā)展G-四鏈體識別分子奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)G-四鏈體與雙螺旋DNA在結(jié)構(gòu)上的極大差異性為選擇性識別的小分子設(shè)計(jì)提供了可能。隨著分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，G-四鏈體DNA的結(jié)構(gòu)多樣性和生物功能性得到不斷闡明。以各種構(gòu)型的G-四鏈體為識別靶點(diǎn)的小分子研究引起了研究人員廣泛的興趣和重視(Expert Opinion On Therapeutic Patents,2013,23,11,1495-1509)。

目前，小分子識別G-四鏈體DNA主要是通過非共價(jià)鍵完成，在作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制的研究方面上存在一定技術(shù)困難，這就需要借助某種信號媒介才能被快速檢測。常用的儀器手段有圓二色譜，核磁共振，表面等離子共振等。這些方法對儀器要求較高，而且價(jià)格昂貴，難以普及。熒光分子能夠?qū)⑦@種結(jié)合信息轉(zhuǎn)換成易檢測的信號響應(yīng)，而且可在單分子水平上實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)檢測，同時(shí)還具有檢測限低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。因此，以熒光為輸出信號的識別分子受到了極大的關(guān)注，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等學(xué)科。另外，目前識別G-四鏈體DNA的小分子化合物還有待于進(jìn)一步解決的問題是如何提高小分子對G-四鏈體的選擇性。很多識別G-四鏈體的小分子與雙螺旋DNA都有一定的結(jié)合能力，因此小分子與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的作用選擇性有待提高。

近年來，三苯胺由于其較好的給電子能力和穩(wěn)定特性，使得三苯胺類結(jié)構(gòu)成為熒光探針分子設(shè)計(jì)的重要骨架之一，廣泛用于生物，醫(yī)藥，材料，染料等領(lǐng)域。申請人前期合成了一系列芳基乙烯類化合物，其對G-四鏈體具有較好的結(jié)合能力。申請人將三苯胺骨架結(jié)合到芳基乙烯結(jié)構(gòu)中，得到了一種具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移性質(zhì)的新型三苯胺類熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移特性的熒光探針及其合成方法和在G-四鏈體結(jié)構(gòu)檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種具有電荷轉(zhuǎn)移特性的熒光探針，所述探針結(jié)構(gòu)如下：

本發(fā)明同時(shí)提供了上述探針的制備和純化方法，反應(yīng)方程式表示如下：

上述一種具有電荷轉(zhuǎn)移特性的熒光探針的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：以正丁醇為溶劑，加入4-甲?；桨?、4-氯-1,2-二甲基喹啉碘鎓和N，N-二甲基乙二胺，110-120℃加熱反應(yīng)12-15小時(shí)；反應(yīng)后自然冷卻至室溫，減壓蒸餾除去溶劑，加入50mL二氯甲烷攪拌10分鐘，過濾得固體產(chǎn)物，再用20mL二氯甲烷洗滌固體兩次，得到具有電荷轉(zhuǎn)移特性的熒光探針。

其中所述的4-甲?；桨贰?-氯-1,2-二甲基喹啉碘鎓和N，N-二甲基乙二胺的摩爾比為1:1.2:1.3。

本發(fā)明還提供上述一種具有電荷轉(zhuǎn)移特性的熒光探針在溶液中的穩(wěn)定性以及在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用，按照下述步驟進(jìn)行：

1)將探針用二甲基亞砜溶解，再用pH 7.4的10mM Tris-HCl緩沖溶液(含60mM氯化鉀)稀釋得到溶液B；將待測DNA樣品用上述緩沖溶液溶解得到溶液A。

2)用紫外分光光度計(jì)測定探針溶液B在0-24小時(shí)內(nèi)的吸收曲線，以此來判定探針的穩(wěn)定性。如若在0-24小時(shí)內(nèi)吸收曲線沒有明顯的變化或出現(xiàn)新的吸收峰則判定探針在此條件下能穩(wěn)定存在。

3)將溶液B和溶液A混合，混合后對混合液進(jìn)行熒光光譜分析，若混合液熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，則可判斷該DNA結(jié)構(gòu)為G-四鏈體，若混合液熒光發(fā)射強(qiáng)度沒有明顯增強(qiáng)，則可以判定該DNA結(jié)構(gòu)為非G-四鏈體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)該探針制合成路線可操作性強(qiáng)，純化方法簡單，總體制備成本低廉，具有較大的市場競爭力。

(2)該探針結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于存儲。

(3)本發(fā)明提供的探針發(fā)射波長長，而且熒光背景低，使得該探針具有廣闊的應(yīng)用前景。

(4)本發(fā)明的探針可以通過熒光光譜特異性檢測和識別G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA，實(shí)現(xiàn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)與其他單、雙鏈DNA的區(qū)分。操作簡單，便捷。

(5)在研究抗癌先導(dǎo)化合物方面具有潛在的參考價(jià)值。

附圖說明

圖1為10μM的熒光探針在0-24小時(shí)內(nèi)的紫外吸收曲線。

圖2為1μM的熒光探針與反平行G-四鏈體Ckit3滴定的熒光光譜(ckit3濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4μM)。

圖3為1μM的熒光探針與平行G-四鏈體CM22滴定的熒光光譜(cm22濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44μM)。

圖4為1μM的熒光探針與反平行G-四鏈體HRAS滴定的熒光光譜(HRAS濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44、0.48μM)。

圖5為1μM的熒光探針與平行G-四鏈體c-myc滴定的熒光光譜(c-myc濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4μM)。

圖6為1μM的熒光探針與平行G-四鏈體22AG滴定的熒光光譜(22AG濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44、0.48μM)。

圖7為1μM的熒光探針與反平行G-四鏈體G3T3滴定的熒光光譜(G3T3濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44、0.48、0.52、0.56、0.6、0.64μM)。

圖8為1μM的熒光探針與混合構(gòu)型G-四鏈體htg-21滴定的熒光光譜(htg-21濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44、0.48、0.52μM)。

圖9為1μM的熒光探針與平行構(gòu)型G-四鏈體Ckit1滴定的熒光光譜(ckit1濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、044、0.48μM)。

圖10為1μM的熒光探針與雙鏈DNA ds26滴定的熒光光譜(ds26濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μM)。

圖11為1μM的熒光探針與雙鏈DNA polyd(A-T)₉滴定的熒光光譜(polyd(A-T)₉濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μM)。

圖12為1μM的熒光探針與雙鏈DNA polyd(G-C)₉滴定的熒光光譜(polyd(G-C)₉濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μM)。

圖13為1μM的熒光探針與雙鏈DNA ct-DNA滴定的熒光光譜(ct-DNA濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2μM)。

圖14為1μM的熒光探針與單鏈DNA ss26滴定的熒光光譜(ss26濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μM)。

圖15為熒光探針與13種DNA作用后的熒光增強(qiáng)倍數(shù)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例一：熒光探針的合成

將0.27g的4-甲酰基三苯胺溶于20mL的正丁醇中，加入0.38g的4-氯-1,2-二甲基喹啉碘鎓和0.11g的N,N-二甲基乙二胺，120℃反應(yīng)15h。反應(yīng)完自然冷卻至室溫，蒸出溶劑。加入50mL二氯甲烷攪拌10分鐘，過濾得固體產(chǎn)物，再用20mL二氯甲烷洗滌固體兩次，得到0.21g純品。產(chǎn)率為34.4％。核磁氫譜¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:9.45(s,1H),8.86(s,1H),8.49(d,J＝8.12Hz,1H),8.26(d,J＝8.84Hz,1H),8.07(t,J＝7.52Hz,1H),7.84-7.78(m,4H),7.56(d,J＝15.76Hz,1H),7.40-7.36(m,4H),7.17-7.10(m,6H),6.99(d,J＝8.12Hz,2H),4.16(s,3H),4.03(s,2H),3.46(s,2H),2.90(s,6H).核磁碳譜¹C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:155.45,154.19,149.84，146.91,142.77,139.96,134.56，130.54，130.43，128.90，126.85，125.74，124.92，121.56，119.57，118.32，118.08，97.98，55.08，43.47，38.79，38.41.高分辨質(zhì)譜HRMS(ESI)：理論值：(M-I)⁺(C₃₄H₃₅N₄⁺)499.2856，實(shí)驗(yàn)值：499.2859。

實(shí)施例二：熒光探針的穩(wěn)定性

1.將熒光探針用DMSO溶劑配制成5mM的儲存液，再用10mM的Tris-HCl的緩沖溶液(pH 7.4，含60mM KCl)稀釋成10μM濃度的探針溶液用于測試。

2.紫外吸收光譜的測定。用紫外分光光度計(jì)在時(shí)間為0，0.1，0.5，1，2，5，7，11，20，24小時(shí)測試上述探針溶液在360-600nm的吸收光譜，以此來判定該熒光探針的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖1所示，探針在0-24小時(shí)內(nèi)的紫外吸收并沒有發(fā)生明顯的變化，沒有新的吸收峰出現(xiàn)，表明在實(shí)驗(yàn)條件下，探針能夠穩(wěn)定存在于溶液中。

實(shí)施例三：DNA樣品的檢測

1.DNA樣品的制備。DNA樣品購于上海生工股份有限公司。將DNA樣品溶于適量的緩沖溶液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，60mM KCl)中，根據(jù)樣品溶液在260nm處的紫外吸收值和摩爾吸光系數(shù)計(jì)算其濃度。

其中，所用的DNA序列為：

Ckit3：GGCGAGGAGGGGCGTGGCCGGC

CM22：TGAGGGTGGGTAGGGTGGGTAA

HRAS：TCGGGTTGCGGGCGCAGGGCACGGGCG

c-myc：TTGAGGGTGGGTAGGGTGGGTAAA

22AG：AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

G3T3：GGGTTTGGGTTTGGGTTTGGG

htg-21：GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

Ckit1：AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG

ds26：CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG

polyd(A-T)₉：ATATATATATATATATAT

polyd(G-C)₉：GCGCGCGCGCGCGCGCGC

ct-DNA：小牛胸腺DNA

ss26：CCGCGAACGCCTAAGCTGCTAACCGC

2.探針溶液的制備。將熒光探針用DMSO溶劑配制成5mM的儲存液，再用10mM的Tris-HCl的緩沖溶液(pH 7.4，含60mM KCl)稀釋成1μM濃度的探針溶液用于測試。

3.熒光光譜檢測。固定熒光探針溶液的濃度為1μM，往探針溶液中分別滴加不同的DNA樣品，均勻后穩(wěn)定1分鐘，用熒光光譜測定體系的熒光發(fā)射，設(shè)定470nm為激發(fā)波長。如果體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)100倍以上，則可判定待測DNA樣品為G-四鏈體結(jié)構(gòu)，如果體系只有微弱的熒光增強(qiáng)，則可判定待測DNA樣品為非G-四鏈體結(jié)構(gòu)。如圖中2-10所示，htg-21，Ckit1，Ckit3，G3T3，CM22，22AG，c-myc，HRAS為G-四鏈體結(jié)構(gòu)，而ct-DNA，ss26，ds26，polyd(A-T)₉，polyd(G-C)₉為非G-四鏈體結(jié)構(gòu)。