本發(fā)明涉及油脂酶法脫膠
技術領域：
：，特別是涉及一種運用固定化復合磷脂酶對油脂進行酶法脫膠的工藝。
背景技術：
：：經(jīng)壓榨、浸出等方法從油料種子中提取的毛油含有蛋白質(zhì)、糖類、磷脂、色素、金屬離子、游離脂肪酸等雜質(zhì)，通常不能直接食用，需要經(jīng)過一系列油脂精煉工序?qū)⑦@些不利于油脂品質(zhì)的雜質(zhì)去除，才能得到符合國家要求的食用油。毛油中所含的磷脂、蛋白質(zhì)和粘液質(zhì)等統(tǒng)稱為膠質(zhì)，毛油中的膠質(zhì)以磷脂為主，故脫膠也稱為脫磷。要滿足物理精煉的要求，必須在脫膠過程中將油脂的磷含量控制在10mg/kg以內(nèi)，否則磷脂進入脫臭塔后在高溫下易結(jié)焦，附著在設備內(nèi)壁，并且產(chǎn)生黑色物，影響精煉油的色澤。傳統(tǒng)的脫膠方法主要包括水化脫膠和酸法脫膠：水化脫膠只能除去毛油中的水化磷脂（hp），脫膠后油中磷含量約為80~200mg/kg，難以滿足物理精煉的要求；酸法脫膠主要是利用酸化作用將毛油中的非水化磷脂（nhp）轉(zhuǎn)化為hp，再通過加入適量水將磷脂去除。根據(jù)毛油品種和品質(zhì)的差異，經(jīng)過酸法脫膠之后，油中磷含量約為15~80mg/kg，也難以滿足物理精煉的要求。近年來，酶法脫膠技術因其在提高油脂工業(yè)的經(jīng)濟、環(huán)保性能等方面具有巨大的應用價值而受到廣泛關注。磷脂酶是一類廣泛存在于動物、植物和微生物中，能夠特異性水解甘油磷脂的酶，根據(jù)磷脂酶與磷脂作用位點的不同，可將磷脂酶分為磷脂酶a1（pla1）、磷脂酶a2（pla2）、磷脂酶b（plb）、磷脂酶c（plc）和磷脂酶d（pld）。目前，在植物油脫膠過程中，主要使用的是pla1、pla2、plb和plc。pla1和pla2能特異性水解磷脂的sn-1或sn-2位酯鍵，生成相應的溶血磷脂；plb能將sn-1和sn-2位的酯鍵都水解，生成相應的甘油酰磷脂，溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很強的親水性，通過水合作用可以方便地除去。plc能特異性水解磷脂sn-3位上甘油磷酸酯鍵，生成相應的甘二酯（dag）和磷酯酸，而dag作為中性油在后續(xù)的精煉過程中不會被去除，因而能有效提高油脂精煉后的得率。研究表明，雖然單一的磷脂酶對毛油中磷脂具有很好的脫除效果，但反應用時較長，因而限制了其在油脂脫膠工業(yè)中的應用。為此，人們研究利用多種磷脂酶對毛油進行脫膠。例如，中國專利cn105038978公開了將pla和plc一起用于酶反應以去除油中存在的磷脂的方法，發(fā)現(xiàn)當兩種酶一起使用時，酶反應的動力學遠快于任何一種酶單獨使用時的情況，即使未對至少一種酶的反應條件進行優(yōu)化時，該反應仍比預期更為迅速，脫膠反應可在小于一小時的時間內(nèi)進行，且脫膠反應時間可快達約30分鐘。雖然pla和plc共同脫膠可大大提高脫膠速度，但pla和plc會殘留在油中，且無法重復利用。在酶法脫膠中，為能重復利用磷脂酶，中國專利cn105132147公開了一種用固定化plc對大豆油脫膠的方法，同時解決了plc的一次性使用和產(chǎn)物分離純化難等問題，但還是運用單一的磷脂酶，脫膠時間長；中國專利cn104560387公開了一種固定化pla1和固定化plc聯(lián)合應用對大豆毛油進行脫，使用6個批次后，固定化酶相對活力仍保持在80％左右，但該方法中pla1和plc不是同時固定在同一載體上，實際上還是固定化pla1和固定化plc先后單獨起脫膠作用，并沒有發(fā)揮pla1和plc的協(xié)同作用；中國專利cn102776066公開了一種用固定化pla2脫膠的方法，該固定化酶重復使用7次后活力可以保持54%以上，同樣的是運用單一的磷脂酶，脫膠時間長。因此，為提高毛油的酶法脫膠效率，減少酶在油中的殘留，如何重復運用復合酶脫膠，是本領域研究的一個新方向。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明主要解決的技術問題是提供一種固定化復合磷脂酶酶法脫膠工藝，先將用于脫膠的pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶同時固定在同一大孔樹脂上，然后將同時固定有pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶的大孔樹脂用于油脂脫膠，pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶發(fā)揮協(xié)同作用對油脂脫膠，不僅可以重復運用復合磷脂酶脫膠，而且油脂中沒有酶殘留，脫膠效率高，得油率高。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的一個技術方案是：提供一種固定化復合磷脂酶酶法脫膠工藝，包括以下步驟：a、制備固定化復合磷脂酶；b、將所述固定化復合磷脂酶用于油脂脫膠；所述復合磷脂酶由磷脂酶a1、磷脂酶c、脂肪酶和蛋白酶組成。進一步地，所述a步驟中，將磷脂酶a1、磷脂酶c、脂肪酶和蛋白酶固定化在同一大孔樹脂上。更進一步地，在步驟a中，將所述磷脂酶a1、磷脂酶c、脂肪酶和蛋白酶按質(zhì)量比為4~5:4~5:1:1稱取后固定化在同一大孔樹脂上。本發(fā)明將pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶同時固定在同一大孔樹脂上，實現(xiàn)重復運用固定化復合磷脂酶對油脂脫膠，脫膠效率高，得油率高，脫膠油中沒有酶殘留。其中，pla1能特異性水解磷脂的sn-1位酯鍵，生成相應的溶血磷脂；脂肪酶能將sn-1和sn-3位的酯鍵都水解，生成相應的甘油酰磷脂；溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很強的親水性，通過水合作用可以方便地除去；plc能特異性水解磷脂sn-3位上甘油磷酸酯鍵，生成相應的甘二酯（dag）和磷酯酸，而dag作為中性油在后續(xù)的精煉過程中不會被去除，因而能有效提高油脂精煉后的得率；蛋白酶可以分解油脂中的蛋白雜質(zhì)，尤其可以分解油脂中的磷脂-蛋白質(zhì)復合體中的蛋白質(zhì)，促進pla1、plc和脂肪酶分解磷脂，提高脫膠效果。本發(fā)明的固定化復合磷脂酶重復使用5次后活力可以保持70%以上。進一步地，所述大孔樹脂為d101、ab-8、d3520中的一種。進一步地，在所述b步驟之前，還包括對所述油脂進行預處理的步驟。更進一步上，所述預處理步驟為：在分離混合器中將油脂攪拌加熱至65~70℃，添加0.2g的質(zhì)量分數(shù)為50％的丙酸溶液后剪切1分鐘，再攪拌1小時；再將混合物冷卻至30~35℃后添加0.2毫升4mol/l氫氧化鈉溶液，剪切混合10秒。所述丙酸鈣為丙酸桿菌發(fā)酵制得，本發(fā)明的實施例中，丙酸鈣的制得參見中國專利cn103667373所公開的方法。進一步地，所述b步驟中，添加所述油脂重量的1%~2.5%的固定化復合磷酯酶對油脂脫膠。進一步地，所述b步驟中，在ph為5.0~7.0、溫度為32~36℃下所述固定化復合磷脂酶對油脂脫膠0.5~1小時。進一步地，在所述b步驟之后，還包括分離固定化復合磷脂酶、脫膠油和膠質(zhì)沉淀物的步驟。進一步，所述脂肪酶為sn-1，3專一性脂肪酶。sn-1，3專一性脂肪酶能特定地水解磷脂的sn-1或sn-3位酯鍵，生成相應的溶血磷脂，促進nhp轉(zhuǎn)化為hp。根據(jù)本發(fā)明進行處理的油包括但不限于：卡諾拉油、蓖麻油、椰子油、玉米油、棉子油、榛子油、大麻籽油、亞麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、橄欖油、棕櫚油、棕櫚仁油、棕櫚軟脂、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、山茶花油、大豆油和葵花籽油。本發(fā)明所處理的油既可以是粗制油，也可以是水脫膠油。本發(fā)明的有益效果是：針對現(xiàn)有技術缺乏重復運用復合酶脫膠的方法、脫膠后酶殘留于油脂中的情況，本發(fā)明的固定化復合磷脂酶酶法脫膠工藝，先將用于脫膠的pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶同時固定在大孔樹脂上，然后將同時固定有pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶的大孔樹脂用于油脂脫膠，pla1、plc、脂肪酶和蛋白酶發(fā)揮協(xié)同作用對油脂脫膠，不僅可以重復運用固定化復合磷脂酶脫膠，而且食用油中沒有酶殘留，脫膠效率高，得油率高。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述：實施例1用大孔樹脂d101制備固定化復合磷脂酶。一、大孔樹脂的預處理吸附用大孔樹脂d101的預處理方法為：（1）質(zhì)量分數(shù)為10%的nacl溶液浸泡4h，水洗抽濾；（2）體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡4h，水洗抽濾；（3）質(zhì)量分數(shù)為5%的hcl溶液浸泡4h，水洗抽濾，至中性；（4）質(zhì)量分數(shù)為2%的naoh溶液浸泡4h，水洗抽濾，至中性；（5）去離子水浸泡于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。二、原酶液的準備分別稱取pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶8g、8g、2g和2g，分別用ph9.0的100ml甘氨酸-氫氧化納緩沖溶液浸提1h，2000r/min離心30min除去雜質(zhì)，取上清液（即為原酶液）于4℃冰箱短時間保存待用。三、復合磷脂酶的固定化移取24ml原酶液（pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶的原酶液各6ml），加入6.0g預處理好的大孔樹脂d101，采用物理吸附法對pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶組成的復合磷脂酶進行固定化，加入20.0ml的質(zhì)量分數(shù)為0.1%的cacl2溶液，于30℃、ph6.5、200r/min水浴搖床中振蕩3h，真空抽濾除去酶液，再用ph9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液抽濾洗滌數(shù)次，冷凍干燥得固定化復合磷脂酶。干燥后測得固定化復合磷脂酶的蛋白吸附率為79%，干燥后測得的固定化復合磷脂酶的酶活分別是：pla1的酶活為6710u/g，plc的酶活為10165u/g，脂肪酶的酶活為55425u/g，蛋白酶的酶活25420u/g。實施例2用大孔樹脂ab-8制備固定化復合磷脂酶。一、大孔樹脂的預處理吸附用大孔樹脂ab-8的預處理方法為：（1）質(zhì)量分數(shù)為10%的nacl溶液浸泡4h，水洗抽濾；（2）體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡4h，水洗抽濾；（3）質(zhì)量分數(shù)為5%的hcl溶液浸泡4h，水洗抽濾，至中性；（4）質(zhì)量分數(shù)為2%的naoh溶液浸泡4h，水洗抽濾，至中性；（5）去離子水浸泡于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。二、原酶液的準備分別稱取pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶8g、8g、2g和2g，分別用ph9.0的100ml甘氨酸-氫氧化納緩沖溶液浸提1h，2000r/min離心30min除去雜質(zhì)，取上清液（即為原酶液）于4℃冰箱短時間保存待用。三、復合磷脂酶的固定化移取20ml原酶液（pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶的原酶液各5ml），加入6.0g預處理好的大孔樹脂ab-8，采用物理吸附法對pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶組成的復合磷脂酶進行固定化，加入16.0ml的質(zhì)量分數(shù)為0.1%的cacl2溶液，于30℃、ph7.0、200r/min水浴搖床中振蕩3h，真空抽濾除去酶液，再用ph9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液抽濾洗滌數(shù)次，冷凍干燥得固定化復合磷脂酶。干燥后測得固定化復合磷脂酶的蛋白吸附率為81%，固定化復合磷脂酶的酶活分別是：pla1的酶活為6520u/g，plc的酶活為9165u/g，脂肪酶的酶活為51240u/g，蛋白酶的酶活22310u/g。實施例3用大孔樹脂d3520制備固定化復合磷脂酶。一、大孔樹脂的預處理吸附用大孔樹脂d3520的預處理方法為：（1）質(zhì)量分數(shù)為10%的nacl溶液浸泡4h，水洗抽濾；（2）體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡4h，水洗抽濾；（3）質(zhì)量分數(shù)為5%的hcl溶液浸泡4h，水洗抽濾，至中性；（4）質(zhì)量分數(shù)為2%的naoh溶液浸泡4h，水洗抽濾，至中性；（5）去離子水浸泡于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。二、原酶液的準備分別稱取pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶10g、10g、2g和2g，分別用ph9.0的100ml甘氨酸-氫氧化納緩沖溶液浸提1h，2000r/min離心30min除去雜質(zhì)，取上清液（即為原酶液）于4℃冰箱短時間保存待用。三、復合磷脂酶的固定化移取30ml原酶液（pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶的原酶液各7.5ml），加入6.0g預處理好的大孔樹脂d3520，采用物理吸附法對pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶組成的復合磷脂酶進行固定化，加入25.0ml的質(zhì)量分數(shù)為0.1%的cacl2溶液，于30℃、ph7.0、200r/min水浴搖床中振蕩3h，真空抽濾除去酶液，再用ph9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液抽濾洗滌數(shù)次，冷凍干燥得固定化復合磷脂酶。干燥后測得固定化復合磷脂酶的蛋白吸附率為85%，固定化復合磷脂酶的酶活分別是：pla1的酶活為8520u/g，plc的酶活為12165u/g，脂肪酶的酶活為59440u/g，蛋白酶的酶活為28650u/g。實施例1~3中，大孔樹脂為d101、ab-8購自安徽三星樹脂科技有限公司，d3520購自南開大學化工廠；pla1、plc、l03脂肪酶和蛋白酶可以從市場上購買，例如從深圳市綠微康生物工程有限公司購買。固定化復合磷脂酶的蛋白吸附率的測定參考bradford法（考馬斯亮藍染色法）。pla1的磷脂酶活力的測定依據(jù)yang等人的方法（degummingofvegetableoilbyanewmicrobiallipase.foodtechnol.biotechnol.2006,44,101-104.微生物脂肪酶對植物油的脫膠.食品技術.生物技術.）；plc酶活的測定依據(jù)高林等報道的方法（高林.磷脂酶c高產(chǎn)菌株的篩選，鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[d]:[碩士學位論文].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學，2007.）；脂肪酶的酶活測定方法參照中國專利cn103525797中公開的脂肪酶活力測定方法；蛋白酶的酶活測定方法參照國家標準gb/t23527-2009。實施例4（1）在分離混合器中將200g的粗制大豆油在正常攪拌下加熱至65~70℃，添加0.2g的質(zhì)量分數(shù)為50％的丙酸溶液，將該混合物剪切1分鐘，然后在正常速度下攪拌1小時；（2）將混合物冷卻至30~35℃，然后添加0.2毫升4mol/l氫氧化鈉溶液，將混合物剪切混合10秒；（3）添加6.5g去離子水、實施例1制備的固定化復合磷脂酶2g，調(diào)節(jié)ph為5.0，將全部混合物剪切1分鐘，在約36℃的溫度下將油混合物以正常速度攪拌45分鐘；（4）將油混合物中的固定化復合磷脂酶去除后離心該油混合物，收集分離的油，獲得3.5ppm殘留磷的脫膠油。實施例5（1）在分離混合器中將200g的粗制大豆油在正常攪拌下加熱至65~70℃，添加0.2g的質(zhì)量分數(shù)為50％的丙酸溶液，將該混合物剪切1分鐘，然后在正常速度下攪拌1小時；（2）將混合物冷卻至30~35℃，然后添加0.2毫升4mol/l氫氧化鈉溶液，將混合物剪切混合10秒；（3）添加7.0g去離子水、實施例2制備的固定化復合磷脂酶3.5g，調(diào)節(jié)ph為6.0，將全部混合物剪切1分鐘，在約32℃的溫度下將油混合物以正常速度攪拌30分鐘；（4）將油混合物中的固定化復合磷脂酶去除后離心該油混合物，收集分離的油，獲得4.7ppm殘留磷的脫膠油。實施例6（1）在分離混合器中將200g的粗制大豆油在正常攪拌下加熱至65~70℃，添加0.2g的質(zhì)量分數(shù)為50％的丙酸溶液，將該混合物剪切1分鐘，然后在正常速度下攪拌1小時；（2）將混合物冷卻至40~45℃，然后添加0.2毫升4mol/l氫氧化鈉溶液，將混合物剪切混合10秒；（3）添加8.0g去離子水、實施例3制備的固定化復合磷脂酶5g，調(diào)節(jié)ph為7.0，將全部混合物剪切1分鐘，在約34℃的溫度下將油混合物以正常速度攪拌60分鐘；（4）將油混合物中的固定化復合磷脂酶去除后離心該油混合物，收集分離的油，獲得2.6ppm殘留磷的脫膠油。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解，根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。當前第1頁12當前第1頁12