本發(fā)明涉及一種人工優(yōu)化合成的mat^#基因(蛋氨酸砜n-乙?；D(zhuǎn)移酶基因)，含有該基因的重組載體，以及利用所述含有該基因的重組載體改變作物抗性的方法。

背景技術(shù)：

草銨膦(glufosinate)是德國赫斯特(hoechst)公司開發(fā)的一種高效、廣譜、低毒、低殘留的非選擇性除草劑，又稱為草丁膦(phosphinothricin,ppt)，iupac標(biāo)準(zhǔn)名稱：2-氨基-4[羥基(甲基)氧膦基]丁酸(2-amino-4-(hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoicacid)，易溶于水，不易溶于有機溶劑，對光穩(wěn)定，在ph5～9的水溶液中易水解。草銨膦可通過植物蒸騰作用在木質(zhì)部進行傳導(dǎo)，生效時間長于百草枯、短于草甘膦，高溫、高濕、高光強可以增進草銨膦吸收。在田間條件下，由于草銨膦迅速被土壤微生物降解，故根系不能吸收或吸收很少。

市售草銨膦是外消旋混合物，只有l(wèi)-型具有除草活性，靶標(biāo)酶是谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,gs)。谷氨酰胺合成酶存在于所有植物組織中，有2種同工酶：細(xì)胞質(zhì)中的gs1(主要存在非光合作用體系中)和葉綠體中的gs2(主要存在光合作用組織中)。谷氨酰胺合成酶在植物的氨同化及氮代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，它催化無機氮向有機氮的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，該酶同時也是植物中唯一的解毒酶，能夠解除由硝酸鹽還原、氨基酸降解及光呼吸中釋放出的銨的毒性。草銨膦能夠特異性地抑制植物的谷氨酰胺合成酶的活性，導(dǎo)致植物體內(nèi)氮代謝紊亂，過量積累銨，進而使葉綠體解體，光合作用受到抑制，最終導(dǎo)致植物死亡。自轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化以來，抗草銨膦作物面積增長迅速，帶動了草銨膦銷售額的增長。預(yù)計到2015年，草銨膦的銷量將突破10億美元，在除草劑中僅次于草甘膦(楊益軍，2013)。

截止2015年，已經(jīng)有6個抗草銨膦基因被發(fā)現(xiàn)，其中發(fā)現(xiàn)較早的bar和pat基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化作物并應(yīng)用于商業(yè)化種植。datta等(1992)用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將bar基因轉(zhuǎn)入水稻ir72中，獲得了對高劑量除草劑草銨膦抗性的水稻植株。christou等(1991)將bar基因?qū)氲蕉喾N水稻品種中，田間試驗實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對除草劑草丁膦具有明顯的抗性。國內(nèi)相繼開展了抗除草劑水稻的研究(朱冰等，1996；劉自剛等，2006)，培育出抗除草劑的雜交稻恢復(fù)系752r(張祥喜等，2000)、測64r、明恢63r、特青r(黎垣慶等，2000)、密陽46r(薛石玉等，2001)、9311r(王才林等，2002)和bar68-1(肖國櫻等，2006；xiaoetal,2007)等。

蛋氨酸砜n-乙?；D(zhuǎn)移酶(methioninesulfonen-acetyltransferase,mat)基因mat于2009年發(fā)現(xiàn)，長度為534bp，與其它抗草銨膦基因的同源性為31.55％～58.64％，是一類新的抗草銨膦基因。mat基因表達(dá)產(chǎn)物長度為177aa，功能和其他抗草銨膦蛋白類似，具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶的活性。通過酶動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，mat的最適ph為8.0～8.5，而bar基因表達(dá)的n-乙?；D(zhuǎn)移酶的最適ph約為6.5(yunetal,2009)。

未經(jīng)密碼子優(yōu)化的mat基因轉(zhuǎn)化的水稻對草銨膦的抗性不強，如在含有不同濃度ppt(0，500，750和1000mg/l)的ms培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)野生型mat基因離體葉片在500mg/l的ms培養(yǎng)基上表現(xiàn)出發(fā)黃，與不含mat基因?qū)φ障啾瓤剐圆伙@著(yunetal,2009)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提高水稻對草銨膦的抗性，提供一種人工優(yōu)化合成的mat^#基因(蛋氨酸砜n-乙?；D(zhuǎn)移酶基因)，含有該基因的重組載體，以及利用含有該基因的載體改變作物抗性的方法。

本發(fā)明提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，其中，該mat^#基因的序列含有seqidno.1所示的序列，且該mat^#基因能編碼具有n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。

本發(fā)明還提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，其中，該mat^#基因的序列含有信號肽的編碼序列和seqidno.1所示的序列，且該mat^#基因能編碼n端帶有信號肽且具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。

本發(fā)明還提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，其中，該mat^#基因的序列含有提高mat^#基因翻譯效率的序列、信號肽的編碼序列和seqidno.1所示的序列，且該mat^#基因能編碼n端帶有信號肽且具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。

本發(fā)明還提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，其中，該mat^#基因的序列為如上所述的mat^#基因的5’端和3’分別連接上相同或不同的內(nèi)切酶識別序列后得到。

本發(fā)明還提供了一種mat^#基因表達(dá)框，其中，該mat^#基因表達(dá)框含有如上所述的mat^#基因、在該mat^#基因的5’端上連接有能夠被rna聚合酶特異識別和高效結(jié)合的啟動子和在該mat^#基因的3’端上連接有能夠給予rna聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的終止子。

本發(fā)明還提供了一種mat^#基因重組載體，其中，該mat^#基因重組載體由如上所述的mat^#基因表達(dá)框插入表達(dá)載體后得到。

此外，本發(fā)明還提供一種改變作物抗性的方法，其中，該方法包括將上述的重組載體轉(zhuǎn)化所述作物，使得到的轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)mat^#基因、并具有除草劑抗性。

通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠使得轉(zhuǎn)基因水稻至少耐受1000mg/l濃度的草銨膦，因此有效地提高了轉(zhuǎn)基因水稻對草銨膦的抗性。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是植物表達(dá)載體pc3300-mat^#的構(gòu)建流程圖。

圖2是質(zhì)粒pc3300-mat^#的酶切鑒定圖。圖中：m1為dl2000分子量標(biāo)記；1～2泳道為pmd19-t-mat^#酶切產(chǎn)物(xhoⅰ)；3～4泳道為pc3300-mat^#酶切產(chǎn)物(xhoⅰ)；5泳道為pc3300-mat^#質(zhì)粒；m2為dl15000分子量標(biāo)記。

圖3a是轉(zhuǎn)基因植株中mat^#基因的pcr檢測電泳圖，圖3b是轉(zhuǎn)基因植株中mat^#基因的southern雜交圖。圖中：圖3a中m為dl2000分子量標(biāo)記；b泳道為空白對照；ck泳道為陰性對照，p泳道為陽性對照；9k-mat泳道為t1代再生植株；1～4泳道為t2代植株；圖3b中m泳道為dl15000分子量標(biāo)記。

圖4是t2代轉(zhuǎn)基因植株9k-mat噴灑草銨膦的實驗結(jié)果。

圖5是t2代轉(zhuǎn)基因植株9k-mat種子在含草銨膦培養(yǎng)基上萌發(fā)的實驗結(jié)果。圖中：ck為水稻品系9k；9ka2為以9k品系為受體轉(zhuǎn)入bar基因獲得的轉(zhuǎn)基因水稻；9k-mat為mat^#基因?qū)攵i稻9k獲得的轉(zhuǎn)基因水稻；0mg/l～600mg/l表示培養(yǎng)基中草銨膦的濃度。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，其中，該mat^#基因具有seqidno.1所示的序列，且該mat^#基因能編碼具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。

所述mat^#基因按照水稻偏愛密碼子的分布原則，置換原mat基因序列(ncbi登錄號：ab378291)中的部分稀有密碼子，同時消除mat基因中影響該基因在水稻細(xì)胞高效表達(dá)的堿基序列，優(yōu)化后獲得本發(fā)明的mat^#基因序列如seqidno.1所示。

分析發(fā)現(xiàn)，原始mat基因中存在1處潛在的內(nèi)含子切割識別序列，利用同義密碼子替換法，消除內(nèi)含子切割識別序列；原始mat基因gc含量達(dá)到65.36％，造成包含多個mrna發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，起始自由能達(dá)到-232.70kcal/mol；在不改變優(yōu)化基因的氨基酸序列的前提下，利用同義密碼子替換法來消除形成的穩(wěn)定發(fā)夾環(huán)等mrna二級結(jié)構(gòu)。分析優(yōu)化后的mat^#基因，密碼子的相對使用度(rscu值)如表1中第3列所示，與水稻和原始mat基因序列相比，優(yōu)化后的mat基因序列的密碼子使用頻率與模式植物水稻的表達(dá)蛋白密碼子使用頻率基本一致；與原始mat基因相比，mat^#基因mrna二級結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，起始自由能降到-198.30kcal/mol；同時為了防止dna序列甲基化的可能，降低了密碼子gcg、acg、ccg和tcg的使用頻率。

獲得的優(yōu)化mat^#基因序列長度為534bp，與原始mat基因的dna序列相比，氨基酸組成和順序不變，改變堿基75個，占堿基總數(shù)的14％，更改密碼子78個，占整個密碼子總數(shù)的43.82％，g+c含量從原來的65.36％降為60.11％。

根據(jù)本發(fā)明，在具有seqidno.1所示的序列的前提下，只要該基因能編碼具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，可以在mat^#基因的兩端添加任意類型和數(shù)目的其他dna，這些基因也應(yīng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

例如，可在mat^#基因上連接適當(dāng)?shù)男盘栯木幋a序列，以實現(xiàn)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運、定位、分泌、儲存等。定位信號肽能夠使mat蛋白產(chǎn)生后定向運輸?shù)郊?xì)胞的特定部位，如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡等，這些特定區(qū)域能夠為mat蛋白提供一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，有效防止mat蛋白的降解，可明顯提高mat蛋白的穩(wěn)定性和積累量，從而提高植物由mat蛋白所賦予的抗性。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一種實施方式，本發(fā)明還提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，該mat^#基因的序列含有信號肽的編碼序列和seqidno.1所示的序列，且該mat^#基因能編碼n端帶有信號肽且具有n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。

優(yōu)選地，所述信號肽編碼序列為葉綠體轉(zhuǎn)運肽tp的編碼序列。

更優(yōu)選地，所述信號肽編碼序列如seqidno.2所示。

更進一步優(yōu)選地，具有信號肽的編碼序列的mat^#基因的序列為seqidno.3所示，該多肽的氨基酸序列為seqidno.4所示的序列。

具體地，所述mat^#基因的5’端有葉綠體轉(zhuǎn)運肽tp的編碼序列(如seqidno.2所示)，且該mat^#基因能編碼n端帶有葉綠體轉(zhuǎn)運肽tp、具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。其中，tp轉(zhuǎn)運肽能夠使mat蛋白靶向性的運輸?shù)郊?xì)胞的葉綠體內(nèi)。本發(fā)明對于seqidno.2所示的序列與seqidno.1所示的序列的連接方式?jīng)]有特別的限定，只要二者位于同一讀碼框，能夠表達(dá)n端帶有tp轉(zhuǎn)運肽的、具有n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽即可。通過以上步驟確定如seqidno.3所示的序列，該優(yōu)化基因能夠編碼n端帶有tp轉(zhuǎn)運肽的、具有n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。在tp轉(zhuǎn)運肽的引導(dǎo)下，mat蛋白靶向性的運輸?shù)郊?xì)胞的葉綠體內(nèi)。葉綠體內(nèi)是n-乙?；D(zhuǎn)移酶作用的場所，可明顯提高mat蛋白的穩(wěn)定性和積累量，從而提高植物相對應(yīng)的抗性水平。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的是，seqidno.3所示的dna序列僅是本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明所述能夠編碼n端帶有tp信號肽的、具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽的序列并不限于seqidno.3所示的dna序列，其中，seqidno.3所示的dna序列表達(dá)出蛋白質(zhì)的氨基酸序列為seqidno.4所示的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一種實施方式，本發(fā)明還提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，該mat^#基因的序列含有提高mat^#基因翻譯效率的序列、信號肽的編碼序列和seqidno.1所示的序列，且該mat^#基因能編碼n端帶有信號肽且具有n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。

優(yōu)選地，提高mat^#基因翻譯效率的序列為kozak序列，所述kozak序列如seqidno.5所示。

更優(yōu)選地，具有提高mat^#基因翻譯效率的序列的mat^#基因的序列如seqidno.6所示。

更詳細(xì)地，為了提高mat^#基因的翻譯效率，所述mat^#基因的5’端優(yōu)選還有seqidno.5所示的dna序列，seqidno.5所示的dna序列屬于kozak序列，其中，kozak序列用來增強真核基因的翻譯效率，避免核糖體出現(xiàn)掃描漏洞(leakyscan)的序列。在本發(fā)明中，seqidno.5所示的序列位于seqidno.3所示的序列的5’端，通過以上方法確定如seqidno.6所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一種實施方式，本發(fā)明還提供了一種mat^#基因，其為密碼子優(yōu)化的mat基因，該mat^#基因的序列為如上所述的mat^#基因的5’端和3’分別連接上相同或不同的內(nèi)切酶識別序列后得到。

優(yōu)選地，所述內(nèi)切酶識別序列為xhoⅰ限制性內(nèi)切酶識別序列，所述xhoⅰ限制性內(nèi)切酶識別序列如seqidno.7所示。

更優(yōu)選地，具有內(nèi)切酶識別序列的mat^#基因序列如seqidno.8所示。

詳細(xì)地，為了載體構(gòu)建的需要，在上述序列的5’與3’端還分別添加了限制性內(nèi)切酶識別位點。在本發(fā)明中，優(yōu)選地在seqidno.6所示的序列5’與3’端分別添加seqidno.7所示的序列(xhoi限制性內(nèi)切酶識別序列ctcgag)，最終確定如seqidno.8所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一種實施方式，本發(fā)明還提供了一種mat^#基因表達(dá)框，該mat^#基因表達(dá)框含有如上所述的mat^#基因、在該mat^#基因的5’端上連接有能夠被rna聚合酶特異識別和高效結(jié)合的啟動子和在該mat^#基因的3’端上連接有能夠給予rna聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的終止子。

優(yōu)選地，所述啟動子為35s啟動子，所述35s啟動子的序列如seqidno.9所示，所述終止子為35spolya終止子，所述35spolya終止子的序列如seqidno.10所示。

更優(yōu)選地，所述mat^#基因表達(dá)框序列如seqidno.11所示。

詳細(xì)地，要想把目標(biāo)基因(即mat^#基因)轉(zhuǎn)入生物中穩(wěn)定表達(dá)，需要有完整的基因表達(dá)框，即目標(biāo)基因上游(5’端)有啟動子序列、下游(3’端)有終止子序列。啟動子序列和終止子序列在目標(biāo)基因表達(dá)時起到控制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的起始部位、轉(zhuǎn)錄強度和轉(zhuǎn)錄終止部位的作用，它并不影響目標(biāo)基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)，對于目標(biāo)基因賦予的除草劑抗性特征沒有任何影響。因此，本發(fā)明中，可以選擇任何能夠適用于基因表達(dá)的啟動子、終止子序列與目標(biāo)基因形成不同組合的基因表達(dá)框。根據(jù)一般生物學(xué)原理，真核和原核生物啟動子-終止子組合都能實現(xiàn)本發(fā)明的mat^#基因的轉(zhuǎn)錄；只是本發(fā)明的mat^#基因按照模式植物水稻的密碼子優(yōu)化，在真核高等植物中蛋白質(zhì)翻譯效率高。

不同啟動子和終止子對于起始和終止目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的能力有差異、作用時空有不同。選擇合適的啟動子和增強啟動子的活性可增強外源基因的轉(zhuǎn)錄。目前在植物表達(dá)載體中應(yīng)用的啟動子有組成表達(dá)型啟動子(例如：camv35s啟動子、ubiquitin啟動子、actin啟動子，等)、誘導(dǎo)表達(dá)型啟動子(例如：創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子、光誘導(dǎo)啟動子rbcs、四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)啟動子，等)、組織特異表達(dá)型啟動子(例如：花藥絨氈層特異表達(dá)啟動子ta29、胚乳特異表達(dá)啟動子、維管束特異表達(dá)啟動子，等)等。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述mat^#基因的5’端還有seqidno.9所示的序列作為mat^#基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。其中，seqidno.9所示的序列為來源于花椰菜花葉病毒35s蛋白的啟動子序列(camv35s)，作為啟動mat^#基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述mat^#基因的3’端還有seqidno.10所示的序列作為mat^#基因轉(zhuǎn)錄的終止子。其中，seqidno.10所示的序列為來源于花椰菜花葉病毒的35s蛋白的polya終止子序列(35spolya)，作為終止mat^#基因轉(zhuǎn)錄的終止子。最終，形成了如seqidno.11所示的序列，且作為mat^#基因表達(dá)的完整表達(dá)框。

另一方面，本發(fā)明還提供一種重組載體，該mat^#基因重組載體由如上所述的mat^#基因表達(dá)框插入表達(dá)載體后得到。

本發(fā)明中，所述重組載體由上述mat^#基因表達(dá)框和載體骨架組成；原核表達(dá)載體骨架插入原核啟動子和終止子組合成的mat^#基因表達(dá)框能實現(xiàn)上述mat^#基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)，真核表達(dá)載體插入真核啟動子和終止子組合成的mat^#基因表達(dá)框能實現(xiàn)上述mat^#基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。如，所述載體可以為t載體(pmd18-t、pmd19-t等)、原核表達(dá)載體(pet32a等)或真核表達(dá)載體(pcambia3300、pcambia3301等)。其中，t載體和原核表達(dá)載體的主要作用是初步驗證目標(biāo)基因和目標(biāo)蛋白的功能，而真核表達(dá)載體的作用是為了后續(xù)將其轉(zhuǎn)化進作物中。因此，能夠滿足上述應(yīng)用的各種t載體、原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體均可用于本發(fā)明。

優(yōu)選地，mat^#基因重組載體為真核植物表達(dá)載體pc3300-mat^#，它以植物表達(dá)載體pcambia3300為載體骨架，插入序列如seqidno.11所示的mat^#基因表達(dá)框構(gòu)建而成。

再一方面，本發(fā)明還提供一種改變作物抗性的方法，該方法包括將如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化所述作物，使得到的轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)mat^#基因、并具有除草劑抗性。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“作物”為本領(lǐng)域公知的概念，指大面積栽種或大面積收獲，供盈利或口糧用的植物。本發(fā)明的基因不僅可用于轉(zhuǎn)入水稻，也可以用于轉(zhuǎn)入玉米、高粱、小麥、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜、樹木、花草等。優(yōu)選地，所述作物為模式作物水稻，所述水稻包括各種水稻，如各亞種(秈稻、粳稻、爪哇稻)、各生態(tài)型(早稻、中稻、晚稻)水稻等。優(yōu)選地，本發(fā)明中優(yōu)選秈稻品系9k作為轉(zhuǎn)化的受體作物。

實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的方法有本領(lǐng)域公知的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法，等。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法可以為傳統(tǒng)的常規(guī)法，如(yukohhieietal.transformationofricemediatedbyagrobacteriumtumefaciens.plantmolecularbiology,1997,35:205-218)中報道的方法，也可采用(seiichitoki,etal.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.theplantjournal,2006,47:969-976)中報道的快速轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明采用改進的農(nóng)桿菌介導(dǎo)快速轉(zhuǎn)化法，具體地，seiichitoki等人進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化時，愈傷組織誘導(dǎo)后不進行繼代而直接浸染，而本發(fā)明根據(jù)所用的愈傷組織的狀態(tài)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼代后第3天達(dá)到最佳狀態(tài)時再進行浸染，且在共培養(yǎng)和預(yù)分化階段均將固體培養(yǎng)基中的瓊脂粉含量提高至12g/l，這樣改進能夠得到更高的轉(zhuǎn)化效率。

術(shù)語“除草劑抗性”是指作物具有一定耐受除草劑的能力。本發(fā)明中，所述除草劑抗性為對除草劑草銨膦的抗性；優(yōu)選地，所述除草劑抗性為耐受至少1000mg/l濃度的草銨膦。

下面，通過以下實施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的說明。

其中，dna序列seqidno.8委托大連寶生物公司合成；各種pcr引物的合成和基因測序工作委托華大基因公司進行；各種酶均購自大連寶生物公司；pcambia3300載體由澳大利亞農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心(cambia，http://www.cambia.org)提供，本發(fā)明人擴增、保存；質(zhì)粒的提取、純化和酶切以及其他常規(guī)分子生物學(xué)操作方法參考《分子克隆》(科學(xué)出版社，第3版)進行。

本發(fā)明實施例中，所用作物為秈稻品系9k，由中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所選育，已在文獻(xiàn)(曾崇華.hd9802s/kasalath選系中高培養(yǎng)力和抗稻瘟病株系的篩選[d].北京:中國科學(xué)院大學(xué),2015)中公開。農(nóng)桿菌菌株eha105購自上海北諾生物科技有限公司，本發(fā)明人繁殖、保存。本發(fā)明中采用文獻(xiàn)(seiichitokietal.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.theplantjournal,2006,47:969-976)所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，但有改良：誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼代1次，繼代后第3d進行浸染；且在共培養(yǎng)和預(yù)分化階段均將固體培養(yǎng)基中的瓊脂粉含量提高至12g/l。

實施例1

本實施例用于說明人工優(yōu)化的mat^#基因的制備方法

首先，查找原始mat基因的dna序列(ncbi登錄號：ab378291)，分析原始mat基因序列的密碼子的相對使用度(rscu值)和水稻蛋白編碼序列的密碼子的相對使用度(rscu值)。其次，分析原始序列中存在的內(nèi)含子切割識別序列、polya加尾識別序列及mrna發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)分析，在保持mat蛋白的氨基酸組成、順序不變的前提下，用水稻偏愛密碼子置換原始mat基因序列中相應(yīng)的密碼子，同時消除影響外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的元件，最終獲得優(yōu)化后的mat基因(序列如seqidno.1所示)，命名為mat^#基因。

分析發(fā)現(xiàn)，原始mat基因中不存在造成植物轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的at富集區(qū)及attta重復(fù)序列、polya加尾識別信號序列，但存在1處潛在的內(nèi)含子切割識別序列，利用同義密碼子替換法，消除了內(nèi)含子切割識別序列；在不改變優(yōu)化基因的氨基酸序列的前提下，利用同義密碼子替換法來消除形成的穩(wěn)定發(fā)夾環(huán)等mrna二級結(jié)構(gòu)，使優(yōu)化基因起始自由能降到-198.30kcal/mol。分析優(yōu)化后的mat^#基因，密碼子的相對使用度(rscu值)如表1中第3列所示，與水稻和原始mat基因序列相比，優(yōu)化后的mat^#基因序列的密碼子使用頻率與水稻表達(dá)蛋白密碼子使用頻率基本一致；同時為了防止dna序列甲基化的可能，降低了密碼子gcg、acg、ccg和tcg的使用頻率。

獲得的優(yōu)化mat^#基因序列長度為534bp，與原始mat基因的dna序列相比，氨基酸組成和順序不變，改變堿基75個，占堿基總數(shù)的14％，更改密碼子78個，占基因密碼子總數(shù)的43.82％，g+c含量從原來的65.36％降為60.11％。

表1

注：括號內(nèi)數(shù)據(jù)為在統(tǒng)計的樣本中每個密碼子使用的次數(shù)。rscu(ij)＝x(ij)/〔x(i)/n〕，其中，rscu(ij)是指第i個氨基酸第j個同義密碼子的密碼子使用相對概率，x(ij)是指第i個氨基酸第j個同義密碼子在一個基因中的出現(xiàn)次數(shù)，x(i)是指第i個氨基酸在這個基因中的出現(xiàn)次數(shù)，這個數(shù)字是該氨基酸對應(yīng)所有同義密碼子的出現(xiàn)次數(shù)之和；n是指該氨基酸對應(yīng)的同義密碼子種數(shù)。

表1示出了人工優(yōu)化合成的mat^#基因、原始的mat基因與水稻蛋白編碼基因在同義密碼子的相對使用度(rscu值)上的比較。

為了使表達(dá)的目標(biāo)蛋白有效地積累和行使功能，在優(yōu)化好的mat^#基因序列的5’端添加seqidno.2所示的序列，該序列可以把目標(biāo)蛋白靶向葉綠體。為了提高mat蛋白的表達(dá)效率，可以對起始密碼子周邊序列進行優(yōu)化，優(yōu)選地在mat^#融合基因的5’端添加了seqidno.5所示的dna序列，其中seqidno.5所示的dna序列屬于kozak序列。根據(jù)進一步實驗的需要，在上述序列的5’與3’端分別添加xhoi內(nèi)切酶識別序列ctcgag，通過以上步驟最終確定如seqidno.8所示的序列。送至大連寶生物公司合成如seqidno.8所示的序列，并將其連接在pmd19-t載體上，構(gòu)建成含有mat^#基因的重組載體pmd19-t-mat^#。

實施例2

本實施例用于說明植物表達(dá)載體pc3300-mat^#的構(gòu)建方法。

將質(zhì)粒載體pcambia3300和pmd19-t-mat^#均用限制性內(nèi)切酶xhoⅰ單酶切，分別回收其大片段和小片段。使用t4dna連接酶連接這2個回收片段，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，擴增后提取質(zhì)粒，pcr和酶切檢測結(jié)果說明重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功(圖2)。通過測序選出連接方向正確的重組質(zhì)粒，得到的新質(zhì)粒載體命名為pc3300-mat^#。

實施例3

本實施例用于說明mat^#基因轉(zhuǎn)化模式植物水稻的方法。

1)水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)

選用秈稻品系9k作為轉(zhuǎn)化受體，取其成熟種子，剝?nèi)シf殼；糙米中加入5％的次氯酸鈉溶液消毒40min，傾去上清液，用無菌雙蒸水清洗3-5次；將糙米接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，32℃黑暗下培養(yǎng)5-7d；挑選從種子盾片部位誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，繼代3d后用于農(nóng)桿菌浸染。

2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織

(a)pc3300-mat^#質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法參考《植物基因工程》(科學(xué)出版社，第2版)進行。

(b)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織。(1)取步驟(a)得到農(nóng)桿菌單菌落，均勻涂抹于含50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)1-2d至菌落長出；(2)加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基懸浮菌體成一定濃度的菌液，測od值在0.2左右；(3)將待浸染的愈傷組織置于濾紙上于無菌風(fēng)下吹干后置于滅菌的三角瓶中，加入稀釋好的農(nóng)桿菌菌液浸染20min，浸染過程中不斷的搖動三角瓶；(4)取出愈傷組織置于滅菌的濾紙上吸干多余菌液后再置于瓊脂粉含量為10g/l的固體共培養(yǎng)基上于24℃暗培養(yǎng)3d；(5)取出共培養(yǎng)的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到含有6mg/l草銨膦、400mg/l羧芐霉素和500mg/l頭孢霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周；(6)之后將篩選后的成活愈傷組織轉(zhuǎn)移到瓊脂粉含量為12g/l的預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周；(7)將預(yù)分化后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，每天12h、1000-1500lux光照下進行分化；(8)7d后愈傷組織出現(xiàn)綠點，14d左右愈傷組織上長出再生小苗，3-4周后將再生小苗轉(zhuǎn)至1/2ms培養(yǎng)基上壯苗培養(yǎng)，待小苗長到10cm左右時移栽入土。移栽成活的轉(zhuǎn)基因再生植株命名為9k-mat。

3)轉(zhuǎn)基因植株的檢測

(a)轉(zhuǎn)基因植株9k-mat的pcr檢測

首先，采用ctab法提取植株總dna，方法參考《植物基因工程》(科學(xué)出版社，第2版)進行。

然后，進行pcr檢測分析：(1)dna試驗材料：轉(zhuǎn)基因植株9k-mat的總dna提取物；陰性對照9k的總dna提取物；陽性對照pc3300-mat^#質(zhì)粒。(2)pcr檢測mat^#基因：上游引物pmat-1的序列如seqidno.12所示，下游引物pmat-2的序列如seqidno.13所示。

對mat^#基因的檢測結(jié)果如圖3.a所示。其中，泳道m(xù)為dl2000dna分子量標(biāo)記，泳道b為不加模板的陰性對照，泳道ck為非轉(zhuǎn)基因植株9k的陰性對照，泳道p為陽性質(zhì)粒的對照，泳道9k-mat為轉(zhuǎn)基因株系的檢測結(jié)果，說明轉(zhuǎn)基因株系9k-mat已成功轉(zhuǎn)入了mat^#基因。

(b)轉(zhuǎn)基因植株9k-mat的southern雜交檢測

首先，采用ctab法提取植株總dna，方法參考《植物基因工程》(科學(xué)出版社，第2版)進行。

其次，以pcr擴增的方法制備探針，具體方法如下：

(1)pcr反應(yīng)體系：正向引物pmat-1(10μmol)1μl，反向引物pmat-2(10μmol)1μl，dna模板(10-20ng/μl)1μl，10×pcr緩沖液2μl，mgcl22μl，dig-dutp標(biāo)記混合物1μl，h2o13.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl。

(2)pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，34個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

(3)檢測擴增產(chǎn)物：制備1.0％的瓊脂糖凝膠，取1μlpcr產(chǎn)物稀釋5倍后電泳檢測。

southern雜交方法參考《植物基因工程》(科學(xué)出版社，第2版)進行。結(jié)果顯示，southern雜交檢測4株t2代植株，全部均有相同的特異性目標(biāo)條帶出現(xiàn)(圖3.b)，初步表明9k-mat株系至少含有2個拷貝的mat^#基因，且連鎖遺傳、不分離。

實施例4

本實施例用于說明mat^#基因在秈稻9k中表達(dá)。

通過測定mat^#基因表達(dá)產(chǎn)物的酶活，用于說明mat^#基因在秈稻9k中能正常表達(dá)。

mat蛋白酶活測定按照文獻(xiàn)(ellmangl.tissuesulfhydrylgroups.archivesofbiochemistryandbiophysics,1959,82(1):70-7)所述方法進行，具體操作步驟如下：

(1)取0.5g葉片，加500μl提取緩沖液(25mmol/ltris-hcl，1mmol/lna2edta，0.15mg/ml苯甲基磺酰氟，ph8.5)，加25mg聚乙烯聚吡咯烷酮，冰上研磨。

(2)將研磨液在4℃下13000rpm離心10min，取上清液，得到粗提液。

(3)取4根滅菌離心管，編號1、2、3、4。分別在離心管中加入100μl粗提液，1～3管放于冰上，將4號管在沸水浴中加熱1min。

(4)分別在管中加入690μl反應(yīng)緩沖液(100mmol/ltris-hcl，ph8.5)，加入100μl5,5-二硫二硝基苯甲酸(終濃度為0.4mg/ml)，10μl乙酰coa(終濃度為0.5mmol/l)。

(5)將4根離心管放于30℃水浴中預(yù)熱1min后，逐管加入100μl草銨膦(終濃度為1mmol/l)，30s后使用uv-2450型號分光光度計測定a412，分別記為a1、a2、a3、a4。用等體積的去離子水替代樣品作為空白對照。

(6)定義1個酶活性單位(u)為1分鐘內(nèi)催化1μmol底物所需的酶量，利用下列公式計算酶的比活力。

其中，ε為摩爾吸收系數(shù)，文獻(xiàn)(ellmangl.tissuesulfhydrylgroups.archivesofbiochemistryandbiophysics,1959,82(1):70-7)值為13600ml·mmol^-1·cm^-1，v為反應(yīng)體系體積(單位ml)，b為光度計直徑(單位cm)，w為樣品鮮重(單位mg)。

以t2代轉(zhuǎn)基因植株9k-mat葉片為材料，測量其表達(dá)的n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果如表2所示。經(jīng)計算，t2代轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)的mat蛋白的平均比活力為6.67×10^-5u/mg鮮重，n-乙?；D(zhuǎn)移酶活性約為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.5倍。

表2

表2示出了t2代轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat的mat蛋白酶活性。

實施例5

本實施例用于說明t2代轉(zhuǎn)基因植株9k-mat噴灑除草劑草銨膦的抗性實驗。

用100ml濃度為1000mg/l的草銨膦水溶液噴灑非轉(zhuǎn)基因植株9k和轉(zhuǎn)基因植株9k-mat，10d后觀察植株生長情況。

結(jié)果如圖4所示，其中，ck為非轉(zhuǎn)基因植株9k，9k-mat為轉(zhuǎn)基因株系。由圖4可以看出，非轉(zhuǎn)基因植株9k已經(jīng)枯死，而轉(zhuǎn)基因的植株則生長正常。說明mat^#基因在轉(zhuǎn)基因水稻中正常表達(dá)，能抵抗?jié)舛葹?000mg/l草銨膦的處理。

實施例6

本實施例用于說明t2代轉(zhuǎn)基因植株的種子在含草銨膦培養(yǎng)基上萌發(fā)的抗性檢測結(jié)果。

方法：將滅菌后的9k、9ka2(含bar基因)和9k-mat種子分別接種到含有0、6、100、300、600mg/l草銨膦的1/2ms培養(yǎng)基上，在24℃光照/19℃黑暗交替條件下發(fā)芽，10天后測定每個發(fā)芽種子的根長和芽長。其中9ka2為以秈稻9k為受體轉(zhuǎn)化了抗草銨膦的bar基因的轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因水稻由發(fā)明人單位研制。

通過種子萌發(fā)實驗測定轉(zhuǎn)基因植株對草銨膦的抗性(圖5、表3)。從圖5可以看出，隨著除草劑濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因受體植株的根系和芽的生長受到了抑制，而且幼苗的顏色發(fā)黃，轉(zhuǎn)基因株系9k-mat的生長并未受到很大影響。統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因水稻種子在草銨膦培養(yǎng)基上萌發(fā)的根長，結(jié)果表明(表3)，當(dāng)草銨膦濃度均為0mg/l時，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻的根長無顯著差異；在存在草銨膦(6～600mg/l)的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat的根長顯著長于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏母L，說明轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat具有草銨膦抗性。轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat在各個處理中都沒有表現(xiàn)出草銨膦對根長的顯著抑制作用，說明轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat用根長度量的草銨膦抗性濃度不低于600mg/l，且9k-mat的抗性至少不低于9ka2。

統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因水稻種子在草銨膦培養(yǎng)基上萌發(fā)的芽長，結(jié)果表明(圖5，表3)，當(dāng)草銨膦濃度為0mg/l時，9k-mat的芽長與對照間無顯著差異；在存在草銨膦(6～600mg/l)的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat的芽長均顯著長于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏难块L，說明轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat具有草銨膦抗性。轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat的芽長在草銨膦6～600mg/l處理均沒有導(dǎo)致芽長比對照顯著降低，說明這轉(zhuǎn)基因水稻9k-mat用芽長度量的草銨膦抗性濃度不低于600mg/l。

表3

注：字母a、b、c表示表格縱向的多重比較結(jié)果，字母e、f、g表示表格橫向的多重比較結(jié)果，標(biāo)志字母中具有相同小寫字母的數(shù)據(jù)之間差異不顯著。

表3示出了轉(zhuǎn)基因水稻種子在含草銨膦培養(yǎng)基上萌發(fā)時的根長和芽長。

以上結(jié)合附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。