本發(fā)明總地涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種csad蛋白及其編碼基因在抗流感病毒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流感病毒對(duì)人類的健康造成極大危害，在已經(jīng)過去的20世紀(jì)，人類發(fā)生過4次大規(guī)模的流感流行，包括1918年的“西班牙流感”大流行、1957年的“亞洲流感”大流行、1968年的“香港流感”大流行和1977年的“俄羅斯流感”大流行。這些流感的大流行使得人類生命財(cái)產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展遭受了巨大的打擊。

流感病毒屬于正粘病毒科，是一類分節(jié)段、有包膜的單鏈負(fù)鏈rna病毒，傳染性強(qiáng)且易發(fā)生變異，包括a、b、c三型，可感染不同宿主。其中a型流感病毒可以感染人類、禽類及哺乳動(dòng)物，是引起季節(jié)性流行性感冒的主要病原體；b型、c型流感病毒則主要感染人類。a型流感病毒又可依據(jù)其表面抗原血凝素(hemagglutinin，ha)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，na)種類分為不同亞型，截止到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了17種亞型的ha和10種亞型的na。a型流感病毒近年來在我國呈現(xiàn)季節(jié)性流行趨勢。

流感病毒顆粒在電鏡下呈球形，直徑為80～120nm，外被囊膜，主要由蛋白質(zhì)和rna組成。病毒顆粒的表面是來自于宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，其中的兩種主要表面抗原h(huán)a和na以及一種離子通道蛋白m2。脂質(zhì)雙層內(nèi)部為來自病毒的基質(zhì)蛋白(matrixprotein，m1)。病毒粒子核心為8條核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoproteincomplex，rnp)，包括病毒基因組片段、rna聚合酶復(fù)合物(rnapolymerasecomplex)以及病毒核蛋白(nucleoprotein，np)。其中pb2(polymerasebasic2)、pb1(polymerasebasic1)、pa(polymeraseacid)三個(gè)蛋白組成了rna聚合酶復(fù)合物的主要成份。另外，核外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nuclearexportprotein/nonstructuralprotein2，ns2/nep)也存在于純化的病毒粒子中。

流感病毒基質(zhì)蛋白m1是包圍在病毒核心外的一層膜結(jié)構(gòu)，介于核蛋白與脂質(zhì)雙層膜之間，與組成脂質(zhì)雙層膜的類脂緊密結(jié)合，在維持病毒形狀與完整性上起重要作用。m1蛋白參與病毒復(fù)制過程多個(gè)環(huán)節(jié)，具有調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄和被感染細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿之間的物質(zhì)運(yùn)輸作用，以及參與病毒的出芽過程，是流感病毒的主要成分之一。

半胱亞磺酸脫羧酶(cysteinesulfinatedecarboxylase,csad)是氨基酸脫羧酶之一。是催化l-半胱亞磺酸脫羧產(chǎn)生氨乙基亞磺酸和二氧化碳的酶，亞磺酸(hypotaurine)經(jīng)過脫氫而生成牛磺酸。該酶可在動(dòng)物的肝臟、脾臟、腎臟、小腸壁等中見到，以磷酸吡哆醛為輔酶。

牛磺酸(taurine)又稱β-氨基乙磺酸。純品為無色或白色斜狀晶體，無臭，?；撬峄瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成。?；撬犭m然不參與蛋白質(zhì)合成，但它卻與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)。人體合成?；撬岬陌腚装彼醽喠蛩狒让?csad)活性較低，主要依靠攝取食物中的牛磺酸來滿足機(jī)體需要。

?；撬崾且环N特殊的氨基酸，是人體必不可少的一種營養(yǎng)元素。經(jīng)過研究證實(shí)，人體心臟中?；撬岷孔罡?。?；撬崾峭ㄟ^保護(hù)心肌而增強(qiáng)心臟功能的。當(dāng)心肌細(xì)胞中鈣離子流入量過高時(shí)，就會(huì)引發(fā)冠心病。?；撬峥梢哉{(diào)整心肌細(xì)胞中鈣離子的量，維持其平衡，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)心。此外，?；撬釋?duì)肺、肝臟、胃腸等都有保護(hù)作用。在日常生活方面，?；撬嶙铒@著的作用就在于增強(qiáng)免疫力和抗疲勞。?；撬峥梢越Y(jié)合白細(xì)胞中的次氯酸并生成無毒性物質(zhì)，降低次氯酸對(duì)白細(xì)胞自身的破壞，從而提高人體免疫力。同時(shí)，?；撬崮芫S持心臟功能，使血液循環(huán)正?；瑥亩谏晌?，使肌體能有效地產(chǎn)生能量。體內(nèi)保持恒定的?；撬?，便能有效地消除疲勞，這是維持人體健康的重要因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種csad蛋白及其編碼基因在抗流感病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供蛋白質(zhì)或其編碼基因在制備抗流感病毒的藥物或免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用；

所述蛋白質(zhì)為如下(a)或(b)：

(a)由seqidno：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將seqidno：1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗流感病毒活性的衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供蛋白質(zhì)及其編碼基因在如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)中的應(yīng)用：

(a1)制備能夠抑制流感病毒復(fù)制的藥物；

(a2)制備能夠抑制流感病毒復(fù)制的免疫增強(qiáng)劑；

(a3)制備能夠結(jié)合并抑制流感病毒m1蛋白的藥物；

(a4)制備能夠抑制流感病毒感染引起的肺組織病理損傷的藥物。

為了便于蛋白(csad)的純化，可在由seqidno：1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1：標(biāo)簽的序列

上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將seqidno：2所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。

在上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因(csad編碼基因)是如下(1)至(3)中任一所述的dna分子：

(1)seqidno：2所示的dna分子；

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)所限定的dna分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；

(3)與(1)或(2)中任一所述的dna分子具有90％以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。

在上述應(yīng)用中，所述流感病毒可為a型或b型流感病毒。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述流感病毒具體為h1n1型流感病毒a/pr8/1934株

所述csad蛋白或其編碼基因的抗流感病毒功能具體體現(xiàn)在如下：所述csad蛋白能夠結(jié)合流感病毒m1蛋白，從而抑制流感病毒的復(fù)制。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有seqidno：2所示的dna分子的抗流感病毒的藥物或免疫增強(qiáng)劑。

本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供含有seqidno：2所示的dna分子且用于制備抗流感病毒的藥物或免疫增強(qiáng)劑的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供含有seqidno：1所示的蛋白質(zhì)的抗流感病毒的藥物或免疫增強(qiáng)劑。

本發(fā)明通過研究129小鼠宿主與流感病毒基質(zhì)蛋白m1相互作用機(jī)制，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)尋找到了129小鼠肺部蛋白中與a型流感病毒pr8基質(zhì)蛋白m1相互作用的靶蛋白csad，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了csad蛋白與流感病毒基質(zhì)蛋白m1的相互作用，并且發(fā)現(xiàn)csad蛋白可以在流感病毒感染前期(12-24h)抑制流感病毒復(fù)制水平；csad對(duì)129小鼠的灌胃實(shí)驗(yàn)表明，csad能夠顯著提高小鼠感染流感病毒后的存活率，并抑制肺部的炎癥反應(yīng)。本發(fā)明的研究結(jié)果為開發(fā)基于宿主細(xì)胞基因靶點(diǎn)的抗病毒藥物提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中免疫共沉淀產(chǎn)物與pcdna-flag-csad與pci-gfp-m1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后提取的總蛋白進(jìn)行westernblot結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中csad蛋白與流感病毒基質(zhì)蛋白m1在a549 細(xì)胞核內(nèi)共定位結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中過表達(dá)細(xì)胞系(a549-csad)與對(duì)照細(xì)胞系(a549-nc)感染流感病毒pr8病毒后病毒滴度對(duì)比圖；

圖4a為本發(fā)明實(shí)施例3中csad對(duì)129小鼠灌胃及流感病毒感染實(shí)驗(yàn)中小鼠存活率對(duì)比圖；

圖4b為本發(fā)明實(shí)施例3中csad對(duì)129小鼠灌胃及流感病毒感染實(shí)驗(yàn)中小鼠感染流感病毒后第四天肺部病理切片對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1通過酵母雙雜交技術(shù)篩選特異性抗病毒蛋白

(1)使用酵母雙雜交技術(shù)，篩選129小鼠肺部組織中與流感病毒基質(zhì)蛋白m1相互作用的蛋白，尋找129小鼠宿主特異性抗病毒蛋白。

(2)處理8-12周齡雌性129小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)各三只，取肺部組織液氮研磨，使用trizol法提取總rna。

(3)使用clontech公司makeyourown“mate&plate^tm”librarysystem試劑盒將總rna(1-2μg)反轉(zhuǎn)錄為cdna，具體步驟如下：

1)將如下試劑加到0.25ml離心管中，混合均勻，簡短離心；

試劑：1-2μl步驟(2)中獲得的rna；1.0μl的cdsⅲ/6引物(5’-attctagaggccgaggcggccgacatg-nnnnnn-3’)；1-2μl；用去離子水補(bǔ)足體積至4.0μl。

2)72℃溫育2min；再放在冰上冷卻2min；簡短離心。

3)離心管放置在室溫下，加入下列試劑后，輕敲混勻，簡短離心。

試劑：2.0μl5xfirst-strandbuffer；1.0μldtt(20mm)；1.0μldntpmix(10mm)；1.0μlmmlv逆轉(zhuǎn)錄酶；用去離子水補(bǔ)足體積至9.0μl。

4)在25–30℃的室溫下，溫育10min；再在42℃溫育10min。

5)加入1.0μlbdsmartiii寡核苷酸。

6)在空氣培養(yǎng)箱或者熱蓋pcr儀上，42℃溫育一個(gè)小時(shí)。

7)放置反應(yīng)試管75℃、10min，終止首鏈合成。

8)室溫下冷卻，在加1.0μl(3個(gè)單位)rnaseh；在37℃溫育20min。

9)從首鏈合成物取2μl液體并加入到一個(gè)干凈的、預(yù)冷的、0.5ml試管中，放置在冰上備用。

(4)通過ld-pcr擴(kuò)增首鏈合成獲得的dscdna。

(5)將(4)中獲得的dscdna與pgadt7質(zhì)粒(購自clontech公司)共轉(zhuǎn)化y187酵母(購自clontech公司)感受態(tài)細(xì)胞，建立129小鼠肺部組織酵母cdna文庫。

1)用dscdna和pgadt7-rec(購自clontech公司)轉(zhuǎn)化ah109酵母菌株(購自clontech公司)準(zhǔn)備酵母的感受態(tài)細(xì)胞；在無菌預(yù)冷的15ml離心管加入下列試劑：20μldscdna；6μlpgadt7-rec；20μlherringtestescarrierdna。

轉(zhuǎn)移46μlherringdna到一個(gè)離心管中并在100℃加熱5min。立即把試管放在冰浴中冷卻dna。加dna到15ml反應(yīng)試管前再進(jìn)行一次加熱及冷卻步驟。加600μlah109酵母感受態(tài)細(xì)胞到herringdna中，輕輕渦旋震蕩混合，加入2.5mlpeg/liac溶液，輕輕渦旋震蕩混合；30℃溫育45min，每隔15min混合一次細(xì)胞；加入160μldmso,混合，再放置試管到42℃水浴，20min。隔10min混合一次細(xì)胞；700×g離心5min，棄掉上清，用3mlypdplus液體培養(yǎng)基重新懸浮。30℃溫育，搖動(dòng)90min。700×g離心5min，棄掉上清，用30mlnacl(0.9％)溶液重新懸浮。

2)在sd/–leu平板上選擇轉(zhuǎn)化子

將1)獲得的ah109酵母菌株懸浮液鋪平板，每個(gè)150mm平板上鋪展150μl懸浮液。(注：檢測轉(zhuǎn)化效率，鋪100μl1:10,1:100,1:1,000,and1:10,000稀釋液在100-mmsd/–leu平板上。)

上面向下30℃溫育平板直到克隆出現(xiàn)(3-6天)。

計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。期望結(jié)果：≥1×10⁶transformants/3μgpgadt7-rec。

3)收集轉(zhuǎn)化子

4℃冷卻平板3-4小時(shí)，每個(gè)平板加入5ml冷凍培養(yǎng)基；使用無菌的玻璃棒輕輕的攪動(dòng)使細(xì)胞進(jìn)入液體；匯集所有的液體到燒瓶中，混合均勻。使用記數(shù)計(jì)計(jì)算細(xì)胞的密度。每1ml等份保存在–80℃下。

(6)將h1n1a型流感病毒pr8株的m1cdna連接到pgbkt7載體(購自clontech公司)ecori與sali酶切位點(diǎn)間作為誘餌質(zhì)粒(使用promega公司的t4dnaligase試劑盒，根據(jù)試劑盒的說明書具體操作)，利用matchmakertwo-hybridsystem篩選與流感病毒m1蛋白相互作用的小鼠宿主蛋白，具體步驟如下：

1)融合文庫宿主菌和誘餌菌株：

a)在室溫水浴中融化1ml等份(≥2×10⁷cells)步驟(5)中獲得的ah109轉(zhuǎn)化子(流感病毒pr8株的m1cdna文庫)。

b)混合5mly187(129小鼠肺部組織酵母cdna文庫)和1ml均份的ah109轉(zhuǎn)化子細(xì)胞在一個(gè)無菌2l燒瓶中。

c)加入45ml2xypda/kan(50μg/ml)。輕輕搖動(dòng)。

d)用兩個(gè)2xypda/kan(50μg/ml)均分液從文庫瓶中洗脫細(xì)胞。

e)30–50rpm轉(zhuǎn)速，30℃溫育20–24小時(shí)。

f)20個(gè)小時(shí)融合后，在相差顯微鏡下檢查一滴融合培養(yǎng)物，如果合子存在，可以再進(jìn)行四個(gè)小時(shí)的融合。

g)把融合混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌100ml的離心管底部。1,000×g離心10min。用0.5xypda/kan(50μg/ml)沖洗融合燒瓶兩次(每次用50ml沖洗)。匯集沖洗液并用它重新懸浮細(xì)胞。

h)1,000×g離心10min。在10ml0.5xypda/kan(50μg/ml)細(xì)胞塊。測量細(xì)胞和培養(yǎng)基總體積。

2)選擇表達(dá)相互作用蛋白的酵母二倍體：

測定融合效率，鋪100μl的1:10,000,1:1,000,1:100,和1:10稀釋的融合培養(yǎng)物于三個(gè)培養(yǎng)基(100mm平板)：sd/–leu、sd/–trp和sd/–leu/–trp。鋪展剩余的融合培養(yǎng)物于tdo或者qdo平板(200μlcells/150mm平板)。在tdo或qdo平板上生長的酵母單克隆即為可能與流感病毒m1蛋白相互作用的宿主蛋白，繼續(xù)測序鑒定。

3)將2)中篩選出的表達(dá)相互作用蛋白的酵母菌株克隆進(jìn)行質(zhì)粒dna 提取，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α細(xì)胞，而后再進(jìn)行測序。測序結(jié)果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提交的基因序列與“musmusculuscysteinesulfinicaciddecarboxylase(csad),mrna”同源性達(dá)到95％以上。

實(shí)施例2免疫印跡及細(xì)胞共定位

將a型流感病毒pr8株基質(zhì)蛋白m1與csad蛋白(核苷酸序列見seqidno：1)全長cdna分別構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒pcdna-flag、pci-gfp中(ogawa,k.,tanaka,y.,uruno,t.,duan,x.f.,harada,y.,sanematsu,f.,yamamura,k.,terasawa,m.,nishikimi,a.,cote,j.f.,etal.(2014).dock5functionsasakeysignalingadaptorthatlinksfcepsilonrisignalstomicrotubuledynamicsduringmastcelldegranulation.journalofexperimentalmedicine211,1401-1413.質(zhì)粒pcdna-flag、pci-gfp公眾自本申請(qǐng)的申請(qǐng)日起二十年可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得)，具體步驟包括：

(1)設(shè)計(jì)a型流感病毒pr8株基質(zhì)蛋白m1全長引物，左右兩端添加酶切位點(diǎn)xhoi、sali酶切位點(diǎn)(m1-f:5’-gccgaattcatgagtcttctaaccgag-3’；m1-r:5’-caggtcgactcacttgaaccgttgcat-3’)，連接到pci-gfp質(zhì)粒中，獲得pci-gfp-m1。

(2)設(shè)計(jì)csad蛋白全長引物，左右兩端分別添加ecori、xhoi酶切位點(diǎn)(引物序列：csad-f:5’-gcggaattcaccatggctgactcaaaac-3’；csad-r:5’-gcgctcgagcaggtcctggcccaggagc-3’)，連接到pcdna-flag質(zhì)粒中，獲得pcdna-flag-csad。

將構(gòu)建好的分別含有m1和csad蛋白的cdna序列的兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞：①48h后裂解細(xì)胞提取蛋白，使用m2affinitygelpurifiedimmunoglobulin(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)進(jìn)行免疫共沉淀(ip)，將ip產(chǎn)物與總蛋白使用不同抗體(gfp、flag標(biāo)簽蛋白抗體)進(jìn)行westernblot，驗(yàn)證csad是否與流感病毒m1蛋白具有相互作用；②48h后使用anti-flag一抗(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)與alexafluor647標(biāo)記的anti-mouseigg二抗(上海翊圣生物科技有限公司)及dapi對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并固定，在熒光顯微鏡下觀察是否存在兩個(gè)蛋白的細(xì)胞內(nèi)共定位。

結(jié)果：如圖1所示，當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來，如果用蛋白質(zhì)flag(csad)的抗體免疫沉淀flag(csad)，那么與csad在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)m1也能沉淀下來(見泳道lane4)。反之，陰性對(duì)照組沒有轉(zhuǎn)染csad，因此m1無法被沉淀下來(見泳道lane3)。

如圖2所示，pcdna-flag-csad與pci-gfp-m1共同轉(zhuǎn)染至hela細(xì)胞(liu,d.,sheng,c.j.,gao,s.j.,yao,c.,li,j.d.,jiang,w.,chen,h.m.,wu,j.x.,pan,c.c.,chen,s.,etal.(2015).socs3drivesproteasomaldegradationoftbk1andnegativelyregulatesantiviralinnateimmunity.molecularandcellularbiology35,2400-2413.公眾自本申請(qǐng)的申請(qǐng)日起二十年可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得)后，使用帶有紅色熒光的flag抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，可以觀察到csad與m1在核內(nèi)發(fā)生共定位，即顯示黃色(overlay下)。

實(shí)施例3csad穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建及感染實(shí)驗(yàn)

使用慢病毒表達(dá)載體pcdh-cmv(購自systembiosciences,inc公司)構(gòu)建csad穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，具體步驟如下：

(1)在csad兩端設(shè)計(jì)xbai、ecori酶切位點(diǎn)，插入pcdh-cmv載體中，獲得載體pcdh-csad；

(2)使用pei轉(zhuǎn)染試劑將pcdh-cmv與pcdh-csad分別轉(zhuǎn)染至a549細(xì)胞(liu,d.,sheng,c.j.,gao,s.j.,yao,c.,li,j.d.,jiang,w.,chen,h.m.,wu,j.x.,pan,c.c.,chen,s.,etal.(2015).socs3drivesproteasomaldegradationoftbk1andnegativelyregulatesantiviralinnateimmunity.molecularandcellularbiology35,2400-2413.公眾自本申請(qǐng)的申請(qǐng)日起二十年可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得)中，具體操作如下：

a)準(zhǔn)備40％-80％的a549細(xì)胞(6-well，5×10⁵/well)，陰性對(duì)照(pcdh-cmv)和目的基因(pcdh-csad)各一個(gè)孔；

b)在400ul無血清dmem培養(yǎng)液中加入2μg質(zhì)粒，混合均勻；

c)在b)的混合液中加入4μl的pei轉(zhuǎn)染試劑(1mg/ml)，混合均勻；室溫靜置10分鐘；

d)向c)的混合液中加入1.1ml的2％fbs/dmem液體培養(yǎng)基，混 合均勻；

e)吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，將混合液全部加入；

f)在37℃培養(yǎng)3小時(shí)，而后換成正常培養(yǎng)基(10％fbs/dmem)；在24-48小時(shí)后檢測基因表達(dá)。

(3)出現(xiàn)綠色熒光后，使用puromycin(5μg/ml)篩選陽性細(xì)胞，大約2周。而后使用流式細(xì)胞儀分選gfp高表達(dá)細(xì)胞，即為a549-csad(過表達(dá))及a549-cmv(對(duì)照)細(xì)胞系。

分別將csad表達(dá)細(xì)胞系a549-csad與對(duì)照細(xì)胞系a549-cmv感染pr8病毒(moi＝0.01)后，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)(0-72h)通過空斑分析法(plaqueassay)測定病毒滴度。感染12h和24h后分別測定dmem培養(yǎng)液滴度。

結(jié)果：如圖3所示，顯示csad可以在感染前期(12-24h)抑制流感病毒復(fù)制水平。

使用1×10⁶pfupr8病毒感染129小鼠，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各三只129小鼠，感染后每天給小鼠對(duì)照蛋白(nc)或csad蛋白各10μg，灌胃施用。記錄小鼠每天體重變化與死亡率，并在感染后第4天處死小鼠制作肺部病理he切片。

結(jié)果：如圖4所示，對(duì)照組小鼠在感染流感病毒后肺泡和細(xì)支氣管壁上皮細(xì)胞嚴(yán)重破壞和增厚，肺泡間孔徑顯著縮??；而實(shí)驗(yàn)組小鼠肺泡和支氣管上皮細(xì)胞破壞和增厚情況均要明顯好于對(duì)照組小鼠。因此，csad可以有效抑制流感病毒感染引起的肺組織病理損傷(圖4b)并顯著提高小鼠的生存率(圖4a)。

最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。